MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS

Quirina Santos-CostaURIA-CPM, FFUL

Parte IV:

1.COLHEITA E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS2.INOCULAÇÃO DE PRODUTOS BIOLÓGICOS3.SEPARAÇÃO DE CMSP A PARTIR DE SANGUE TOTAL

HUMANO POR GRADIENTE DE FICOLL

Métodos de Diagnóstico de Infecções Virais

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COLHEITA E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS

1. Obtidas a partir de doentes na fase aguda da doença;

2. Transporte: Em meio tamponado (3-4ml) com 2% de soro bovino fetal, 100 µg/

ml gentamicina e 0,5% de anfotericina B (fungisona) Temperatura:

4ºC por períodos inferiores a 24h; -70ºC por períodos longos.

3. O Sucesso de um isolamento varia inversamente com o tempo decorrido entre a colheita e o início da cultura viral.

4. Ex. de produtos biológicos para Virologia: Zaragatoas (nasais, faríngeas, oculares, rectais, de lesões, etc.) Sangue Fezes Urina LCR Saliva Lágrimas.

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INOCULAÇÃO DE PRODUTOS BIOLÓGICOS1. Zaragatoas: introduzir a zaragatoa no meio de

transporte, agitar fortemente (vórtex) e espremer. Transferir para novo tubo, centrifugar e inocular.

2. Fezes: fazer uma suspensão a 10% em solução tamponada (BSS). Centrifugar a alta velocidade (10 000 x g durante 60 min.). Ao sobrenadante adicionar gentamicina e incubar 30-45 min. Inocular em células susceptíveis.

3. Sangue: Colher o sangue em tubo com anticoagulante (heparina/ EDTA-5%PBS). Isolar, por migração diferencial em gradiente de Ficoll-Hipaque (Metrizoato de sódio), o plasma, as células mononucleadas (linfócitos + monócitos) e os polimorfonucleares. Inocular em células susceptíveis.

4. LCR e outros fluidos corporais: inocular directamente.

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1.Separação de sangue total humano por gradiente de FicollCOMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO DO VÍRUS

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1.Separação de sangue total humano por gradiente de Ficoll (contagem das CMSP)COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO DO VÍRUS

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CONTAGEM DE CÉLULAS EM

HEMATÍMETRO DE NEUBAUER

N/4 * 105 células / ml

1 2

3 4

1mm

1mm

Altura= 0,1 mmÁrea= 1mm*1mm=1mm2

Volume= 0,1mm3

N (1+2+3+4) 0,1 µL 4

X 1000 µL

Diluição com Azul de Tripan 1/10 (90 µL + 10 µL)

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Parte IV cont.:

1.MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS: directos e indirectos

2.MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS

a)Isolamento viralDetecção da Presença de Vírus em CulturaIdentificação de Vírus em CulturaTitulação de Vírus em Cultura

b)Microscopia Electrónica

Métodos de Diagnóstico de Infecções Virais

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MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DIRECTO

Identificação da presença do vírus ou dos seus componentes na amostra clínica.

1. Demonstração do vírus• Microscopia electrónica (ME)• Cultura em sistemas celulares• Inoculação em ovos embrionados• Inoculação em animais

2. Demonstração de componentes do vírus• Genoma vírico (PCR, hibridação in situ,

Southern ou Northern-blot)• Antigénios víricos (IF, IP, ELISA, aglutinação)

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MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO

TÉCNICAS PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS:

1. Reacção de Fixação do Complemento (RFC);

2. Reacção de Inibição da Hemaglutinação (IHA);

3. Métodos Imunoenzimáticos (EIA);

4. Métodos ImunoRadioactivos (RIA);

5. Aglutinação;

6. Western Blot (WB).

Pesquisa de Anticorpos Específicos (IgG, IgM) para um determinado vírus (Serelogia).

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1. Isolamento viral

A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura

MÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS :

• Efeito citopático: A presença de alguns vírus pode ser revelada pelas alterações degenerativas que eles induzem nas células infectadas. Estas alterações, que podem ser visualizadas ao microscópio, são denominadas colectivamente como efeito citopático (ECP).

• Hemadsorção: Alguns vírus alteram a superfície da célula infectada conferindo-lhe afinidade para as hemácias (Vírus Influenza).

• Interferência viral: Certos vírus que não induzem ECP, são postos em evidência recorrendo à sua capacidade de interferir com a replicação de um segundo vírus (vírus indicador), o qual possui um ECP característico (Vírus da Rubéola + CoxsaKie A9).

• Hemaglutinação: Alguns vírus produzem proteínas hemaglutinantes que podem ser postas em evidência adicionando suspensão de hemácias de uma espécie adequada (humana, galinha, pinto, etc.) (Virus da Rubéola, Vírus Influenza e Parainfluenza).

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A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura: ECP.


• Enterovirus: • Arredondamento das células; • Inclusão eosinófila citoplasmática com compressão

do núcleo;• Nas fases mais avançadas o núcleo deformado

aparece mais escuro e a célula diminui de volume.• HSV:

• Arredondamento das células;• Nas fases mais avançadas podem aparecer

sincícios;• Inclusão eosinófila difusa intranuclear.

• Reovirus:• Nas células não coradas o ECP vão é facilmente

visualizado;• Inclusão eosinófila citoplasmática rodeando o

núcleo sem o deformar.• Adenovirus:

• Inclusão intranuclear compartimentada;• Nucléolo intacto.

• HIV, VRS:• Formação de sincícios.

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A. Detecção da Presença de Vírus em Cultura.


Vírus Exemplos de Células Susceptíveis

Herpes Simplex (HSV) Vero, Hep-2

Varicela-Zona (VZV) Células diplóides humanas (HEK, HEL)

Citomegalovirus (CMV Fibroblastos humanos (MRC-5

Adenovirus Hep-2, HEK

Poliovirus MK, BGM, LLC-MK2, Vero

Coxsackie B MK, BGM, LLC-MK2, Vero

Echovirus MK, BGM, LLC-MK2

Influenza A e B MK, LLC.MK2, MDCK

Parainfluenza MK, LLC-MK2

Papeira MK, LLC-MK2, HEK, Vero

Respiratório Sincícial (RSV) Hep-2, Vero

Rinovirus HEK, HEL

Sarampo MK, HEK

Rubéola Vero, RK13

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1. Isolamento viral


B. Identificação de Vírus em Cultura


• Imunofluorescência directa (IFD): usando anticorpos marcados

com fluorocromos (FITC). €€€€€€€€€

• Imunoperoxidase directa: princípio igual ao da IFD; anticorpos

marcados com peroxidase. €€€

• Neutralização: baseia-se na perda de infecciosidade de um vírus

devido à interacção com o anticorpo específico.II M

AC VIRO

LGO

IA C

LÍNIC

A QSC

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1. Isolamento viral



C. Titulação de Vírus em Cultura


Método das «placas»: Consiste na quantificação das placas de lise induzidas por uma determinada diluição viral (UFP).

Método da diluição limite (end-point dilution): Consiste na inoculação, de diluições crescentes duma suspensão viral,

em células susceptíveis. Calcula-se a diluição em que é

possível detectar replicação viral em 50% das cultura

inoculadas (DI50 ou TCID50).

1 DI50 = 0.7 UFP

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Método das «placas» UFP/mlMÉTODOS DIRECTOS DE DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS :

900uL+100uL

100uL

1. 1x104 células;2. 3 dias depois, retirar o

meio de cultura;3. Adicionar as diluições

dos vírus;4. 1h depois, adicionar

agarose ou sephadex;5. Cobrir com corante

vital Vermelho neutro;6. Contar as placas de

lise.

100uL

+900uL

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

100uL

100uL+900uL

100uL+900uL

100uL+900uL

(30+33+40+29+P5+P6+P7+P8)UFP/ mL=8

X1

V= 0,1mLX10+3

(30+33+40+29+P5+P6+P7+P8)

(Incontáveis)

(03+03+04+09+P5+P6+P7+P8)

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Método da diluição limite (end-point dilution) TCID50%:

105,5 Doses Infectantes 50%

Ou frascos

de cultura

com ECP ou

infecções

Ou frascos

de cultura

sem ECP, ou

não infectados

A/(A+B)

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1. Isolamento viralA. Detecção da Presença de Vírus em Cultura


C. Titulação de Vírus em Cultura

4. Microscopia Electrónica



BIBLIOGRAFIA

A history of experimental virology / Alfred Grafe ; trad. Elvira Keckendorf. - Berlin : Springer, 1991. - XI, 343 p. ; 24 cm

ISBN 3-540-51925-4, CDU 576.8(091), Cota: 340 B - 10731

Basic Cell Culture – a practical approach , J. M. Davis, May, 2002, ISBN: 0199638535

Virology : laboratory procedure manual / coord. Mayo Foundation. - Rochester : Mayo Foundation, cop.1985. - IX, 247 p. ; 28 cm. - (Laboratory Procedures in Clinical Microbiology),

CDU 576.8, Cota: 340B-01 - 10417

Clinica Virology Manual, Steven Specter, Richard L. Hodinka, Stephen A. Young; 2000, 3rd Ed

Methods and Techniques in Virology, Pierre Payment, Michel Trudel, 1993

http://www.cdc.gov

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