MICROBIOLOGIA AMBIENTALE in ACQUACOLTURA

Dott.ssa Piera Anna Martino

DIMEVET – Università degli Studi di Milano

Corso di Perfezionamento

«Benessere dell’animale da laboratorio ed Animal Care (Roditori-Lagomorfi-Specie Acquatiche)»

6 aprile 2018

QUALITA’ DELL’ACQUA

La qualità dell’acqua rappresenta l’elemento più importante per mantenere in salute gli animali

•I pesci sono in grado di adattarsi a cambiamenti nella qualità dell’acqua senza eccessivo stress

•NO cambiamenti rapidi

•Principali parametri dell’acqua, i cui cambiamenti possono causare fluttuazioni ambientali:

– Temperatura, ossigeno, composti dell’N, pH, salinità, durezza

L’ACQUARIO: parametri

TEMPERATURA Adattamento della temperatura corporea a quella

dell’ambiente circostante

Temperatura ottimale per avere la massima efficienza

Temperature molto alte o basse sono pericolose

La temperatura deve essere più costante possibile, con variazioni minime e molto lente

Uso di termoriscaldatori

L’ACQUARIO: parametri

FILTRAZIONE

Acquario sistema biologico isolato

Necessità di un sistema di filtrazione per depurare l’habitat ed evitare l’accumulo di sostanze di rifiuto

Impianti sempre in funzione e con adeguata manutenzione

I filtri devono essere puliti e cambiati o rigenerati

http://www.scanbur.com/housing-ventilation/aquatic-line/zebrafish-systems/zebtec/

L’ACQUARIO: qualità dell’acqua

DUREZZA

Somma totale delle concentrazioni di calcio e magnesio

Gradi di durezza con definizione non universale

Se la concentrazione di Ca2+ è bassa si ha: Tossicità dell’ammoniaca

Tossicità dei metalli

Mortalità e minore resistenza degli avannotti alle infezioni

SALINITA’

Concentrazione di NaCl

Acque dolci: 0.01 -1 ppt

FATTORI AMBIENTALI

COMPOSTI DELL’AZOTO AMMONIACA

Valore “safe” di ammoniaca non ionizzata: 0.02 mg/L

Aumenta ed è molto tossica in caso di Sovraffollamento

Sovra-alimentazione

FATTORI AMBIENTALI

NITRITI [< 0.1 mg/L]**

Sono il prodotto intermedio di due processi mediati da batteri

1. Nitrificazione (aerobi Nitrosomonas)

2. Denitrificazione (Nitrobacter)

NITRATI [< 1g/L]

Meno tossici

**Aumentano in caso di sovraffollamento, dieta iperproteica, aumento di Nitrosomonas

OSSIGENO

6-15 mg/L

Forte stress immunitario se la concentrazione di O2 diminuisce; morte per ipossia

“Malattia delle bolle di gas” se la concentrazione di O2 aumenta

L’ACQUARIO: qualità dell’acqua

Zebrafish

In natura vivono in acqua dolce, poco mosse, con pH ≈ 8

Vivono in piccoli gruppi di 5-20 individui; non hanno cure

parentali; durata della vita di circa 5 anni

Tollerano bene le diverse condizioni ambientali, poiché in

natura vivono in habitat che possono variare in modo

significativo (aree monsoniche)

Se il range non è ottimale però

Necessità di più energia per l’omeostasi, per la crescita, per la

produzione di gameti, per la sopravvivenza e per il

funzionamento del Sistema Immunitario PROBLEMI

Zebrafish

Temperatura

Poichilotermi euritermi con ampio range di tolleranza

termica da 6.7 a 41.7 °C (risposta naturale)

T = 28,5 °C (24-30 °C)

Temperature più elevate possono compromettere il

differenziamento sessuale o la funzionalità cellulare

pH

7-8 come per i pesci di acqua dolce

Durezza

Si tratta di «hard water species» che preferiscono valori > 100 mg/L di CaCO3

Salinità

Tollerano diverse concentrazioni saline

Variabilità tra facilities, ma il range ottimale da

mantenere stabile è 0,25 -0,75 ppt

Ossigeno disciolto

I pesci tropicali come Zebrafish consumano più O2 per unità di peso rispetto ai pesci più grandi

Livello da mantenere: alla saturazione o poco più sotto

(≈ 7,8 mg/L a 28 °C)

Tossico > 1 ppm

Tossico > 0.02 ppm

LO STATO SANITARIO

Idealmente i pesci “da esperimento” dovrebbero essere free da agenti infettivi e da qualsiasi tipo di stress

Infezioni sub-cliniche sono abbastanza frequenti ma con effetti sui risultati sperimentali spesso ignoti

Elevata influenza dei fattori ambientali

PESCE

PATOGENO AMBIENTE

MALATTIA

Cosa cerchiamo nell’acqua?

PATOLOGIE BATTERICHE

Un management inadeguato dei parametri chimico-fisici ed igienico-sanitari può portare allo sviluppo di infezioni a varia eziologia

I batteri possono essere Patogeni primari Opportunisti

I batteri possono causare lesioni cutanee Direttamente Indirettamente dopo invasione sistemica

I batteri si possono riscontrare nell’acqua

LE PATOLOGIE BATTERICHE in ZEBRAFISH

SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA

È anche conosciuta come “setticemia da Aeromonas mobile”, “bocca rossa”, “peste rossa”, “ulcer disease”

È causata da Aeromonas hydrophila e colpisce tutte le specie di pesci

Batterio Gram-negativo, mobile, con un singolo flagello polare, in grado di crescere anche a 37 °C

Alcuni ceppi possono produrre pigmenti marroni

La diagnosi si basa sulla coltura e l’identificazione del microrganismo

Aeromonas hydrophila

A. hydrophila è stato associato ad un’ampia varietà di condizioni cliniche e può essere isolato anche in presenza di altri patogeni

Patogeno primario o un semplice “invasore” secondario?

Osservazione di risposte chemiotassiche verso il muco dei pesci in alcuni ceppi

Produzione di prodotti extracellulari con attività proteolitica ed emolitica (correlata alla virulenza); enterotossine

Casi individuali o anche epidemie

SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA

La setticemia emorragica batterica può essere:

Iperacuta con assenza o presenza di sintomi

Acuta con perdita di squame, emorragie focali anche a livello della bocca

Comparsa di ulcere cutanee sul corpo; anemia e danno renale ed epatico

Cronica (più rara)

SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA

BACTERIAL TAIL ROT

È anche conosciuta come “bacterial fin rot”, pseudomoniasi, setticemia emorragica

È causata da Pseudomonas fluorescens ed ha diffusione ubiquitaria

Batterio Gram-negativo, in grado di crescere tra 22-28 °C, con colonie pigmentate giallo brillante

La diagnosi si basa sulla coltura e l’identificazione del microrganismo

Pseudomonas fluorescens

BACTERIAL TAIL ROT

•Cause predisponenti: •Stress •Bassa temperatura dell’acqua che rappresenta il

serbatoio primario •P. fluorescens può essere sia patogeno primario sia

secondario •Morbilità e mortalità discrete

Erosione della pinna e/o della coda segno cardinale

Comparsa di setticemia

Morte per infezione peracuta

Sopravvivenza anche in presenza di lesioni estese

Presenza di ulcere cutanee, petecchie ed eritema

Assenza di emorragie attorno alle ulcere ≠ infezione da Aeromonas

BACTERIAL TAIL ROT

Erosione della pinna e/o della coda segno cardinale

Comparsa di setticemia

Morte per infezione peracuta

Sopravvivenza anche in presenza di lesioni estese

Presenza di ulcere cutanee, petecchie ed eritema

Assenza di emorragie attorno alle ulcere ≠ infezione da Aeromonas

BACTERIAL TAIL ROT

EDWARDSIELLOSI

Edwardsiella tarda

Gram-negativo, appartenente alle Enterobacteriaceae, è un patogeno intracellulare che cresce in un range tra 30-37 °C

È causa di setticemia generalizzata associata a scarsa qualità dell’acqua e a stress

Trasmissione attraverso l’acqua contaminata a livello di cute, branchie o per via orale

Zebrafish usati anche come modelli sperimentali di questa patologia

EDWARDSIELLOSI

I segni clinici possono includere:

Piccole lesioni cutanee che possono evolvere in ascessi necrotici

Addome disteso e ano gonfio per l’accumulo di liquido ascitico

Depigmentazione

Rene di dimensioni aumentate

Ascessi in organi interni

BACTERIAL GILL DISEASE (BGD)

È anche chiamata “environmental gill disease” poiché è legata al sovraffollamento e a scarsa qualità dell’acqua

Elevata concentrazione di residui organici

Elevata concentrazione di ammoniaca nell’acqua

Stress da trasporto tipico negli Zebrafish

Vari agenti causali appartenenti al gruppo dei gliding bacteria

Flavobacterium columnare, F. branchiophilum

Flexibacter

Citophaga

Flavobacterium

BACTERIAL GILL DISEASE

Eccessiva produzione di muco ed iperplasia dell’epitelio delle branchie

Cute infetta

perdita dello strato epidermico esterno ed esposizione del derma

Infezioni della pinna e coda (fin and tail rot)

Fin and Tail rot

AEROCISTITE BATTERICA o INFEZIONI BATTERICHE DELLA VESCICA NATATORIA

Infezione cronica grave sostenuta da più batteri:

Aeromonas hydrophila, Aeromonas spp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas spp., Flexibacter, Flavobacterium

Cause sottostanti ignote

Colonizzazione da parte di batteri intestinali?

Microsporidiosi?

Immunocompromissione?

Stress?

Scarsa qualità dell’acqua?

Presenza di eritema alla base della pinna (non patognomonica)

Colorazione di Gram della vescica natatoria

Batteri filamentosi colorati con Gram e Ziehl-Neelsen

STREPTOCOCCOSI

Le infezioni da Streptococcus spp. sono ubiquitarie e possono causare elevate mortalità (>50%) in 3-7 gg Anche cronicizzazione con mortalità entro parecchi giorni in

pochi animali

Streptococcus iniae

Stress importante fattore predisponente

Altri stressori: Elevate temperature dell’acqua

Sovraffollamento

Manipolazione

Scarsa qualità dell’acqua

Elevata concentrazione di ammoniaca

Zebrafish usati anche come modelli sperimentali di questa patologia

I pesci colpiti possono presentare diversi segni clinici che progrediscono rapidamente, oltre a mortalità: Emorragie nell’occhio o attorno, a livello branchiale o alla

base delle pinne

Esoftalmia (“pop-eye”)

Alterazioni nel nuoto

Ulcerazioni

Identificazione: mediante colorazione di Gram di impronte con

l’osservazione di tipiche catenelle Gram-positive

coltura e identificazione di streptococchi

STREPTOCOCCOSI

Forte iperemia alla base delle pinne pettorali

Tipiche catenelle di streptococchi da liquido peritoneale dopo colorazione di Gram

MICOBATTERIOSI

Infezioni croniche sistemiche sostenute da Mycobacterium spp.

M. marinum, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. peregrinum, M. haemophilum

Forme croniche con bassi livelli di mortalità ma anche infezioni acute con gravi epizoozie

perché queste diverse manifestazioni?

elevata virulenza dei ceppi

immunodepressione

M. chelonae

Struttura della parete dei micobatteri

Lo strato degli acidi micolici (cere) rappresenta il 60% del peso secco

M. marinum

M. chelonae

MICOBATTERIOSI

I cambiamenti clinici e macroscopici sono variabili ma il segno tipico è la comparsa di noduli bianchi multipli = granulomi negli organi viscerali

Negli Zebrafish si ha anche un calo delle performances riproduttive accompagnato da edema generalizzato con addome rigonfio e ulcere cutanee

Micobatteri in macrofagi. Colorazione di Ziehl-Neelsen

Granulomi multipli a livello renale

(macchie biancastre)

Macrofagi con melanina

MICOBATTERIOSI

DIAGNOSI

Osservazione di macrofagi “ripieni” di batteri colorabili con la colorazione per alcool-acido resistenti (Ziehl-Neelsen)

Difficile crescita in coltura

PCR utile per lo screening di infezioni latenti/subcliniche

Infezione diffusa in Zebrafish. Massiccia proliferazione di fagociti nei visceri con distribuzione diffusa di batteri (frecce).

P = pancreas Colorazione di Ziehl-Neelsen

PROFILASSI E TERAPIA

Attenzione ad un corretto management Mantenimento di una buona qualità dell’acqua, con

ricambi d’acqua al 5-10 %/die;

Immediata rimozione dei pesci morti;

Manipolazione prima dei pesci sani rispetto ai malati;

Uso di cibo pathogen-free quando possibile;

Accurata disinfezione di tutta la strumentazione e dei devices utilizzati ogni volta;

Pulizia dell’ambiente;

Quarantena in apposite vasche per almeno 3 settimane;

Accesso limitato ai soli autorizzati nelle aree «pulite»

PROFILASSI E TERAPIA

• Trattamento antibiotico • Uso appropriato, se possibile, di diversi antibiotici:

• Ossitetraciclina

• Eritromicina

• Fluorchinoloni

• Terapie antibiotiche con dosaggi adeguati e giusta tempistica

• Attenzione ad alcuni parametri dell’acqua: pH, durezza, temperatura

• Attenzione ai batteri del ciclo dell’azoto

PROFILASSI E TERAPIA

• Trattamento con disinfettanti • Verde malachite

• (cancerogeno potenziale e teratogeno/mutageno; no in USA)

• Formaldeide 37% (fungicida registrato negli USA)

• Perossido di idrogeno (con minimo impatto ambientale)

• Cloruro di sodio (NaCl)

• Acqua salata: 29 g/L

• Acqua dolce: 15 g/L

RISCHIO ZOONOSICO

EDWARDSIELLOSI

Edwardsiella tarda

È causa di gravi malattie enteriche (gastroenteriti) ma anche di meningite, ascessi epatici, infezioni di ferite

Il rischio zoonosico legato a Teleostei infetti è piuttosto limitato anche se è indispensabile,

durante la manipolazione, indossare guanti protettivi

RISCHIO ZOONOSICO

STREPTOCOCCOSI

Streptococcus iniae

Primo caso nel 1991 in Texas; secondo caso nel 1994 in Canada

Comparsa di cellulite alle mani con febbre

Rischio minimo nelle persone sane

Rischio elevato in immunocompromessi

Attenzione durante la manipolazione dei pesci

RISCHIO ZOONOSICO

MICOBATTERIOSI

In genere si tratta di infezioni che non mettono a rischio la vita se non in soggetti immunocompromessi

Attenzione durante la manipolazione dei pesci

Infezione localizzata alle estremità dove la temperatura è più bassa

Mycobacterium marinum

swimming pool granuloma

GRAZIE PER L’ATTENZIONE