12/28/2010

1

Metabolismul nucleotielor

A. Biosinteza

• Nucleotide structura & rol

• Biosinteza nucleotidelor purinice IMP, AMP, GMP– Provenienţa atomilor nucleului purinic

– Localizarea enzimelor

– Etapele & reacţiile sintezei IMP

– Inhibitori sintetici = medicamente citostatice & bacteriostatice

– Conversia IMP → AMP & GMP

– Reglarea sintezei ribonucleotidelor monofosforilate

– Conversia nucleotidelor monofosforilate → di- si trifosforilate

– Calea de recuperare a purinelor

– Conversia ribonucleotidelor difosforilate → deoxiribonucleotide difosforilate

– Patologie: Sindromul Lesch-Nyhan

• Biosinteza nucleotidelor pirimidinice– Provenienţa atomilor nucleului pirimidinic

– Localizarea enzimelor

– Etapele & reacţiile sintezei UMP

– Transformarea UTP → CTP

– Transformarea dUMP → dTMP

– Patologie: Aciduria orotică

Nucleotide – Structura & Rol

• Unităţi de construcţie a acizilor nucleici

• Surse de energie

• Activatori ai precursorilor glicogenului, lipidelor complexe, proteinelor

• Componente ale coenzimelor

• Efectori allosterici

12/28/2010

2

Provenienţa atomilor nucleului purinic

Atomii de azot provin din Asp, Gly, 2Gln

Atomii de carbon provin din CO2, Gly, 2Formil-FH4

Ribozo-fosfat

! Nucleul purinic se constituie pe ribozo-5’-fosfat

Sinteza IMP – Localizare & Precursori & Etape

• Localizare

Toate enzimele = citoplasmatice

– Precursori

Ribozo-5-fosfat , aspartat (Asp), glicocol (Gly), glutamina (Gln), CO2, N10-

formil-H4F

– Sursa de energie = 5 ATP (6 legături macroergice!)

• Etape

1. Sinteza 5-fosforibozil-1-pirofosfat-ului (PRPP)

2. Sinteza 5-fosforibozilaminei

3. Sinteza inozinmonofosfat-ului (IMP)

12/28/2010

3

Sinteza IMP – Etapa 1

PRN = Fosforibonucleotid = AMP, GMP, IMP

• Transformarea ribozo-5-fosfat → fosforibozilpirofosfat (PRPP)

• Transformarea PRPP → Fosforibozilamina

Sinteza IMP – Etapa 2

a

12/28/2010

4

Sinteza IMP – Etapa 3

Sinteza IMP - Reacţii

12/28/2010

5

Inhibitori = citostatice & bacteriostatice• Analogi ai acidului p-aminobenzoic (PABA): sulfonamide

Inhibă competitiv sinteza bacteriană a acidului folic

=> se reduce sinteza purinelor & acizilor nucleici => efectul bacteriostatic

• Analogi ai acidului folic:

- trimetoprim

Inhibă dihidrofolat reductaza => impiedică refacerea H4F

=> Inhibă sinteza purinelor => se reduce sinteza acizilor nucleici

=> efectul bacteriostatic

- metotrexat

Inhibă sinteza purinelor => se reduce sinteza acizilor nucleici

=> se previne multiplicarea celulelor canceroase

=> efectul citostatic

Sunt afectate toate celulele care se divid rapid, inclusiv cele din măduva osoasă,

piele, tractul gastro-intestinal, foliculii părului, sistemul imunitar

=> efecte secundare nedorite: anemie, căderea părului, imunodeficienţă etc.

Conversia IMP → AMP şi GMP

-

Acid micofenolic

Reduce sinteza acizilor nucleici

din limfocitele B & T

Medicament utilizat pentru a

preveni rejecţia grefelor

12/28/2010

6

Sinteza IMP& AMP& GMP – Reglare

Enzime reglatoare

• PRPP sintetazaRetroinhibiţie: AMP, GMP (efect maxim când ambele

sunt în concentraţie optimă)

• Glutamin PRPP amidotransferazaRetroinhibiţie: ATP, ADP, AMP la un centru reglator

GTP, GDP, GMP la alt centru reglator

Activare în avans: PRPP

• Adenilosuccinat sintetaza şi IMP dehidrogenazaRetroinhibiţie: AMP, respectiv GMP

Activare: GTP, respectiv ATP (ca şi cosubstrate)

Sinteza nucleotidelor di- & trifosforilate

NDKGDP + ATP

Guanilat kinaza

Adenilat kinaza

GDP + ADPGMP + ATP

2ADPAMP + ATP

GTP + ADP

12/28/2010

7

Calea de recuperare a purinelor

• Adenin fosforibozil transferaza (APRT)

Adenina + PRPP AMP + PPi

• Hipoxantin-Guanin fosforibozil transferaza (HGPRT)

Hipoxantina + PRPP IMP + PPi

Guanina + PRPP GMP + PPi

AMP, IMP, GMP nu mai trebuie sintetizate de novo !

= Cale de sinteză a IMP, AMP, GMP pornind de la bazel

purinice rezultate prin catabolimul nucleotidelor şi PRPP

Se bazează pe existenţa enzimelor:

12/28/2010

8

Sinteza deoxiribonucleotidelor difosforilate

P O

OHOH

P

O

CH2 O Baza

BazaOCH2OP

O

P

OH H

NDP

dNDP

Tioredoxina

Tioredoxina

reductaza

NADP+

NADPH

RibonucleotidRductaza

+ H+

_dATP

SH

SH

S

S

Patologie - Sindromul Lesch-Nyhan

HGPRT PRPP (substrat în sinteza de novo)

IMP, GMP (inhibitori ai sintezei de novo)

Sinteza de novo a nucleotidelor purinice

Producerea acidului uric Forma severă de gută

Litiaza renală

Manifestări neurologice caracteristice:

- retard mental

- automutilare

- miscări involuntare

Guanina GMPHGPRT

PRPP PPi

Hipoxantina IMPHGPRT

PRPP PPi

Automutilare a buzelor şi degetelor Cristale de urat pe scutece

12/28/2010

9

Bisinteza nucleotidelor pirimidinice

• Provenienţa atomilor ciclului pirimidinic

Aspart

at

CO2

Glutamina

• Localizare: citoplsmă & mitocondrie (dihidroorotat DH)

• Etape

1. Sinteza carbamoil fosfat-ului

2. Sinteza acidului orotic

3. Transformarea acidului orotic în UMP

! La început se constituie ciclul piridinic şi apoi acesta reacţionează cu PRPP

Bisinteza nucleotidelor pirimidinice

12/28/2010

10

Sinteza UMP- Etape

Sinteza UMP – Reacţii & ReglareCO2 Glutamina ATP+ +

Carbam oilfosfatsintaza II

H3N+

C

O P

C arbamoil

fosfat (C AP)

+

H3N+

COO-

CH2

C

O

CH

Aspartat

-O Asp Trans-

carbam oilaza

O C

NH2

NH

-O

CH

O

C

CH2

COO-

C arbamoil aspartat

(C AA)

Didroorotaza

H2O

+H N

CN

CH

CH2

C

H

H

O

O

O

Acid dihidro

orotic (DHO A)

NAD+

NADH H+

+

DH

COO-

COO-

O

O

H

H

N

CN

C

Acid orotic

(O A)

PRPPPPi

TransferazaN

CN

CH

O

O

COO-

Rib-5- P

Decarboxilaza

CO2Rib-5- P

O

O

HN

CN

C

O MPUMP

AT P+_

UT P

& PRPP

• Enzima reglatoare = carbamoilfosfat sintaza II (citoplasmatică)

12/28/2010

11

Sinteza UTP & CTP & TMP

UMP UDP UTP

ATP ADP ADPATP ATP

CTP sintazaAK NDK

TMP sintazaUMP

NADPH H+

+

Reductaza

NADP+

dUDP

H2O Pi

FosfatazadUMP

TMP

Gln

Metilen H4F

H2F

N

N

NH2

O

Rib-5- P P P

CTP

dRib-5- P

O

N

N

C

O

CH3

H4F

Reductaza

NADPHNADP+

_5-Fluorouracil

_

Metotrexat

Transformarea dUMP → dTMP

12/28/2010

12

Patologie – Aciduria orotică

• Deficienţa UMP sintazei

(cu cele 2 domenii: orotat fosforibozil transferaza & OMP decarboxilaza)

=> acumularea şi eliminarea urinară a acidului orotic

=> creştere anormală & anemie megaloblastică

• Dieta bogată în uridină => ameliorarea anemiei şi reducerea excreţiei

acidului orotic

1

Catabolismul acizilor nucleici & nucleotidelor

• Digestia & absorbţia acizilor nucleici exogeni

• Catabolismul acizilor nucleici endogeni

• Catabolismul nucleotidelor purinice

• Provenienţa şi soarta acidului uric

• Patologie: SCID, guta

• Catabolismul nucleotidelor pirimidinice

• Patologie: aciduria orotică

Digestia & absorbţia acizilor nucleici

Oligonucleotide

Nucleaze

(pancreas)

DenaturareStomacpH acid

ADN

ARN

Acizi nucleici

denaturati

Intestin

subtire

EnterocitAcid uric

(fecale)

Intestin

gros

Fosfodiesteraze

(pancreas)

Intestin

subtire

Mononucleotide

Nucleotidaze (mucoasa intestinala)Intestin

subtire

Nucleozide

Nucleozidaze (mucoasa intestinala)Intestin

subtire

Pentoze

Purine & pirimidine

Acid uric

Urina

Circulatie

Enzimele

florei intestinale

2

Catabolismul acizilor nucleici endogeni

Acizi nucleari

Nucleaze

citoplasmatice Nucleotide

H2O

Catabolismul nucleotidelor purinice

IMP

H2O

Pi

Inoz ina

Pi

Ribozo 1-fosfat

N

N

N

N

O

Hipoxantina

O2 H2O+

H2O2

Fosforilaza

Xantinoxidaza

N

N

N

N

O

O

Xantina

Adenozindeam inaza

NH3H2O

Adenoz ina

Pi

H2O

AMP

H2O NH3

AMP deam inaza

5'-Nucleotidaza 5'-Nucleotidaza

oxidazaXantin

O

O

N

N

N

N O

Acid uric+O2 H2O

H2O2

Guanaza

H2ONH3

O

N

N

N

NH2N

Guanina

Pi

Ribozo 1-fosfatFosforilaza

Guanoz ina

5'-Nucleotidaza

Pi

H2O

GMP

• Defosforilare nucleotid: AMP → Adenozina;IMP → Inozina; GMP → Guanozina

• Dezaminare nucleotid: AMP → IMP sau nucleozid: Adenozina → Inozina

• Fosforoliza Inozinei & Guanozinei => Hipoxantina & Guanina + Ribozo-1P

• Transformarea Hipoxantinei & Guaninei → Xantina → Acid uric

3

Catabolismul AMP & GMP

Provenienţa & Soarta acidului uric

Sinteza de

novo

300-600 mg/zi

Nucleotide

purinice

Purine

exogene

600 mg/zi

Nucleotide

tisulare

Baze purinice

Acid

uric

1200mg

Urina600mg/zi Intestin

200mg/zi

4

Boala Defectul Natura defectului Comentarii

Guta

PRPP sintetaza Activitatea Hiperuricemie

PRPP sintetaza Rezistenta la retroinhibitie Hiperuricemie

PRPP sintetaza Afinitatea pt. ribozo 5P Hiperuricemie

PRPP amidotransferaza Rezistenta la retroinhibitie Hiperuricemie

HGPRT Partial defecta Hiperuricemie

Lesch-Nyhan HGPRT Lipsa enzimei Hiperuricemie

SCID ADA Lipsa enzimei Imunodeficienţă

Litiaza renala APRT Lipsa enzimei Litiază renală

Xantinurie Xantin oxidaza Lipsa enzimeiHipouricemie

Litiază renală

Von Gierke Glucozo 6P-aza Lipsa enzimeiPRPP purine

Hiperuricemie

Defectele metabolismului nucleotidelor purinice

5'-Nucleotidaza5'-Nucleotidaza

AMP deam inaza

NH3H2O

AMP

H2O

Pi

Adenoz ina

H2O NH3

deam inaza (ADA)Adenozin

O

N

N

N

N

Inoz ina

Pi

H2O

IMP

Riboza

Patologie - Deficienţa adenozin deaminazei SCID(“Severe Combined Immunodeficiency Disease”)

• Gena ADA este exprimată în citosolul tuturor celulelor

• În limfocitele umane ADA are cea mai intensă activitate

ADA conduce la adenozinei =>

dATP = inhibitor al ribonucleotid reductazei

Sinteza deoxiribonucleotidelor

Sinteza ADN şi diviziunea celulară

TRATAMENT

• Izolarea copilului într-un mediu steril

• Transplant de maduvă

• Terapie genică

5

Patologie - GUTA

• Hiperuricemia primarăDeterminată de mutaţiile genelor: PRPP sintetazei => creşterea producţiei de purine

=> creşterea cantităţii de acid uric

HGPRT => reducerea reutilizării hipoxantinei şi guaninei

=> cresterea cantităţii de acid uric

• Hiperuricemia secundară- insuficienţa renală

- chemoterapie

- consum excesiv de alcool (de ce?) şi alimente bogate în purine

- boala von Gierke (de ce?)

- intoleranţa la fructoză (de ce?)

Hiperuricemia primară – Alterarea PRPP sintetazei

Ribozo 5-fosfat PRPP

O PPO

OHOH

P O CH2 O

Mg+2

AMPATP

PRPP sintetaza

OH

OHOH

P O CH2 O

KMVmax

Ki

Sinteza excesiva de nucleotide purinice

Productie excesiva de acid uric

Hiperuricemie

= Guta primara

Cristale aciculare de urat monosodic

Depozitate în ţesuturile moi cristalele iniţiază un process inflamator

Infiltrarea granulocitelor care fagocitează cristalele de urat ROS alterarea ţesutului eliberarea enzimelor

lizozomale răspuns inflamator

Producerea lactatului în ţesutul sinovial scăderea pH-ului depunerea de noi cristale de urat apariţia tofilor

gutoşi

6

Guta – Simptome & Tratament

Tof gutos

TRATAMENT

Inhibiţia xantin oxidazei cu oxipurinol (alloxantina), catabolit al allopurinolului (xantina şi hipoxantina

fiind mai solubile în apă sunt mai uşor de eliminat)

Intensificarea excreţiei acidului uric (probenecid, sulfinpirazona)

Antiinflamatoare (aspirina)

Antichemotactice (colchicina) pentru prevenirea acumulării granulocitelor în zona afectată

Ex. Catabolismul timinei

Catabolismul nucleotidelor pirimidinice

hidrogenarea dublei legături => dihidrotimina

desfacerea ciclului dihidropirimidinic

îndepărtarea grupării amidice

transaminare => metilmalonil semialdehida

7

Boala Enzima defecta Comentarii

Aciduria orotică Tip IOrotat fosforibozil transferaza

&

OMP decarboxilaza

Defect de creştere

Anemie severă cauzată de eritrocitele

hipocrome

LeucopenieAciduria orotică Tip II OMP decarboxilaza

Aciduria orotică

fără componenta

hematologică

Ornitin transcarbamoilaza

(ureogeneza)

Carbamoil fosfatul mitocondrial

Biosinteza pirimidinelor

=> Encefalopatia hepatică

Aciduria orotica

indusă de

medicamente

OMP decarboxilazaCataboliţii alopurinolului & 6-azauridinei

inhibă OMP decarboxilaza

Defectele metabolismului nucleotidelor pirimidinice

10/4/2010

1

• Replicare la procariote

- Caracteristici

- Factori necesari

- Etape

• Replicare la eucariote

• Modificări postreplicare

• Inhibiţia replicarii

• Agenţi mutageni. Mecanisme de reparare

• Sinteza de ADN pe matriţă de ARN

REPLICARE = Sinteza ADN

1

• Are loc în timpul diviziunii celulare

• Este semiconservativă

Dintr-o moleculă de ADN “părinte” => 2 molecule “fiice” care conţin un lanţ părinte şi un lanţ

complementar, nou sintetizat.

REPLICARE PROCARIOTE

Caracteristici

Asigură stabilitatea genetică a fiecărui

organism şi conservarea informaţiei

genetice de la o generaţie la alta, ȋn

cadrul aceleiaşi specii

2

10/4/2010

2

Dovada replicării semiconservative

Experienţa lui Meselson şi Stahl (1957)

3

Dovada replicării semiconservative

10/4/2010

3

• Este bidirecţională

Începe de la origine (“ori C”) prin separarea celor două lanţuri părinte şi formarea a două

furci de replicare.

Cele două furci de replicare se deplasează simultan, în direcţie opusă, până când se

întâlnesc (în punctul “ter” situat pe partea cealaltă a cromozomului, opusă originii)

.

REPLICARE PROCARIOTE

Caracteristici

5

Prin copierea continuă a lanţului sens (direcţia 3‟-5‟) => “lanţul conducător”,

Prin copierea discontinuă a lanţului antisens (direcţia 5‟-3‟) => “fragmentele Okazaki”

(1000-2000 nucleotide), componente ale “lanţului întârziat”.

REPLICARE PROCARIOTE

Caracteristici

6

10/4/2010

4

REPLICARE PROCARIOTE

Caracteristici

• Direcţia replicării este 5’→3’

7

• Matriţă (“template”) = fiecare lanţ al ADN părinte, citit în direcţia 3‟-5‟. Necesară pentru ghidarea legării nucleotidului complementar în vederea formării noului lanţ de ADN;

• Deoxiribonucleotide trifosforilate: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (substrate ale ADN polimerazelor);

• Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP (substrate ale ARN polimerazei);

• Enzime:

- ADN polimeraze ADN-dependente: I, II si III

- ARN polimeraza (primaza): cu activitate 5‟-3‟ polimerazică care sintetizează “primeri” (oligoribonucleotide), folosind ca matriţă monolanţul de ADN;

- Helicaze: enzime care despiralează ADN părinte (ex. Dna B, proteina rep);

- Topoizomeraze: enzime care elimină suprahelicarea produsă prin despiralare, fie prin tăierea unui singur lanţ (tipul I), fie prin tăierea ambelor lanţuri (tipul II, ex. giraza);

- ADN ligaza: uneşte capătul 3‟ al unui fragment Okazaki cu fosfatul din capătul 5‟ al altui fragment Okazaki (folosind ca sursă de energie ATP);

• Proteine:

- dna A: recunoaşte originea replicării şi iniţiază despiralarea ADN;

- SSB (“Single-strand binding protein”): împiedică reasocierea lanţurilor şi acţiunea enzimelor de clivare a monolanţurilor;

- n, n’, n’’, i, dna C: formează primozomul.

REPLICARE PROCARIOTE

Factorii necesari

8

10/4/2010

5

ADN polimeraze ADN-dependente

• Activitatea exonucleazică 3‟-5‟ asigură fidelitatea replicării, este responsabilă

de “proof reading”, respectiv de corectarea greşelilor de citire;

• Activitatea exonucleazică 5‟-3‟ sau activitatea de excizie-reparare este

esenţială pentru îndepărtarea primerilor şi pentru repararea ADN alterat.

Tip de

polimerază

Activitate

polimerazică

Activitate

exonucleazică

Rol

POl I 5‟-3‟ 3‟-5‟ şi 5‟-3‟ Îndepărtează primerii

Repară ADN

POL II 5‟-3‟ 3‟-5‟ Repară ADN

POL III 5‟-3‟ 3‟-5‟ Alungeşte primerii de

ARN folosind dATP,

dGTP, dCTP, dTTP

9

Activităţile ADN polimerazei III

ADN

matrita Lant nou sintetizat

ADN

polimeraza

Activitate 5’→3’

polimerazicaActivitate 3’→ 5’

exonucleazica

Enzima

avanseaza

Enzima

revine

Functia polimerazica Functia corectoare

Nucleotidul trifosforilat este selectionat si fixat

(prin legaturi de H) de baza complementara din lantul

matrita, apoi este legat (prin legatura 3’-5’ fosfoester)

la capatul 3’ al lantului in curs de sinteza.

Daca ADN polimeraza imperecheaza gresit un

nucleotid, foloseste activitatea 3’-5’ exonucleazica

pentru excizarea lui.

Activitatea 3’-5’ exonucleazică permite ADN polimerazei III să corecteze (“proofread”)

lanţul nou sintetizat

10

10/4/2010

6

Primaza = ARN pol. ADN dependentăAre activitate 5‟-3‟ polimerazică => sintetizează “primeri” (oligoribonucleotide),

folosind ca matriţă monolanţul de ADN;

11

Rolurile helicazei & topoizomerazei

Helicaza (ex. Dna B, proteina rep) despiralează ADN părinte;

Topoizomeraza elimină suprahelicarea produsă prin despiralare, fie prin tăierea

unui singur lanţ (tipul I), fie prin tăierea ambelor lanţuri (tipul II);

12

10/4/2010

7

Acţiunea ligazei

ADN ligaza: uneşte capătul 3‟ al unui fragment Okazaki cu fosfatul din capătul 5‟

al altui fragment Okazaki (folosind ca sursă de energie ATP);

13

REPLICARE - Etape

• Iniţiere

• Elongare

• Terminare

14

10/4/2010

8

REPLICARE – Etapa de iniţiere

Etapa de iniţiere = Etapa de formare a replizomului

• Recunoaşterea “secvenţelor consens” (AT)n din regiunea “ori” de către

dnaA, urmată de împachetarea (tasarea) regiunii şi despiralarea duplexului în

regiunea învecinată, respectiv formarea celor două “furci de replicare”;

• Inserţia complexului dnaB-dnaC;

• Deplasarea furcii de replicare prin acţiunea dnaB şi expulzarea dnaA;

• Stabilizarea porţiunii despiralate prin fixarea proteinei SSB;

• Constituirea primozomului prin ataşarea proteinelor n, n‟, n‟‟, i şi a primazei;

• Sinteza ARN primer (amorsă);

• Constituirea replizomului prin ataşarea polimerazei III şi a helicazei (proteina

rep) la primozom.

15

REPLICARE - Etapa de elongare

Etapa de elongare = etapa de alungire a amorsei (ARN primer)

• Legarea succesivă a deoxiribonucleotidelor de către ADN Pol III

(catalizează atacul nucleofil al OH din capătul 3‟al primerului asupra

grupării α-fosfat al NTP complementar nucleotidului din lanţul matriţă).

ADN Pol III are acţiune 5‟-3‟polimerazică =>numai lanţul sens (3‟-5‟) poate fi

copiat continuu => lantul conducator (“leading strand”).

Copierea lanţului antisens (5‟-3‟) presupune formarea mai multor bucle (pentru

schimbarea sensului) şi sinteza mai multor amorse de ARN prin alungirea

cărora rezultă fragmentele Okazaki (1000-2000 nucleotide).

• Constituirea lanţului întârziat (“lagging strand”) prin acţiunea Pol I (care

înlocuieşte primerii cu deoxiribonucleotide) şi a ligazei (care uneşte

fragmentele Okazaki);

• Înaintarea furcilor de replicare produce în amonte o suprahelicare pozitivă

care necesită intervenţia topoizomerazelor16

10/4/2010

9

Copierea lanţului antisens (5’-3’) presupune formarea de

bucle pentru schimbarea sensului

Lant

conducator

Lant

intarziat

ADN

polimerazaADN

polimeraza

ARN

primer

Directia de deplasare

a furcii de replicare

Primozom

17

REPLICARE - Etapa de elongare

Lanţul ȋntârziat este

sintetizat ȋn direcţia

5’-3’ dinspre furca de

replicare şi necesită

mai mulţi primeri

Lanţul conducător este

sintetizat ȋn direcţia 5’-3’

către furca de replicare şi

necesită un singur primer

18

10/4/2010

10

Etapa de terminare = etapa ȋn care proteina “ter-binding” se

leagă de secvenţele de terminare “ter” situate pe partea

opusă a cromozomului

=> este oprită acţiunea helicazei (Dna B).

REPLICARE - Etapa de terminare

INHIBITIA REPLICARII la procariote

Norfloxacina

= inhibitor al ADN girazei (topoizomeraza II) bacteriene

= medicament utilizat pentru tratarea infecţiilor bateriene19

Recapitulare

Începe la furca de replicare prin

• separarea lanţurilor (facilitată de helicază, SSB, ADN topoizomeraze)

• legarea ADN polimerazei

ADN polimeraza sintetizeaza noile lanţuri ȋn direcţia 5’→3’ folosind

• primeri sintetizaţi de primază

• lanţurile parentale de ADN ca matriţe

Rezultă 2 lanţuri complementare fiice (replicarea este semiconservativă):

• lanţul conducător prin alungirea unui singur primer, ȋn direcţia 5‟→3‟ , către furca de replicare

• lanţul ȋntârziat prin alungirea mai multor primeri, ȋn direcţia 5‟→3‟ , dinspre furca de replicare

20

10/4/2010

11

REPLICARE - Eucariote

• Are loc numai în faza S a diviziunii celulare

La eucariotele superioare se divid activ un număr

restrâns de celule (ex. celule din piele, cripte

duodenale, foliculi piloşi).

Precursorii eritrocitelor (eritroblaste) se divid de un

număr limitat de ori, apoi îsi pierd nucleul (se

transformă în eritrocite) şi părăsesc ciclul celular.

Majoritatea celulelor sunt reţinute, după mitoză, în

faza G0 de nondiviziune (“resting phase”).

Reintrarea în ciclul celular poate fi determinată de

condiţii de stress şi este controlată de kinazele ciclin-

dependente (CDK).

Aceasta explică regenerarea rapidă (câteva

săptămâni) a ficatului distrus în proporţie de 90%.

21

REPLICARE - Eucariote

• Eucariotele au mai multe polimeraze

TipActivitate

exonucleazicăRol

α - Sinteza primerilor şi a “fragmentelor Okazaki”

(200 nucleotide)

Repararea ADN

β - Repararea ADN

γ 3’-5’ Replicarea ADN mitocondrial

δ 3’-5’ Sinteza “lanţului conducător”

ε 3’-5’ Repararea ADN

22

10/4/2010

12

• Decurge de 10 ori mai încet (100 de pb/sec) datorită gradului înalt de condensare;

• Accesul la ADN a proteinelor şi enzimelor necesare replicării este facilitat prin desfacerea cromatinei (etapa limitantă de viteză), proces iniţiat de metilarea în poziţia 5 a citozinelor (sub acţiunea ADN-metil transferazei).

• Există mai multe origini (aproximativ 100 pentru fiecare cromozom);

• Mai multe (20-80) origini situate într-o anumită zonă a cromozomului formează o unitate de replicare (replicon); repliconii se activează treptat pe parcursul fazei S a ciclului celular;

REPLICARE - Eucariote

23

REPLICARE - Eucariote

Mai multe origini

Bidirecţională

24

10/4/2010

13

REPLICARE - Eucariote

Telomeraza

facilitează

replicarea

telomerelor

(capetele

cromozomilor)

25

Modificări postreplicare = Modificări epigenetice

Organism 5'-metil citozina (mC)

Animale 2-7%

Plante >25%

↓ 5'- mC => ↑expresia genei

↑ 5'- mC => ↓ expresia genei

Metilarea “insulelor CpG”

• Se transmite de la o generaţie la alta

• Este specifică fiecărui ţesut

• Este realizată de metilaze SAM-dependente

• Vizează doar citozinele din secvenţe 5'-CpG-3„ (≈ 30000 insule CpG ≈ 1-2 kb )

Demetilarea insulelor CpG determină expresia genelor asociate

26

10/4/2010

14

REPLICARE - Inhibiţie

Elongarea ADN poate fi blocată prin incorporarea

analogilor de nucleotide proveniţi din analogi de

nucleozide (fosforilaţi de enzimele de “salvare” )

care conţin:

2’deoxiriboză modificată:

- lipsa OH din pozitia 3‟

ex. Dideoxiinozina = didanozina = ddI

- ȋnlocuirea OH din poziţia 3‟ cu azido

ex. Azidotimidina = zidovudina = AZT= antiviral

2’deoxiriboza ȋnlocuită cu arabinoza (epimer)

ex. citozin arabinozid = citarabina = araC = citostatic

adenin arabinozid = vidarabina = araA =antiviral

Analogii de nucleozide ȋncetinesc multiplicarea

ADN-ului celulelor care se divid rapid (canceroase)

şi a virusurilor!27

Alterarea ADN- Efectul fumatului

28

10/4/2010

15

Alterarea ADN- Efectul UV

29

REPARARE ADN - Etape

Xeroderma pigmentosum = cancer de piele

cauzat de acumalarea mutatiilor datorita

absentei excinucleazei UV-specifice 30

10/4/2010

16

Sinteza de ADN pe matriţă de ARN

31

Rolul revers transcriptazei ȋn

infecţia cu retrovirus

32

10/3/2010

1

• Definiţie

• Localizare (timp, spaţiu)

• Factori necesari

• ARN polimeraza – caracteristici

• Unitate transcripţională

• Etape

• Procesare transcript primar

• Inhibitori

• Control & Reglare. Operonul Lactoza

• Transcriere la eucariote

TRANSCRIERE

1

TRANSCRIERE - Definiţie

Transcriere = sinteza de ARN (începând cu capătul 5’) folosind ca matriţă lanţul

3’-5’ al ADN care corespunde unei gene (nu se transcrie tot ADN-ul !).

Viteza = 20-50 nucleotide /sec; Frecvenţa erorilor = 10-4 (1 bază din 104 baze)

2

10/3/2010

2

Scopul transcrierii = Sinteza moleculelor de ARN necesare traducerii:

- ARNm = matriţă

- ARNt = transportori ai aminoacizilor

- ARNr = componente ale ribozomilor

TRANSCRIERE - Scop

La procariote, spre deosebire de eucariote, sinteza proteinelor începe înainte

de a se finaliza sinteza ARNm!

3

Când are loc?

- unele gene (constitutive) sunt transcrise constant

- unele gene (inductibile/represabile) sunt transcrise “la nevoie”

TRANSCRIERE

Factori necesari ( la procariote)

- Matriţa = lanţul 3’-5’ al ADN-ului ce corespunde unei gene

- Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP

- Enzime: ARN polimeraza ADN-dependentă, giraza

- Proteine: factorul ρ (ro)

4

10/3/2010

3

ARN polimeraza - StructuraH

olo

en

zim

a

Miez = (α2’)

α -necesară pentru reconstituirea miezului

-leagă factorii transcripţionali

-conţine centrul activ polimerazic

-conferă susceptibilitatea la inhibitori

(ex. rifampicina)

’- conţine sarcini pozitive care facilitează

fixarea enzimei pe ADN (cu sarcini -)

Factor de iniţiere sigma (σ)

-recunoaste promotorul şi astfel asigură

poziţionarea corectă a ARN polimerazei

pe ADN în vederea iniţierii transcrierii

α2 ’σ α2 ’ + σ

Holoenzima = factor σ + miez (α2’)

5

Promotor (promoter) - Definiţie

= Regiunea recunoscută de subunitatea de tip σ (sigma) a ARN polimerazei,

situată înaintea secvenţei codificante (poziţia -1→-70)

6

10/3/2010

4

Tipuri de factori sigma din E.coli

Tip Promotor recunoscut Secvenţa consens promotor

Regiunea -35 Regiunea -10

σ70 Majoritatea genelor TTGACAT TATAAT

σ32 Gene induse de şocul termic TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA

σ28 Gene pentru motilitate şi

chemotaxie

CTAAA CCGATAT

σ38 Gene pentru faza staţionară şi

răspuns la stres

?

Regiunea -24

?

Regiunea -12

σ54 Gene pentru metabolismul

azotului şi alte funcţii

CTGGNA TTGCA

D.N. Amosti, M.J. Chamberlain, 1989, Pro.Nat’lAcad Sci USA 86: 830

R. Hengge-Aronsis, 1996, Mol. Microbiol. 21:8877

Unitatea transcripţională = fragmentul de ADN care se extinde de la

promotor terminator

ARN

Transcriere

Promotor

+1

Terminator

GENA

Unitate transcripţională - Definiţie

Produsul transcrierii = transcript primar

8

10/3/2010

5

TRANSCRIERE - Etape

• INIŢIERE

• ELONGARE

• TERMINARE

9

Etapa de INIŢIERE

• Fixarea ARN polimerazei pe regiunea promotor

=> “complex promotor deschis” şi

formarea primei legături fosfodiester

ARN pol

ARN pol

ARN pol

-40 +20

Secvenţe nespecifice

Promotor

-40 +20

Complex promotor închis

Complex promotor deschis

-9 +2

10

10/3/2010

6

Etapa de ELONGARE

= Sinteza ARN în direcţia 5’-3’, cu eliberarea factorului σ

11

Etapa de ELONGARE (continuare)Pe măsură ce ARN polimeraza înaintează pe matriţa de ADN şi catalizează formarea

de noi legături fosfodiester se formează un helix hibrid ADN-ARN scurt;

Concomitent are loc:

• un proces de rerăsucire (“rewinding”) a dublului helix de ADN, în urma polimerazei

• un proces de desrăsucire (“unwinding”) a dublului helix de ADN, în faţa polimerazei

12

10/3/2010

7

Etapa de TERMINARE

• Independentă de factorul ρ

semnalizată de formarea “structurii în agrafă” (rezultat al transcrierii palindromului din “terminator”) care încetineşte deplasarea ARN Polimerazei.

După structura în

agrafă, transcriptul

conţine o secvenţă

UUUUU

care facilitează

eliberarea ARN din

hibridul ADN-ARN

Eliberarea ARN sintetizat şi a ARN polimerazei

13

Etapa de TERMINARE (continuare)

• Dependentă de factorul ρ (ro)care se leagă de secvenţe bogate în C de lângă capătul 3’ al ARN nou sintetizat şi

migrează în spatele ARN polimerazei, în direcţia 5’-3’, până când ajunge în regiunea

terminator

14

10/3/2010

8

Secvenţa care va fi tradusă

+1 Gena ADN

Secvenţa

conducătoare

“leader”

Secvenţa

remorcă

“trailer”

Transcript primar ARNm

5’ 3’

Transcript primar = copia liniară a unităţii transcripţionale (fragmentul de ADN

cuprins între secvenţele de iniţiere şi terminare).

La procariote (spre deosebire de eucariote), ARNm este identic cu transcriptul

primar, care posedă la extremităţi 2 secvenţe suplimentare (leader & trailer)

care nu se vor exprima în proteină.

Procesare transcript primar

15

Procesare transcript primar

Atât la procariote cât şi la eucariote transcriptul primar al ARNr şi ARNt suferă

modificări post-transcripţionale catalizate de ribonucleaze (excizia unor fragmente).

ARNt suferă modificari suplimentare (=> nucleotidele minore) care conferă identitate

fiecărui tip de ARNt.

Trancript primar (45S) din care se formează toate tipurile de ARN cu excepţia ARNm

16

10/3/2010

9

Inhibitori ai transcrierii

• Inhibitori care se inseră între 2 perechi GC ale ADN => blochează elongarea

Ex. actinomicina D (dactinomicina)

• Inhibitori care inhibă giraza => împiedică înaintarea ARN polimerazei

Ex. acidul nalidixic, norfloxacina

• Inhibitori care se leagă de ARN polimerază, inhibând elongarea

Ex. rifampicina (rifampin)

• Analogi ai ribonucleotidelor (inhibă elongarea)

Ex. 3’-deoxiadenozina (cordicepina)

17

CONTROLUL TRANSCRIERII

Controlul transcrierii se realizează, la nivelul etapei

de iniţiere, modificând afinitatea ARN polimerazei

pentru promotor prin:

• schimbarea tipului de subunitate sigma

• modificarea miezului polimerazei (ex. ataşarea ppGpp)

• intermediul proteinelor activator (ex. CAP) sau represor

18

10/3/2010

10

REGLAREA TRANSCRIERII

La bacterii genele structurale care codifică enzime implicate în aceaşi

cale metabolică sunt adiacente şi împreună cu unicul promotor formează

un operon.

=> Prin transcrierea genelor structurale se formează un singur

ARNm policistronic. Transcrierea genelor structurale este

reglată de gena reglatoare care codifică proteina represor.

19

REGLAREA TRANSCRIERII

(continuare)

Prin exprimarea genei reglatoare => represorul inactiv.

Ca urmare a legării corepresorului => un complex activ care se leagă de operator

(secvenţă specifică din promotor), şi blochează accesul ARN polimerazei la promotor.20

10/3/2010

11

OPERONUL LACTOZA (Lac)

21

Reglarea operonului Lac

Allolactoza

(izomer al lactozei)

În prezenţa glucozei => adenilat ciclaza inactivă => nivel scăzut AMPc => nu se formează

complexul CAP-AMPc necesar pentru accesul şi legarea ARN polimerazei la promotor.

În prezenţa lactozei, se formează allolactoza (cantitate mică) care se leagă specific de represor

şi, prin modificări conformaţionale, determină desprinderea represorului de pe operator, fapt care

nu este suficient pentru iniţierea transcrierii genelor structurale! 22

10/3/2010

12

Reglarea operonului Lac

C. Dacă este prezentă doar glucoza => ↓ AMPc => complexul CAP-AMPc este absent

=> ARN polimeraza nu se leagă de promotor şi genele nu sunt sunt transcrise, indiferent

dacă operatorul este ocupat de represor!

În absenta glucozei adenilat ciclaza este activă => nivel ridicat AMPc (“hunger signal”) => se

formează complexul CAP-AMPc apt să se lege de locusul specific din promotor => este facilitat

accesul ARN polimerazei la promotor.

În prezenţa lactozei operatorul este liber şi ARN polimeraza poate transcrie genele structurale

permiţând bacteriei să utilizeze lactoza ca sursă de energie

23

Reglarea operonului lactoza - Recapitulare

24

10/3/2010

13

Transcrierea la eucariote

• Mai complexă decât la procariote

• Există polimeraze diferite pentru sinteza fiecărui tip de ARN:

- Polimeraza I pentru ARNr 45S (în nucleoli)

- Polimeraza II pentru ARNm (în nucleoplasmă)

- Polimeraza III pentru ARNt şi ARNr 5S (în nucleoplasmă)

- Polimeraza mitocondrială pentru ARN-urile mitocondriale (matrice)

• Fiecare din cele 4 tipuri de polimeraze utilizează promotori diferiţi

• ARN polimeraza II utilizează o diversitate de promotori care conţin secvenţe “consens”:

- caseta TATA (poziţia -32) reprezentând semnalul “unde” începe transcrierea

- casetele CAAT şi GC (în amonte faţă de +1) reprezentând semnalul “când” începe transcrierea

• Pe lângă secvenţele consens (recunoscute de factorii de iniţiere) există

- secvenţe situate la distanţă de promotori (în amonte sau în aval de punctul de start)

care măresc (“enhancer”) sau reduc (“silencer”) viteza de iniţiere a transcrierii ca

urmare a interacţiunii cu factorii de transcriere

- “elemente de răspuns” la hormoni liposolubili

Elemente

de răspuns

Enhancer &

silencer

Caseta

CAAT

Caseta

TATA

Gena

structurală

Expresie reglabilă Expresie bazală25

Inhibitori ai transcrierii la eucariote

ARN polimerazele animale (mai ales polimeraza II) sunt inhibate de amanitină,

produsă de ciuperca otrăvitoare Amanita phalloides

26

10/3/2010

14

Sinteza ARN pe matriţă de ARN• Unele virusuri au ca material cromozomial ARN care se replică în celula

gazdă sub acţiunea ARN polimerazei ARN dependente (replicaza) sintetizată în organismul gazdă.

• După infecţie se sintetizează, pe matriţa de ARN (+), o replică complementară (-) rezultând un duplex ARN.

• Catena ARN (-) va servi ca matriţă pentru sinteza a numeroase catene complementare (+).

• ARN-ul viral va funcţiona ca ARNm pentru sinteza proteinelor virale

ARN viral Duplex ARN Molecule fiice

omoloage ARN viral

+ +- - - - - -

27

1

TRADUCERE

• Definiţie

• Cod genetic

• Factori necesari

• Etape

• Inhibitori

• Reglare

• Modificări post-traducere

1

Traducere = sinteza unui lanţ polipeptidic, la nivel ribozomal,

folosind ca matriţă ARNm citit în direcţia 5’-3’

TRADUCERE - Definiţie

5’

3’

2

2

Factori necesari– Matriţă: ARNm policistronic (citit în direcţia 5’→3’)

– 20 Aminoacizi standard

– ARNt specific fiecărui Aa (>20)

– 20 Aminoacil-ARNt sintetaze

– Subunităţi ribozomale: 30S, 50S

– Factori de iniţiere:IF1, IF2, IF3

– Factori de elongare: EF-Ts, EF-Tu, EF-G (translocaza)

– Factori de terminare (eliberare): RF1, RF2, RF3 (RRF)

– Sursă de energie: GTP + Mg2+

– Enzime: Met-ARNt formilaza, peptidil transferaza (localizată pe 50S)

– Donor grupare formil: acidul N10-formil tetrahidrofolic (N10-CHO-H4F)

TRADUCERE - Factori necesari

(la procariote)

3

TRADUCERE – Caracteristici procariote

Traducerea însoţeşte transcrierea O moleculă de ARNm este tradusă simultan

de mai mulţi ribozomi situaţi la o distanţă de ≈

100 nucleotide (polizom) => mai multe lanţuri

polipeptidice

Viteza: 20-40 amino acizi/sec

Este consumatoare de energie:

•1GTP pentru iniţiere,

•2GTP pentru fiecare leg. peptidică 4

3

CODUL GENETIC - Caracteristici• Permite

“traducerea unui text scris într-o limbă care utilizează 4 cuvinte”: bazele

A, G, C, U într-o limbă care utilizează 20 cuvinte”: cei 20 Aa standard

• Rezultă prin combinarea celor 4 baze grupate câte 3 => 64 codoni

• Este universal, degenerat dar nu şi ambiguu!

Khorana & Nirenberg 5

Codonii se citesc începând cu codonul de iniţiere AUG,

fără semne de punctuaţie, până la unul dintre codonii STOP

(nonsens): UAA, UAG, UGA

“Citirea” codonilor

6

4

Etapa de INIŢIERE

• Sinteza aminoacil-ARNt

• Formarea complexului de iniţiere 30S

• Formarea complexului 70S

Etapa de initiere presupune:

7

Etapa de INIŢIERE

Sinteza aminoacil-ARNt

La procariote Met-ARNtfmet este convertit în

formil-Met-ARNtfmet sub acţiunea transformilazei

(donor formil-H4F)!

8

5

Etapa de INIŢIEREFormarea complexului de iniţiere 30S si apoi a complexului 70S

• Pe locusul Peptidil (P) se găseşte formil-metionil-ARNt (fMet-ARNt)

• Locusul Aminoacil (A) este liber

Complexul de initiere 30S

Complexul 70S

9

Etapa de ELONGARE

• Inserţia Aminoacil-ARNt următor (AA2-ARNt) pe locusul

Aminoacil (A)

• Formarea legăturii peptidice

10

6

Etapa de ELONGARE

• Inserţia Aminoacil-ARNt următor (AA2-ARNt) pe locusul Aminoacil (A)

Hidroliza GTP asociat factorului de elongare Tu consfinţeşte legarea corectă a AA2-ARNt

Tu-GDP → Tu-GTP

prin intervenţia factorului Ts11

Etapa de ELONGARE

• Formarea

legaturii

peptidice

Sub acţiunea peptidil

transferazei (din

subunitatea 50S) se

transferă fMet pe

gruparea NH2 a

aminoacil-ARNt2

Translocaza (EF-G)

determină glisarea

(cu un codon) a

ribozomului spre

capătul 3’ a ARNm

Simultan ARNt-ul

descărcat părăseşte

locusul P 12

7

Etapa de ELONGARE

13

Etapa de TERMINARE

• Recunoaşterea codonului STOP

(UAG) de către unul dintre factorii de

eliberare (RF)

• Hidroliza legăturii ester catalizată de

peptidil transferaza “transformată” de RF

în hidrolază

• Eliberarea ARNt descărcat urmată de

disocierea ribozomului 14

8

Diferenţe procariote-eucariote

Eucariote Procariote

Fixarea ARNm la subunitatea

ribozomală mică

Capătul 5’ (CAP) al ARNm

leagă factorii eIF şi subunitatea

40S care conţine Met-ARNtmet;

ARNm este scanat pentru

găsirea codonului START

Secvenţa Shine-Dalgarno situată în

amonte de codonul AUG se leagă

prin legături de H de o secvenţă

complementară din ARNr 16S

Primul amino acid Metionina Formil-Metionina

Factorii de iniţiere >12 eIF 3 IF

Ribozomi 80S (40S + 60S) 70S (30S + 50S)

15

Traducere - InhibitoriPuromicina blochează elongarea substituindu-se unui aminoacil-ARNt

Efectele altor medicamente:

• tetraciclina împiedică inserţia aminoacil-ARNt pe locusul A

• cloramfenicolul inhibă peptidil transferaza

• eritromicina inhibă translocarea

Analog structural al extremităţii 3’ a tirozil-ARNt

16

9

Modificări post traducere

• Îndepărtarea grupării formil a fMet terminale (procariote)

• Îndepărtarea Met sau a unor fragmente peptidice

• Acetilare

• ADP-ribozilare

• Carboxilare

• Acilare cu acizi graşi

• Glicozilare

• Hidroxilare

• Metilare

• Fosforilare

• S-farnezilare (ex. oncoproteine)17

Sinteza proteinelor membranare & secretate

Începe cu sinteza peptidei semnal

Peptida semnal este recunoscută de SRP (“signal recognition particle”)=> este sistată

temporar sinteza proteinei

SRP este legat de receptorul specific de pe membrana reticulului endoplasmic

Peptida semnal pătrunde în lumenul reticulului prin porul învecinat receptorului şi este

clivată de “semnal peptidază”

Continuă sinteza proteinei

18