Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learninguCZ.04.1.03/3.2.15.3/0407

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Základy biochemie KBC / BCH

Metabolismus nukleotidů

Metabolismus nukleotidů

•

Osnova•

Syntéza purinových ribonukleotidů•

Syntéza adeninových a guaninových ribonukleotidů•

Kontrola biosyntézay

purinových nukleotidů•

Recyklace purinů•

Syntéza pyrimidinových nukleotidů•

Syntéza uridinmonofosfátu•

Syntéza uridintrifosfátu

a cytidintrifosfáttu•

Kontrola biosyntézy pyrimidinových nukleotidů•

Tvorba deoxyribonukleotidů•

Tvorba deoxyribos•

Tvorba thyminu. •

Odbourávání

nukleotidů•

Katabolismus purinů•

Dráha močové

kyseliny•

Katabolismus pyrimidinů2

Struktura purinu a pyrimidinu

N

N

N

N

H

N

N

Purin Pyrimidin

12

345

67

89

56

123

4

3

Ribosa a 2-deoxyribosa

OH OHO

OHH

OH

H

OH

CH2

H

Ribosa

1´2´3´

4´

5´OH OHO

OHH

H

H

OH

CH2

H

2´-Deoxyribosa

1´2´3´

4´

5´

4

β-N-glykosidová

vazba. Ve vazbě

je uhlík C1´.

N

N

N

N

NH2

OH O

OHH

OH

H

OH

CH2

H

β-N-Glykosidová vazba

5

Ribonukleotid a deoxyribonukleotid Nukleosid je pouze báze a pentosa vázaná

N-glykosidovou vazbou.

OBáze

O

OHH

OH

H

OH

CH2

H

O3P

5´-Ribonukleotid

1´2´3´

4´

5´OH

Báze

O

OHH

H

H

O

CH2

H

O3P

3´-Deoxyribonukleotid

1´2´3´

4´

5´2-

2-

6

Názvy a zkratky bází

nukleových kyselin, nukleosidů

a nukleotidůStrukturní

vzorec

Adenin

Ade

A

Guanin

Gua

G

Cytosin

Cyt

C

Uracil

Ura

U

Thymin

Thy

T

N

N

N

N

NH2

X

N

N

N

N

O

XNH2

H

N

N

NH2

O

X

N

N

O

O

X

H

N

N

O

O

dX

H CH3

Adenosin

Ado

A

Guanosin

Guo

G

Cytidin

Cyd

C

Uridin

Urd

U

Deoxythymidin

dThd

dT

Adenylová kyselina

Adenosinmonofosfát

AMP

Guanosylová kyselina

Guanosinmonofosfát

GMP

Cytidylová kyselina

Cytidinmonofosfát

CMP

Uridylová kyselina

Uridinmonofosfát

UMP

Deoxythymidylová kyselina

Deoxythymidinmonofosfát

dTMP

Báze(X = ribosa, 2´-deoxyribosa)

Nukleosid(X = ribosafosfát, 2´-deoxyribosafosfát)

Nukleotid(X = H)

7

Biosyntéza purinových ribonukleotidů

•

Nukleotidy jsou fosforečné

estery pentos (ribosy nebo

deoxyribosy) ve kterých je purinová

nebo pyrimidinová

báze vázána na uhlík C1´sacharidu.

•

V roce 1948 John Buchanan dělal pokusy s holuby, které

krmil různými izotopy značenými sloučeninami a zjišťoval pozici značených atomů

ve vylučované

močové

kyselině. •

Buchananovy závěry:

NH

C

N

NC

CC N

C

Amidoskupina glutaminu

12

345

67

89Formiát

Aminoskupina aspartátu

Formiát

GlycinHCO3

-

8

Schéma biosyntézy IMP, ATP, GTP, dATP a dGTP

NC

N

NC

CC N

C

ribosa-PGlutamin

12

345

67

89

AspartátN 10-Formyltetrahydrofolát

GlycinCO2

GlutaminN 10-Formyltetrahydrofolát

Struktura purinového kruhu

IMP

ATP GTP

dATP dGTP

RNA

DNA9

Inosinmonofosfát (IMP) –

prekurzor AMP a GMP.

O

N

O

OHH

OH

H

OH

H

NH

N

N

O

PO-

O

O-

Hypoxanthin

Inosinmonofosfát (IMP)

10

Jednotlivé

kroky biosyntézy inosinmonofosfátu

•

1. Výchozím materiálem je produkt pentosafosfátové

dráhy α-D-ribosa-

5-fosfát, která

se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP). •

2. Vstup atomu N9 purinu reakcí

PRPP s Gln. Dochází

k inverzi konfigurace na β. Kontrolní

krok biosyntézy –

současná

hydrolýzy PPi

!! Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA).

•

3. Vstup purinových atomů

C4, C5 a N7. Atomy vstupují

ve formě

Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).

•

4. Vstup purinového atomu C8. Volná

aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).

•

5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě

Gln za účasti ATP →

ADP + Pi

. •

6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární

kondenzace za účasti ATP tvoří

5-aminoimidazolribotidu (AIR). •

7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3-

za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku

karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).

11

Jednotlivé

kroky biosyntézy inosinmonofosfátu (IMP)

•

8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP →

ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR).

•

9. Odštěpení

fumarátu z SACAIR. Podobná

reakce reakci močovinového cyklu. Tvoří

se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR). •

10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá

formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato

reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-

aminobenzoové

kyseliny !!•

11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není

nutné

ATP. •

Poznámka: U živočichů

jsou reakce 10 a11 katalyzovány bifunkčními enzymy, stejně

jako reakce 7 a 8. Reakce 3, 4 a 6 probíhají

na jednoduchém proteinu. Meziprodukty multifunkčních enzymů

nejsou uvolňovány do prostředí, ale posouvány tunely k dalšímu enzymu.

•

Podobná

situace je u pyruvátdehydrogenasového komplexu, synthasy mastných kyselin, synthasy glutamátu a tryptofansynthasy.12

1.

Výchozím sloučeninou je produkt pentosafosfátové

dráhy α-D-ribosa-5-fosfát, která

se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP).

ATP

O O

OHH

OH

H

OH

CH2

H

O3P H

α-D-Ribosa-5-fosfát (R5P)

2-

α

AMP1 Ribosafosfátpyrofosfátkinasa

O O

OH

OH

H

OH

CH2

H

O3P H

P

O

O-

O-P O

O

O-

5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP)

2-

α

13

2. Vstup atomu N 9 purinu reakcí

PRPP s Gln.

Dochází

k inverzi konfigurace v poloze 1´na

β. Kontrolní

krok biosyntézy –

současná

hydrolýzy PPi

!! Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA).

Glutamin + H2O

Glutamát + PPi

2 Amidofosforibosyltransferasa

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH2

β-5-Fosforibosylamin (PRA)

2-

β

O O

OH

OH

H

OH

CH2

H

O3P H

P

O

O-

O-P O

O

O-

5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP)

2-

α

14

3. Vstup purinových atomů

C4, C5 a N7.

Atomy vstupují

ve formě

Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).

GAR synthetasaGlycin + ATP

ADP + Pi

3

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH

O C

CH2 NH2

Glycinamidribotid (GAR)

2-

β

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH2

β-5-Fosforibosylamin (PRA)

2-

β

15

4. Vstup purinového atomu C8.

Volná

aminoskupina GAR je formylována N10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR).

GAR transformylasaN 10-Formyl-THF

THF4

Formylglycinamidribotid (FGAR)

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P NH

O C

CH2 NH2

Glycinamidribotid (GAR)

2-

β

C

CH2

NH

CHNH

OO

ribosa-5-fosfát

16

5. Vstup purinového atomu N3.

Vstupuje ve formě

Gln za účasti ATP →

ADP + Pi

.

FGAM synthetasaATP + Glutamin + H2O

ADP + Glutamát + Pi

5

Formylglycinamidinribotid (FGAM)

C

CH2

NH

CHNH

ONH

ribosa-5-fosfát

Formylglycinamidribotid (FGAR)

C

CH2

NH

CHNH

OO

ribosa-5-fosfát

17

6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární

kondenzace za účasti ATP tvoří

5-aminoimidazolribotidu (AIR).

AIR synthetasaATP

ADP + Pi

6

5-Aminoimidazolribotid (AIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CHN

CH

NH2

Formylglycinamidinribotid (FGAM)

C

CH2

NH

CHNH

ONH

ribosa-5-fosfát

5

18

7. Vstup C6 atomu purinu.

Vstupuje jako HCO3

-

za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku

karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).

AIR karboxylasaATP + HCO3

-

ADP + Pi

7

Karboxyaminoimidazolribotid (CAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

OOC

5-Aminoimidazolribotid (AIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CHN

CH

NH2

5

5

4

-

19

8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP →

ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR).

SAICAIR synthetasaAspartát + ATP

ADP + Pi

8

5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid (SAICAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

OCOO

CH NH

CH2

COO

5

4

-

Karboxyaminoimidazolribotid (CAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

OOC

5

4

-

-

20

9. Odštěpení

fumarátu z SACAIR. Reakce podobná

reakci močovinového cyklu. Tvoří

se 5-aminoimidazol-4-

karboxamidribotid (AICAR).

AdenylosukcinátlyasaFumarát9

5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

O

NH2

5

4

5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid (SAICAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

OCOO

CH NH

CH2

COO

5

4

-

-

21

10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá

formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-

4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány

sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové

kyseliny !!

AICAR Transformylasa10

5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid (FAICAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH

C

O

NH2

CHO 5

4

N 10-Formyl-THF

THF

5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH2

C

O

NH2

5

4

22

11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není

nutné

ATP.

IMP cyklohydrolasa11

Inosin-5´-monofosfát (IMP)

NC

CN

CH

N

C

O

NH

CH

O O

OHH

OH

H

OH

H

O3P

5

4

H2O

5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid (FAICAIR)

N

ribosa-5-fosfát

C

CN

CH

NH

C

O

NH2

CHO 5

4

2-

23

Biosyntéza adeninového a guaninového ribonukleotidu•

IMP se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí

na AMP a GMP. •

AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se naváže Asp, což

je spojeno s hydrolýzou GTP →

GDP a Pi

. V další

reakci se eliminuje fumarát z adenylsukcinátu za tvorby AMP.

•

GMP se syntetizuje z IMP také

ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti NAD+

→

NADH za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup amidodusíku Gln za účast ATP →

AMP + PPi

a tvorby GMP.

O

OHO

CH3

OCH3

CH3

OH

O

Mykofenolová kyselina

Poznámka:

V B a T

lymfocytech, odpovídajících za imunitní

odpověď

organismu, je vysoká

aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí

ke zvýšené

tvorbě

GMP nutných pro proliferaci. Produkt plísně, mykofenolová

kyselina, tento enzym inhibuje a využívá

se jako imunosupresivum po transplantacích !!24

Adenylosukcinátsynthetasa

Inosin-5´-monofosfát (IMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

Aspartát + GTP

Adenylosukcinát

N

N

N

NH

N

ribosa-5-fosfát

OOC CH2 CH COO

Xantosin-5´-monofosfát (XMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

O

H

GDP + PiNAD+ + H2O

NADH + H+

IMP dehydrogenasa

- -

První

krok biosyntézy AMP a GMP

25

Druhý rok biosyntézy AMP a GMP

Adenylosukcinátlyasa

Adenylosukcinát

N

N

N

NH

N

ribosa-5-fosfát

OOC CH2 CH COO

Xantosin-5´-monofosfát (XMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

O

H

Glutamin + ATP + H2O

Glutamát + AMP + PPi

- -

GMP synthetasa

Guanosin-5´-monofosfát (GMP)

N

N

N

O

N

ribosa-5-fosfát

H

NH2

HAdenosin-5´-monofosfát

(AMP)

N

N

N

NH2

N

ribosa-5-fosfát

Fumarát

26

Biosyntéza nuklosiddifosfátů

a nukleosidtrifosfátů

•

Pro vstup nukleotidů

do nukleových kyselin, musí

být nukleosidmonofosfáty převedeny na odpovídající

trifosfáty.

•

Převedení

na nukleosiddifosfáty: Nukleosidmonofosfátkinasy.

•

Např. adenylátkinasa –

AMP + ATP ↔

2 ADP •

Podobně

guanylátkinasa –

GMP + ATP ↔ GTP + ADP

•

Nukleosiddifosfáty jsou převáděny na nukleosidtrifosfáty –

nukleosiddifosfátkinasou.

GDP + ATP ↔

GTP + ADP

27

Regulace biosyntézy purinových nukleotidů

•

Dvě

hladiny regulace.

•

A) Rychlost tvorby IMP je nezávisle, ale synergicky kontrolována hladinou adeninových a guaninových nukleotidů. Vysoká

hladina nukleotidů

inhibuje syntézu IMP.

•

B) Místo regulace je za místem syntézy IMP. Rychlost syntézy GTP se zvyšuje s koncentrací

[ATP], zatímco rychlost syntézy AMP s rostoucí

koncentrací

[GTP].

28

Schéma regulace biosyntézy purinových nukleotidůRibosa-5-fosfát

PRPP

5-Fosforibosylamin

IMP

Adenylosukcinát

AMP

ADP

ATP

XMP

GMP

GDP

GTP

AKTIVACEINHIBICE

29

Recyklace purinových nukleotidů•

Při obměně

nukleových kyselin se uvolňují

báze adenin, guanin a hypoxanthin a ty jsou recyklovány cestou odlišnou od biosyntézy.

•

U savců

jsou puriny recyklovány dvěma enzymy: •

Adeninfosforibosyltransferasa (APRT) katalyzující

reakci:

Adenin + PRPP ↔ AMP + PPi

•

Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (HGPRT) katalyzující

reakci:

Hypoxanthin + PRPP ↔ IMP + PPiGuanin + PRPP ↔

GMP + PPi

•

Lesch-Nyhamův syndrom

–

deficit HGPRT, akumuluje se PRPP, u chlapců, vysoká

hladina močové

kyseliny v moči, spojeno s neurologickými potížemi, agresívní

a destruktivní

chování. 30

Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů

•

Biosyntéza pyrimidinů

je podstatně

jednodušší

než

purinů. Čtyři atomy pyrimidinu jsou z Asp, jeden C2 má

původ v CO2

a dusíkový atom N3 je z amidu Gln. Produktem biosyntézy je uridinmonofosfát (UMP), který je prekurzorem cytidinmonofosfátu (CMP).

C

N

NC

CC

56

123

4Aminoskupina

glutaminu

HCO3-

Aspartát

31

Biosyntéza uridinmonofosfátu

(UMP)

•

Syntéza UMP je šestistupňová. Na rozdíl od biosyntézy purinů

je pyrimidinový kruh syntetizován samostatně

a poté

připojen k ribosa-5-

fosfátu.

•

1.

Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární

e

nzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3

-

a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP. Srovnej s močovinovým cyklem.

•

2.

Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP !

•

3.

Uzavření

kruhu za tvorby dihydroorotátu. •

4.

Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové

Fe a je lokalizován na vnější

straně

vnitřní

mitochondriální

membrány, kde je reoxidován chinony. Ostatní

enzymy jsou cytosolární. Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů

v T

lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní

onemocnění

rheumatoidní

arthritidu. 32

Biosyntéza uridinmonofosfátu

•

5.

Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-

5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi

. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také

podílí

na recyklaci ostatních

pyrimidinových bází

jako jsou uracil a cytosin.

•

6.

Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023

– jeden z

nejúčinnějších enzymů

vůbec !!

•

Poznámka: Biosyntéza pyrimidinů

je cílem antiparasitických léčiv. Např. parazit Toxoplasma gondii

(toxoplasmosa) způsobuje oslepnutí, neurologické

dysfunkce a u lidí

se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsynthetasa II, enzym, který se strukturou i kineticky liší

od savčího. Parazit není

schopen využít pyrimidinové

báze hostitele a proto je musí

syntetizovat de novo.

33

1.

Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární

enzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3

-

a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP.

Karbamoylfosfátsynthetasa II1

Karbamoylfosfát

NH2

C

O PO3

O2-

2 ATP + HCO3- + Glutamin + H2O

2 ADP + Glutamát + Pi

34

2. Syntéza karbamoylaspartátu.

Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP !

Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa)2Pi

Karbamoylfosfát

NH2

C

O PO3

O2-

Aspartát

CH

CH2

NH

C

O

OH

CO COO

NH2

-

Karbamoylaspartát35

3. Uzavření

kruhu za tvorby dihydroorotátu.

Dihydroorotasa3

H2O

CH

CH2

NH

C

O

CO COO

NH

-

Dihydroorotát

CH

CH2

NH

C

O

OH

CO COO

NH2

-

Karbamoylaspartát

36

4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové

Fe a je lokalizován na vnější

straně

vnitřní

mitochondriální

membrány, kde je reoxidován chinony.

Dihydroorotátdehydrogenasa4Chinol

C

CH

NH

C

O

CO COO

NH

-

Orotát

CH

CH2

NH

C

O

CO COO

NH

-

Dihydroorotát

Chinon

37

5. Vstup ribosa-5-fosfátu.

Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´-

monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi

. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také

podílí

na recyklaci ostatních pyrimidinových bází

jako jsou uracil a cytosin.

Orotátfosforibosyltransferasa5PPi

C

CH

N

C

O

CO COO

NH

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P

-

PPRP

C

CH

NH

C

O

CO COO

NH

-

Orotidin-5´-monofosfát (OMP)

β

2-

Orotát

38

6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023

– jeden z nejúčinnějších enzymů

vůbec !!

OMP dekarboxylasa6

CO2

CH

CH

N

C

O

CO

NH

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P

Uridin-5´-monofosfát (UMP)

β

2-

C

CH

N

C

O

CO COO

NH

O O

HH

OH

H

OH

CH2

H

O3P

-

Orotidin-5´-monofosfát (OMP)

β

2-

39

Syntéza uridintrifosfátu (UTP) a cytidintrifosfátu (CTP)

•

Enzymy: nuklosidmonofosfátkinasa a nukleosiddifosfátkinasa analogie syntézy purinových nukleotidtrifosfátů.

UMP + ATP ↔ UDP + ADP UDP + ATP ↔

UTP + ADP

•

CTP se tvoří

aminací

UTP CTP synthasou. U živočichů

je donorem aminoskupiny Gln u baktérií

přímo NH3

.

O

N

O

HH

OH

H

OH

CH2

H

P

O

O-

O P

O

O-

P OO-

O

O-

NH

O

O

UTP

Glutamin + ATP + H2O

Glutamát + ADP + Pi

O

N

O

HH

OH

H

OH

CH2

H

P

O

O-

O P

O

O-

P OO-

O

O-

NH

NH2

O

CTP40

Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů

-

inhibice zpětnou vazbou.

AKTIVACE

BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U BAKTERIÍ (E. coli)

BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U ŽIVOČICHŮ

HCO3- + Glutamin + ATP

Karbamoylfosfát

Karbamoylaspartát

Dihydroorotát

Orotát

OMPINHIBICE

UMP

UDP

UTP

CTP

PRPP

HCO3- + Glutamin + ATP

Karbamoylfosfát

Karbamoylaspartát

Dihydroorotát

Orotát

OMP

INHIBICE

UMP

UDP

UTP

CTP

PRPP

AKTIVACE

41

Biosyntéza deoxyribonukleotidů

•

Deoxyribonukleotidy jsou syntetizovány z odpovídajících ribonukleotidů

redukcí

pozice 2´.

Katalyzují

allosterické

enzymy ribonukleotidreduktasy (RNR). Substrátem je nukleotiddifosfát, reakce je radikálová

a RNR je udržována v redukovaném stavu thioredoxinem. Po redukci je dNDP fosforylovcán ATP na dNTP.

O

Báze

O

HH

OH

H

OH

H

P

O

O-

O P

O

O-

O-

NDP

O

Báze

O

HH

H

H

OH

H

P

O

O-

O P

O

O-

O-

dNDP

42

Biosyntéza deoxythymidinmonofosfátu.

•

Deoxythymidinmonofosfát (dTMP), součást DNA, je syntetizován methylací

dUMP. dUMP je generován hydrolýzou dUTP:

dUTP + H2

O →

dUMP + PPi

•

Vytvořený dTMP je ihned fosforylován na dTTP ! Tyto dvě

reakce spotřebovávající

energii jsou nutné

jako prevence vstupu dUTP do DNA. Enzymový systém katalyzující

syntézu DNA z dNTP efektivně

nerozlišuje mezi dUTP a dTTP.

•

Vlastní

methylace dUMP: Enzym thymidylátsynthasa a nositel methylu N 5, N 10

–methylentetrahydrofolát (N 5, N 10

–methylen-THF).

•

Poznámka: Přenášená

methylenová

skupina, mající

oxidační

stav formaldehydu, je redukována na methyl (oxidační

stav methanol) na úkor oxidace THF na dihydrofolát (DHF). 43

Schéma methylace dUMP na dTMP

C

C

N

C

CO

N

dRibosa-5-fosfát

O

H

H

H

dUMP

6

5

CH2

N

NH

N

N

N

CH2

CH2O

H

NH2

R

H7

65

8

910

N 5,N 10-Methylentetrahydrofolát

+

C

C

N

C

CO

N

dRibosa-5-fosfát

O

H CH3

H

dTMP

CH2

N

NH

N

N

NH

CH2

O

H

NH2

RDihydrofolát

+

C NH

CH CH2 CH2 C O-

O COO O-

nR = ; n = 1-644

Regenerace N 5, N 10

–methylentetrahydrofolátu

Dihydrofolátreduktasa (DHFR) (FdUMP = fluordeoxyuridinmonofosfát)

DHF

THF

N 5,N 10-Methylen-THF

Methotrexát Aminopterin Trimethoprim

dUMP dTMPFdUMP

Thymidylátsynthasa

NADPH + H+

NADP+

Dihydrofolátreduktasa

NH3+ CH COO

CH2OH

-

Serin

NH3+ CH2 COO-

Glycin

Serinhydroxymethyltransferasa

45

Inhibice thymidylátsynthasy nebo dihydrofolátreduktasy –

terapie rakoviny.

•

Tvorba dTTP je kritický proces pro rychle proliferující

buńky jako jsou rakovinné. Přerušení

syntézy dTTP vede k jejich zániku. Normální

buňky, kromě

buněk kostní

dřeně, imunitního systému, kartáčového lemu střev a vlasových

uzlíků, jsou na tyto zásahy méně

citlivé.

•

5-Fluordeoxyuridylát (FdUMP) je ireversibilní

inhibitor thymidylátsynthasy. FdUMP se váže na thymidylátsynthasu jako dUMP. Při vlastní

methylaci nelze odštěpit F (F+) stejně

jako H+

a enzym je tak svázán v inaktivním kovalentním

ternárním komplexu enzym-FdUMP-THF. Takové

inhibitory nazýváme mechanism-based inhibitors

nebo také

suicide substrates (sebevražedné

substráty).

ON

O

OHH

H

H

OH

H

P

O

O-

O-

C

CC

CO

N

O

H F

H

5-Fluorodeoxyuridylát (FdUMP)

46

Inhibice dihydrofolátreduktasy.

Blokuje se regenerace THF. Antifoláty, DHF analoga, se váží

na DHFR 1 000 x pevněji než

DHF.

R = H Aminopterin R = CH3 Methotrexát (amethopterin)

N

N

NH2

CH2 OCH3

OCH3

OCH3

NH2

CH2

N

NH

N

NNCH2

NH2

H

NH2

R

C NH

CH CH2 CH2 COO

O COO-

-

Trimethoprim47

Odbourávání

(katabolismus) nukleotidů•

Většina potravy obsahuje nukleové

kyseliny. Nukleové

kyseliny jsou intaktní

ke kyselému prostředí

žaludku a jsou odbourávány až

v tenkém střevě

pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová

povaha nukleotidů

jim nedovoluje procházet přes buněčné

membrány a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve střevní

stěně

hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami:

Nukleosidasa: Nukleosid + H2

O →

báze + ribosa Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi

→

báze + ribosa-5-fosfát

•

Recyklováno je jen velmi malé

množství

bází

nukleových kyselin z

potravy –

musí

probíhat biosyntéza de novo. •

Ribosa-1-fosfát jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP) je prekurzorem PRPP.

•

Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající

deriváty ionosinu, které

jsou dále degradovány. 48

Schéma katabolismu purinových nukleotidů

1. část

Purinnukleosidfosforylasa (PNP)

N

N

N

N

NH2

Ribosa-5-fosfát

N

N

N

N

O

Ribosa-5-fosfát

H

N

N

N

N

O

Ribosa-5-fosfát

O

H

H

N

N

NH

N

O

Ribosa-5-fosfát

NH2

H

AMP IMP XMP GMP

H2O

Pi

Nukleotidasa

AMP deaminasa

H2O NH4+

AdenosinAdenosindeaminasa

H2O NH4+

H2O

Pi

Nukleotidasa

Inosin

Ribosa-1-P

Purinnukleosidfosforylasa (PNP)

Hypoxanthin

Pi

H2O

Pi

Nukleotidasa

Xanthosin

Ribosa-1-P

Purinnukleosidfosforylasa (PNP)

Xanthin

Pi

H2O

Pi

Nukleotidasa

Guanosin

Ribosa-1-P

Guanin

Pi

Xanthinoxidasa Guanindeaminasa

49

Schéma katabolismu purinových nukleotidů

2. část

O2 + H2O H2O2

Hypoxanthin

H2O2

Xanthin

O2 + H2O

GuaninXanthinoxidasa Guanindeaminasa

NH4+ H2O

Xanthinoxidasa

N

N

N

N

O

O

H

H

O

H

H

Močová kyselina

50

Cyklus purinových nukleotidů

•

Cyklus hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Zvyšuje se svalová

aktivita zvyšováním aktivity citrátového cyklu. Svaly nemají

dostatečné

množství

enzymů, které

by doplňovaly meziprodukty citrátového cyklu –

anaplerotické

reakce. Cyklus purinových nukleotidů

je dodavatelem fumarátu pro svalový citrátový cyklus !!!

IMP

Adenylosukcinát

AMP

H2O NH4+

AMP deaminasa

Aspartát + GTP

GDP + Pi

AdenylosukcinátsynthetasaAdenylosukcinátlyasa

Fumarát

H2O + Aspartát + GTP NH4+ + GDP + Pi + Fumarát51

Xanthinoxidasa (XO)

Převádí

hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu.

•

U savců

je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer obsahující

FAD a Mo komplex cyklující

mezi Mo6+

a Mo4+. Koncovým akceptorem elektronů

je O2

přecházející

na H2

O2 což

je nebezpečná

oxidační

sloučenina ihned štěpena katalasou na H2

O a O2

.

Hypoxanthin Xanthin

NH

NH

N

N

O

NH

NH

NH

N

O

O

Močová kyselina (enol forma)

NH

NH

NH

N

O

O

O H7

89

Močová kyselina (keto forma)

NH

NH

NH

N

O

O

O

H

Ureát

NH

NH

NH

N

O

O

O-H++

pK = 5.4

52

Osud močové

kyseliny

•

Konečným produktem degradace purinů

u člověka a primátů

je močová

kyselina vylučovaná

močí.

•

Totéž

platí

pro ptáky, suchozemské

plazy a většinu hmyzu. Smyslem je zadržovat vodu, protože močová

kyselina je jen omezeně

rozpustná

ve vodě

a proto její

vylučování

ve formě

krystalů

nebo pasty šetří pro

organismus vodu.

•

U všech dalších organismů

je močová

kyselina dále degradována.•

Savci, vyjma primátů, oxidují

močovou kyselinu na ve vodě

dobře rozpustný allantoin.

•

Kostnaté

ryby štěpí

allantoin dále na allantoovou kyselinu. •

Chrupavčité

ryby a obojživelníci degradují

allantoovou kyselinu na močovinu a tu vyměšují.

•

Mořští

bezobratlovci rozkládají

močovinu na amoniak a amonné

ionty.

53

Schéma další

degradace močové

kyseliny

N

NH

NH

N

O

O

O

H

HMočová kyselina

VYLUČOVANO:

Primáti Ptáci Plazi Hmyz

2 H2O + O2Urátoxidasa

CO2 + H2O2

N

NH2

NH

N

O

O

H

H

O

Allantoin

Další savci

H2OAllantoinasa

NH2

NH

COOH

O

NH2

NH

O

Allantoová kyselina

Kostnaté ryby

H2OAllantoikasa

Močovina

Chrupavčité ryby Obojživelníci

CHO-COOHGlyoxylová kyselina

O

CNH2 NH22

2 H2OUreasa

Mořští bezobratlí

2 CO2

4 NH4+54

Dna je onemocnění

provázené

zvýšenou hladinou močové

kyseliny v tělesných tekutinách.

•

Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené

vylučování

močové

kyseliny. Jedním z důvodů

je nedostatečnost HGPRT (Lesch-Nyhamův syndrom) vedoucí

k nadměrné

produkci z důvodů

akumulace PRPP.

•

Dna se léčí

podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu,

což

je strukturní

analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně

naváže na redukovanou formu enzymu a tím ho ireversibilně

inhibuje. Příklad „suicide inhibitor“

nebo mechanism-

based substrate.

Hypoxanthin Alloxanthin

NH

NH

N

N

O

NH

NH

NH

N

O

O

Allopurinol

NH

NH

N

N

O

78

55

Odbourávání

(katabolismus) pyrimidinových nukleotidů

•

Živočišné

buňky degradují

pyrimidinové

nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají

přes defosforylace, deaminace a štěpení

glykosidových vazeb. Vznikající

uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází.

•

Konečnými produkty jsou β-alanin a β-aminoisobutyrát.

•

Obě

sloučeniny jsou dále převáděny transaminací

a aktivací

na malonyl-

CoA a methylmalonyl CoA.

•

Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA.

•

Závěr: Produkty degradace pyrimidinových nukleotidů

přispívají

k energetickému metabolismu buňky.

56

Degradace pyrimidinových nukleotidů

I. část

N

N

NH2

Ribosa-5-fosfát

O H

H

CMP UMP (dTMP)

H2O

Pi

Nukleotidasa

CytidinCytidindeaminasa

H2O NH4+

H2O

Pi

Nukleotidasa

Uridin (Deoxythymidin)

(d)Ribosa-1-PUridinfofsforylasa

Uracil (Thymin)

Pi

Dihydrouracildehydrogenasa

N

N

O

Ribosa-5-fosfát

O

H CH3

H

Dihydrouracil (Dihydrothymin)

NADPH + H+ NADP+

N

NH

O

O

H CH3

H

HH

57

Degradace pyrimidinových nukleotidů

II. část

β-Ureidopropionasa

NH4+ + CO2H2O

H2OHydropyrimidinhydratasa

Dihydrouracil (Dihydrothymin)

N

NH

O

O

H CH3

H

HH

β-Ureidopropionát (β-Ureidoisobutyrát)

NH

CH2

CHC

O-

O

CH3

NH2

O

β-Alanin (β-Aminoisobutyrát)

NH2CH2

CHOOC CH3

-

58

Transaminace a aktivace β-alaninu a β-aminoisobutyrátu

NADH + H+

CoA + NAD+

Aminotransferasa

2-Oxoglutarát Malonát semialdehyd (Methylmalonát semialdehyd)

β-Alanin (β-Aminoisobutyrát)

NH2CH2

CHOOC CH3

-

GlutamátOCH

CH

COO

CH3

-

Malonyl-CoA (Methylmalonyl-CoA)

OC

CH

COO

CH3

CoAS

-

59