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Page 1 Avan Avan ç ç os os Tecnol Tecnol ó ó gicos gicos Colunas Colunas HPLC HPLC

Merck Colunas HPLC

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Page 1

AvanAvanççosos TecnolTecnolóógicosgicos

ColunasColunas HPLCHPLC

Page 2

MERCK EM DARMSTADT

300.000 QUILOS/ANO DE SÍLICA PARA CROMATOGRAFIA

Page 3

MERCK NO MUNDO 31/12/06

121_Ricany-Jazlovice, Czech Republic122_Riga, Latvia123_Rio de Janeiro, Brazil124_Riad, Saudi Arabia125_Rockland, USA126_Rome, Italy127_San Diego, USA128_Santiago de Chile, Chile129_São Luis, Brazil130_São Paulo, Brazil131_Savannah, USA132_Schaffhausen, Switzerland133_Schwalbach, Germany134_Semoy, France135_Seoul, South Korea136_Shah Alam, Malaysia137_Shanghai, China138_Singapore, Singapore139_Sofia, Bulgaria140_Spittal, Austria141_Stockholm, Sweden142_Sydney, Australia143_Taipeh, Taiwan144_Taloja, India145_Tallin, Estonia146_Taoyuan, Taiwan147_Tokyo, Japan148_Tunbridge Wells, United Kingdom149_Unterschleissheim, Germany150_Vantaa, Finland151_Vienna, Austria152_Wilna, Lithuania153_Wadeville, South Africa154_Warsaw, Poland155_West Drayton, United Kingdom156_Zagreb, Croatia157_Zug, Switzerland

81_London, United Kingdom82_Lorenskog, Norway83_Lyon, France84_Madison, USA85_Madrid, Spain 86_Mailand, Italy87_Makati-Stadt, Philippines88_Manlleu, Spain 89_Martillac, France90_Mainz, Germany91_Meyzieu, France92_Milwaukee, USA93_Mississauga, Canada94_Modderfontein, South Africa95_Mollet del Vallés, Spain96_Monaco, Monaco97_Montevideo, Uruguay98_Moscow, Russia99_Mumbai, India100_Napa, USA101_Ness-Ziona, Israel102_Netanya, Israel103_Newport, United Kingdom104_Norwood, USA105_Nottingham, United Kingdom106_Oakville, Canada107_Onahama, Japan108_Osaka, Japan109_Oslo, Norway110_Overijse, Belgium111_Palmerston North, New Zealand112_Panama City, Panama113_Paris, France114_Poole, United Kingdom115_Potters Bar, United Kingdom116_Prague, Czech Republic117_Pyongtaek-Shi, South Korea118_Quetta, Pakistan119_Quito, Ecuador120_Reinbek, Germany

41_Durham, USA42_Espoo, Finland43_Mexico City, Mexico44_Etobicoke, Canada45_Feltham, United Kingdom46_Fontenay-sous-Bois, France47_Fourways, South Africa48_Frankfurt a. M., Germany49_Frederiksberg, Denmark50_Geneva, Switzerland51_Gernsheim, Germany52_Gibbstown, USA53_Goa, India54_Grafing, Germany55_Guangzhou, China56_Guatemala City, Guatemala57_Hanoi, Vietnam58_Hauppage, USA59_Hawthorne, USA60_Hellerup, Denmark61_Herzlia-Pituach, Israel62_Ho-Chi-Minh City, Vietnam63_Hohenbrunn, Germany64_Hong Kong, China65_Hull, United Kingdom66_Istanbul, Turkey67_Ivrea, Italy68_Jakarta, Indonesia69_Jeddah, Saudi Arabia70_Karatschi, Pakistan71_Kaunas, Latvia72_Kawagoe City, Japan73_Kilsyth, Australia74_Kuwait City, Kuwait75_Läufelfingen, Switzerland76_Lehrte, Germany77_Les Berges du Lac, Tunisia78_Lima, Peru79_Lisbon, Portugal80_Ljubljana, Slovenia

01_Altdorf, Switzerland02_Amsterdam, Netherlands03_Ardea, Italy04_Athens, Greece05_Atsugi, Japan06_Aubonne, Switzerland07_Auckland, New Zealand08_Bangkok, Thailand09_Bari, Italy10_Barra do Corda, Brazil11_Beijing, China12_Beirut, Lebanon13_Belgrad, Serbia14_Bogotá, Colombia15_Boston, USA16_Bratislava, Slovakia17_Brisbane, Australia18_Brussels, Belgium19_Bucharest, Romania20_Budapest, Hungary21_Buenos Aires, Argentina22_Bunschoten, Netherlands23_Cairo, Egypt24_Calais, France 25_Cambridge, Canada26_Caracas, Venezuela27_Carlos Spegazzini, Argentina28_Casablanca, Morocco29_Chilly-Mazarin, France30_Chilworth, United Kingdom31_Coinsins, Switzerland32_Copenhagen, Denmark33_Corsier-sur-Vevey, Switzerland34_Dammam, Saudi Arabia35_Darmstadt, Germany36_The Hague, Netherlands37_Dietikon, Switzerland38_Dijon, France39_Dubai, United Arab Emirates40_Dublin, Ireland

Page 4

UNIVERSO MERCK

Page 5

Paulo FellippeDaniel Teixeira

Paulo FellippeAlexandre RosoliaDouglas ViccoGuilherme Carrara

Assistência TécnicaEquipe de Vendas

EQUIPE DE CROMATOGRAFIA

Page 6

DanielColunas HPLC

GuilhermeEquipamento / Validação

AlexandreEquipamento / Rede / Preparativa

DouglasEquipamento / Software

ASSESSORIA TÉCNICA

Page 7

•Parte 1: Introdução a HPLC e princípios básicos

•Parte 2: Seleção de colunas e fase móvel

•Parte 3: Sílica Convencional

•Parte 4: Sílica Ultra-Pura

•Parte 5: Blocos monolíticos

CONTEÚDO DO TREINAMENTO

Page 8

ParteParteParteParte 1 : 1 : 1 : 1 :

IntroduIntroduIntroduIntroduçççção a HPLC e ão a HPLC e ão a HPLC e ão a HPLC e

PrincPrincPrincPrincíííípios Bpios Bpios Bpios Báááásicossicossicossicos

Page 9

Medalha Tswett, recebida pela Merck KgaA em 1980.

COMO TUDO COMEÇOU

Page 10

A FUNÇÃO DA COLUNA

Page 11

A ADSORÇÃO QUÍMICA

Page 12

Por que separam?

Amarelo é APOLAR: tem mais afinidade pela FASE MÓVEL e elui primeiro

Vermelho é POUCO POLAR: tem menos afinidade pela FASE MÓVEL e elui depois

Azul é POLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONÁRIA e elui por último

Fase Estacionária Polar (Sílica)Fase Móvel Apolar (Hexano)

AZ V AM

CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL

Page 13

mecanismo:

Retenção por interação da fase estacionária polar com a parte polar da molécula da amostra.

Fase estacionária:

SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2

Fase Móvel:

heptano, hexano, ciclohexano, dioxano, metanol

método:

Separação de componentes não polares para médio polares (Hidrocarbonetos e ácidos carboxílicos)

O

OSi

O

H

O

SiO

O

OO

2CH

SiO

O

OO

H

H

H

O

FASE NORMAL

Page 14

Por que separam?

Azul é POLAR: tem mais afinidade pela FASE MÓVEL e elui primeiro

Vermelho é POUCO APOLAR: tem menos afinidade pela FASE MÓVEL e elui depois

Amarelo é APOLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONÁRIA e elui por último

Fase Estacionária Apolar (RP18)Fase Móvel Polar (Água)

AM V AZ

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Page 15

mecanismo:

Retenção por interação da fase estacionária não polar (cadeia de hidrocarbonetos) com a fase não polar da molécula da amostra.

Fase estacionária:

n-octadecil (RP-18), n-octil (RP-8), etil (RP-2), Fenil, -NH2, -CN, -Diol, Polimeros hidrofobicos

Fase móvel:

metanol ou acetonitrila / água ou tampão, THF ou dioxano.

H2O

H2O

H2O

CH3OH

CH3OH

2CH OH

O

O

SiO HO

SiO

O

O

O Si

3CH

3CH

SiO

O

O

O Si

3CH

3CH

FASE REVERSA

Page 16

POLAR APOLAR

Água - Metanol - Acetonitrila - Acetona - THF - Hexano

POLARIDADE DA FASE MÓVEL

Page 17

POLAR APOLAR

Sílica – DIOL – NH2 – CN – RP8 – RPselectB – RP18

POLARIDADE DA FASE ESTACIONÁRIA

Page 18

Fase Normal Fase Reversa

Polaridade da f.e. � alta � baixa

polaridade da fase móvel � baixa-média � média-alta

ordem de eluição da amostra � menos polar primeiro � mais polar primeiro

Aumento da retenção por

Fase Normal Fase Reversa

� Decréscimo da polaridade da FM � Aumento da polaridade da FM

� Aumento da polaridade da molécula da amostra � Decréscimo da polaridade damolécula da amostra

CARACTERIZAÇÃO

Page 19

ParteParteParteParte 2 :2 :2 :2 :

SeleSeleSeleSeleçççção de colunas e ão de colunas e ão de colunas e ão de colunas e

fase mfase mfase mfase móóóóvel vel vel vel

Page 20

Terceira Geração (1990): Purospher®

- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partículas esféricas.

Quarta Geração (2000): Purospher® STAR- partículas esféricas de 3 µm e 5 µm, maior potencial

Primeira Geração (1970): LiChrosorb®

- a primeira coluna para HPLC; partículas irregulares; 1ª fase reversaRP18

Segunda Geração (1980): LiChrospher®, Superspher®

- partículas esféricas de 4 e 5 µm com seletividade otimizada

DESENVOLVIMENTO DE FASES PARTICULADAS

Page 21

FaseFase ReversaReversa::

modificação: RP-8, RP-select B, RP-18, -CN, -Diol, -NH2

Estrutura: LiChrosorb®, LiChrospher®, Superspher®, Purospher®,

Purospher® STAR, Chromolith®.

FaseFase Normal:Normal:

modificação: Si, -Diol, -CN, -NH2

Estrutura: LiChrosorb®, LiChrospher®, Superspher®, Purospher®

STAR , Chromolith®.

TIPOS DE RECHEIO

Page 22

LiChrosorb®

LiChrospher®

Superspher®

Purospher®

Purospher® STAR

esférico

irregular

Chromolith® monolítico

Tamanho de partícula

ESTRUTURA DO RECHEIO

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Diâmetro

(mm)

Com

pri

men

to (

mm

)

LiChroCART

man

uC

AR

T

Pré-coluna

Hibar

DIMENSÕES FÍSICAS

Page 24

• Adaptação do fluxo de trabalho:

4.6mm (1 ml/min) para 4.0mm (x ml/min):

(2.3)2/ (2)2= 1/x 5.29/4= 1/x 5.29x= 4 x= 0.75 ml/min

Economia de 25% de solvente por minuto com separações equivalentes!

INFLUÊNCIA DO DIÂMETRO INTERNO

Page 25

O acoplador manu-CART® “4” é utilizado em colunas com 2 mm, 3 mm, 4 mm e 4.6 mm de diâmetro interno.

Os cartuchos podem ter250 mm, 150 mm, 125 mm e 75 mm de comprimento.

É utilizado para pré-colunas de 4-4 e 10-2.

HOLDER MANU-CART

Page 26

Montando sem a pré-coluna:

1. Coloque a rosca no cartucho

2. Fixe as duas partes da trava voltadas paradentro e as envolva com a rosca

3. Rosqueie o conector de tubulação

Montando com pré-coluna:

1. Coloque a rosca no cartucho

2. Fixe as partes da trava voltadas para fora

3. Coloque a pré-coluna neste espaço vazioformado

4. Rosqueie o conector de tubulação

MONTANDO UM MANU-CART

Page 27

A fase móvel interage físico-quimicamente com as substâncias presentes na amostra e com o enchimento da coluna, assim influenciando de forma decisiva na separação.

Recomendações:• Água usada deve ter alto grau de pureza, grau HPLC tipo LiChrosolv® (vendida pela Merck em embalagens de 1 L), ou água ultra-purificada por equipamentos (EasyPure RT VWR).

• A leitura de resistividade indica somente o teor de íons. Para medir o teor de orgânicos

na água podemos utilizar a técnica de TOC (carbono orgânico total) e eliminá-los com o

uso de equipamentos de purificação com luz UV (oxida orgânicos a CO2 e H2O).

• Não utilizar reagentes de grau técnico, p/síntese, resíduos de pesticidas, p/análise, ou UV em análises com gradiente.• Solventes grau HPLC.

• A maioria dos problemas de análise e com o equipamento tem origem na fase móvel. Porém... Coluna e Equipamento são sempre culpados!

A FASE MÓVEL

Page 28

• Água destilada é inadequada.

• Água deve ser grau HPLC.

• Livre de bactérias, utilizando uma filtração de 0,2 µm (brevundimonas diminuta).

• Resistividade de pelo menos 18 megohm/cm.

• Teor de orgânicos < que 20 ppb

• Para evitar o entupimento do filtro de 2µm basta a membrana de 0,45µm.

FILTRAÇÃO DA FASE

Page 29

• Membranas de ésteres de celulose usadas na microbiologia servem

somente para filtração de água.

• Membranas de PTFE e celulose regenerada são compatíveis com a

maioria dos solventes orgânicos e com água.

MEMBRANAS DE FILTRAÇÃO

Page 30

Relação de Transparência

• Quando a fase móvel não é muito

transparente, diminui a

sensibilidade (pois o detector

precisa subtrair o sinal para zerar a

absorbância) e aumenta o ruído.

• Offset: Indica o quanto o detector

teve que compensar a absorbância

da fase móvel para poder zerar a

linha de base; enfim indica a

qualidade da fase móvel

(transparência).

TRANSPARÊNCIA DA FASE MÓVEL

Page 31

Fases móveis saturadas com ar podem resultar em bolhas ou problemas nabomba, noise, drift, assim como outros problemas relacionados ao detector.

0

20

40

60

80

100

120

Aquecimento

Hélio

Vácuo

Ultrassom

OBS: Aquecimento é o modo mais

eficiente de remoção de gases dissolvidos,

mas é inconveniente.

Purga com He é eficiente por

apenas alguns minutos.

Vácuo é menos eficiente, mas

pelo menor custo é usado por muitos.

GASES DISSOLVIDOS

Page 32

ParteParteParteParte 3333 : : : :

SSSSíííílica Convencionallica Convencionallica Convencionallica Convencional

Page 33

Terceira Geração (1990): Purospher®

- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partículas esféricas.

Quarta Geração (2000): Purospher® STAR- partículas esféricas de 3 µm e 5 µm, maior potencial.

Primeira Geração (1970): LiChrosorb®

- a primeira coluna para HPLC; partículas irregulares; 1ª fase reversaRP18.

Segunda Geração (1980): LiChrospher®, Superspher®

- partículas esféricas de 4 e 5 µm com seletividade otimizada.

FASES ESTACIONÁRIAS PARA HPLC

Page 34

LiChrospher ®Superspher ®

LiChrosorb ®10 µ 1 µ

10 µ 1 µ

ESTRUTURA DOS MATERIAIS

Page 35

Sorbents Particlesize(µm)

Poresize(Å)

Porevolume(ml/g)

Spec.surface

area(m2/g)

% C Surfacecoverage(µmol/m2)

Efficiency (N/m)

LiChrosorb® RP-8 5, 10 100 1,0 300 9,5 3,4 55.000, 20.000LiChrosorb® RP-select B 5, 10 60 0,75 300 11,4 4,21 55.000, 20.000LiChrosorb® RP-18 5, 10 100 1,0 300 16,2 3,0 55.000, 20.000LiChrospher® RP-8 5, 10 100 1,25 350 12,5 4,04 55.000, 25.000LiChrospher® RP-8e 5, 10 100 1,25 350 13,0 4,44 55.000, 25.000LiChrospher® RP-select B 5, 10 60 0,9 360 11,5 3,55 55.000, 25.000LiChrospher® RP-18 5, 10 100 1,25 350 21,0 3,61 55.000, 20.000LiChrospher® RP-18e 5, 10 100 1,25 350 21,6 4,09 55.000, 20.000Superspher® RP-8 4 60 1,25 350 12,5 4,04 100.000Superspher® RP-8e 4 60 1,25 350 13,0 4,44 100.000Superspher® RP-select B 4 60 0,9 360 11,5 3,55 100.000Superspher® RP-18 4 100 1,25 350 21,0 3,61 100.000Superspher® RP-18e 4 100 1,25 350 21,6 4,09 100.000

Especificações

SÍLICA GEL MODIFICADA PARA FASE REVERSA

Page 36

Eluent: Methanol / 0.01M phosphate buffer pH 3.0 (2:98, v/v) + 2 ml/l triethylamine

Flow rate: 2 ml/minDetection: UV 270 nmSample: 1. Ascorbic acid;

2. Nicotinic acid; 3. Pyridoxol hydrochloride; 4. Niacin; 5. Thiamin hydrochloride

Eluent: Acetonitrile / Water (70:30)Flow rate: 2 ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. 4,4-DDOH

2. α-Endosulphan 3. 4,4-DDM 4. Heptachlor5. p,p-DDT6. o,p-DDT7. Aldrin

Eluent: Acetonitrile / Water (75:25)Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 254 nmSample: 1. Benzene

2. Naphthline3. Fluoren4. Anthracen5. Benzanthracen

Vitaminas

1

2

3

4 5

14 min

Pesticidas1

2

3

45 6

7

14 min

Aromáticos

1

2

3

4

5

14 min

TAMPÃO? TRIETILAMINA?

Page 37

HA A- H+

+ B H+

+

BH+

Compostos Iônicos: Molécula orgânica que contém um ou mais grupos funcionais capazes de comportar-se como ácido ou base na faixa de pH correspondente.

Ácidos ou Bases Fortes: são compostos que ionizam-se completamente na faixa de pH correspondente.

DEFINIÇÕES

Page 38

Plotagem em forma de S.

Quando um ácido (HA) ou base (B) ioniza, torna-se muito menos hidrofóbico (mais hidrofílico). Como resultado, sua retenção em fase reversa reduz de 10 a 20 vezes.

Ponto central: pH = pKa, metade dos compostos ionizados.

pKa ± 1.5: toda mudança em retenção com origem no pH ocorre nesta faixa.

pH < 2.5 ou pH > 5.5: composto estácompletamente ionizado ou completamente molecular, e a retenção não altera muito nesta faixa.

99 % BH+

99 % B

FUNÇÃO DE PKA E PH

Page 39

Curva de dissociação do ácido benzóico (pKa = 4.2).

Assim, recomenda-se que o pH esteja pelo menos +/- 1 unidade fora do pKa.

Quanto mais afastados estes valores, menores serão os efeitos de pequenas mudanças de composição de fase móvel na retenção.

DISSOCIAÇÃO DE ÁCIDO

Page 40

TAMPÃO PARA FASE REVERSA

Page 41

OH

SiO

SiOSi

OSiO

OH

OH

OH

OH

X Si

CH3

CH3

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

C6H13

OH

SiO

SiO

SiO

SiO

O

OH

O

OH

SiCH3

C18H37

CH3

SiCH3

C18H37

CH3

SiCH3 CH3

CH3

OH

SiO

SiOSi

OSiO

O

O

O

O

SiCH3

CH3

Si

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

CH3

Endcapping

Modificação monofuncional

Endcapped

MODIFICAÇÃO MONOFUNCIONAL DE SIO2

“ODS-1”

Page 42

1. Thiourea t0

2. Aniline basic3. Phenol acidic4. 2,3 – Dihydroxynaphthalene chelating5. 4 - Ethylaniline basic6. Diethylphthalate neutral7. N, N – Dimethylaniline basic8. Toluene neutral9. Ethylbenzene neutral

Chromatographic Conditions:

Column:

LiChrospher

RP18e

4 mm x 250 mm

Mobile Phase:

Methanol/Water

58/42 (v/v)

Flow rate:

1.0 mL/min

Temperature:

40°C

Detection:

UV 254nm

TESTE ENGELHARDT

Page 43

Eluent: Methanol / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (50/50, v/v)

Flow rate: 1ml/minDetection: UV 254 nmSample: 1. Anilin 6. N,N-Dimethylaniline

2. Phenol 7. Toluol3. o-Toloidine 8. Benzoeic acid4. m-Toloidine methylester5. p-Toloidine 9. Ethylbenzene

Eluent: Acetonitrile / Water (75/25, v/v)Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 254 nmSample: 1. Benzene

2. Naphthalin3. Fluorene4. Anthracen5. Benzanthracen

Teste Engelhardt

12

3,4,5

6

30 min

Eluent: Methanol / 0.7 mM acetic acidr(2/100, v/v)

Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 260 nmSample: 1. Iso nicotinic acid

2. Nicotinic acid3. Iso nicotinic acid amide4. Nicotinic acid amide

1

23

4

5

30 min

Ácido nicotínico + derivados Aromáticos1

2

3

4

30 min

7

8

9

1

RP-8 CONVENCIONAL COM LAVAGEM ÁCIDA

Page 44

Separação de medicamentos (com eluente ácido)

Eluent: Acetonitrile / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (20/80, g/g)

Flow rate: 1ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. Barbituric acid

2. Codeine phosphate3. Atropinium sulfate4. Papaverine5. Noscapinium chloride6. Diphenhydramine

Eluent: Acetonitrile / phosphate buffer pH 2.3(31.2/86, g/g)

Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. Diphenhydramine

2. MPPH3. Diazepam

Medicamentos

1

2

3

6

30 min

Eluent: Acetonitrile / 0.02 M KH2PO4 pH 4.7 (25/75, v/v)

Flow rate: 2 ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. Atenolol

2. Metaprolol3. Bisoprolol4. Propranolol

1

2

3

30 min

betabloqueadores DMD-Test1

2

3

4

30 min

4

5

1

1 13

RP-8 CONVENCIONAL COM LAVAGEM ÁCIDA

Page 45

ParteParteParteParte 4444 : : : :

SSSSíííílica Ultralica Ultralica Ultralica Ultra----PuraPuraPuraPura

Page 46

SiOSiO22(Na, K, Fe)

[-Si (OH)2 - O -Si (OH)2- O -]n

M2O - nSiO2

Tipo A

M= Na, K, Fe

- Si - O - Si - O -O

- Si - O - Si - O -O

n

SiOSiO22

Tipo B

- Si - O - Si - O -O

- Si - O - Si - O -O

n

Si (OC2H5)4

[-Si (OC2H5)2 - O -Si (OC2H5)2 - O -]n

Método Convencional Método Otimizado

PRODUÇÃO DE SÍLICA GEL

Page 47

TeorTeor de de metaismetais em em µµg/Lg/L

Sódio Cálcio Magnésio Ferro Alumínio

LiChrosorb® 340-400 1300 160-220 20-25 15-20

LiChrospher® 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140

Purospher® 1 1 1 3 1Purospher® STAR

DIFERENÇAS

Page 48

Si O H

Si O H

vicinal

SiO H

O Hgeminal

SiO H livreNa +

SiO-

-Fe

2+SiO-

SiO Si Me

OSi

OOO O O

OH

OH OH

OH

Si SiO O SiOSi

O

OH

Mat

rix

Grupos silanolÍons metálicos

SiO

Impurezas metálicas da sílica – pH > 3,0

H

H

H

INFLUÊNCIA DOS METAIS

Page 49

O

O

OH

OH

OH

Purpurin

O

O

OH

OH

Quinizarin

Chromatographic conditions:

Mobile phase: Methanol / 20 mM Phosphate buffer

pH 3,0; 75:25 (v/v)Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 254 nmTemperature: 30 °CSample: 1.) Purpurin

2.) Quinizarin

Purospher® STAR RP-18 e

RP-18 convencional

0 5 10

0 5 10

1.

2.

2.

AGENTES QUELANTES

Page 50

Modificação bifuncional de SiO2

OH

SiO

SiOSi

OSiO

OH

OH

OH

OH

X SiX

CH3

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

C6H13

OH

Si

O

CH3

OH

SiO

SiOSi

OSiO

O

O

O Si

CH3

Si

CH3

SiO

OSi

CH3

OSi

CH3

OHO

SiCH3

OH

Modificação bifuncional

OTIMIZAÇÃO DA MODIFICAÇÃO FUNCIONAL

“ODS-2”

Page 51

1.

400 20

RP-18 convencional

Piridina (1)

N CH3N

2-Metilpiridina (2)

Chromatographic Conditions:Mobile phase: Methanol / Water

55:45 (v/v)Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 254 nmTemperature: 35 °C

0 20 40

1

2

Purospher® RP-18 e

INFLUÊNCIA DA DESATIVAÇÃO

Page 52

Column:LiChroCART® 125-4 Purospher® RP-18 e, 5 µm

Mobile phase:Methanol / 0.02 M Phosphate buffer pH 7.6 40:60 (v/v)

Flow rate: 0.5 ml/min

Detection: UV 254 nm

Temperature: 30 °C

Sample: 1.) Uracil2.) Procainamide3.) N - Acetylprocainamide

Aplicação

0 7,5 15

1

2

3

0 7,5 15

1

2

3

Purospher RP-18e

Sílica RP-18 tipo A

PROCAINAMIDAS

Page 53

0

1

12 24 min

2

3

4

5

6

78

9

1. Thiourea t0

2. Aniline basic3. Phenol acidic4. 2,3 – Dihydroxynaphthalene chelating5. 4 - Ethylaniline basic6. Diethylphthalate neutral7. N, N – Dimethylaniline basic8. Toluene neutral9. Ethylbenzene neutral

Chromatographic Conditions:

Column:

Purospher

RP18e

4 mm x 125 mm

Mobile Phase:

Methanol/Water

55/45 (v/v)

Flow rate:

1.0 mL/min

Temperature:

ambient

Detection:

UV 254nm

TESTE ENGELHARDT

Page 54

APLICAÇÕES COM SÍLICA ULTRA-PURA

Page 55

Purospher STAR HPLC Columns- vantagens e comparação com sorbentesclássicos

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 56

Terceira Geração (1990): Purospher®

- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partículas esféricas.- Excelente simetria de picos.

Quarta Geração (2000): Purospher® STAR- partículas esféricas de 3 µm e 5 µm, maior eficiência de separação.- Seletividade “completa”- Maior estabilidade de pH: 1.5 a 10.5.

Primeira Geração (1970): LiChrosorb®

- a primeira coluna para HPLC; partículas irregulares; 1ª fase reversaRP18.

Segunda Geração (1980): LiChrospher®, Superspher®

- partículas esféricas de 4 e 5 µm com seletividade otimizada.

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 57

Caracterização cromatográficaModificação monomérica e polimérica dos silanóis

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

“ODS-3”

Page 58

• As colunas a base de sílica normal resistem a um pH entre 2-7,5.

• Abaixo do limite de pH, ocorre hidrólise dos silanóis desativados.

• Acima do limite de pH, temos a solubilidade da sílica.

Purospher - 2.0 a 7.5Purospher Star - 1.5 a 10.5

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 59

A: k‘ (Pentyl benzene)

9.59

B: α (Pentyl-/ Butyl benzene)1.51

C: α (Triphenylene/ o-Terphenyl)1.63

D: α (Caffeine/ Phenol)0.44

E: α (Benzylamine/ Phenol; pH7.6) 0.23

F: α (Benzylamine/ Phenol; pH2.7) 0.02

9,0

1,6

6,0

3,01,5

1,4

2,4

1,8

1,2

0,2

0,0

0,4

0,8

0,6

0,3

0,0

0,6

1,0

A

B

C

D

E

F

Seletividade Estérica (C)

Capacidade(A)

Capacidade dos silanóis (D)

Capacidade de troca iônica (E,F)

Hidrofobicidade(B)

Teste de Tanaka

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 60

0

10

B

A

C

D

E

F

Purospher® STAR RP-18e, 5µm

Competitor-S

0

10

B

A

C

D

E

F

0

10

B

A

C

D

E

F

0

10

B

A

C

D

E

F

Competitor-Z

Competitor-L Competitor-N

0

10

B

A

C

D

E

F

Competitor-D

0

10

B

A

C

D

E

F

0

10

B

A

C

D

E

F

Competitor-P

Competitor-I

9,0

1,6

6,0

3,01,5

1,4

2,4

1,8

1,2

0,2

0,0

0,4

0,8

0,6

0,3

0,0

0,6

1,0

A

B

C

D

E

F

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 61

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 62

Colunas de 3µm para separações rápidas com alta performance.Tocoferóis

Mobile phase: Methanol / Water 95:5 (v/v)Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 280 nmTemperature: 40°CSample: δ - Tocopherol (1), β - Tocopherol (2), α - Tocopherol (3), α - Tocopherol Acetate (4)

0,0 5.0 10.0

1

2

3

4

0,0 15.0 30,0

1

2

3

4

LiChroCART® 55-4 Purospher® STAR RP-18e, 3 µm LiChroCART® 250-4 Purospher® RP-18e, 5 µm

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Page 63

QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS

Dúvidas em Colunas Particuladas para HPLC?

Comentários?

Page 64

ParteParteParteParte 5555 : : : :

Blocos MonolBlocos MonolBlocos MonolBlocos Monolííííticosticosticosticos

Page 65

Descubra a nova era cromatográfica!

BLOCO MONOLÍTICO

Page 66

1.51463.0001 Chromolith Flash RP-18e (25 x 4.6 mm)1.51450.0001 Chromolith SpeedROD RP-18e (50 x 4.6 mm)1.02129.0001 Chromolith Performance RP-18e (100 x 4.6 mm)

BLOCO MONOLÍTICO

Page 67

Vista de secção axial do bloco

monolítico

Macroporos: 2µµµµmMesoporos: 13 nm

Estrutura porosa bimodal definida

BLOCO MONOLÍTICO

Page 68

Page 69

Bastões monolíticos de sílica Envoltos por polímero

BLOCO MONOLÍTICO

Page 70

BLOCO MONOLÍTICO

Page 71

• Tipo de sílica: Alta pureza

• Tamanho da partícula: bloco monolítico

• Tamanho do macroporo: 2 µm

• Tamanho do mesoporo: 130 Å (13 nm)

• Área Superficial: 300 m2/g

• Volume de poro: 1 ml/g

• Modificação: RP-18 endcapped

• % de Carbono: 18 %

• Cobertura Superficial: 3.6 mmol/m2

• Estabilidade de pH: 2 – 7.5

• Porosidade Total: >81%

BLOCO MONOLÍTICO

Page 72

Chromolith® Performance

Chromolith® X colunas de material particulado

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8

Fluxo (mL/ min)

Ret

ropr

essã

o of

erec

ida

(bar

)

Coluna X: 5µµµµmColuna S: 5µµµµmColuna Z: 5µµµµm

BLOCO MONOLÍTICO

Page 73

1. Retropressão muito menor

BLOCO MONOLÍTICO

Page 74

1 mL/min - 17 bar

5 mL/min - 85 bar

5

1

2

43

9 mL/min - 153 bar

Chromolith® Performance RP-18e100 mm x 4.6 mm

5 ß-Bloqueadores

Mobile Acetonitrile/Phase 0.1% TFA in

water (20(80; v/v)

Flow rate 1-9 ml/minDetection 222 nmSample 1. Atenolol

2. Pindolol3. Metoprolol4. Celiprolol5. Bisoprolol

BLOCO MONOLÍTICO

Page 75

1 mL/min - 17 bar

5 mL/min - 85 bar

9 mL/min - 153 bar

5

1

2

43

1

2

43 5

9 mL/min - 153 bar

12

1.50.0

BLOCO MONOLÍTICO

Page 76

1. Retropressão muito menor= análises mais rápidas

BLOCO MONOLÍTICO

Page 77

Cortesia de Dr. Thomas E GundersenAS Vitas, Noruega

min0 0.1 0.2 0.3min0 0.1 0.2 0.3

To

col

Alp

ha.

toco

ph

ero

l To

col

Alp

ha.

toco

ph

ero

l

Chromolith Speed ROD 7 ml/min

Chromolith Speed ROD 10 ml/min

BLOCO MONOLÍTICO

Page 78

1. Pressão muito menor = análises mais rápidas

2. Comprimento da coluna não é limitado pela pressão

BLOCO MONOLÍTICO

Page 79

Column Chromolith SpeedROD RP-18e50-4.6mm

Mobile A: Acetonitrilephase B: WaterGradient Time/min %A %B

0,0 10 903,0 50 504,5 50 50

Flow rate 4 mL/minDetection UV 220 nmTemp. ambientInj.Volume 10 µLSample 1. Prednisolone

2. Cortisone3. Nortestosterone4. Estradiol5. Testosterone6. Corticosterone7. Estrone8. Progesterone

0,0 2,0 4,0

1

23

4

5

6

78

min

Picos mal resolvidos???

BLOCO MONOLÍTICO

Page 80

Column 2 colunasChromolith Performance RP-18e100-4.6mm

Mobile A: Acetonitrilephase B: WaterGradient Time/min %A %B

0,0 20 807,0 90 10

Flow rate 3 mL/minDetection UV 220 nmTemp. ambientInj.Volume 10 µLSample 1. Prednisolone

2. Cortisone3. Nortestosterone4. Estradiol5. Testosterone6. Corticosterone7. Estrone8. Progesterone

0,0 3,5 7,0

1

2 3

4

5

6

7

8

min

BLOCO MONOLÍTICO

Page 81

1. Pressão muito menor = análises mais rápidas

2. Comprimento da coluna não é limitado pela pressão= melhor resolução de picos

BLOCO MONOLÍTICO

Page 82

1.51467.0001 Acoplador para Chromolith

ACESSÓRIOS

Page 83

Column Length (mm)

Back pressure (bar)

Plate Number N (Anthracene)

Chromolith Performance 1x 100 30 10.000 Chromolith Performance 2x 200 60 19.000 Chromolith Performance 3x 300 90 27.000 Chromolith Performance 4x 400 120 35.000

Chromolith Performance 5x 500 150 41.000

Particulate 5 µm Competitor X 250 320 16.000 Particulate 5 µm Competitor Z 250 210 17.500 Particulate 5 µm Competitor L 250 220 18.500

Particulate 3.5 µm Competitor X 150 330 11.500 Particulate 3.5 µm Competitor Z 150 260 14.000 Particulate 3.5 µm Competitor L 150 400 19.000

[diâmetro: 4.6 mm, fase móvel: acetonitrila/água (60/40; v/v), fluxo: 3 mL/min, temperatura: 25°C, injeção: 10 µL de antraceno (10 µg/mL)].

BLOCO MONOLÍTICO

Page 84

1 metro de coluna: 10X Chromolith® Performance

BLOCO MONOLÍTICO

Page 85

300 60 min

3

56

1

2

7

4

14 x Chromolith® Performance

100-4.6mm = 1.4 metro

108 000 N/coluna !!!

117 bar

1. Tiuréia, 2. benzeno, 3. tolueno, 4. Etil-, 5. propil-, 6. butil-, 7. pentilbenzeno

ACN/ Água (80/ 20; v/v)

BLOCO MONOLÍTICO

Page 86

1. Pressão muito menor = análises muito mais rápidas

2. Tamanho da coluna não limitado pela pressão= melhor resolução

3. Bloco monolítico de sílica muito resistente

BLOCO MONOLÍTICO

Page 87

1. Pressão muito menor = análises muito mais rápidas

2. Tamanho da coluna não limitado pela pressão= melhor resolução

3. Bloco monolítico de sílica muito resistente= maior vida útil

BLOCO MONOLÍTICO

Page 88

PRÉ-COLUNAS

Page 89

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

No. of injections

Cap

ac

ity

fac

tor

k'

Progesterone

Anthracene

[temparature: 45°C; mobile phase: acetonitrile/water (60/40; v/v); flow rate: 2 mL/min, injection volume: 10 µL]

TEMPERATURA MÁXIMA

Page 90

www.chromolith.com

chrombook.merck.de

Website da Chromolith:

BLOCO MONOLÍTICO

Page 91

Especificações USP28 RecheioL1 RP-18L3 SiL7 RP-8L8 NH2L10 CNL20 Diol

BLOCO MONOLÍTICO

Page 92

ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROM

Page 93

Dúvidas sobre Blocos Monolíticos?Comentários?

BLOCO MONOLÍTICO

Page 94

• “(...) No fim, tudo dá certo... Se ainda não deu certo, éporque não chegou ao fim.”

Trecho retirado de “O Encontro Marcado” (Fernando Sabino).

(11) 9940-0807

(11) 3346-8558

[email protected]

MUITO OBRIGADO PELA ATENÇÃO!