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Microbiologia - Cellula Batterica PROF MILICI March 14, 2012 1 Microbiologia - Cellula Batterica PROF MILICI March 14, 2012 1 cellula batterica ____ • microorganismi procarioti (un nucleo non cirdondato da una membrana nucleare, hanno un unico cromosoma circolare nel citoplasma), mancano tutti i sistemi vescicolari tipici delle eucariotiche. abbiamo però i ribosomi, sede di sintesi proteica. il citoplasma è racchiuso dalla membrana citoplasmatica e da una parete batterica. • dimensione da 2-50 micron, possono essere osservati con il microscopio ottico • il metabolismo batterico +è molto rapido, tranne che per qualche particolare specie. il tempo di generazione standard dei batteri è di 15-20 minuti.( fa eccezione il bacitto della TBC che ha un tempo di generazione di circa 48 ore, quindi significa che ha bisogno di molto tempo per crescere, servono 60gg per isolarlo.) • tempo di generazione: tempo che intercorre tra una divisione cellulare e la successiva. ____ raggruppamenti morfologici ____ • morfologia: • i batteri possono avere forma: sferica (cocchi) a virgola (vibrioni) allungata (bacilli, che sono tutti gli enterobatteri, il bacillo della tbc) a spirale (spirilli, spirochete). coccobacilli: ne sferico ne allungato. • i cocchi sono di forma sferica, e possono essere singoli o uniti (diplococchi, tetradi, streptococchi (lineari) stafilococchi) •i diplococchi possono raggrupparsi grazie alla loro parte terminale leggermente arrotondata che facilita l'associazione (es. pneumococco) • i cocchi si dividono ma le cellule rimangono unite, formando lunghe catene streptococchi • se i cocchi si dividono secondo piani irregolari, rimanendo ammassati a grappolo abbiamo gli stafilococchi • i raggruppamento dei bacilli sono anche essi vari: a v, a palizzata etc... • possono formare gli streptobacilli se si dividono per piani paralleli, rimanendo uniti. • gli spirilli hanno una struttura rigida, con poche spire, le spirochete sono sflessibili con molte spire (agente della sifilide treponema pallidum o spirochete pallidum) ____ cromosoma batterico ____ • oltre al cromosoma, in alcuni batteri, abbiamo dei fattori genetici extracromosomici: plasmidi. questi presentano dei geni che codificano per la produzione di tossine e per la resistenza ad antibiotici. • una caratteristica fondamentale dei plasmidi è quella di replicarsi indipendetemente dal cromosoma batterico e di trasferirsi da una cellula all'altra tramite fenomeni di coniugazione (soprattutto nei gram negativi, che sono dotati dei pili sessuali: che sono pili cavi, strutture accessorie, mediante i quali si trasferiscono geni da un batterio donatore ad uno ricevente) • un batterio che normalmente non è resistente ad un farmaco può acquisisre resistenza tramite trasferimento di geni da altri batteri tramite i pili sessuali. • i fattori genetici extracromosomici quindi hanno la caratteristica di replicazione autonoma e possono essere trasferiti per coniugazione. ____ ribosomi ____ • tra i ribosomi batterici e quelli della cellula eucariotica c'è differenza per dimensione. quelli della cellula superiore hanno coefficente di sedimentazione 80, quelli del batterio hanno coefficiente di sedimentazione di 70. questo "peso" diverso è un vantaggio, perchè alcuni antibiotici possono agire selettivamente sul ribosoma batterico risparmiando i ribosomi eucariotici, ostacolandone la funzione. • mentre i ribosomi delle cellule superiori aderiscono al RER, quelli citoplasmatici sono situati liberi nel citoplasma in vicinanza della membrana batterica. • possono essere suddivisi in una sub 30s e una 50s. • la sub 30s è costitua da un rna (16s) e 21 proteine chiamate l1 l2 l3 etc... • la sub 50 è formata due rna (5s e 23s) e 34 proteine chiamate s1 s2 s3 etc... ____

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Microbiologia - Cellula Batterica PROF MILICIMarch 14, 2012

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Microbiologia - Cellula Batterica PROF MILICIMarch 14, 2012

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cellula batterica____

• microorganismi procarioti (un nucleo non cirdondato da una membrana nucleare, hanno ununico cromosoma circolare nel citoplasma), mancano tutti i sistemi vescicolari tipici delleeucariotiche. abbiamo però i ribosomi, sede di sintesi proteica. il citoplasma è racchiuso dallamembrana citoplasmatica e da una parete batterica.• dimensione da 2-50 micron, possono essere osservati con il microscopio ottico• il metabolismo batterico +è molto rapido, tranne che per qualche particolare specie. il tempo digenerazione standard dei batteri è di 15-20 minuti.( fa eccezione il bacitto della TBC che ha untempo di generazione di circa 48 ore, quindi significa che ha bisogno di molto tempo per crescere,servono 60gg per isolarlo.)• tempo di generazione: tempo che intercorre tra una divisione cellulare e la successiva.____

raggruppamentimorfologici____

• morfologia:• i batteri possono avere forma: sferica (cocchi) a virgola (vibrioni) allungata (bacilli, che sonotutti gli enterobatteri, il bacillo della tbc) a spirale (spirilli, spirochete). coccobacilli: ne sferico neallungato.• i cocchi sono di forma sferica, e possono essere singoli o uniti (diplococchi, tetradi, streptococchi(lineari) stafilococchi)• i diplococchi possono raggrupparsi grazie alla loro parte terminale leggermente arrotondata chefacilita l'associazione (es. pneumococco)• i cocchi si dividono ma le cellule rimangono unite, formando lunghe catene streptococchi• se i cocchi si dividono secondo piani irregolari, rimanendo ammassati a grappolo abbiamo glistafilococchi• i raggruppamento dei bacilli sono anche essi vari: a v, a palizzata etc...• possono formare gli streptobacilli se si dividono per piani paralleli, rimanendo uniti.• gli spirilli hanno una struttura rigida, con poche spire, le spirochete sono sflessibili con moltespire (agente della sifilide treponema pallidum o spirochete pallidum)____

cromosomabatterico____

• oltre al cromosoma, in alcuni batteri, abbiamo dei fattori genetici extracromosomici: plasmidi.questi presentano dei geni che codificano per la produzione di tossine e per la resistenza adantibiotici.• una caratteristica fondamentale dei plasmidi è quella di replicarsi indipendetemente dalcromosoma batterico e di trasferirsi da una cellula all'altra tramite fenomeni di coniugazione(soprattutto nei gram negativi, che sono dotati dei pili sessuali: che sono pili cavi, struttureaccessorie, mediante i quali si trasferiscono geni da un batterio donatore ad uno ricevente)• un batterio che normalmente non è resistente ad un farmaco può acquisisre resistenza tramitetrasferimento di geni da altri batteri tramite i pili sessuali.• i fattori genetici extracromosomici quindi hanno la caratteristica di replicazione autonoma epossono essere trasferiti per coniugazione.____

ribosomi____

• tra i ribosomi batterici e quelli della cellula eucariotica c'è differenza per dimensione. quelli dellacellula superiore hanno coefficente di sedimentazione 80, quelli del batterio hanno coefficiente disedimentazione di 70. questo "peso" diverso è un vantaggio, perchè alcuni antibiotici possono agireselettivamente sul ribosoma batterico risparmiando i ribosomi eucariotici, ostacolandone lafunzione.• mentre i ribosomi delle cellule superiori aderiscono al RER, quelli citoplasmatici sono situatiliberi nel citoplasma in vicinanza della membrana batterica.• possono essere suddivisi in una sub 30s e una 50s.• la sub 30s è costitua da un rna (16s) e 21 proteine chiamate l1 l2 l3 etc...• la sub 50 è formata due rna (5s e 23s) e 34 proteine chiamate s1 s2 s3 etc...____

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membranacitoplasmatica____

• circonda il citoplasma e analogamente a quella delle cellule superiori è costituita da un doppiostrato fosfolipidico. i lipidi idrofobi sono rappresentati da acidi grassi. mentre le teste idrofile sitrovano all'interno e all'esterno del batterio, le code si trovano al centro della membrana. ladifferenza tra la cellula eucariotica e procaritica è l'assenza di steroli. (non gli interessa iltrasporto delle sostanze).• vi sono delle proteine trans membrana, responsabili del trasporto di sostanze nutrienti versol'interno anche contro gradiente di concentrazioene.• la membrana citoplasmatica ha funzione di regolazione di scambi metabolici tra interno e esternodella cellula trasportando sostanze con diversi meccanismi:• diffusione passiva, diffusione facilitata, trasporto attivo, traslocazione di gruppo.____

meccanismi ditrasporto____

• DIFFUSIONE PASSIVA: trasporto dall'esterno a maggior concentrazione, verso l'interno,secondogradiente di concentrazione. questo procedimento non richiede dispendio energetico. l'ossigenoviene trasferito con tale meccanismo.• DIFFUSIONE FACILITATA: molto simile al primo trasporto, ma in questo caso la sostanza datrasposrtare si lega ad un carrieri proteico. il glicerolo penetra con tale meccanismo• TRASPORTO ATTIVO: fa penetrare sostanze contro gradiente di concentrazione. le sostanze chepenetrano grazie al trap attivo sono amminoacidi, ioni inorganici, acidi organici etc...• TRASLOCAZIONE DI GRUPPO: simile al trasporto attivo, solo che le sostanze trasportate subisconouna trasformazione chimica durante il trasporto. ad esempio: glucosio, mannosio,n-acetilglucosammina prima di essere trasportate vengono fosforilate.____

altre funzioni dimembrana____

• nella membrana vi sono anche delle proteine che assolvono alla funzione mitocondriale. lafosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri nelle cellule eucariotiche. nei batteri, i mitocondrisono assenti e proteine di membrana assolvono a questa deficienza.• un'altra caratteristica è che la membrana presenta una invaginazione detta MESOSOMA, che sitrova al centro della cellula batterica. questo è importante perchè pare abbia un ruolofondamentale nella ripartizione del materiale genetico dopo la divisione cellulare.• la membrana batterica è sede di proteine molto importanti: permeasi (trasporto di sostanzenutritive all'interno e di enzimi all'esterno); proteine biosintetiche (sintesi di lipidi di membrana,peptidoglicani, acidi tecoici, lipopolisaccaridi); proteine respiratorie (sintesi di ATP durante iltrasporto di elettroni).____

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parete cellulare____

• una caratteristica peculiare della cellula batterica è la presenza della parete batterica checonferisce caratteristiche particolari al batterio:• la parete batterica innanzi tutto conferisce la morfologia al batterio; protegge la cellula dallalisosmotica: all'interno della cellula batterica vi è una pressione osmotica molto piu alta di quelladelle cellule eucariotiche, quindi vi sarebbe un richiamo d'acqua dall'esterno all'interno chefarebbe scoppiare la cellula. la parete batterica ha anche delle caratteristiche di colorazione: aseconda della colorazione possiamo capire che tipo di parete ha il batterio,se positivo o negativoalla colorazione gram: di conseguenza possiamo sapere a quali sostanze è più debole.• questa parete è costituita fondamentalmente dal peptidoglicano, che a sua volta è rappresentatodall'alternarsi di due amminozuccheri che sono: la N-Acetilglucosammina e l'acidoN-Acetilmuramico.• questi due amminozuccheri sono legati tra loro da un legame beta 1,4 glucosidico (tra duedimeri di n-acetilglucosammina e acido muramicoil legame è beta 1.6 glucosidico).• sul legame beta 1,4 glucosidico agisce un enzima che è il LISOZIMA, che si trova nella saliva, nellelacrime, nell'albume dell'uovo; quando agisce il lisozima si ha uno scompaginamento delproteoglicano• dall'acido muramico si diparte una catena tetrapeptidica rappresentata (in ordine) dallal-alanina, acido diglutammico, l-lisina (in alternativa acido mesodiamminopimedico) e infine la d-alanina.• i due amminozuccheri si alternano in maniera costante formando lunghi filamenti costituiti da20-30 amminozuccheri, e questi filamenti sono tenuti insieme da legami detti legami crociati, chesi stabiliscono tra il 3° amminoacido di una catena e il 4° dell'altra (tra l-lisina e d-alanina).• gli amminoacidi sono destrogiri (gli amminoacidi umanin sono levogiri); notiamo la presenza diamminoacidi che non rientrano tra i 20 umani, in particolare l'acido mesodiamminopimedico.• i vari elementi del peptidoglicano verranno formati in sede citoplasmatica. vengono quinditrasportati all'esterno della membrana citoplasmatica tramite un vettore chiamatoundecaprenolo (o bactoprenolo), un lipide a lunga catena. questo carrier lipidico permette disuperare la parete idrofobica.• quando tutti i componenti della parete si troveranno fuori dalla membrana verranno assemblatedalle transpeptidasi (legami tra il 3 e il 4 amminoacido della catena tetrapeptidica) e dalletransglicosilasi (legame tra acido muramico e l-alanina).• quando gli elementi sono stati assemblati, il residuo della vecchia parete è un segnale chimico perla cellula, per il quale vengono sintetizzati enzimi detti autolisine, che hanno il compito didisgregare la vecchia parete cellulare per permettere alla cellula di dividersi. le autolisinecomprendono due tipi di enzimi: le amidasi (scindono il legame tra l'acido muramico e lal-alanina) e le glicosilasi (scindono il legame tra monomeri o dimeri di acido muramico en-acetilglucosammina).____

parete cellulare(gram positivi)____

• la parete dei gram positivi è costituita da due filamenti di proteoglicani (molto sottile rispettoquella dei gram negativi).• mentre nei gram negativi, il legame tra 3 e 4 amminoacido della catena tetrapeptidica sonodiretti, nei gram positivi possono essere sia diretti che mediati da un ponte di pentaglicina (5molecole di glicina).• nei gram positivi oltre al peptidoglicano abbiamo gli acidi teicoici. gli acidi teicoici sono dal puntodi vista chimico dei polimeri di glicerolfosfato (triolo esterificato con acido fosforico) eribitolfosfato (pentolo). possiamo anche avere acidi lipoteicoici, e sono attaccati alla membranaplasmatica fungendo da ponte tra membrana e parete.• gli acidi teicoici stimolano una funzione immunitaria dell'organismo ospite; grazie alle lorocariche si oppongono all'ingresso di sostanze nocive favorendone quello delle sostanze nutritive,in oltre sono importanti per la stabilità della membrana. si oppongono anche all'azione delleautolisine.oltre al peptidoglicano abbiamo gli acidi teicoici. gli acidi teicoici sono dal punto di vistachimico dei polimiri di glicerolfosfato (triolo esterificato con acido fosforico) e ribitolfosfato(pentolo). possiamo anche avere acidi lipoteicoici, che sono attaccati alla membrana plasmaticafungendo da ponte tra membrana e parete.• gli acidi teicoici stimolano la funzione immunitaria dell'organismo ospite; grazie alle loro caricheelettriche si oppongono all'ingresso di sostanze nocive favorendone quello delle sostanze nutritive,in oltre sono importanti per la stabilità della membrana. si oppongono anche all'azione delleautolisine.____

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parete cellulare(gram negativi)____

• nei gram negativi, invece degli acidi teicoici abbiamo una membrana esterna, uguale a tutte lemembrane biologiche dal punto di vista chimico: costituita cioè da un doppio strato fosfolipidico.• fra la seconda membrana ed il peptidoglicano c'è sempre uno spazio detto spazio periplasmico.• la differenza tra membrana superficiale e profonda dei gram negativi è che nella membranaesterna c'è la presenza di proteine dette PORINE, che sono dei canali acquosi, carichinegativamente. esse sono responsabili di trasporto di alcune proteine.• la membrana esterna dei gram negativi delimita lo spazio periplasmico che, verso l'interno, èdelimitato dalla parete cellulare; si oppone all'azione della fagocitosi e all'azione del complemento;si oppone all'ingresso di sostanze nocive per il batterio, come proteine leucocitarie, antibiotici, salibiliari, enzimi digestivi dell'ospite. permette il transito di sostanze nutrienti e ostacola l'ingresso disostanze tossiche.• le porine sono classificabili in: porine non selettive e porine selettive.• le porine non selettive fanno passare qualsiasi sostanza le cui dimensioni siano compatibili con illoro diametro.• le porine selettive sono in comunicazione con pompe a trasporto attivo presenti nella membranacitoplasmatica INTERNA (non quella esterna), e quindi lasceranno passare solo i substraticompatibili con le quelle pompe.• nella membrana esterna dei gram negativi vi sono dei complessi importantissimi: come illipopolisaccaride LPS.• LPS è distinguibile in due frazioni:• Lipide A ha una funzione di tipo endotossico (corrisponde alle endotossine dei gram negativi), èuna porzione polisaccaridica, responsabile delle caratteristiche antigeniche dei gram negativi,(antigene O): è quindi il responsabile della risposta immunitaria. Il lipide A è formato da acidopalmidico, milistico e stearico.____

endotossine edesotossine____

• Cosa sono le endotossine? sostanze di natura lipopolisaccaridica prodotta dal batterio, che non vieneriversata fuori dalla cellula, ma ne rimangono all'interno, quindi vengono liberate al momento della lisi dellacellula. sono termoresistenti, agiscono a grandi dosi, e si differenziano dalle esotossine.• Invece, le esotossine sono sostanze di natura proteica (quindi termolabili), prodotte dal batterio e riversateall'esterno del batterio stesso. le esotossine agiscono anche a piccole dosi.• le esotossine hanno meccanismo d'azione specifico (ogni tossina ha un meccanismo specifico); le endotossinehanno tutte lo stesso meccanismo d'azione: sono dei pirogeni, cioè inducono febbre perchè agiscono sul centrodella termoregolazione, danno disturbi intestinali, provocano diminuzione di leucociti e piastrine, necrosi deitessuti, vasodilatazione e vasopermeabilizzazione con emorraggie puntiformi (petecchie), ipotensione, shockemorraggico e morte.• un'altra differenza importante tra le eso e le endo tossine è che le esotossine essendo termolabili, possonoessere trattate con il calore o con il formolo, per trasformarle in anatossine (o tossoide).• per definizione l'anatossina è quella tossina che ha perso il potere tossico, ma ha comunque il potereantigenico. quindi le anatossine possono essere utilizzate a scopo profilattico (per fare vaccini).• le endotossine non possono essere trasformate in sostanze profilattiche, perchè sono sostanze di naturalipidica e non possono essere trattate con il calore.____

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struttureaccessorie: capsulae glicocalice____

• alcuni batteri posseggono certe caratteristiche che altri non posseggono. queste strutture sonodette accessorie, e sono rappresentate da capsula flagelli spore• CAPSULA: struttura all'esterno della parete batterica il cui spessore molto spesso supera quellodella cellula batterica; non si colora (quando pensiamo di avere a che fare con batteri capsulatiricorriamo ad una colorazione negativa con inchiostro di china. avremo quindi il batterio ed ilcampo sostante colorato di nero, e la capsula apparira come alone incolore).• il GLICOCALICE presente nei batteri è costituito da uno strato di fibrille molto lasse che oltre aconsentire l'adesione dei batteri alle mucose dell'ospite forma una specie di biofilm, che ingloba ibatteri e li difende dall'aggressione da parte di sostanze antibatteriche che si trovanonell'ambiente circostante.• il glicocalice può evolvere in alcuni batteri verso la formazione di una vera e propria capsula, masolitamente queste due strutture non coesistono.• sia capsula che glicocalice facilitano quindi l'adesione e la successiva colonizzazione dei tessutidell'ospite; in particolare la capsula è responsabile dei processi morbosi causati dai batteri, perchèsi oppone alla fagocitosi (che fanno parte della componente aspecifica della difesa del nostroorganismo).• per fare un esempio di germe capsulato che verra studiato nella parte speciale lo (StaphilococcusPneumoniae) PNEUMOCOCCO può provocare la polmonite grazie alla presenza di questa struttura,considerato fattore di virulenza, perchè a parità di batterio patogeno, un batterio capsulato è piùvirulento.• virulenza: a parità di potere patogeno, virulenza è la capacità di indurre un grado maggiore di patogenicità• oltre al pneumococco altri batteri che possiedono la capsula sono la Klepsiella Pneumoniae, Bacillodel Carbonchio, Meningococco.• dal punto di vista chimico la capsula è di natura polisaccaridica, ad eccezione del bacillodel carbonchio che presenta una capsula di natura peptdicica, cioè costituita da polimeri diacido diglutammico.____

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struttureaccessorie: flagellipili e spore____

• FLAGELLI, adibiti a locomozione, hanno forma cilindrica, diametro di 20nm e una lunghezza dicirca 15-20 micron. a seconda della disposizione che hanno nei batteri possiamo distinguerebatteri monotrichi (vibrione del colera) batteri lofotrichi (ciuffo di flagelli localizzati ad un polodella cellula), batteri peritrichi (con tutta la superficie cellulare se hanno tutta la superficiecellulare ricoperta di flagelli) e batteri atrichi.• i flagelli sono costituiti da un composto proteico: la FLAGELLINA. studi al M.E: hanno consentito dievidenziare la struttura del flagello la quale è costituita da molecole di flagellina che aggregandosivariamente formano lunghe catene elicoidali dal cui intreccio si origina il cosiddetto filamentonella parte basale. il filamento si lega alla parete batterica tramite un sistema di dischisovbrapposti che costituiscono il corpo basale. mentre prende il nome di uncino il breve segmentoche collega il filamento al corpo basale.• la sintesi dei flagelli è molto complessa in quanto prevede l'intervento di circa 20-30 geni: unocodifica per la flagellina, gli altri codificano per l'uncino e il corpo basale.• il movimento dei flagelli è dovuto alla chemiotassi (movimento orientato e indotto da uncomposto chimico che provoca la rotazione di questa struttura molto rigida).• nei batteri gram positivi, che non hanno flagelli, o in alcune spirochete il movimento è dovuto:nei gram-positivi ai moti browniani, cioè all'urto delle molecole del fluido in cui sono immersi ibatteri; mentre nei secondi il movimento è dovuto ad un sottile filamento localizzato ad un polodella cellula.• alcuni batteri non patogeni per l'uomo si muovo per strisciamento, cioè per contrazione di sottilifilamenti, originanti da piccole sfere poste sulla parete batterica.• I flagelli possono essere eliminati da un batterio, perchè sono di natura proteica, e con il calore possonoessere degradate. verranno studiati dei batteri flagellati che verranno privati dei flagelli, e l'allontanamentodi queste strutture verrà utilizzato nella diagnostica virologica.• I PILI o FIMBRIE sono organi di adesione (l'adesività è il primo passo per esprimere il poterepatogeno: un batterio prima di penetrare nell'organismo ospite deve prima ADERIRE). questefimbrie sono più rigide e piccole, ma comunque di natura proteica, composte da PILINA.• distinguiamo pili sessuali (responsabili del trasferimento di geni (o virus) da un batterio all'altromediante fenomeni di coniugazione) e pili comuni (o fimbrie), atti a permettere l'adesività aitessuti dell'ospite.• Le SPORE hanno funzioni molto importantiperche sono molto resistenti anche alle granditemperature, e possono germinare. le spore rappresentano forme di resistenza del batterio incondizioni ambientali sfavorevoli (alterazioni di pressione, temperatura, ph). la spora può averediverse forme (sferica o allungata), può deformare il corpo batterico perche spesso si trovaall'interno al centro del batterio, e dato che può avere dimensioni superiori al batterio stesso puòindurne la deformazione. resistono per molti anni (si sono trovate spore batteriche in mummieegiziane, che sono state in grado di germinare).• date le particolari caratteristiche morfologiche, la spora è una particolarità esclusiva dei batterigram-positivi____

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spora,sporulazione egerminazione____

• la spora è composta dall'esterno all'interno come segue:• esosporio: uno strato lipoproteico molto sottile che non sempre è presente• tunica: costituita da un doppio strato proteicoin cui sono abbondanti i gruppi disolfuro S-S• corteccia: costituita da un doppiostrato di peptidoglicano con un numero di legami crociatosicuramente inferiore a quello presente nella parete dei gram positivi. questo strato dipeptidoglicano ci indica che la spora può essere soltato presente nei gram-positivi (perche lostrato di peptidoglicano dei gram negativi è molto sottile)• nucleo:circondato ed immerso nel citoplasma; presenta l'acido dipicolinico, presente sotto formadi sale (dipicolinato di calcio), di cui la cellula si arricchisce durante il processo di sporulazione(infatti non è mai presente nella cellula vegetativa). questo sale conferisce alla spora resistenzaall'essiccamento.• il processo che porta alla formazione di una spora da un batterio è detto sporulazione.• il processo che porta alla formazione di un batterio da una spora è detta germinazione.• funzione della spora - Esempio pratico: il bacillo del tetano vive nell'intestino dei grossi animali,nell'ambiente esterno non può vivere perchè è anaerobio obligato. quando viene espulso con losterco viene posto sotto forma di spora. nel caso in cui la spora entri in ferite nelle quali siverificherà assenza di ossigeno (assenza di sangue) la spora può germinare e formare il batterioche induce la patogenesi.• come si forma la spora?• inizia con la divisione dei cromosoma batterico: uno dei due cromosomi si circonda dei vari stratidella spora.• la spora è molto resistente all'essiccamento, ai disinfettanti fisici e chimici, ai raggi UV. quindiper eliminare spore da materiale patologico dobbiamo ricorrere a temperature di 121°C e pressionedi 760mmHg, che si può indurre in autoclave, dove si verifica un aumento di calore umido.____

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colorazione diGram____

• è un test semplice ed efficace per distinguere tra le due principali classi batteriche ed iniziare unaterapia.• per osservare i batteri dobbiamo utilizzare il microscopio ottico. per fare diagnosi di malattieinfettive, dopo il prelievo di materiale biologico è l'osservazione del materiale.• l'esame può essere condotto in diversi modi:• a fresco - consiste nel prelevare una piccola parte di materiale, metterla su un vetrino portaogetto, coprirla con un vetrino copri ogetto, e osservarla con il microscopio ottico. questo esameda scarse informazioni: da informazioni solo sulla morfologia, sul raggruppamento morfologico,sulla mobilità (perchè lavoriamo su batteri in vivo).• le informazioni maggiori si hanno colorando il preparato.• diciamo subito che i coloranti che adoperiamo in batteriologia devono essere necessariamentecoloranti BASICI perchè la cellula batterica è ricca in acidi nucleici, quindi basofila: alcuni colorantibasici sono il blu di metilene, il cristalvioletto (violetto di genziana), la fucsina basicafenicata (con acido fenico).• Le colorazioni possono essere semplici o differenziali• le colorazioni semplici comportano l'utilizzo di un solo colorante in un solo tempo.utilizziamo il blu di metilene da solo, o il nero di china (vedi sopra) ma pur ottenendo delle scarseinformazioni.• colorando non possiamo risalire al tipo di mobilità perchè affinchè possa iniziare la colorazione ilmateriale deve essere prima fissato. una delle tappe della fissazione è l'uccisione dei batteri. quindinon si muovono più (capitan ovvio).• PROCEDURA PER LA COLORAZIONE SEMPLICE : una volta che preleviamo il materialepatologico da esaminare lo stendiamo su vetrino portaoggetto, lo facciamo asciugare atemperatura ambiente e lo fissiamo (3 volte alla fiamma):• il fissaggio serve a fare aderire il materiale patologico al vetrino, che altrimenti, durante lacolorazione potrebbe essere asportato. il fissaggio rende i batteri piu permeabili alla colorazione, ein oltre la fissazione, li uccide: l'uccisione dei batteri riduce la possibilità di infezione dell'operatore.• a questo punto coloriamo con un solo colorante;• laviamo con acqua;• osserviamo al M.O. : SOLTANTO vedremo morfologia e raggruppamento• le colorazioni che i microbiologi devono utilizzare in laboratorio sono quelle dettedifferenziali, che comportano utilizzo di piu coloranti in piu tempi.• un metodo di colorazione differenziale, messo a punto da un medico danese, Gram, che nel 1884lavorava presso l'obitorio di Berlino, e utilizzo per primo questo metodo che serviva a differenziarei batteri dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti.• questo metodo viene oggi adoperato nei laboratori e ci consente di dividere i batteri in grampositivi e negativi.• i diversi comportamenti dei batteri in questa metodica di colorazione sono dovuti in gran partealla diversa composizione chimica e strutturale della parete cellulare.• come procediamo? esempio pratico di COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM:• paziente con ascesso, prelievo materiale patologico (materiale purulento, PUS), lo sistemiamo sulvetrino, lo facciamo asciugare a temperatura ambiente o sotto una lampadina elettrica, lo fissiamo3 volte alla fiamma di un becco Bunsen, procediamo alla colorazione.• nella colorazione procediamo prima con il violetto di genziana, che colora la cellula in violetto.• successivamente utilizziamo un mordente il reattivo di Lugol (contiene iodio e ioduro dipotassio). il mordete reagisce con il colorante formando un complesso difficilmente dissociabiledalla successiva azione decolorante dell'alcool etilico.• cosa succede?• dopo l'utilizzo del Lugol, va utilizzato l'alcool, per pulire il composto, e si evidenziano le differnzetra gram positivi e gram negativi.• nei gram positivi, l'alcool ha difficoltà a penetrare nella parete batterica, e quindi la cellulaconserverà il violetto di genziana, che non può essere pulito• nei gram negativi la paretenatterica ha piu strati, ma anche pori più grandi. l'alcool riesce aentrare attraverso questi pori, e la sua natura a solubilizzare la componente lipidica della parete.questa solubilizzazione comporta la detersione del colorante. a questo punto la cellula risultaincolore.• per evidenziare queste cellule incolori si utilizza un colorante di contrasto: la safranina. lasafranina colora tutti i gram negativi, riuscendo a permeare alla parete batterica dei gram negativie rimanendovi.• i gram positivi sarano colorati in violetto per il violetto di genziana, i gram negativi sarannocolorati in rosso per la safranina____

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colorazione diZiehl-Neelsen____

• è un metodo particolare per i micobatteri come il bacillo di Koch per la tubercolosi o il batteriodella lebbra, che a differenza del primo non è coltivabile in laboratorio, perchè non è stato ancoratrovato un terreno di coltura che soddisfi la sua richiesta nutrizionale.• il batterio della lebbra viene meno ai postulati di Koch. questi dicono che bisogna isolare imicrorganismi da tutti i casi di malattia. e dopo essere coltivati in laboratorio in vitro, per essere inoculati inanimali da esperimento per creare lo stesso quadro clinico dell'uomo.• Per alcuni batteri, i postulati di Koch possono essere disattesi, in quanto nell'uomo possonoprovocare una certa sintomatologia mentre negli animali non inducono alcun tipo di risposta.• Questo metodo di colorazione è peculiare per i micobatteri, in quanto questi sono batteriacido-alcool resistenti.• l'acido alcool resistenza è conferita da un enorme contenuto lipidico che si trova sullaparete cellulare dei micobatteri; tra questi lipidi abbiamo delle cere (cera D, che si comporta daimmunoadiuvante, cioè coadiuva la risposta immunitaria); inoltre abbiamo i cosiddetti micosidi, aiquali appartiene anche il cosiddetto fattore cordale (che fa parte degli acidi micolici della parete)responsabile del raggruppamente a cordone che i micobatteri assumono in unterreno liquido.• PROCEDURA:• soggetto affetto da TBC,• arriva richiesta di isolamento di bacillo tubercolare per una sospetta tubercolosi polmonare.quindi bisgna ispezionare l'espettorato.• viene messo il materiale sul vetrino, viene fatto asciugare, viene fissato per 3 volte alla fiamma e procedoalla colorazione.• il primo colorante da usare è la fucsina basica fenicata. questa è rossa.• l'acido fenico viene posto sul vetrino insieme al colorante. l'acido fenico funge damordente. (in un solo passaggio si mette mordente e colorante)• questa colorazione deve avvenire a caldo, fino allo sviluppo dei primi vapori, perchè a causadel contenuto lipidico la fucsina non entra.• a questo punto trattiamo la soluzione con acido solforico al 10% o acido cloridrico al 4%(insomma acidi inorganici forti).• questo trattamento induce la pulitura da dalla fucsina di altri batteri con la parete nonacido-alcool resistente.• nonstante questo trattamento il micobatterio rimarra colorato in rosso per la fucsina,perchè sia l'acido che l'alcol, dato lo spessore e la composizione della parete non riescono adentrare nel batterio.• tutti i batteri che non sono acido alcool resistenti, venendoi privati della fucsina basicafenicata, e rimanendo incolore, vengono quindi colorati con blu di metilene.• se abbiamo micobatteri li troveremo colorati di rosso su sfondo blu; se non abbiamo mico batteritroviamo solo sfondo blu.• la tipologiadella parete dei micobatteri induce oltre l'acido alcool resistenza, anche una crescita molto lenta,perchè i nutrienti hanno difficolta ad entrare. infatti per dare una risposta di diagnosi per il bacillotubercolare si devono aspettare almeno 60gg, perchè la crescita potrebbe essere molto lenta, e un risultatonegativo, potrebbe diventare positivo.____

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colorazione diAlbert____

• peculriare per i corinebatteri (bacillo difterico)• la difterite era un tempo causa di morte per i bambini che morivano di collasso cardiocircolatorio,non per il batterio in se, che non è un bacillo invasivo (si ferma nella cavità orofaringea).l'esotossina del bacillo invade tutti i parenchimi: rene surrene fegato e cuore, che si sfianca e cessadi pompare.• la vaccinazione antidifterica è obbligatoria, è costituita da anatossina (o tossoide). cioè esotossina trattatacon calore che perde potere patologico ma mantiene il potere immunogenico.• esempio pratico: sospetta difterite; tampone faringeo, si colora il materiale con il metodo dialbert.• il bacillo difterico è caratterizzato dall'avere nel citoplasma dei granuli chiamati granulimetacromatici. la metacromasia è una caratteristica che possiedono alcuni batteri i quali hanno lacapacità di colorarsi in maniera diversa dal colorante adoperato. in questo tipo di colorazioneutilizziamo una miscela di blu di toluidina e verde di metile.• utilizziamo il reattivo di lugol come mordente in concentrazione doppia rispetto allacolorazione di gram• per il fenomeno della metacromasia i granuli citoplasmatici si coloreranno in violetto (viranoil blu al violetto per la metacromasia); mentre il corpo batterico si colorerà in verde pallido(sempre per la metacromasia).• oggi la difterite, grazie al vaccino obbligatorio, qui non esiste. eviteremo di parlarne, e ci dedicheremo adargomenti più attuali.• queste nozioni servono perchè molto spesso in passato il medico per salvare il bambino doveva ricorrere aduna tracheotomia, perchè a livello della trachea si formavano delle pseudomembrane dette CRUPT difterico,che impedivano la respirazione.____

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esame colturale____

• per fare diagnosi di malattie batteriche seguiamo sempre delle tappe: prelievo, esamemicroscopico (informazioni su morfologia, raggruppamento morfologico, caratteristiche tintorialiNON VITALITA); la seconda tappa è rappresentata dall'esame colturale.• dopo l'arrivo di materiale clinico dobbiamo approntare dei terreni di coltura per permettere albatterio causa della patologia di moltiplicarsi per studiarlo.• dobbiamo predisporre dei terreni validi per la crescita, altrimenti il batteri non crescerà mai.• i batteri hanno bisogno di fattori ambientali e di sostanze nutritive per crescere. in relazione allafonte di carbonio e di energia necessari per costruire le loro macromolecole i batteri possonoessere divisi in fotoautotrofo e fotoeterotrofi.• i fotoautotrofi utilizzano la luce solare come fonte di energia, e come fonte di carbonio l'anidridecarbonica• i fotoeterotrofi utilizzano come fonte di energia la luce solare, e come fonte di carbiono deicomposti organici• chemioautotrofi: utilizzano come sorgente di energia dei composti inorganici, fonte di carboiniol'anidride carbonica• chemioeterotrofi: utilizzano i composti organici come fonti sia di energia sia di carbonio• i batteri che hanno alte capacità biosintetiche, ma basse esigenze nutrizionali si accontentano diun terreno definito minimo. deve contenere acqua, azoto, fosforo e i vari metalli.• nei terreni di coltura dobbiamo sempre inserire delle fonti di carbonio (che generalmente èrappresentata dal glucosio, che funge anche da energia) una fonte di azoto (rappresentata dai salidi ammonio); una fonte di fosforo (per la biosintesi degli acidi nucleici) e dei metalli (rame ferromanganese magnesio) che servono ad attivare i sistemi enzimatici batterici: se non funzionano glienzimi i batteri non possono biosintetizzare nulla.• i batteri piu esigenti che partendo da questo terreno minimo non sono in grado di biosintetizzarele loro molecole hanno bisogno di terreni complessi, che contengono dei fattori di crescita ometaboliti essenziali;• i metaboliti essenziali sono delle sostanze che il batterio non è in grado di sintetizzare, edeve ricevere dall'esterno (vitamine, amminoacidi).• un'altra differenza nell'ambito dei terreni di coltura è una differenza dal punto di vista fisico:terreni liquidi e terreni solidi.• un esempio di terreno liquido è il brodo di carne. (anticamente si otteneva bollendo la carne,filtrandola, aggiustando il ph e aggiungendo il peptone , che è un derivato delle proteine. oraesistono i liofilizzati).• il principio del terreno liquido è che l'indice della coltura batterica è data dalla torbidità cheassume il liquido che all'inizio era limpido; non possiamo però sapere se si tratta di una sola speciebatterica o più specie.• per avere più informazioni bisogna trasferire questi batteri in un terreno solido.• il terreno solido utilizzato in laboratorio è l'agar nutriente: passa in funzione della temperaturadallo stato solido a quello liquido. sopra i 45° è fluido, non si può utilizzare come substrato per ibatteri. sotto i 45° si può utilizzare per colture.• l'agar di per ser non ha funzioni nutritive, è un polisaccaride solforato, diventa nutriente quandosi aggiunge il brodo.• l'agar nutriente si ottiene aggiungengo al brodo il 2% di agar (un polisaccaride). l'agar imprigionail brodo nutriente costituendo un substrato sia nutriente che solido.• nell'agar nutriente abbiamo la formazione di colonie.• dalle colonie, a seconda della loro colorazione e della loro morfologia possiamo risalire alle variespecie batteriche.• a seconda delle esigenze batteriche utilizziamo dei terreni complessi.• un esempio di terreno complesso è l'agar sangue.si ottiene aggiungendo all'agar nutriente il2-5% di sangue di montone o di coniglio.• questo si utilizza per la maggior parte dei batteri esistenti (monococchi, streptococchi,stafilococchi).• se aumentiamo la temperatura dell'agar sangue, per poi riportarla sotto i 45°, otteniamo ilcosiddetto sangue cotto, o agar cioccolato (per la caratteristica colorazione); in questa manieraavviene la lisi di globuli rossi per avere più emoglobina disponibile.• terreno chimicamente definito: terreno di cui conosciamo l'esatta composizione chimica delle sostanze, eviene adoperato per studiare il metabolismo dei batteri____

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terreno ditrasporto____

• se vogliamo trasportare in laboratorio materiale clinico, per il mantenimento di germi vividobbiamo utilizzare un terreno di trasporto, per mantenere le reciproche concentrazioni di batteripresenti, ne mantengo soprattutto la vitalità, non permettendo la loro moltiplicazione.• il trasporto è caratterizzato dall'assenza di fattori di crescita, di soluzioni saline tampone.altrimenti le colonie si moltiplicherebbero, e non possiamo più utilizzare le specie che ciinteressano____

terreno diarricchimento____

• il terreno di arricchimento è liquido, e ha lo scopo, partendo da un materiale polimicrobico, diisolare solo una specie.• ESEMPIO: tifo addominale - dobbiamo ricorrere deal terreno di arricchimento, per far aumentarela popolazione solo dei batteri patogeni, e che lasci inalterata la popolazione di latri batteriintestinali.• il terreno di arricchimento in questo caso è rappresentato dal brodo nutriente al selenito disodio.• in questo terreno manteniamo costanti le concentrazioni degli altri germi presenti (che fannoparte della popolazione microbica intestinale) e privilegiando la crescita logaitmica dei batteripatogeni che vogliamo isolare.____

terreno selettivo____

• è un terreno solido, che ci consente di isolare alcune specie patogene svantaggiando lacrescita di batteri concomitanti o contaminanti.• se io voglio isolare da un campione di feci una salmonella tiphi, devo ricorrere ad un terreno diarricchimento (che è liquido) e ad un terreno selettivo (che è solido).• sia terreno di arricchimento che terreno selettivo hanno funzione selettiva in quanto favoriscono solo unaspecie determinata.• il tereno selettivo per salmonella e shighella (detto terreno SS) è costituito da sali biliari(eliminano i batteri gram positivi), lattosio (che viene fermentato SOLO da batteri non patogenicome proteus o e.coli), un indicatore del pH (il rossofenolo) e dei sali di piombo: questi sonoimportanti perchè la salmonella tiphi ha la capacità di formare il solfuro di idrogeno. questo saleinteragisce con i sali di ferro o piombo, precipitando in solfuro di piombo o di ferro, econferendo alle colture di samonella un colore nerastro. in questo modo potremmo identificarele colonie incolore di shighella e le colonie nere di salmonella.• in questi tipi di terreni non abbiamo altri batteri oltre quelli per cui si creano situazioni idoneeper la crescita (per questo è detto terreno selettivo).• il terreno di Saboureaud è un tipo di terreno selettico che consente la crescita dei micetilievitiformi o filamentosi escludendo i batterio perchè contiene un alta concentrazione diglucosio e un pH molto acido intorno a 4,5 - 6. (il ph ottimale per i batteri è 7.2 - 8, un ph cosìbasso favorisce l'uccisione dei batteri).____

terrenodifferenziale____

• è un terreno che consente in laboratorio di discriminare tra i batteri lattosio-fermentanti e nonfermentanti (funge anche da terreno selettivo)• il terreno differenziale più utilizzato in microbiologia è il terreno Mac Conkey.• uso questo terreno se parto da un materiale polimicrobico e devo capire se i batteri che ho isolatofermentano il lattosio (quindi non patogeno) o non lo fermentano (patogeni).• in questo terreno lo zucchero chiave è il lattosio, bisogna anche usare un indicatore di ph ( ilrossoneutro, che tingerà le colonie in presenza di bassi pH), dei sali biliari (che inibiscono lamoltiplicazione di gram-positivi).• se il batterio fermenta il lattosio si ha produzione di acido, perciò le colonie si coloreranno dirosso.• se il batterio non fermenta il lattosio le colonie saranno incolore.• questo può fungere anche da terreno selettivo perchè la presenza di sali biliari elimina i grampositivi.____

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terreno per glianaerobi____

• sono detti anaerobi i batteri che cerescono in assenza assoluta di ossigeno.• in questi terreni vanno inserite delle sostanze riducenti come la cistenia, l'emina, tioglicollato cheallontanano l'ossigeno.• Metodo microbiologico.• Il terreno tioglicollato fluido è stato allestito da Brewer per la coltura rapida di anaerobi e aerobi.• Il peptone di caseina è stato aggiunto da Vera nel 1944.• Il terreno sostiene un buon livello di crescita per numerosi organismi, inclusi gli anaerobi stretti,• senza incubazione in atmosfera anaerobica. Il tioglicollato di sodio, oltre a ridurre il potenziale diossidoriduzione, è in grado di neutralizzare l’attività antibatterica dei composti del mercurio.• Queste caratteristiche rendono l’FTM particolarmente utile per stabilire la presenza di contaminanti neimateriali biologici e di altro tipo. Questa formula, grazie alla sua capacità di stimolare la crescita, è stataadottata dalla farmacopea statunitense (USP), dall'AOAC e dalla farmacopea europea (EP) per i test disterilità e come terreno di arricchimento.• Il terreno tioglicollato fluido è ampiamente usato in microbiologia clinica anche come arricchimento, inparticolare per i campioni prelevati da siti corporei normalmente sterili.• BD Fluid Thioglycollate Medium, avendo un basso potenziale di ossidoriduzione, non è il terreno di scelta pergli aerobi stretti, ad es. non fermentanti, Micrococcus e organismi simili.• Per questi organismi, utilizzare Tryptic Soy Broth o brodo di infuso cuore-cervello.• BD Fluid Thioglycollate Medium contiene glucosio, peptone ed estratto di lievito, che forniscono i fattorinecessari per la crescita batterica. Tioglicollato di sodio e L-cistina sono• agenti riducenti che impediscono l’accumulo di perossidi, che risultano letali per alcuni microrganismi. Laresazurina è un indicatore di ossidoriduzione che vira al rosa se viene• ossidata, mentre appare incolore se viene ridotta. Il piccolo quantitativo di agar contribuisce a tenere bassoil potenziale di ossidoriduzione, stabilizzando il terreno rispetto alle correnti di• convezione, per mantenere l’anaerobiosi negli strati più profondi del terreno. Spesso il terreno tioglicollatofluido appare lievemente opaco per il suo contenuto di agar. Durante l'allestimento, questo terreno prontoall'uso viene sottoposto a un getto di azoto, che scolora l'indicatore resazurina. Il terreno, tuttavia, può essereutilizzato finché non viene ossidato per circa il 30% (strato superiore), come indicato dalla colorazione rosadella resazurina in prossimità della superficie. Se l’ossidazione ha superato tale livello, il brodo può essereriscaldato una volta a vapore o in acqua bollente, raffreddato e utilizzato.• La farmacopea statunitense permette la presenza di acqua nel glucosio (destrosio) e quindi include 5,5grammi nella formula.• Poiché la presenza di umidità è nociva per il terreno disidratato, viene aggiunto un quantitativo equivalentedi glucosio in forma anidra.• quando dobbiamo processare un materiale anaerobio è opportuno operare sotto cappe con flussolaminare, dove l'ossigeno viene sostituito con un gas inerte, che è l'azoto.____

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condizioniambientali____

• se incubiamo il materiale biologico in condizioni non idonee non avremo mai formazioni dicolonie.• i fattori ambientali essenziali sono: la temperatura, l'ossigeno, il pH, l'umidità, la pressioneosmotica.• TEMPERATURA: tutti i batteri hanno un range tdi temperatura all'interno del quale c'è unoptimum al quale crescono. questo optimum è molto vicino al limite superiore di tolleranza (limitedi tolleranza: se aumentiamo la temperatura oltre il limite di tolleranza gli enzimi vengonodegradati, e i batteri non crescono).• in funzione del comportamento dei batteri in funzione della temperatura li distinguiamo inpsicrofisi, mesofili e termofili• gli psicrofili crescono a temperatura da 0 a 20 gradi centigradi. anche a -7 gradi. si trovanonei oceani, nelle zone polari e nei cibi refrigerati o congelati. sono detti psicrofili perchè sonoamanti del freddo. questi non sono patogeni per l'uomo, ma possono contaminare gli alimenti• i mesofili crescono dai 20 ai 40 con un optimum di 37°C. questi sono patogeni per l'uomo• i termofili crescono ad alte temperatura 50 - 90 gradi. anche a 250°C. si trovano in acquetermali, in sorgenti di vapore. la loro termostabilità diende dalla sequenza e composizione inamminoacidi dei loro enzimi. la sequenza degli amminoacidi è responsabile della comparsa dilegami forti, o legami a H, o altri legami deboli, che stabilizzano la struttura delle proteine.• i termofili non possono crescere a temperatura ambiente; e i mesofili non a temperature basse.MA siccome la maggior parte dei batteri che contamino gli alimenti, un abbassamento delletemperatura evita una contaminazione dei cibi.• le basse temperature generalmente non uccidono i batteri, ma bloccano la loro crescita. tornandoperò in condizoni favorevoli riprendono la loro crescita.• ESEMPIO: meingococco: molto sensibile anche alle basse temperature, anche quelle di frigorifero:non le sopporta perchè va in lisi. il materiale va processato subito, non può essere conservato,altrimenti il batterio può perdere la sua vitalità e non può essere studiato. ci sono dei mesofili chein presenza di temperature intorno i 50°C muoiono.• OSSIGENO ATEMOSFERICO: nei processi di respirazione, gli accettori finali di idrogenioni sonomolecole di ossigeno. alcuni batteri fanno a meno dell'ossigeno per la produzione di energia: fannouso della fermentazione. in questo modo usano invece dell'ossigeno un composto organico oinorganico come recettore finale di idrogenioni.• gli aerobi obligati sono il micobacterioum tuberculosis, che cresce solo in presenza di ossigeno.• gli anaerobi obbligati non tollerano l'ossigeno perchè mancano dell'enzima catalasi. questoserve a scindere il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno. quindi l'acqua ossigenata che siaccumula in processi metabolici si accumula, e la sua tossicità li uccide.• gli aerobi e anaerobi facoltativi possono crescere in persenza o assenza di ossigeno. peròcrescono sicuramente meglio in presenza di ossigeno ricorrendo quindi alla respirazione.• in fine i microaerofili crescono a basse tensioni di ossigeno e gradiscono un elevataconcentrazione di anidride carbonica (fino al 10%).• ESEMPIO: gonococco e meningococco, e l'agente eziologico della brucellosi Brucella Maelithensis.• per favorire la crescita degli anaerobi, questi devono essere incubati in particolari strutture dettegiare o GAS PAK. in questi vi è del palladio, un generatore di idrogeno (che elimierà l'ossigenointeragendo con esso e formando acqua). delle cartine imbevute di blu di metilene, che sono unindicatore di anaerobiosi: inizialmente sono azzurre, quando non vi sarà più ossigeno le cartinediventeranno bianche, e allora potremo incubare le piastre.• pH: tutti i batteri hanno un optimum di pH. per la maggior parte dei patogeni è intorno laneutralità: 6.8 - 7.2 ; il vibrione del colera ha un optimum di 8-10; i lieviti e le miceti hanno un pHpiu basso.• nei terreni di coltura bisogna tenere il pH costante, perchè durante le attività metaboliche vi è unaumento di pH. quindi abbiamo bisogno di sostanze tampone: fosfato monobasico di potassio efosfato bibasico di potassio, che mantengono il valore di pH il più possibile costante• UMIDITA': l'acqua del terreno non deve trovarsi legata, ma deve essere libera in maniera chepossa essere usata dal batterio nei processi metabolici.• ESEMPIO: agar 2% costituisce substrato solido ma contiene acqua libera; agar 15% costituiscesubstratosolido ma trattiene tutta l'acqua• PRESSIONE OSMOTICA: ha un valore importantissimo perchè l'acqua tende a passare da unmezzo ipertonico a uno ipotonico. se non vi fosse la parete tutta l'acqua dei terreni di colturapasserebbe dentro al batterio causando lisi. però vi sono batteri, come i lieviti, che sopportano alteconcentrazioni di zucchero, ma non sopportano alte concentrazioni di sali. al contrario gli alofilisopportano alte contentrazioni di sali. se vogliamo coltivare batteri come i micoplasmi, che nonhanno parete, dobbiamo utilizzare delle soluzioni per evitare la lisi data dall'osmosi____

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Microbiologia - Azione patogena dei batteri PROF MILICIMarch 30, 2012

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Microbiologia - Azione patogena dei batteri PROF MILICIMarch 30, 2012

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Generalità eparametri diinfezione____

• fin dalla nascita la cuta è colonizzata da batteri. solo il colon possiede milioni di batteri deivresiche hanno capacità particolari.• molti batteri hanno intrapreso con l'organismo ospite un rapporto di commensalismo:convivono con l'ospite, ma non si ha vantaggio da questi, ne svantaggio.• altri rapporti che condividono i batteri con l'organismo ospite sono i rapporti di simbiosi:convinvenzxa obbligatoria dalla quale entrambi traggono vantaggi.• la protocooperazione è un rapporto vantaggioso sia per i batteri che per noi.• i saprofiti sono battei che vivono all'esterno e si nutrono di materiale inanimato.• i parassiti vivono a spede dell'organismo ospite.• i parassiti obbligati non possono fare a meno dell'organismo ospite , e vivono nei tessuti diquesti. i parassiti facoltativi sono quei parassiti che possono vivere anche nell'ambiente esterno(pediculus capitis, se cade dai capelli può morire per la troppa differenza di temperatura).• vi sono dei batteri che hanno stabilito rapporti di commensalismo, o altri che hanno diversirapporti, perchè metabolizzano sostanze utili per l'organismo ospite, si oppongono all'ingresso dipatogeni e sintetizzano fattori importanti per l'organismo.• anche i batteri che vivono normalmente con noi possono diventare patogeni in caso in cui lecondizioni dell'ospite cambino.• colonizzazione: la colonizzazione dei batteri significa insediamenti di alcuni microbi nei tessutidell'ospite. si possono avere risultati diversi.• i germi colonizzanti possono essere eliminati dai fattori di difesa dell'ospite, o proliferare estabilirsi negli organi. in questo ultimo caso, in cui i batteri si moltiplicano sulla superficiedell'organo o all'interno dello stesso può verificarsi una infezione. il termine infezione è diversodalla malattia.• infezione: adesione, colonizzazione e infestazione e dei microrganismi viventi senzasintomatologia clinica.• il passaggio da infezione a malattia dipende dalle capacità aggressive del microrganismo e dallecapacità difensive dell'ospite.• patogenicità di un batterio: la capacità di dare malattie. ci sono dei patogeni primari che dannosempre malattie, ci sono dei patogeni opportunisti, nel senso che sono generalmente commensali eper alterazioni dell'equilibrio dell'ospite diventano patogeni (esempio della candida albicans,perchè colonizza le mucose vaginali, l'apparato respiratorio ecc... ma quando un ospite sisottopone a interventi chirugici, è portatore di cateteri o è immunodeficente la candida è indotta aproliferare. un altro esempio è datto dallo pneumococco: lo streptococcus pneumoniae è responsabiledella polmonite. normalmente vive nel cavo faringeo: per alterazione delle mucose dell'alberorespiratorio in seguito a influenza il batterio si virulenta inducendo malattie. gli stafilococchipossono entrare da ferite della cute, dove normalmente risiedono, all'interno dell'organismo).• virulenza: il grado di patogenicità di un microrganismo, e presuppone due altri concetti: lacapacità di resistere alle resistenze dell'ospite, detta infettività; e la gravità delle lesioni che puòprodurre.• l'infettività: nel numero di microrganismi necessari per potere dare sintomi di malattia.l'infettività viene quantificata come dose infettante.• dose infettante 50: la carica di germi necessaria a dare malattia nel 50% di animali testati inesperimenti; dose letale 50: numero di microrganismi necessari a procurare morte nel 50% dianimali testati in esperimenti.• infettività e gravità di lesioni prodotte sono due termini indipendenti: il virus influenzale èaltamente infettante, come anche tutti i microrganismi delle malattie dell'infanzia, ma nonprovoca gravi lesioni; però il bacillo tubercolare, con infettività non molto alta, può arrivare acausare danni significativi all'ospite, con conseguenze anche letali se non si segue terapiaadeguata.piu alta è l'infettività più bassa è la carica sufficiente a indurre la malattia.• malattia contagiosa è diverso da malattia infettiva. la malattia contagiosa è una malattia cheviene trasmessa da un malato ad uno sano mediante diverse modalità: contagio interumano diretto(via sessuale (gonorrea ,hiv, treponema pallidum, clamidia) via alimentare (alimenti contaminati)tramite vettori (tramite insetti)). non tutte le malattie provocate da batteri virus protozoi e micetisono contagiose. la contagiosità è dovuta alla trasmissibilità; anche se spesso vi sono malattieindotte da microrganismi come il tetano non contangiose. il tetano si acquisisce tramite feritalacerocontusa e successivo contatto con elementi ambientali contenenti la spora tetanica, ma nonè contagiosa. quindi le malattie infettive sono quelle generalmente provocate da infezioni dibatteri virus protozoi e miceti, e non sono contagiose.____

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fattoricondizionanti lareplicazionebatterica in vivo____

• perchè un microrganismo possa provocare una malattia deve possedere delle caratteristiche:deve potere infettarlo, deve resistere alle difese dell'ospite, e deve provocare un dannoall'ospite.• è stato studiato ampliamente che i batteri nella loro superifie posseggono molecole mediante lequali interreagiscono con strutture o molecole complementari presenti nelle celluledell'ospite. è necessaria una complementarietà tra le molecole dei microrganismi e quelle dellecellule ospiti. a questo punto i batteri possono moltiplicarsi in situ nonostante vengano ostacolatidai flussi e dai fuidi organici(muco urine peristalsi). questa capacità di legarsi è detta adesività, edè il primo atto della patogenesi. queste molecole presenti nei batteri, e presenti anche nei miceti,prendono il nome di adesine, e consentono ai batteri di interreagire con i tessuti dell'ospite perattaccarvisi e invaderlo.• strutture adesive: la capsula è importante per l'adesività ai tessuti dell'ospite;• il glicocalice costituito da fibrille che forma un biofilm; i pili comuni; fibrille presenti in alcunibatteri gram positivi (streptococco betaemolitico di gruppo a, stafilococcus aureus);• strutture pilosimili: simili ai pili comuni, conosciuti anche come antigeni F, localizzati su alcuniceppi di E.coli patogeni per l'uomo suini e bovini, che aderiscono alle pareti del grosso intestine.queste permettono al batterio di moltiplicarsi e di elaborare una enterotossina, responsabile digastroenteriti. quindi la patogenesi è strettamente associata alla adesività.• vi sono anche dei batteri che producono fattori diffusibili, oppure che aderiscono in manieradiversa. un esempio ci è dato da batteri di interesse strettamente odontoiatrico: i batteriresponsabili della carie dentaria. commensali della cavità orale streptococcus mutans e sanguis.questi utilizzano il saccarosio trasformandolo in glucosio e fruttosio. il glucosio viene trasformatoulteriormente in destrano, uno zucchero con proprietà adesive: questo zucchero fissa i batteri aidenti, e forma degli aggregati. questi aggregati costituiscono la cosiddetta placca dentaria. questibatteri aggregati si moltiplicano massivamente producendo molti acidi, acido lattico in particolare,che demineralizza lo smalto dei denti, dando origine alla carie dentaria.• altri fattori di patogenicità sono gli enzimi extracellulari, che sono essenziali ai finidell'espressione del potere patogeno dei batteri, ad esempio la coagulasi è un enzima chetrasforma il fibrinogeno in fibrina, formando attorno al batterio deli reticoli di fibrina che loproteggono dalla fagocitosi;• la ialuronidasi depolimerizza l'acido ialuronico, costituente fondamentale del tessuto connettivo,facilitando la diffusione batterica nei tessuti;• la fibrinolisina è un enzima che scioglie i coaguli di fibrina precedentemente formati per lacoagulasi, favorendo la diffusione del batterio nei tessuti dell'ospite;• la collagenasi depolimerizza il collagene, che si trova nelle ossa, cartilagini e cute, permette alChlostridium perfrigens di indurre la gangrena gassosa, una malattia a carico dei tessuti muscolari;• la leucocidina, che altera la funzionalità dei leucociti polimorfonucleati, che forma dei pori sullamembrana di queste cellule, provocando uscita di liquidi ed elettroliti provocando l'annullamentodell'azione difensiva di queste cellule.• tra gli altri fattori che impediscono la fagocitosi possiamo trovare la capsula, perchè puòmascherare i recettori presenti nelle cellule ai quali si legano i macrofagi, che devono ingerire edeliminare le sostanze estranee; la leucocidina e la coagulasi hanno anche esse una azione anti-fagocitosi;• molti germi utilizzano la fagocitosi per potersi diffondere meglio nell'organismo ospite: il micobatteriodella tubercolosi e si fa fagocitare dai macrofagi e vi si moltiplica all'interno, ed è trasportato daessi nell'organismo, nel quale poi si riversa.____

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esotossine____

• le esotossine sono sostanze proteiche prodotte dai batteri che vengono riversate in ambienteextracellulare. le esotossine possono essere classificate a seconda del batterio che le ha prodotte:tossina colerica, tetanica ecc..• ogni esotossina agisce in un certo modo: bastano 30 grammi di tossina difterica per uccidere 10 milionidi persone, mentre un solo grammo di tossina botulinica è sufficiente ad uccidere la popolazione degli statiuniti.• le esotossine possono essere trasformate in anatossine (sostanza che perde il potere tossico,ma conserva il potere antigenico che può essere sfruttata a scopo profilattico).• possiamo categorizzare le tossine anche a seconda dei distretti di azione: neurotossine,citotossine ecc..• le neurotossine agiscono a livello nervoso (tossina botulinica e tetanica). la tossina botulinicaagisce a livello di giunzioni neuromuscolari impedendo la trasmissione dell'impulso ai muscoliperiferici inducendo paralisi flaccida. può arrivare more perparalisi dei muscoli respiratori.• la tossina tetanica agisce a livello di gangliosidi del sistema nervoso centrale, bloccando gliimpulsi inibitori a livello delle giunzioni neuromuscolari. ne consegue uno spasmo dei muscoliflessori ed estensori, paralisi spastica e morte per spasmo dei muscoli respiratori.• le enterotossine (tossina colerica) agoscono nell'intestino. la tossina colerica interferisce conl'adenilato ciclasi (enzima che trasforma l'atp in amp ciclico). l'aumento di cAmp provoca perditadi ioni cloro bicarbonato sodio e potassio. questa perdita di elettroliti provocherà, per problemiosmotico, un afflusso massivo di acqua: possono perdersi fino 10 litri di acqua con 10 scarichediarroiche in un ora. il paziente muore disidratato.• le citotossine alterano le funzioni cellulari, bloccano la sintesi proteica e provocano la morte. latossina difterica ha come meccanismo d'azione il blocco della sintesi proteica impedendo lereazioni di trasferasi durante la traslazione dell'mRNA, percui si ha un blocco dell'allungamentodella catena proteica per mancato inserimento di amminoacidi nella catena peptidica.____

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difesedell'organismo____

• la malattia è il risultato della lotta tra capacità aggressive e difensive del microrganismo e dell'ospite.• ci sono virus che danno infezione, che inevitabilmente diventa malattia (morbillo); invece infezione del virusdella polio invece non induce necessariamente malattie.• la cute e le mucose svolto un ruolo essenziale nella difesa contro le malattie infettive: mettiamoimmuto difese aspecifiche e difese specifiche.• difese aspecifiche: integrità della cute e delle mucose e la fagocitosi, difese specifichelinfociti b e t.• la cute è una barriera difensiva aspecifica molto importante dell'organismo. il pluristrato ricco dicheratina si oppone alla colonizzazione e alla moltiplicazione dei microganismi.• se questi raggiungessero il derma, troverebbero un pH acido dato dalle ghiandpole sudoripare,che ostacolerebbe la divisione batterica• il muco e le ciglia vibratili sono molto importanti: sspesso la barriera mucociliare è essenziale perl'impedimento della moltiplicazione dei patogeni; è costituita da un apparato cicliato ricco dimuto, e si estende dalle basse vie respriratorie fino alle narici.• il muco è costituito da una parte liquida ed una gel. il gel ricopre la fase liquida e vienecontinuamente trasportato dal movimento delle ciglia vibratili alla faringe. tutte le particelleintrappolate dal muco possono essere deglutiti o eliminati con l'espettorato.• il muco in oltre opera impedendo che alcuni virus vengano a contatto con le cellule epiteliali, e liespone anche alla interazione con le IgA: immunoglobuline secretorie, che tappezzano le mucoseimpedendo l'adesività dei microrganismi.• tutte le mucose sono colonizzate da batteri: mucosa respiratoria, congiuntivale, vaginale, apparatogastro-intestinale, uro-genitale. come fanno questi batteri a difenderci?• questi batteri possono occupare recettori ai quali potrebbero legarsi altri patogeni, e questaazione competitiva impedisce adesività e colonizzazione di altri batteri dannosi; questi in oltrepossono produrre altre sostanze antibatteriche (a livello della vagine i lactobacilli produconol'acido lattico, impedendo al gonococco di dare malattia; a livello dell'intestino abbiamo dei batterifusiformi che producono acidi grassi volatili, e questi impediscono la moltiplicazione di e.colienterotossigenici, che potrebbero dare gravi malattie); l'azione competitiva dell'azione microbicaresidente è data dalla produzione di un ambiene anaerobico, che renderà impossibile l'attacco dibatteri patogeni aerobi.• se provochiamo un dismicrobismo attraverso varie modalità, può accadere che molti batteri omiceti commensali si moltiplichino attivamente inducendo malattie (Clostridium difficile, chefa parte dei microbi intestinali. in seguito ad una terapia antibiotica protratta, alla quale il germerisulta essere resistente, si induce massiva moltiplicazione di esso che induce la colitepseudomembranosa, la quale è difficile da curare, e da gravi problemi al soggetto colpito; la candidapuò dare vaginiti e malattie dell'apparato gastrointestinale).• i fagociti devono sapere distinguere tra il self e il nonself. qualsiasi sotanza estranea in grado diindurre risposta immunitaria uorale o cellulo-mediata è detta antigene.• sono buoni antigeni le sostanze proteiche e polisaccariche. le sostanze lipidiche non sono ingrado di stimolare risposte da sole, ma sono ingrado di reagire con gli anticorpi preformati.inducono risposta immunitaria solo se sono associati a carrieri proteici.• ai meccanismi aspecifici subentrano i linfociti;• sui batteri sono presenti molecole lette dal sistema immunitario. la seconda fase è quelladella processazione dell'antigene, ad opera di cellule aspecifiche che trasmettono il segnale adaltre cellule che si attivano ed innescano i processi atti a eliminare.____

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Microbiologia - Antibatterici <i>PROF MILICI</i>May 5, 2012

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Microbiologia - Antibatterici <i>PROF MILICI</i>May 5, 2012

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Farmaci antibatterici____

• hanno incrementato la possibilità di sopravvivenza delle popolazioni, la prognosi delle malattiainfettive (prima si moliva di polmonite, meningite tubercolosi), i farmi antibatterici vengono ancheusati come profilassi prima di un untervento chirurgico, nelle forme cliniche, dove ci può essere unaumento di batteri in situazioni post operatorie che avrebbero portato a setticemie.• per antibiotici intendiamo le sostanze prodotte da sostanze naturali (penicillina dal penicillumect..)• le sostanze prodotte sinteticamene in laboratorio vengono detti chemioterapici.• sia gli antibiotici che i chemioterapici sono detti farmaci antibatterici.• i prodotti semisintetici consistono nella modificazione chimica di una sostanza naturale• in base al meccanismo d'azione possiamo distinguere i farmaci antibatterici in farmici inibenti lasintesi del peptidoglicano, farmaci che alterano le funzionalità della membrana cellulare, farmaciche agiscono sulle dna topoisomerasi, faraci che inibiscono la rna polimerasi, farmaci cheinibiscono la sintesi proteica, la sintesi dei folati, e dei farmaci che agiscono con meccansismidiversi.____

farmaci cheinibiscono lasintesi deipeptidoglicani____

• dobbiamo distinguere farmaci con tossicità selettiva, che risparmiano le cellule ospiti, e altri cheagiscono con tossicità generalizzata; e tra farmaci batteriostatici (rallentamento della crescitamicrobica, che può riprendere se il farmaco viene allontanato), e i farmaci battericidi (letali per lacellula batterica, perche le strutture per le quali riesce a moltiplicarsi vengono alterate).• tra i farmaci che agiscono inibendo la sintesi della parete batterica abbiamo i glicopeptidi, lafosfoglicina, e beta-lattanici.• la fosfomicina è una sostanza naturale prodotta da alcuni streptomices, e secondo la vecchiaterminologia puo essere considerato un antibiotico.• dal punto di vista strutturale presenta una analogia con l'acido fosfoenolpiruvico con cui competecon l'acido fosfoenol piruvico sull'enzima enolpiruviltrasfersasi: questo enzima è essenziale per lacostruzione dell'acido n-acetilmuramico a partire dall'acido fosfoenolpiruvico el'n-acetilglucossamina.• l'uso di questo farmaco è limitato dalla insorgenza di fenomeni di resistenza al farmaco, quindialla fosfomicina ormai si preferiscono nuovi farmaci che non inducono con facilità resistenza.• i glicopeptidi sono prodotti naturali estratti da alcuni ceppi di actinomicetales, (dalbavancina,telavancina, ortavacina, tecoplanina, vancomicina). questi farmaci si legano al dimero di d-alanina, chesi diparte dall'acido n-acetil muramico, impedendo la transglicosilazione, che è essenziale per laformazione della struttura del peptidoglicano. ne risulta una funzione battericida, perche la sintesidi peptidoglicano è compromessa.• questi farmaci sono attivi solo sui gram positivi, perche date le dimensioni delle molecole questenon possono attraversare la membrana esterna dei gram negativi, ergo hanno uno spetto diattività molto limitato (solo i gram positivi).• i betalattanici, o penicilline, sono prodotti naturali, estratti dal penicilliu, e possono anche esseresintetizzati in laboratorio. il maggior rappresentante è la pennicillina g, che fu il primo farmacoutilizzato in terapia clinica. i betalattanici hanno affinità per il dimero alanina d-alanina,competendo per l'enzima transpeptidasi, deputato alla formazione dei legami crociati delle catenepolipeptidiche: ne viene meno la sintesi del peptidoglicano, e si ha morte del batterio.• oxacillina, pennicillina g, ampicillina, picarcillina, piperacillina.• siccome l'anello beta lattanico che fa parte di questi composti è un gruppo chimico moltoversatile, è recentemente stato introdotto in altri farmaci, come le cefalosporice, (cefotaxime,ceftriaxome), come i carbapenemi e i monobattami, che rispetto alle pennicilline hanno unafarmacocinetica diversa (via di introduzione diversa, una diffusione diversa)____

farmaci chedanneggiano lamembranacitoplasmatica____

• le polimixine sono estratte da germi appartenenti al genere bacillus.• queste sono polipeptidi ciclici, che sono costituiti da amminoacidi basici. il loro bersaglio è unfosfolipide importante della membrana che è la fosfatidiletanolammina (soprattutto colpisce igram negativi, perche i gram positivi hanno un bassissimo contenuto di questo fosfolipide,rendendo quasi inattivi questi farmaci, che alterano la funzione della membrana, agendo comefossero dei detergenti). hanno esito battericida.• la daptomicina, è un lipopeptide ciclico semisintetico, che in presenza di ioni calcio lega lamembrana cellulare danneggiandola irreversibilmente. al contrario delle polimixine questofarmaco ha una azione battericida solo sui gram positivi, perche date le dimensioni della molecola,questa non può attraversare la membrana esterna dei gram negativi.____

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farmaci chedanneggiano ledna topoisomerasi____

• enzimi responsabili della organizzazione spaziale del cromosoma batterico, importanti per la suareplicazione.• i chinoloni, prodotti di sintesi di laboratorio caratterizzati da un anello chinolonico. questi silegano al dna, e alle dna topoisomerasi formando un complesso ternario, come conseguenza si hala frammentazione del cromosoma batterico.• il rappresentante dei chinoloni è l'acido nalidixico, che è attivo solo sui batteri gram negativiresposabili di infezioni di vie urinarie. altri farmaci recentemente introdotti, che hanno miglioricaratteristiche farmacocinetiche e con attività sui micobatteri, i gram positivi, e batteriintracellulari la levofluoxacin, la ciprofloxacina, gatifloxacina e maxifloxacina.• negli anni 90 c'è stato il boom di questi farmaci per l'infezione di clamidia tracomatis: hannoavuto molti insuccessi di laboratorio. le tetracicline o i macroliti sono i farmaci piu indicati perqueste infezioni.• la novobiocina, è un prodotto naturale estratto da alcuni ceppi di streptomices. la novobiocinaagisce sulla sub. b della dna topoisomerasi. quindi un punto diverso da quello riconosciuto daichinoloni.• questo farmaco blocca attivita atp asica, necessaria alla dna topoisomerasi, con effettobatteriostatico.____

farmaci chebloccano la rnapolimerasibatterica____

• gli unici farmaci che agiscono questo enzima sono le ansamicine, il cui rappresentatefondamentale è la rifampicina.• questa è un derivato semisintetico della rifamicina, estratta da ceppi di nocardia. la rifampicina hauno spettro di attivita molto ampio (gram pos. gram neg e soprattutto micobatteri).• nei casi di tbc la rifampicina è sicuramente utilizzata con altri farmaci.____

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farmaci chebloccano la sintesiproteica____

• le dimensioni, la struttura del ribosoma batterico sono diverse da quelli delle cellule eucariotiche,e quindi possono agire con selettività.• gli amminoglicosidi sono dei farmaci che sicuramente hanno come bersaglio la sus 30S. sonoformato da amminoazuccheri, che hanno un legame glucosidico che li lega ad un anello dettoanello aminociclitolo. questi impediscono la formazione della catena peptidica per inserimento dierrori in questa catena, con formazione di proteine aberranti, e conseguente effetto battericida.• gli aminoglicosidi agiscono su gram positivi e negativi; e alcuni di essi, tra cui la amicacina, lacanamicina, la streptomicina, e la gentomicina vengono utilizzate per la cura di infezioni damicobatteri. ma la loro ototossicità (tossica per i nervi acustici) e nefrotossicità rende questi farmacinon di prima scelta.• gli oxazolididoni, che sono prodotti di sintesi di laboratorio, il cui bersaglio è la sub. 50S. questolegame tra farmaco e subunità impedisce la formazione del complesso di inizio 70S, per cui si hauna azione batteriostatica. il LINEZOLID, il principale esponentendi questa classe di farmaci,vieneadoperato per stafilococchi pennicillino resistenti e enterococchi vancomicino resistenti (grampositivi multiresistenti).• le tetracicline, che possono essere sia sintetiche che naturali, prodotte da alcuni streptomices,sono chiamate tetracicline perche hanno una struttura tetraciclica, che si lega alla sub 50Simpedendo l'accesso dell'amminoacil-tRNA, impedendone l'accesso al sito a del ribosoma,bloccando la sintesi proteica, con effetto batteriostatico. agiscono sui gram positivi, e anche suibatteri intracellulari. lunico svantaggio di questi farmaci è rappresentato dalla insorgenza difenomeni di resistenza, per cui devono essere sostituiti da altri farmaci.• il cloramsefenicolo, può essere naturale (da alcuni streptomices venezuelae) o sintetico. ancheluyi ha come bersaglio la sub 50S, e si lega in corrispondenza del sito peptidil transferasico, coneffetto batterio statico. agisce su gram positivi, negativi e intracellulari.• il cloramfenicolo veniva adoperato nel tifo affominale, ma è un famaco molto tossico (afasiamidollare), che deve essere usato con molta parsimonia.• i macrolidi sono ricavati da alcuni streptomices, e sono caratterizzati da una strutturamolecolare con un anello lattonico di 14, 15, 16 atomi di carbonio. si legano alla sub 50s impedendola transpeptidizzazione e la traslocazione della catena peptidica dal sito a al sito b del ribosoma.l'effetto finale è batteriostatico. i macrolidi sono molto adoperati sui gram positivi (clamidia, che èintracellulare). l'eritromicina è il rappresentante dei macroliti.• altri farmaci utilizzati sono la claritromicina e la azitromicina, che si distinguono dalla primaperche hanno una farmaco cinetica sicuramente migliore e un buono spettro di attività. per lafacilità di somministrazione (orale) si può usare molto in pediatria, infatti si può dare laeritromicina invece della pennicillina.• le lincosamidi, che comprendono la clindamicina, che è underivato sintetico della lincomicina(estratta da streptomices lincolnensis), agiscono sulla 50s inibendo la transpeptidizzazione e latraslocazione con conseguente effetto batteriostatico.• le strepogramine, molecole naturali estratte da streptomices, dal punto di vista strutturale sonoformate da due tipi di molecole: di gruppo A e di gruppo B che si legano alla sub.50S in due sitidiversi, determinando un effetto battericida. analogamente ai macrolidi, hanno un attivitàesclusiva sui gram positivi (non intracellulari).• alle streptogramine appartengono il dalfopristin e il quinopristin, molecole con P.M. elevato,quindi costo elevato, con somministrazione parenterale, non sono preferite rispetto ai macrolidi.questi farmaci sono utilizzati esclusivamente per i batteri gram positivi multiresistenti.• la mupirocina, che viene utilizzata per la cura degli stafilococchi e streptococchi per via locale, eper modificare lo stato di portatore nasale di stafilococcus auerus (asintomatici fonte d'infezioneper altri soggetti, serve per eliminare lo stafilococco da un portatore sano). questo farmaco ha unaanalogia strutturale con l'isoleucina, e compete con l'enzima isoleucil sintetasi perl'incorporazione della isoleucina nella caneta peptidica nascente. ne consegue un effettobatteriostatico.• l'acido fusidico, agisce sui gram positivi (stafilococci e streptococchi), e viene ustato per vialocale e generale. ha una struttura steroidea.____

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farmaci chebloccano la sintesidi acidi folici____

• i sulfamidici e il trimetoprim, hanno entrambi effetto batteriostatico. usati parallelamentahanno azione battericida; in associazione, questi due farmaci, evitano l'insorgenza di fenomeni diresistenza. l'associazione di farmaci in terapia evitiamo l'insorgere di resistenza.• sulfamidici sono stati i primi batteriostatici usati. questi derivano dallaparamminobenzensulfurilammide, simile all'acido paramminobenzoico precursore dell'acidofolico. quest'ultimo è un importante donatore di unità monocarboniose, essenziale per la sintesi diacidi nucleici purinici.• quindi questi farmaci bloccano sia la sintesi dei folati che degli acidi nucleici.• i sulfamidici competono quindi per il sito attivo della diidropteroato sintetasi, che introdurrebe ilPABA nell'acido diidropteroico.• il trimetoprim è una diamminopirimidina, inibitore competitivo di un precursore dell'acido folicoche agisce su enzima detto diidrofolato sintetasi, che è implicato nella sintesi degi acidi folici.____

farmaci ad azioneintrabatterica____

• il metronidazolo, utile ai dentisti, è unfarmaco utilizzato dei batteri anaerobi obbligati(popolazione batterica cavo orale= batteri anaerobi per la maggrio parte).• questi farmaci non sono attivi, ma iniziano ad essere attivi quando penetrano nella cellulabatterica.• il metronidazolo ha un gruppo NO, che quando enetra nel batterio, viene idrolizzato da unanitroreduttasi, che forma composti tossici che inducono la morte dei batteri.• l'isoniazide (idrazide dell'acido isonicotinico) è un farmaco utilizzato e attivato dai micobatteri,da una catalasi perossidasi; per cui in ultima analisi si formano gruppi chimici tossici per imicobatteri, e si ha la loro morte.____

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Microbiologia - Miceti PROF MILICIMarch 28, 2012

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Microbiologia - Miceti PROF MILICIMarch 28, 2012

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generalità____

• struttura eucariotica, è quindi una cellula superiore. presenta un nucleo e sistemi vescicolaripresenti in una normale cellula superiore. hanno anzi una peculiarità rispetto ad una cellulasuperiore.• i miceti sono molto diffusi nell'ambiente esterno possono essere unicellulari o pluricellulari.• sono immobili, si riproducono per mezzo di spore, che hanno un significato diverso dalla sporabatterica: la spora batterica ha un significato di resistenza, le spore fungine hanno significato ditipo sessuale, infatti possono essere agamiche o sessuali.• i saprofiti sono delle specie fungine ambientali; altre specie possono essere patogene sia perl'uomo che per gli animali e i vegetali.• la micologia medica è la branca della microbiologia che si occupa dei miceti patogeni• i miceti causano i cosiddetti avvelenamenti che sono dovuti a ingesione di miceti macroscopici,micotossicosi dovute all'ingestione di sostanze tossiche elaborate da alcune specie fungine(Aspergillus flavus), forme allergiche, che sono secondarie ad una precedente esposizione adantigeni fungini (aspergillosi polmonare allergica), e le micosi che sono dovute alla penetrazione,colonizzazione e invasione dei tessuti viventi.• le micosi (malattie da funghi) si dividono in micosi superficiali, micosi cutanee, micosi delsottocutaneo, micosi sistemiche.____

cellula fungina____

• Nucleo circondato da una membrana molto porosa.• il numero di cromosom è difficile da determinare, ed è studiato solo nella candida albicans enell'aspergillus fumigadus (un lievito e una muffa) e sono 8.• questi 8 cromosomi sono stati determinati tramite elettroforesi in campo pulsato. anche conqueste metodiche molto raffinate la loro determinazione risulta difficile per la produzione dibande diverse da parte di cromosomi omologhi.• il RE presenta delle vescicole che sono addossate alla membrana nucleare;• l'apparato del golgi presenta delle lamelle che sono in prossimità di invaginazioni dellamembrana citoplasmatica• anche i mitocondri sono diversi da quelli delle cellule superiori, in quanto possono avere formaallungata o sferica, presentano DNA, e i vacuoli citoplasmatici posseggono pigmenti e materialenutritivo, soprattutto glicogeno.• ma la struttura peculiare della cellula fungina è la parete, che differisce da quella batterica.____

parete fungina____

• il componente fondamentale è la chitina, un polimero della n-acetilglucosammina, con legamibeta 1,4-glucosidici.• può essere unita a quote variabili di glucani (polimeri di glucosio) mannani (polimeri did-mannosio), lipidi e proteine.• le protenie, grazie a residui di cisteina, e formazione di legami S-S contribuiscono alla solidità diquesta parete.• in alcuni miceti (zigomiceti) avremo anche il chitosano. che è un polipeptide, polimero dellad-glucosammina.• durante la fase di accrescimento la parete subisce varaizioni qualitative e quantitative deicomposti: si può considerare una struttura dinamica.• queste cambia di forma e dimensione, e quindi occorre l'intervento di parecchi enzimi che sonosia idrolitici che biosintentici: abbiamo infatti delle glucanasi, e glucano sintetasi, e chitinasi echitino sintetasi.• la funzione della parete, analogamente a quella batterica, conferisce la morfologia alle cellule,inoltre, grazie alla presenza dei mannani, aderisce alle mucose e ai tessuti dell'ospite (è quindiresponsabile de''adesività).• ha delle caratteristiche antigeniche sempre grazie ai mannani, e inoltre modula la rispostaimmunitaria si a umorale che cellulo-mediata.____

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membrana fungina____

• la membrana fungina si differenzia da quella degli eucarioti superiori per la mancanza dicoleresterolo;• in sostituzione abbiamo l'ergosterolo: struttura tristratificata che regola gli cambi metabolici tracitoplasma e ambiente extracellulare.• in oltre contiene enzimi importanti per la biosintesi della parete fungina.• membrana, che è molto spessa, dall'esterno verso l'interno troviamo:• strato fibrillare• mannoproteine• i glucani• uno strato di glucanochitina• uno strato di mannoproteine di composizione diversa da quello precedente.____

strutturafacoltatova____

• l'unica struttura facoltativa dei miceti è la capsula• la capsula quali miceti la posseggono?• in alcuni miceti, oltre alla parete sempre presente nei funghi, abbiamo una struttura accessoria dinatura polisaccaridica i cui componenti fondamentali sono i galattomannani e un altropolisaccaride detto glucuronoxilomannano.• l'unica specie fungina che possiede la capsula è il Cryptococcus neoformans. la capsula si coloracon colorazione negativa con nero di china.____

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Corpo cellulare____

• il corpo di qualsiasi micete, unicellulare o pluricellulare prende il nome di tallo.• del tallo funginoesistono diverse varietà morfologiche utili per l'identificazione della specie.• i miceti hanno unamorfologia molto varia. il corpo tallofungino è costituito da elementi tubularichiamati IFE. le ife hanno diametro sempre uguale o superiore ad un micron.• questo serve a distinguerli dalle microife di alcuni batteri il cui diametro è sempre minore di unmicron.• le ife possono avere una cavità unica, e vengono dette IFE CENOCITICHE. Alcune IFE ossonopossederepiù cavità, dette setti, e vengono chiamate IFE SETTATE. anche nelle ife settate, il liberoscorrimento di sostanze, quali il citoplasma o acidi nucleici, da una cellula all'altra avviene graziead un poro che si trova nella parte centrale di ogni setto.• le ife settate possono essere mononucleate o plurinucleate.• le ife crescono in senso apicale, e man mano che crescono si intrecciano tra loro e costituiscono ilcosiddetto micelio. il micelio è un insieme di ife intrecciate tra loro.• in ogni colonia fungina, sia in ambiene naturale che in coltura distinguiamo due tipi di micelio:• micelio aereo: a contatto con l'aria e deputato alla riproduzione della specie fungina perhcècontiene spore sia gamiche che sessuali• micelio vegetativo immerso: a contatto con il substrato, ha una funzione trofica, cioè serve adassumere le sostanze nutrive.• i miceti che presentano IFE VERE ed un MICELIO VERO vengono detti miceti filamentosi, o muffe:ad esempio l'asperggilus, il penicillus, i dermatofiti (responsabili di malattie cutanee).• le muffe del pane, dei formaggi appartengono a questo gruppo perchè sono caratterizzate da unmicelio vero e ife vere.• un secondo gruppo di miceti è rappresentato dai lieviti, o miceti lievitiformi, che presentanocorpo unicellulare. ogni cellula ha forma ovale o rotondeggiante.• le cellule dei lieviti sono chiamate blastospore o blastoconidi perchè si riproducono pergemmazione.• quando le blastospore gemmano, formano delle lunghe catene che prendono il nome dipseudoife, che si differenziano dalle ife vere, perchè ogni cellula che costituisce la pseudoifa, hauna sua autonomia e non comunica con la cellula contigua.• le pseudoife presentano dei restringimenti tra una blastospora e l'altra.• questa scarsa connessione tra le pseudoife è causa della rottura di queste, dando luogo allesingole blastospore che le costituivano.• molto spesso l'operatore al M.O. ha difficoltà nella distinzione delle ife vere dalle pseudoife.• però possono essere distinte grazie al fatto che solo le pseudoife presentano restringimenti tra leblastospore; che nelle pseudoife nei punti di giunzione si formano dei grappoli di blastospore; ementre le ife vere hanno delle cellule terminali che sono più grandi delle precedenti, nellepseudoife le cellule terminali sono uguali o più piccole rispetto le altre.• le pseudoife non si formano mai nelle muffe. i lieviti non sviluppano mai un micelio aereo perchèsviluppano pseudoife, che si sfaldano in blastospore, non riuscendo a crescere.• esempio di miceti lievitiformi: Candida (pur essendo un lievito, soltanto nella Candida albicanspossiamo avere le ife vere. vive nel nostro organismo, si trova nel cavo orofaringeo, nelle mucosevaginali e gastrointestinali.esso è detto opportunista perchè diventa patogeno quando si èsottoposti a terapia cortisteroidea, nei portatori di protesi dentarie, lunga somministrazione diantibiotici, gli emodializzati, i portatori di cateteri); Malassetia furfur (micete che da quelle lesioniche sono localizzate al livello di decolleté e si vedono soprattutto in estate. PTIRIASIS VERSICOLOR.vive da commensale nella cute. analogamente alla candida, questo micete da commensale sipresenta come blastospore a grappolo d'uva. quando si presenta patogenico avremo lacontemporaena presenza di blastospore e pseudoife. la compresenza di questi due fattori èsufficiente per diagnosticare la virulenza di questo micete. è indotto virulento da diversi fattoricome la gravidanza, l'eccessiva sudorazione, non è contagiosa).• esempio: in seguito a vaginite si fa tampone vaginale e dopo osservazione si vedono blastospore.ci si deve preoccupare? no, perchè essendo un commensale, le spore devono si trovanonormalmente in basse quantità. bisogna notare se ci si presentano pseudoife o ife vere, indice divirulenza per la candida. quindi bisogna coltivare il materiale e vedere se la carica di candida èelevata. altrimenti, se vi sono poche colonie è normale: la candida è un commensale del nostroorganismo. la candida diventa virulenta perchè vi sono dei fattori che permettono il passaggiodalla fase di commensalismo alla fase di parassitismo.____

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miceti dimorfi____

• costituiscono un altro gruppo di miceti, che sono caratterizzati da una duplice morfologia:lievitiforme e filamentosa o in relazione alle condizioni ambientali, o meglio in rapporto all'azionepatogena che essi svolgono.• un esempio di micete dimorfo ci è Histoplasma capsulatum. Non ha una capsula, ma perchè il primoricercatore che l'ha isolato, per artefati di colorazione che simulavano una capsula, lo ha cihamatocosì.• questo fungo, nell'ambiente esterno, da saprofita, si presenta come una muffa, ed è caratterizzatoda ife settate, da micronidi (gli elementi infettanti), e macroconidi (dette anche aleurie) chehanno una forma rotondeggiante, una parete molto spessa, e delle protrusioni radiali.• in vivo, quando il micete da malattia (malattie molto gravi, letali) si presenta sotto forma dilievito.• un'altro esempio di dimorfismo è dato dal Coccidioides Immitis questo micete, in ambiente esternosi presenta sotto forma di ife settate, e artroconidi (o artrospore) che sono gli elementi infettanti.• in vivo, si presenta sottoforma di lievito, e più precisamente da delle sferule di formarotondeggiante, che sono dei lieviti.• N.B. la candida, ma massetia sono dei lieviti, ma molto spesso li definiamo ERRONEAMENTE dimorfiperchè da commensali diventano patogenici. il dimorfismo per questi due microorganismi riguardasolamente la natura patogenica.____

metabolismo deimiceti____

• i miceti sono eterotrofi, e per costruire le loro macromolecole devono degradare sostanzeorganiche.• sono aerobi o anaerobi facoltativi, non esistono in natura miceti anaerobi obbligati, per cuipossono sia respirare che fermentare.• come fonte di carbonio usano i composti organici, possono assimilare o fermentare molticomposti. queste prove di assimilazione e fermentazione vengono utilizzate per identificare lespecie funghine in laboratorio.• la Co2 viene solo fissata, e non utilizzata come fonte di carbonio.• come fonte di azoto usano nitrati o ammoniaca• come fonte di fosforo utilizzano fosfati, e per lo zolfo utilizzano solfati.• gli studi sul metabolismo dei miceti non sono ancora completi, ma sappiamo che le sostanzeliposolubili penetrano nella cellula fungina per diffusione passiva. le sostanze idrosolubilipenetrano attraverso pori che si trovano sulla membrana e sono trasportati da carrier proteici,mentre gli amminoacidi e gli zuccheri penetrano per trasporto attivo, per cui c'è dispendio dienergia da parte della cellula.• il trasporto degli amminoacidi è complesso, ed è finemente regolato dagli ioni ammonio degliamminoacidi stessi. in particolare controllano gli enzimi metabolici, e molto spesso reprimono isistemi di controllo.• per quanto riguarda i miceti dimorfi si è visto che l'eterotrofia è maggiore nella fase diparassitismo; e durante il trasporto di amminoacidi si evidenzia ancora di più il loro cambiamentomorfologico (da muffa a lievito o vicecersa).• i miceti si riproducono per mezzo di spore, sono corpuscoli che originano dal tallo, e sono ingrado di riprodurre la specie fungina purchè siano presenti adeguate situazioni nutrizionali edambientali.• i due tipi di riproduzione, sessuale ed agamica, si alternano in ogni specie fungina con ritmo efrequenza diversi a seconda della specie.• avviene nei funghi imperfetti (perchè usano spore dette spore imperfette).• le spore agamiche, o imperfette, non differiscono morfologicamente dalle altre cellule del corpofungino.• a seconda che siano prodotte da ife specializzate del corpo fungino, chiamate conidiofori, oda ife vegetative comuni del corpo fungino: prendono il nome rispettivamente di conidi etallospore.____

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riproduzioneagamica medianteconidi____

• i conidi si formano per gemmazione dal conidioforo, il conidio si forma sempre all'apice delconidioforo.• il conidio può essere singolo, o può essere raggruppato lassamente o compattamente. quandosono compatti prendono il nome di effluorescenze, mentre quando sono lassi prendono il nomedi capitoli.• molto spesso possono essere raggruppati a formare delle catenelle, il cui elemento più giovane èa contatto con il conidioforo, dato che si forma sempre per gemmazione.• in altre specie il primo deriva per gemmazione dal conidioforo, e i successiviche si formano,nascono sempre dai precedenti, per cui il più giovane è quello distale.• in altre specie fungine i conidi si formano con madiltà diversa: si differenziano dentro cellule digrosse dimensioni;• nel primo caso si differenziano in cellule chiamte fialidi (perchè hanno forma di fiala), il fialidepuò essere singolo o raggruppato insieme ad altri formando figure molto eleganti, complesse adesempio il genere penicillium; mentre se i fialidi si raggruppano in maniera compatta hannoconformazione tipica il genere aspergillum.• quando queste fialospore giungono a maturazione si riversano all'esterno, perchè si liberanodalla porzione apicale del fialide. l'aspergillus è un micete opportunista: da delle patologie quandole difese immuitarie sono compromesse (aspergillosi polmonare invasiva, aspergillosi polmonareallergica, aspergilloma). prima questi miceti erano considerari dei semplici contaminanti, ma oggihanno assunto un ruolo fondamentale in alcune patologie come le micosi delle unghia.• gli zigomiceti sono specie fungine che danno affezioni rinocerebrali molto spesso mortali lezigomicosi, causate dagli zigomiceti, difficili da diagnosticare.negli zigomiceti le spore, o conidi, sifidderenziano all'interno di una grossa cellula di forma rotondeggiante di nome sporangio, e lespore che vi crescono vengono dette sporangiospore.• lo sporangio si trova all'estremità di lunghe ife cenocitiche non settate [quando vedo ife cenocitichecon formazione rotondeggiante capiscono che si tratta di spore di zigomiceti, e sono molto pericolose]• quando le sporangiospore diventano mature si riversano all'esterno grazie alla lisi della paretedello sporangio.____

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riproduzioneagamica mediantetallospore____

• a seconda della modalità di formazione le tallospore sono divise in:• blastospore, derivano per gemmazione da un altra blastospora (si parla quindi di lieviti), oeccezionalmente da una pseudoifa, o ancora meno frequentemente da una cellula terminale di unifa vera.la gemmazione delle blastospore avviene la migrazione del nucleo dalla cellula madre allacellula figlia, ingrossamento della gemma, fino al raggiungimento di dimensioni analoghe a quelledella cellula madre, e in fine distacco della gemma per rottura della giunzione.• artrospore sono spore di forma rettangolare definite da alcuni autori "spore a barella", derivantida frammentazione di ife settate, o per dissoluzione di cellule intercalari prive di citoplasma.questa seconda modalità è tipica del Coccidioides Imitis. Le endospore rappresentano il mezzo diriproduzione del C.Immitis. Questo presenta infatti riproduzione mediante endospore eartospore.• endospore: questo micete si forma sotto forma di lievito, e darà delle cellule di piccoledimensioni chiamate sferule immature, all'interno delle quali le endospore si formano per unprocesso di divisione nucleare, addensamento del citoplasma, neosintesi della parete etrasformazione in cellule di maggiori dimensioni chiamate sferule mature. anche in questo caso,quando le endospore sono mature si liberano per lisi della membrana, andando a contaminare altritessuti.• aleurie sono spore agamiche, facilmente confondibili con i conidi, ma adifferenza dei conidi chesi formano dai conidiofori per gemmazione, le aleurie si formano per rigondfiamento otrasformazione di cellule terminali del corpo fungino; di conseguenza non vengono eliminatifacilmente, ma si staccano soltanto in seguito alla rottura dell'ifa portante. dal punto di vistadiagnostico sono molto importanti le auleurie unicellulari, tipiche dell'Histoplasma capsulatum,e aleurie pluricellulari, tipiche dei dermatofiti• clamidospore hanno la funzione delle spore batteriche, si formano quando le condizioniambientali diventano sfavorevoli alla sopravvivenza del micete: mancanza di sostanze nutritive,alterazione di ph, temperatura ecc. hanno forma rotondeggiante, parete molto spessa e si formanoin posizione apicale o intercalare di ife o pseudoife. quindi possiamo reperirle sia nei micetifilamentosi che lievitiformi. queste strutture hanno anche esse un valore diagnostico, perchèquando le troviamo in un lievito pensiamo subito alla Candida albicans o dubliensis, se le troviamo inmiceti filamentosi pensiamo ai dermatofiti dal punto di vista metabolico le clamidospore sonomolto lente, venivano definite spore dormienti. come facciamo a indurre la produzione diclamidospore in vistro? coltiviamo il micete in un terreno povero all'amido di riso o farina di mais,e grazie ad un vetrino coprioggetto, creiamo una parziale anaerobiosi. nel giro di 7-8 giornipossiamo trovare all'esame microscopico la presenza di clamidiospore. se troviamo questestrutture possiamo pensare sia alla candida albicans che dubliensis. come faccio a capire qualecandida è a produrre queste spore? possiamo capirlo attraverso saggi biochimici di fermentazione.____

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riproduzionesessuata____

• questo tipo di riproduzione ci aiuta nella tassonomia. infatti quelli che non hanno riproduzionesessuale sono detti imperfetti.• la spora sessuale deriva da fusione di due gameti, o da organuli del tallo fungino, che producono igameti e che vengono detti gametangi.• sia i gameti che i gametangi possono essere uguali per forma e dimensione e li chiamo quindiomogameti o omogametangi. possono essere diversi per forma e dimensione e verranno quindichiamati eterogameti po eterogametangi.• in ogni caso la spora si forma in 3 fasi:• plasmogamia: fusione di gameti o gametangi di segno opposto. in genere il gamete maschileviene indicato con il segno + e quello femminile con il segno -.• cariogamia: dalla spasmogamia origina lo zigote, l'unica cellula dipoide del micete, perchè tutti imiceti hanno un corpo aploide.• meiosi riduttiva: avviene solo dopo la formazione dello zigote.• abbiamo 3 forme di spore sessuali che caratterizzano 3 classi: zigospore (degli zigomiceti, cheusano anche riproduzione agamica, quindi sono miceti perfetti); le ascospore, che appartengonoagli ascomiceti, e le basidiospore caratteristiche dei basidiomiceti.• le zigospore si formano dall'unione del gametangio maschil,detto anteridio, e del gametangiofemminile, detto ascogonio. successivamente si ha cariogamia e meiosi riduttiva. per cui avremouna spora scura e bernoccoluta. dopo si formerà uno sporangio, perchè negli zigomiceti abbiamosia la riproduzione agamica che sessuata.• le ascospore, caratteristiche degli ascomiceti (tutti i dermatofiti e alcune specie di aspergillus.quindi anche questi possono usufruire di riproduzione sia sessuata agamica che sessuata). ilgametangio maschile si chiama anteridio, e ascogonio quello femminile. nella plasmogamia si hal'unione dei due gametangi, lisi della parete divisoria e trasferimento dei nuclei dall'anteridioall'ascogonio. dall'ascogonio fecondato si formano delle ife ascogene settate binucleate. questa èla fase di dicarion. la cariogamia, con la successiva meiosi riduttiva avvengono nella penultimacellula delle ife ascogene settate, la quale si trasformetà in un asco contenente 4 ascospore mature.se avverrà una mitosi il loro numero sarà portato a 8.• le basidospore sono spore che si formano per l'unione o plasmogamia di due micelimononucleati che fungono da gameti. quando due miceli mononucleati vengono a contatto tra diessi avviene uno scambio di nuclei, per cui si formerà un micelio secondario binucleato (fase dibicarion). la cariogamia e la successiva mitosi riduttiva avverranno nell'ultima cellula del miceliosecondario binucleato. in essa, che aumenterà molto di volume, appariranno protuberanzeall'interno delle quali migrano i nuclei che provengono dalla meiosi riduttiva. alla fine avremo unbasidio contenente 4 basidiospore mature. se ci sarà nua mitosi avremo un basidio con 8basidiospore. il Criptococcus neoformans è un basidiomicete, l'unico dei basidio miceti patologici perl'uomo.____

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Microbiologia - Azione patogenica dei miceti PROF MILICIApril 17, 2012

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Microbiologia - Azione patogenica dei miceti PROF MILICIApril 17, 2012

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Meccanismipatogenici dimiceti____

• i miceti per dare patologie hano diversi meccanismi di patogenicità: adesività, produzione ditossine, produzione di enzimi, dimorfismo fungino, composizione e struttura della parete fungina.____

adesività____

• per i miceti per i miceti filamentosi patogenicità risiede nella loro capacità di penetrare neitessuti grazie alla azione meccanica di spinta delle ife in accrescimento.• la loro patogenicità risiede nella loro capacità di elaborare degli enzimi (dermatofiti cheratinasi,aspergillus elastasi) nella loro capacità di adattarsi alle condizioni avverse dell'organismo ospitecome temperatura e pH, e nella loro capacità di modificarsi morfologicamente e antigenicamente,e quindi di eludere le risposte immunitarie.• l'adesività è il prerequisito fondamentale dei miceti per l'invasività dei tessuti per lacolonizzazione e l'invsione dei tessuti.• sin dalla nascia cute e mucose sono colonizzate da candida, soprattutto la mucosa dell'alberorespiratorio, la mucosa vaginale e gastrointestinale.• l'adesività può avvenire secondo diversi meccanismi, che possono essere aspecifici, come peresempio le forze elettrostatiche di superficie che mediano l'adesività anche a supporti interti,come protesi dentarie, cateteri, valvole cardiache. può anche essere specifica, cioè mediata darecettori presenti nella cellula ospite, rappresentati dai glicosfingolipidi, e adesine presentinella cellula fungina presenti a livello di parete, rappresentate dalle mannoproteine.• ancora una volta l'adesività può essere diretta tra la cellula fungina e la cellula ospite, omediata da un ligando bivalente che funge da ponte tra la cellula fungina e la cellula ospite. questoligando bivalente può essere rappresentato da un altro organismo come E.coli, le cui fimbrie riconosconostrutture simili al mannostio presenti sia sulla cellula fungina che sulla cellula ospite; anche la fibronectina,la laminina e il collagene e altre proteine possono fungere da mediatori. anche il fibrinogeno e componentiplasmatiche possono fungere da ponte.• è stato visto che candida albicans, tra tutte le specie di candida, ha la possibiltà di aderire alle celluleepiteliali di mucosa orale, un fattore di virulenza in piu rispetto alle altre candida.• alcuni conidi di aspergillus fumigadus posseggono recettori per il fibrinogeno, fibronectina per cui risultanoessere molto adesivi.____

dimorfismo____

• oltre all'adesività i miceti hanno il dimorfismo, che i batteri non hanno.• i miceti filamentosi possono sfuggire alla fagocitosi per le loro dimensioni. i lievitiformipossono riprodursi all'interno di polimorfonucleati e macrofagi.• nel caso di candida vi è un passaggio dalla forma di lievito nella situazione di commensale allaforma filamentosa nella situazione di parassitismo. in questo passaggio tra la fase di lievi alla fasedi muffa si forma una struttura molto importante: il tubulo germinativo.• la produzione di tubuli germinativi è un arma importante per la candida, perchè il tubulo cambiagli antigeni di superficie, e quindi vengono eluse le risposte immunitarie che via via si vanno formando.• inoltre si ha la presentazione di nuove molecole che rendono piu adesivi i tubuli alle celluledell'ospite; cambia lo strato mannoproteico che aumentano anche esse l'adesività.• in coccidioides immitis sono state evidenziate proteine citoplasmatiche leganti facilmenteproteine dell'ospite e anche alle IgA secretorie, questo è anche un fattore di virulenza.• alcuni ormoni, ad esempio il beta-17-extradiolo favorisce in coccidioides immitis favoriscono lamaturazione delle endospore e la liberazione di esse attraverso la parete delle sferule del micete.____

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tossine____

• nel caso di c.albicans le esotossine vengono distine in tossine di basso peso molecolare e altopeso molecolare (canditossine e gliotossine ad alto peso). queste tossine sono grandi fattori divirulenza perchè deprimono la risposta immunitaria, e si è visto che le esotossine di candidapossono essere neutralizzati da sieri contenenti anticorpi contro le tossine.• per le endotossine non vi sono molte differenze tra endotossine fungine e endotossine di batterigram negativi: necrosi dei tessuti, epatotossicità.• aspergillus flavus e soprattutto i suoi conidi, quando vengono inalati in maniera massiva sonoresponsabili di una serie di affezioni dovute alla produzione da parte di questi miceti di afatossine,che possono contaminare gli alimenti e possono essere responsabili di fenomeniepatocarcinogenetici.• emolisine, gliotossine prodotte da aspergillus flavus e fumigatus possono inibire l'adesione deimacrofagi, la fagocitosi, l'attività citotossica mediata dai linfociti t, possono indurre laframmentazione del dna e l'apoptosi.• a. fumigatus produce inoltre una proteina, una citotossina, chiamata lestrictocina, la quale è statatrovata nel siero e nelle urine di pazienti affetti da aspergillosi polmonare. questa proteina è unbuon immunogeno, che interagisce con IgG(prodotte durante aspergilloma polmorare) e IgE(prodotte nell'aspergillosi polmonare allergica).____

enzimi____

• sono anche importanti gli enzimi prodotti: amilasi, cheratinasi, collagenasi, elastasi, lipasi, fosfatasi,fosfolipasi, proteasi, ureasi, lactasi, ialuronidasi, e aspartilproteinasi.• servono a degradare e digerire le sostanze con le quali si nutrono, e facilitano la diffusione deimiceti nei tessuti.• candida albicans produce proteinasi acide che degradano IgA, che tapezzano le mucose eimpediscono l'adesione alle mucose dell'ospite.• c.albicans e candida parapsilosis producono delle proteinasi acide che sono responsabili di candidosi vulvovaginali, e non solo: questi ceppi sono in grado di riprodurre la malattia anche in animali da esperimento.• mutanti di candida che non producono proteinasi acide sono avirulenti.• particolare importanza ha una famiglia di enzimi: aspartilproteinasi. questa famiglia di enzimipossiede circa dieci geni che codificano per altrettante proteine e si è visto che c'è una relazionetra produzione di enzimi e virulenza dei miceti: infatti i ceppi produttori sono sicuramenteresposabili di candidosi orali, vuvlo-vaginali. e si è visto che i ceppi isolati da pazienti con hiv sonoaltamente produttori di questi enzimi.• si è visto anche a. fumigatus produce proteinasi acide in grado di trasformare la profibrinolisina infibrinolisina con conseguente coagulazione del plasma.• inoltre producono anche delle elastasi e delle collagenasi, che hanno un ruolo importantenella patogenesi dell'aspergillosi polmonare invasiva in quanto il tessuto polmonarepossiede circa il 30% di elastina.• c.immitis possiede delle chitinasi che oltre ad avere un ruolo importante nell'accrescimento delmicete è un ottimo immunogeno, per cui viene utilizzato come antigene nelle reazioni sierologichedi fissazione del complemento per evidenziare anticorpi anti coccidioides immitis.• c. neoformans possiede una fenoloossidasi la quale partendo da composti bifenolici sintetizza lamelanina. in questo micete la melanina è un fattore di virulenza importante, perchè essendopresente sulla superficie cellulare conferisce al micete una resistenza ai raggi uv in vitro, e daipolimorfonucleati in vivo.• la predilezione del neoformans del trofismo del snc è perchè nel snc c'è un substrato della fenoloossidasi.____

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strutture delmicete____

• i mannani della parete hanno un imporate ruolo nella patogenesi; la capsula del c. neoformans.• queste strutture interagiscono con l'ospite, provocando un danno ai suoi tessuto e ostacolandola risposta.• componenti della parete fungina insolubili in alcali sono iln grado se inoculati in animali di dareeffetti patologici. (postulati di Koch)• blastospore di c.albicans di pazienti affetti da sindrome di kawasaki (malattia febbrile acuta coninteressmento dei linfonodi muco-cutanei che porta a morte i bambini soprattutto per aneurismadell'aorta) se isolate e inoculate intraperitonealmente in animali da esperimento sono in grado diriprodurre una malattia simile alla s. di kawasaki. quindi questo dimostra che sono loro iresponsabili di questa sindrome.• i glucuronoxilomannani e i galattomannani sono veri e propri fattori di virulenza in quantoimpediscono adesione e fagocitosi dei macrofagi e inducono lesioni granulomatose.• si è visto il ruolo di un componente della parete fungina dei miceti dimorfi che èl'alfa-1,3-glucano.• questo componente è presente soprattutto nella fase lievitiforme. i polimorfonucleati non hannogli enzimi necessari ad eliminare questo componente;• si è visto che l'H.capsulatum, può essere reso avirulento mediante passaggi colutari in vitro, equindi contiene una quantità di inferiore di composto.• per candida albicans altri fattori di virulenza sono i recettori per il complemento che mascherano i ligandi eimpediscono la fagocitosi. nei ceppi meno virulenti, questi recettori mancano, per cui può avvenire lafagocitosi.• questi recettori aumentano in condizioni di iperglicemia: per questo albicans tende ad aderire amucose di pazienti diabetici.____

meccanismi diinfezione____

• la malattia fungina dell'uomo è incidentale: in un soggetto immuocompetente le difese siaspecifiche che aspecifiche riescono a eliminare facilmente i miceti.• infatti le malattie fungine interessano individui con s.i. depresso.• nel caso di micosi esogene il contatto avviene tramite i conidi che penetrano attraverso tramitecute e annessi cutanei.• nel caso di micosi del sottocutaneo l'infezione avviene tramite ferite provocate da spine o daschegge che innestano il fungo oltre la soluzione di contunuo di cute e mucosa, che sicuramente, seintegre rappresentano un importante barriera difensiva.• per le micosi viscerali o sistemiche il contagio avviene per via aerogena, e la primalocalizzazione è inevitabilmente quella polmonare. la gravità della malattia dipende dal numero dielementi fungini inalati e dallo stato immunitario dell'ospite. molta importanza hanno gli elementicon grandezza inferiore a 2 micron, e possono raggiungere gli alveoli dove, data l'assenza di cigliavibratili manca la difesa aspecifica.• nei pazienti immunodepressi superando queste vie il micete raggiunge le vie linfatiche o sanguignecreando micosi sistemiche o diffuse.• in queste micosi troviamo un certo tropismo del micete: c.neoformans: neurotropismo.• nel caso di miceti commensali la malattia insorge per cause predisponenti: fattori atrogeni,patogeni, fattori predispondenti.• gli eventi che portano da un infezione di una mucosa a una micosi disseminata, nel caso di candidaalbicans, sono i seguenti:• adesione di blastospore alle mucose• produzione di tubuli germinativi• produzione di grandi quantità di acidi (piruvico, lattico, prodotti dei metabolismo dei carboidrati)che irritano la mucosa suscitando risposta infiammatoria.• produzione di lipasi, distruzione delle membrane cellulari dell'ospite• aumento dei microbi acidofili, che competono con la moltiplicazione dei miceti• grazie a questi fattori il micete incontra la lamina propria. superata la lamina propria incontra lasottomucosa.• per l'assenza di difese specifiche o aspecifiche possono entrare nel circolo ematico o linfaticocausanto micosi sistemiche (pericarditi, endocarditi).____

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Microbiologia - Farmaci antimicotici PROF MILICIMay 5, 2012

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Microbiologia - Farmaci antimicotici PROF MILICIMay 5, 2012

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Antibiogramma____

• metodica alla quale ricorre il microbiologo per saggiare in vitro la sensibilità o la resistenza delbatterio isolato a 1 o più antibiotici. Si effettua perché nell’ambito di popolazioni sensibili sipossono selezionare dei mutatnti resistenti. La resistenza è dovuta a diversi fattori.• L’antibiogramma aiuta il clinico ad effettuare una terapia adeguata. Non sempre c’ècorrispondenza tra le prove in vitro e le cinetiche in vivo. Ciò dipende da: farmacocinetica,compliance del paziente, SI. Il “fallimento terapeutico” nel quale si traduce la resistenzaterapeutica, dipende da fattori dipendenti sia dal farmaco che dal paziente.____

Metodidell'antibiogramma____

• Il metodo ROUTINARIO: per diffusione in Agar (o metodo di Kirbij e Bawer).• si isola una specie batterica in coltura pura (da una coltura mista. È ritenuto responsabile dellapatologia) e li riso spendiamo in un terreno liquido. Li insemenziamo in un terreno idoneo delgerme in esame (se il terreno non è idoneo possiamo avere una mancata crescita del batterio e nonsapremo se ciò è dovuto al farmaco o alla carenza dei fattori nutritivi). Successivamente poniamosula coltura, dei dischetti di carta bibula impregnati di una concentrazione nota di un farmaco(possiamo saggiare fino a 7-8 antibiotici).• Mettiamo ad incubare 18-24 °C per permetter la moltiplicazione. Laddove il farmaco è attivo sulgerme, attorno al dischetto si formerà un ALONE DI INIBIZIONE. Questo ci conferma che il farmaco èattivo e il germe è sensibile. Se il germe è resistente, esso continuerà a crescere attorno aldischetto. Maggiore l’alone di inibizione, maggiore l’azione del farmaco sul germe. Parleremo,allora, di germe sensibile, a sensibilità intermedia e resistente. La diffusione del farmaco puòavvenire in maniera netta (a partire dal dischetto) o irregolare. Ciò dipende dal farmaco.• il metodo per diffusione ci permette di calcolare la MIC (minima concentrazione inibente, la crescitabatterica). Ricorriamo, in questo caso, all’E-test. Metodo: utilizziamo una singola striscia di cartabibula con dosi decrescenti di un solo farmaco. Laddove si forma l’alone, avremo individuato laMIC.• il metodo standardizzato (per laboratori avanguardistici)si attua tramite diluzione in provetta oin brodo. Serve, anche questo, per determinare la MIC. Il farmaco da saggiare (solitamente nuovodi cui non si conoscono le proprietà) viene diluito a concentrazioni sempre decrescenti.• La provetta nella quale si mostra moltiplicazione batterica, è la MIC. C’è ora un micro metodo didiluizione, con una micro piastra con 96 pozzetti in cui posso valutare fino a 6 farmaci (sempre indiluizioni decrescenti).• Il test più commerciale, mostra delle colorazioni nei pozzetti: la MIC si presenta dove è presente ilrosso. SVANTAGGIO: dopo 24 ore i colori variano. Il metodo si chiama CLS M27-A2. Questo è ilmetodo più veloce in caso di micosi. [Per Candida, la MIC del fuconazolo è 4mg].____

FarmaciAntimicotici____

• I farmaci antibatterici agiscono con un meccanismo di citotossicità selettiva, risparmiandol’ospite.• I farmaci fungini, invece, non sono così selettivi in quanto la cellula fungina è molto simile,nelle strutture in essa presenti, alle cellule eucariotiche umane. Tale somiglianza fa sì che gliantimicotici non possano agire con un meccanismo di citotossicità selettiva.• Analogamente a quelli antibatterici, in base al meccanismo di azione i farmaci antimicotici sidividono in farmaci che:

- A. Inibiscono la biosintesi della parete cellulare- B. Inibiscono la sintesi e la funzionalità della membrana citoplasmatica- C. Inibiscono la sintesi di acidi nucleici- D. Alterano il metabolismo cellulare.

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Farmaci cheinibiscono labiosintesi dellaparete fungina____

• ECHINOCANDINE• Le echinocandine (nuovi farmaci) sono esa-peptdi ciclici: Caspofungina, anidulafungina e micaungina.

- MECCANISMO D’AZIONE: inibiscono la beta 1-3 glucano- sintetasi, enzima necessario perl’integrazione del glucosio nei glucani di parete (costituita da chitina e glucani con strutturalineare o ramificata, mannani, lipidi e proteine), con conseguente deplezione dei glucani dellaparete ed instabilità osmotica. Vengono alterate anche alcune attività enzimatiche i cuienzimi si ritrovano nella parete cellulare.

• La caspofungina viene largamente impiegata nella terapia delle infezioni micotiche nei pzimmunodepressi.• Hanno attività fungistatica/fungicida su specie dei generi:

- Candida- Aspergillus

• I Criptococcus neoformans sono resistenti e gli Zigomiceti mostrano una resistenza innata(resistenza non acquisita in seguito all’esposizione al farmaco).

- La caspofungina (prima molecola in commercio. somministrata esclusivamente per viaendovenosa. Viene e metabolizzata dal fegato escreta per via renale. Effetti collaterali: epatiti,febbre, leucopenia, alterazione del metabolismo epatico e lieve emolisi) è la prima molecolaappartenente a questa classe entrata in commercio, insieme con la anidulafungina. [le primedue sono molto attive in vitro]. Abbiamo poi la micofungina.

• La caspofungina deriva per idrolisi della pneumocandina B.____

Farmaci chealterano la sintesae la funzionalitàdella membrana____

• La membrana della cellula fungina è costituita da uno strato fosfolipidico in cui sono inseriteproteine. I lipidi sono costituiti dal 25% di ERGOSTEROLO (non presente nei batteri e nelle cellumane).• I ricercatori hanno pensato di utilizzare l’ergosterolo come bersaglio per farmaci antimicotici cheagiscono a questo livello. Questi farmaci sono, in realtà, tossici perché si legano anche alcolesterolo presente nelle membrane cellulari dell’ospite.____

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Polieni____

• I Polieni sono dei farmaci accomunati dalla stessa struttura chimica caratterizzati dalla presenzadi un anello macrolitico di C con un numero variabile di doppi legami coniugati.• A seconda del numero di questi (doppi legami di catena) dividiamo i polieni in:• 1.Tetraeni• 2.Pentaeni• 3.Esaeni• 4.Eptaeni• Non sono solubili in acqua, hanno lo stesso meccanismo d’azione (inibiscono la sintesi dell’ergosterolo) estesso spettro d’azione (molto ampio). Agiscono sui lieviti, dermatofiti, aspergilli, miceti dimorfi (esclusi glizigomiceti)

- MECCANISMO D'AZIONE: si legano all’ergosterolo di membrana formando dei pori per cuiviene alterata la permeabilità della struttura con perdita di ioni K e molecole a basso pesomolecolare a cui segue la lisi osmotica. Son farmaci FUNGICIDI o FUNGICIDI a seconda deltempo di esposizione e della concentrazione del farmaco. Questi farmaci creano dapprima unlegame debole, reversibile, con l’ergosterolo (effetto fungistatico) per poi dare un effettofungicida. Questo dipende dalla concentrazione del farmaco.

• Fanno parte di questo gruppo:- 1.L’amfotericina B = usato per le micosi sistemiche. Viene somministrato per via endovenosa eper via orale (via che permette uno scarso assorbimento). Viene metabolizzata dal fegato edescreta per via renale e biliare. Effetti collaterali: si presentano molti effetti collaterali, esoprattutto a livello dei tubuli distali e prossimali del rene. Per far fronte a questi effetticollaterali vengono somministrati in formulazioni liposomiali (incapsulata nei liposomi ilfarmaco passa direttamente dalle cell epatiche alle cell fungine. Il nome commerciale èl’AMBISONE). Altri effetti collaterali sono: anemia, tachicardia, cefalea, leucopenia, tromboflebiteasettica, danno renale (il più temuto). L’amfotericina B è un immunostimolante: promuove larisposta cellulo-mediata e il sistema anticorpale, stimolando la produzione di IgG e IgM. Puòlegarsi labilmente anche al colesterolo delle cellule umane: questo spiega la sua tossicità.- 2.Nistatina = viene utilizzata per via orale nelle candidosi del tratto gastro-enterico e per via topicanelle candidosi vaginali (Candida) e cutanee.

• La resistenza a tali farmaci è data da una modificazione nella composizione degli steroli dimembrana.• Possiamo avere:

- 1. Una resistenza primaria- 2. Resistenza secondaria, data da una diminuzione dell’attività in caso di trattamentiprolungati.

____Composti Azolici -Generalità____

• I composti azolici sono farmaci che interrompono la via sintetica dell’ergosterolo.• Si dividono in:

- a) Imidazolici caratterizzati dal punto di vista chimico, da un anello imidazolico, legato adaltri anelli aromatici mediante un legame C-N- b) Triazolici si differenziano dagli imidazolici per la presenza di 3 atomi di azoto nellacatena.

• a)e b) hanno lo stesso effetto e lo stesso spettro d’azione.- MECCANISMO D’AZIONE: poco solubili in acqua e agiscono su un enzima che intervienenella sintesi dell’ergosterolo: lanosterolo 14-α-demetilasi, citocromo p450 dipendente. Lasintesi dell’ergosterolo inizia a partire dall’acetil-CoA si passa alla sintesi dello squalene poi del lanosterolo (squalene epossidasi) – ergosterolo. Affinché si passi dal lanosteroloall’ergosterolo, deve interagire un enzima che priva il lanosterolo di un gruppo metilico:lanosterolo de-metilasi. Una volta che gli azoli si legano all’enzima, non può formarsil’ergosterolo. Gli azoli si legano tramite un atomo di azoto del nucleo azolico al Fe del gruppoeme del citocromo p450. Si ha l’accumulo di alfa-metil-steroli e mancata sintesidell’ergosterolo.

• L’effetto di tali farmaci è fungicida: alterazione della permeabilità.• Non è stata verificata alcuna interazione degli azoli con le cellule umane: questo spiega la scarsatossicità di tale classe di farmaci.____

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CompostiImidazolici____

• Ai composti imidazolici appartengono:- 1.Ketoconazolo viene somministrato per via endovenosa o orale. Ha un buonassorbimento e buona diffusione tissutale (eccetto che nel liquor cefalo-rachidiano) doposomministrazione orale. Ha un’emivita di 8 h. tra gli effetti collaterali il più gravo è l’effettoepatotossico alterazioni epatiche, epatiti irreversibili (svelate dall’aumento delletransaminasi), turbe endocrine (ginecomastia, impotenza, oligospermia, impotenza eirregolarità mestruali), riduzione del tasso plasmatico di testosterone e cortisone. Tali effettisono dovute all’affinità del ketoconazolo per la citocromo p450 delle cell superiori: questoenzima catalizza la sintesi degli enzimi endogeni. La sospensione della terapia porta ad unaregressione anche degli effetti collaterali. Il 10% del farmaco somministrato, viene eliminatoinvariato dal rene (non può essere utilizzato per infezioni delle vie urinarie); inoltre, solo il10% attraversa la barriera ematoencefalica (non può essere utilizzato per le malattie del SNC).- 2.Clotrimazolo l’uso è TOPICO per candidiasi cutanee, forme cutanee provocate dadermatofiti e da Malassetia furfur.- 3.Miconazolo farmaco molto tossico utilizzato non solo per le mucose cutanee, ma ancheper micosi viscerali. Oggi è sostituito da nuovi imidazolici. Viene somministrato per viaendovenosa o orale

• Solo 1 e 3 riescono ad agire sulle micosi invasive.• 3 viene utilizzato per le candidosi cutanee e pitiriasi versicolor.____

CompostiTriazolici____

• Ai composti triazolici appartengono: cambia la farmacocinetica, rispetto agli imidazolici e siriduce la loro affinità per il citocromo p450 (sono poco tossici)

- a) Itraconazolo viene usato per via orale e presenta una buona attività su Criptococcus,Candida, aspergilli, dermatofiti e dimorfi tranne gli zigomiceti. Buon assorbimento doposomministrazione orale, ma bassa concentrazione nei tessuti, compreso il liquor (no terapia dipatologie SNC)- b) Fluconazolo differisce dall’itraconazolo per la sua farmacocinetica. È idrosolubile, bassolegame con le proteine plasmatiche, buona penetrazione nel liquor cefalorachidiano (terapiadelle meningiti ed encefaliti da Criptococcus e Candida). È inattivo su zigomiceti e alcunespecie di Aspergilli. Agisce bene su Candida, dematofiti, dimorfi, e alcuni aspergilli. L’unicosvantaggio è lo spettro limitato.- c) Policonazolo: rispetto al fuconazolo, inattivo sulla Candida Krusei (resistenza intrinseca)e Glabrata, il policlonazolo è attivo su Candida, Aspergilli, Fusarium (miceta opportunistaresistente all’amfotericina B). Anello azolico contiene 3 atomi di azoto

• Spettro e meccanismo d’azione sono uguali per i tre.• Tra i nuovi farmaci triazolici abbiamo:

- a )Voriconazolo si differenzia dal fluconazolo, perché agisce su specie lievitiformi, es.candida (Glabrata e) che mostrano resistenza al fluconazolo (primaria o secondaria). Vienesomministrato per via orale e viene metabolizzato dal fegato ed agisce sul Fusarium. usatoin candidosi esofagea e aspergillosi polmonare. Viene usato nelle micosi sistemiche deipazienti immunodepressi.- b) Posaconazolo presente in commercio- c) Ravuconazolo non presente in commercio.

____DerivatiAllilaminici____

• I derivati allilaminici sono antimicotici di sintesi.• Analogamente agli azoli inibiscono la sintesi dell’ergosterolo mediante l’inibizione dellaSQUALENE- EPOSSIDASI, enzima che catalizza una tappa intermedia di questa via metabolica cheprecede la de metilazione dei metilsteroli. Viene impedito il passaggio da squalene a lanosterolo.Determinano un accumulo di metil-steroli.• Appartiene a questa classe:

- Terbinafina = in vitro mostra elevata affinità tra lieviti, dimorfi, aspergilli, dermatofiti. Invivo, essa è in grado di agire solo sui dermatofiti. Viene utilizzato esclusivamente nella terapiadelle dermatofitosi per via topica e orale sfruttando la sua capacità di accumularsielettivamente nell’epidermide e nel tessuto adiposo, compreso il sottocutaneo. Vieneutilizzato sfruttando le sua capacità selettive.

• Altri composti sono: il tolnaftato, la naftifina, la morolfina (onicomicosi che è un derivato della morfolina).Vengono utilizzate per micosi cutenee e la morolfina viene utilizzata per le onicomicosi (micosidelle unghia).____

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Inibitori dellasinteri degli acidinucleici____

• GRISEOSULVINA = prodotta da Penicillium griseofulvum, è un benzofurano clorato. Venivautilizzato nel caso di patologie sostenute da dermatofiti.• MECCANISMO D'AZIONE= blocca la mitosi cellulare delle giovani ife in accrescimento. La mitosi siblocca in metafase. Dopo somministrazione per via orale viene veicolata dalle proteine plasmatichee si concentra negli strati cornei della cute, incorporandosi nella cheratina in via di formazione.Viene utilizzata nelle dermatofitosi a lungo decorso, generalizzate e viene escreta per via renale edenterica. Tra gli effetti collaterali abbiamo: vomito, diarrea, vertigini che, però, non sono tali daimporre la sospensione della terapia. Viene tutt’oggi utilizzata, sebbene sostituita dallaterminafina, per le onicomicosi.• 5-FLUORO-CITOSINA = è un fluoro derivato della pirimidina, citosina. Il farmaco può avereazione fungi statica o fungicida a seconda della concentrazione. Penetra nella cell per mezzo dellacitosil-permeasi e subisce un processo di deaminazione da parte della citosin-deaminasi,divenendo 5-fluoro-uracile. Un altro enzima che interviene nella trasformazione di questo farmacoè la URIDIN-CHINASI che trasforma il 5-fluoro-uracile in acido 5-fluoro-deossiuridilico che vieneincorporato nell’RNA del micete. Viene, così, bloccata la sintesi proteica. Inibisce anche latimidilato-sintetasi, un enzima chiave per la sintesi del DNA (l’acido fluoroddeossiuridilico). Lecellule fungine che non posseggono la citosin-deaminasi, sono insensibili a questo farmaco!• Spettro d’azione: LIEVITI• Somministrato in associazione sinergica con Amfotericina B per ridurre il rischio di resistenza incorso di trattamento. Viene somministrata per via orale o endovenosa. La sua azione fungi statica ofungicida è data dalla sua concentrazione.• Sebbene possa essere utilizzato anche per micosi del SN. Effetto collaterale: facilita la comparsa difenomeni resistenza. Per tal motivo viene associato all’Amfotericina B.____

Inibitori delmetabolismocellulare____

• Ciclopiroxolamina: inibitore del ricambio energetico; blocca i processi fisiologici di assorbimentoe di trasporto di metaboliti essenziali. Viene usato nella terapia delle dermatofitosi delle candidosicutanee (uso topico).____

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Microbiologia - Virus PROF MILICIMarch 30, 2012

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Microbiologia - Virus PROF MILICIMarch 30, 2012

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caratteristiche____

• sono molto semplici, e sono parassiti intracellulari obbligati. non hanno metabolismo autonomo edevono utilizzare necessariamente i meccanismi biosintetici della cellula ospite.• le loro dimensioni sono intono al nm. per cui non sono osservabili al microscopio ottico, per cuidobbiamo ricorrere al microscopio eletttronico.• i virus possiedono un solo tipo di acido nucleico: dna o rna. mai entrambi.• dna o rna funzionano come depositari dell'informazione genetica, per cui il virus può replicarsinella cellula, può trasferire il suo genoma da una cellula all'altra e può replicare le suemacromolecole, sempre servendosi degli apparati della cellula ospite.• una prima distinzione dei virus si può fare caratterizzando:• virus nudi che hanno l'acido nuclei dna o rna circondato da un involucro proteico che prende ilnome di capside. il capside ha quuindi il compito di proteggre l'acido nucleico. il calside ècostituito da subunità proteiche chiamate capsomeri; acido nucleico + capside = nucleocapside;• possiamo caratterizzare anche i virus che oltre al nucleocapside posseggono un involucropericapsidico detto anche envelope. l'envelope è costituito da un doppio strato fosfolipidico diderivazione della membrana della cellula ospite. il virus maturo fuoriesce dalla membrana dellacellula infetta, e questo envelope conterra proteine di derivazione cellulare e glicoproteine virali.• queste funzionano da antirecettori: questi sono deputati all'ancoraggio della particella virale allamembrana della cellula ospite.• nei virus nudi, senza envelope, la funzione antirecettoriale viene affidata alle proteine delcapside.• i virus possono essere a dna o rna che codifica per proteine funzionali e strutturali. le proteinestrutturali faranno parte della struttura dei virus, mentre quelle funzionali servono per la loroduplicazione.• la scarsa capacità codificante dei virus soprattutto a rna impone che il capside sia formato dapochi tipi di proteine, addirittura, nei virus piu piccoli, il capside sarà costituito da un soo tipo diproteine.• le singole catene polipeptidiche del capside si possono legare secondo legami non covalenti inmodo tale da costituire due simmetrie: cubica o icosaedrica e una simmetria di tipo elicoidale.• nella simmetria di tipo icosaedrico le singole catene proteiche, dette capsomeri, sidistribuiscono tra di loro a costituire un guscio quasi sferico all'interno del quale si troveràl'acido nucleico. nella simmetria di tipo icosaedrico i capsomeri si ritroveranno sulla superficie diun icosaedro (un poliedro regolare costituita da 20 faccie e 12 vertici). i capsomeri dei verticihanno un'aspetto pentagonale e quindi vengono detti pentoni; mentre i capsomeri che si trovanosulla superficie dell'icosaedro hanno un profilo di tipo esagonale e sono chiamati esoni.• nella simmetria di tipo elicoidale le singole unità proteiche chiamate protomeri si dispongonosecondo un asse elicoidale che circonda l'acido nucleico che i trova all'interno assumendo unastruttura di tipo bastoncellare. in questa simmetria, invece, i singoli protomeri ragiscono tra loro econ l'acido nucleico contenuto all'interno, formando strutture rigide, come accade per esempio nelvirus del mosaico del tabacco, oppure strutture con rigidità minore (virus animali, soprattutto nelvirus influenzale, che è elicoidale).• i virus a dna hanno simmetria prevalentemente di tipo icosaedrico, mentre i virus a rna possonoavere sia una simmetria icosaedrica che elicoidale• fanno eccezione i pox virus, ai quali appartiene il virus del vaiolo, che hanno una simmetria moltocomplessa, non ben definita (da alcuni definita a mattone).• i virus possono essere a dna o rna e in entrambi i casi gli acidi nucleici sono depositaridell'informazione genetica, che codificano per proteine strutturali e funzionali alla replicazione.____

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virus RNA____

• possono avere rna bicatenario, anche se normalmente sono monocatenari.• l'rna può essere mono- o pluri-segmentato.• può essere a polarità positiva o negativa• lineare o circolare• i virus a rna rappresentano l'unico esempio in cui l'rna funziona da depositario dell'informazionegenetica.• i virus a rna a polarità positiva possiedono all'estremità 5' delle sequenze nucleotidiche ugualiagli rna messaggeri cellulari, per cui l'rna a polarità positiva funge direttamente da messaggero, esubito tradotto in proteine a livello ribosomiale.• i virus a rna a polarità negativa non possono fungere da messaggeri, e quindi devono codificareper una rna polimerasi rna dipendente adatto a trascrivere la molecola di rna in messaggeri.inquesti tipi di virus questo enzima non è frutto dell'attività trascrizionale del nucleo della cellulaospite, per cui il virus lo porta con se insieme al genoma nel momento in cui viene liberato nellacellula.• la rna polimerasi rna dipendente dei virus a rna a polarità POSITIVA viene sintetizzata nel cicloreplicativo, e farà parte delle proteine funzionali.• questa rna polimerasi rna dipendente non è un enzima fedele, in quanto puo compiere deglierrori. e ciò è responsabile dell'alta frequenza di mutazione e variabilità che caratterizza il virus arna.• i virus a rna a polarità positiva si caratterizzano per il fatto che il genoma si disgrega dalleproteine in maniera tale che possa essere tradotto a livello ribosomiale (in quanto funge damessaggero). ciò NON accade per i virus a rna a polarità negativa, in cui l'rna rimane associato alleproteine del capside durate tutto il ciclo replicativo.____

virus DNA____

• vengono classificati sempre in base alle caratteristiche dell'acido nucleico.• a parte i parvovirus (piccoli virus) che hanno dna mono catenario; e a parte gli epadnavirus (virusepatite b) che hanno un genoma parzialmente bicatenario;• i virus a dna hanno un genoma aploide bicateniaro, che può essere linare o circolare.• è lineare negli adenovirus, herpesvirus, parvovirus e poxvirus (virus vaiolo)• è circolare negli papillomavirus, e nei poliomavirus e anche negli epadnavirus (questi oltread averlo parzialmente bicatenario è circolare)• la complessità genetica dei virus in generale dipende dalla grandezza del dna: più grande è ilgenoma più complessi sono.• i virus con un piccolo genoma, come i parvovirus hanno una complessità genetica paragonabile aquella devi virus a rna. i virus di grandi dimensioni possono codificare anche per cento proteine.• a differenza dei virus a rna che si replicano in sede citoplasmatica, ad eccezione del virusinfluenzale (che pur essendo a rna ha una fase nucleare), i virus a dna usano polimerasi chetrascriptasi della cellula ospite. quindi sia la trascrizione che la replicazione dei virus a dnaavverrà in sede nucleare. fanno eccezione i poxvirus (che pur essendo a dna si replicano nelcitoplasma).• i virus a dna sono caratterizzati da una minore variabilità genetica, in quanto la dna polimerasidella cellula ospite è un enzima fedele, e se vi sono errori la polimerasi correttore di bozze licorregge.____

classificazionesecondo acidonucleico____

• virus a dna monocatenario• virus a dna bicatenario• virus a rna o dna con attività retrotrascrizionale• virus a rna mono segmentato• virus a rna plurisegmentato• virus a rna monocatenario a polarità positiva• virus a rna monocatenario a polarità negativa• viroidi e prioni____

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replicazione virale____

• affinchè un virus si possa moltiplicare in una cellula ospite per dare luogo a nuove particelle viraliè necessario che la cellula sia sensibile e permissiva• una cellula sensibile deve contenere i recettori attraverso cui il virus può legarsi grazie ai suoiantirecettori.• una cellula permissiva deve contenere tutti i meccansimi biosintetici adatti all'espressione delgenoma virale, e alla sua replicazione.• soltanto in questo caso il ciclo virale è definito produttivo: cioè si formeranno paticelle viralimature che fuoiriusciranno dalla cellula infetta.• può accadere che la cellula sia sensibile ma non permissiva, in questo caso il ciclo viene definitoabortivo; si può verificare quando il virus presenta dei difetti nella sua replicazione op quando lacellula non permette al genoma virale la sua completa espressione. alcuni virus, come il parvovirusp19 si replicano esclusivamente in cellule che si trovano in fase s, cioè quando tutti i meccanismicellulari adatti alla sintesi di dna siano presenti ed efficienti.• nel caso in cui il ciclo è restrittivo o abortivo si possono verificare tanti eventi:• persistenza del virus dento la cellula: in questo caso il virus va in latenza, il genoma virale siintegra con la cellula ospite, si può replicare ad ogni ciclo cellulare; o può rimanere nel citoplasmasotto forma di episoma. in questi casi la cellula può andare int rasformazione, evento durante ilquale alcune proteine precoci del virus possono interferire con proteine che regolano laproliferazione cellulare, e si ha quindi una trasformazione della cellula (cancerogenesi).• nel caso in cui la cellula è sensibile e permissiva si avrà un ciclo replicativo completo. le variefasi del ciclo sono:• prima fase: assorbimento• seconda fase: penetrazione• terza fase: scapsidamento• quarta fase: espressione e replicazione del genoma• quinta fase: maturazione• sesta fase: liberazione____

prima fase:ASSORBIMENTO____

• presuppone una compatibilità tra recettori cellulari e antirecettori virali.• i recettori cellulari sono rappresentati proteine (virus hiv usa il recettore cd4; alcuni echovirususano il recettore cd55);• i recettori possono anche essere di natura glicidica. e dato che la maggior parte dei virus usanorecettori glicidici, questi virus hanno un ampio spettro d'ospite (per spettro d'ospite si intende ilnumero di specie animali che risultano sensibili all'infezione da parte di un determinato virus. Es.:virus poliomelite ha uno spettro d'ospite ristretto, perchè infetta uomo e scimmie; il virus dellarabbia ha uno spettro d'ospite molto ampio perhcè infetta molte specie animali).• alcuni virus, oltre ai recettori della cellula ospite utilizzano per l'assorbimento una molecolasecondaria, detta co-recettore. per i virus con envelope gli antirecettori virali appaiono comeproiezioni che si dipartono dalla superficie della particella virale; per i virus nudi, un esempio chepossiamo fare è il poliovirus, gli antirecettori si ritrovano in rientranze che solcano la superficiedel virus. l'interazione recettore-antirecettore si traduce in un legame di tipo sterico; e affinchè laparticella virale venga ancorata stabilmente alal membrana della cellula ospite occore un ambientericco di ioni, che serve a neutralizzare le cariche elettriche presenti sulle superfici complementariin maniera tale da ridurre la repulsione elettrostatica. questo processo non richiede dispendio dienergia ed è indipendente dalla temperatura.• per alcuni virus l'assorbimento rappresenta una fase irreversibile, perchè se all'assorbimentonon segue la penetrazione il virus perde la capacità infettante. ad esempio, nel poliovirus,durante l'assorbimento può venire persa una proteina del capside, per cui l'acido nuleico risultasensibile all'azione delle proteasi e delle ribonucleasi cellulari.• per altri virus, se all'assorbimento non consegue la penetrazione la particella virale conserva lacapacità infettante: un esempio ci è dato dagli orthomixovirus (a cui appartiene il virusdell'influenza) sulla cui superficie vi è una glicoproteina con funzione enzimatica dettaneuroamilidasi, la quale scinde il legame tra virus e cellula ospite. in questo caso il virus che sistacca dalla cellula può andare a infettare altre cellule.• oltre alla modalità solita di assorbimento vi è un metodo mediato da anticorpi: la particella viraleche deve penetrare nella cellula verrà circondata da anticorpi specifici e catturata da recettoricellulari per immunoglobiline: questa infezione prende il nome di infezione anticorpo-mediata,caratteristica del virus HIV e del virus dell'influenza A.____

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seconda fase:PENETRAZIONE____

• la fase di penetrazione avviene in maniera diversa a seconda che si tratti di virus nudi o conenvelope.• nei virus con envelope la penetrazione avviene per fusione della particella virale con lamembrana citoplasmatica. questa fusione avviene grazie alla presenza di proteine fusogene chesi trovano sulla particella virale.• ricordiamo la gp41 del virus dell'HIV e la proteina ha2 del virus dell'influenza a. questaproteina viene attivata dal pH acido degli endosomi, infatti il virus dell'influenza A penetra per endocitosi. ela successiva fusione della membrana avviene con la membrana dell'endosoma.• i virus nudi penetrano per endocitosi.• nei poliovirus abbiamo un fenomeno insolito, nel senso che una proteina del capside deipoliovirus durante la fase di penetrazione provoca la formazione di un poro sulla membrana dellacellula ospite, per cui l'rna verrà introdotto direttamente nel citoplasma: non avremo l'ingressodella particella in toto, ma solo la traslocazione dell'acido nucleico a livello citoplasmatico.____

terza fase:SCAPSIDAMENTO____

• uan volta che il virus è penetrato nella cellula ospite deve liberare l'acido nucleico daicomponenti proteici e dal capside.• per alcuni virus lo scapsidamento avviene automaticamente, in altri avviene ad opera di enzimiproteasi cellulari, per altri ancora avviene ad opra di enzimi lisosomiali che vengono scaricatinel vacuoli fagocitari.• una volta che il genoma si è liberato dai suoi costituenti che lo circonda può rimanere nelcitoplasma o raggiungere il nucleo.• tutti i virus a rna , ad eccezione del virus influenzale, si replicano nel citoplasma, e tutti i virus adna, ad eccezione del poxovirus, si replicano nel nucleo• i virus a dna, e il virus influenzale oltre a attraversare la membrana citoplasmatica devonoattraversare anche la membrana nucleare.• a livelo di questa troviamo il complesso del poro nucleare, costituito da 50 nucleoporine chehanno il compito di trasferire le molecole all'interno o all'esterno del nucleo.• studi recenti hanno dimostrato che attraverso il complesso del poro possono passareparticelle che hanno dimensione intorno a 36nm.• per cui si è visto che i parvovirus, che hanno dimensioni di 8-25 nm e gli epadnavirus,soprattuto il virus dell'epatite b, che hanno dimensioni intorno i 35nm possono attraversare lamembrana del poro senza bisogno di essere disassemblati, cioè privati dei costituenti esterni.____

quarta fase:ESPRESSIONE____

• il genoma virale deve provvedere a ricostruire tutti i componenti per dare luogo a un nuovaprogenie virale, per fare cio deve utilizzare tutti meccanismi biosintetici della cellula ospite.• la fase che piu dipende dalla cellula ospite è la sintesi proteica• i virus devono presentare ai ribosomi gli rna messaggeri in maniera tale essere letti e tradotti alivello poliribosomiale.• la cellula però pone dei limiti: essa forma i suoi rna messaggeri a livello del nucleo e sustampo del dna. i virus che possono raggiungere il nucleo e sono a dna possono raggiungereil nucleo e far sintetizzare messaggeri.• i virus a rna hanno rna che funge esso stesso da messaggero, oppure devono sintetizzare unapolimerasi rna dipendente che svolga questo compito.• esistono diverse strategie per fare cio a seconda che si tratti virus a dna o rna.• i virus a rna rappresentano gli unici esempi in cui l'rna funziona da depositario dell'informazionegenetica, e quindi, dato che la cellula non forma rna su stampo di rna, alcuni virus a rna devonopossedere una polimerasi in grado di operare la trascrizione.____

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replicazione deivirus a RNA____

• nei virus a rna noteremo 5 strategie di replicazione diverse:• nei virus a polarità positiva non hanno bisogno di essere trascritti, ma funzionano subito damessaggeri. nei poliovirus e nei flavivirus (rna a polarità +) il prodotto della trascrizione dellasuccessiva traduzione è una poliproteina che viene scissa da enzimi virali in proteine strutturalie proteine funzionali. le proteine strutturali sono quelle che faranno parte della struttura delvirus, mentre tra le proteine funzionali abbiamo la rna polimerasi rna dipendente la qualetrascrive l'rna genomico formando rna messaggero. quesro rna genomico funge da stampo per lasintesi di una rna a polarità negativa, la quale funzionerà da stampo per la sintesi di una rna apolaritò positivo che farà parte della progenie virale.• nei togavirus (rna +) vi sarà prima la traduzione dell'estremità 5' che codificano per le proteinefunzionali. dopo la replicazione del genoma si formeranno le proteine strutturali che faranno partedell'estremità 3'. questi virus rna+ chiaramente possiedono già una rna polimerasi rna dipendenteche viene sintetizzata tra le proteine funzionali all'inizio del ciclo replicativo, e non hanno bisognodi veicolarla con loro gia pronta.• nei virus a polarità negativa , non avendo rna+ non possono avere messaggeri, quindi hannobisogno della rna polimerasi rna dipendente veicolata dal virus stesso. il prodotto dellatraduzione è rappresentato da proteine funzionali e strutturali. tra le proteine funzionali siformerà la rna polimerasi rna dipendente la quale trascrive l'rna- in rna+ che viene dettofilamento antigenomico. questa molecola, pur essendo a polarità positiva non funge damessaggero, ma fungerà da stampo all'rna negativo che apparterrà alla progenie virale.• i virus a polarità negativa con rna plurisegmentato (orthomixovirus - virus influenza) hannola particolarità di avere un genoma costituito da 7-8 segmenti. ogni segmento verrà trascrittoseparatamenteo. in oltre, all'estremità 5' hanno sequenze nucleotidiche non virali, ma chehanno sottratto agli rna messaggeri cellulari, per tale motivo, pur essendo a rna hanno unafase nucleare.• vi sono virus rna detti ambisenso con polarità sia positiva che negativa. in questo casi ilvirus si comporta come avesse solo rna negativo: forma una molecola antigenomica che fungeràda stampo per il genoma delle nuove particelle virali.• i virus a rna bicatenari sono gli orbivirus, i rotavirus e i reovirus. questi sono caratterizzati dalfatto di un rna bicatenario circondato da un doppio involucro esterno. il virus nel citoplasmaperde l'involucro piu esterno: cio provoca la permeabilizzazione dello strato piu interno conattivazione della rna polimerasi rna dipendente che ha il compito di operare la trascrizionedell'acido nuclei virale. i prodotti della trascrizione sono rna messaggeri che vengono tradotti inproteine strutturali, e possono anche fungere da stampo per la sintesi del genoma, che all'iniziosarà monocatenario, e successivamente, quando sarà assemblaro per la costituzione di nuoveparticelle virali, assumerà struttura bicatenaria.• i retrovirus sono dei virus caratterizzati da due molecole di rna a polarità positiva identiche.gli rna verranno trascritti in rna messaggeri, che fungeranno da stampo per molecole diDNA. questo fenomeno insolito prende il nome di retrotrascrizione, operato dalla DNApolimerasi RNA dipendente (o trascrittasi inversa). la nuova molecola di dna raggiunge ilnucleo, e ad opera di un enzima detto integrasi verrà integrata al genoma cellulare. così puòdare luogo ad una infezione latente o può dare inizio ad un processo di trascrizione cheporterà ad un ciclo produttivo, oppure possono essere espresse alcune proteine virali.____

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replicazione deivirus a DNA____

• i virus a dna sono tutti a dna bicatenario, quasi sempre lineare, con eccezione del parvovirus,che ha un dna moncatenario lineare, gli epadnavirus, con dna parzialmente bicatenario, e lafamiglia papomviridae e papillomaviridae hanno un dna circolare.• i virus a dna normalmente si replicano in cellule che sono infase attiva di replicazione, moltospesso esistono virus che producono proteine che stimolano la cellula a entrare in fase direplicazione. come sempre abbiamo detto i virus a dna si replicano in sede nucleare ad opera dienzimi cellulari: dna polimearsi dna dipendente.• fa eccezione il poxvirus, (ai quali appartiene il virus del vaiolo) che si replica nel citoplasma.• in seguito alla traduzione del genoma negli adenovirus e herpesvirus si formeranno 3 gruppidi composti: proteine precocissime, precoci e tardive• le proteine precocissime e precoci hanno funzione enzimatica e regolatoria• le proteine tardive hanno esclusivamente funzione strutturale• nella famiglia papomaviridae e papillomaviridae si formeranno due classi di proteine:precoci e tardive• i poxvirus compiono il loro ciclo replicativo nel citoplasma ad opera di enzimi cellulari. dopo latrascrizione che avviene ad oipera di enzimi cellulari, si formeranno mrna che verranno tradotti inproteine precoci,e fra queste proteine precoci abbiamo degli enzimi che hanno la funzione direplicare l'acido nucleico. avremo dna e rna polimerasi e fattori di crescita necessari alla sintesi deldna.• una volta sintetizzato il dna, questo verrà in parte assemblato per la costituzione delle nuoveparticelle virali, in parte trascritto in rna messaggeri che codificheranno per proteine strutturali.• i parvovirus sono virus a dna monocatenari, e nell'ambito di questi virus dobbiamo distinguerequelli che possono replicarsi autonomamente da quelli che hanno bisogno di virus hepler (come gliadenovirus).• nel caso di virus autonomi, come ad esempio il parvovirus b19, in un primo tempo il virus cheha una sola catena di dna raggiunge il nucleo, in maniera tale che si possa formare la catenacomplementare ad opera di enzimi nucleari. questa si formerà grazie alla presenza all'estremità delgenoma di catene nucleotidiche ripetute invertite che replicandosi a forcina formano una specie diinnesco necessario alla polimerasi cellulare per la sintesi della catena. a questo punto si formerà unadoppia catena di dna, che successivamente verrà scissa da una proteasi virale in due catenepolinucleotidiche complementari.• gli epadnavirus, a cui appartiene il virus dell'epatite b, hanno dna parzialmente bicatenario conuna interruzine nella catena apolarità positiva. il virus raggiunge il nucleo dove ad opera di enzimicellulari verrà trasformato in una molecola completamenta bicatenaria. questa molecola completamentebicatenaria verrà traascritta in rna chiamati genomici e subgenomici. gli rna subgenomici funzionanoesclusivamente da messaggeri. mentre quelli genomici fungono da stampo per la sintesi dellamolecola negativa di DNA. analogamente ai retrovirus abbiamo un processo diretrotrascrizione, ad opera di una trascrittasi inversa.____

quinta fase:MATURAZIONE____

• la fase di assemblaggio avviene spontaneamente: le varie subunità virali si dispongonodiversamente nello spazio in modo da costituire la struttura virale.• l'assemblaggio per i virus nudi può avvenire nel citoplasma (poliovirus) o nel nucleo(adenovirus). durante la fase di assemblaggio possono avvenire nel virus modificazionnibiochimiche che lo portano a maturare, rendendolo pronto per uscire dalla cellula ospite.• la fase di assemblaggio può avere errori, perchè possono formarsi capsidi vuoi o incompleti.• per i virus nudi, l'uscita del virus dalla cellula ospite avviene per esocitosi, tramite variazionedella permeabilità cellulare e blocco delle sintesi macromolecolari della cellula.• per i virus con envelope la fuoriuscita avviene per gemmazione attraverso due modalità:attraverso la membrana citoplasmatica previo inserimento di proteine e glicoproteine viralisulla membrana della cellula che gemmerà, o attraverso la membrana nucleare.• per gli herpesvirus il processo di gemmazione avviene nella membrana nucleare, quindi l'involucroderiva dalla membrana nucleare. il virus si ritrova in vescicole secretorie che trasportano i virus attraverso ilcitosol cellulare e lo riversano all'esterno mediante fusione delle loro membrane con la membrana dellacellula ospite.• generalmente per i virus fuoriescono per lisi cellulare e si ha la morte della cellula, ma ci sonoalcuni virus, come il virus della rabbia e il virus della rosolia (virus teratogeno: provocamalformazioni al feto), che nonstante vengano liberati in continuazione dalla cellula ospite non necompromettono la vitalità.____

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effetto citopatico____

• se non disponiamo di un microscopio elettronico non vediamo virus, ma attraverso unmicroscopio ottico possiamo vedere le cellule, e dagli effetti che comporta un virus capire se lecellule sono infette.• la presenza di un virus altera le caratteristiche morfologiche, alterazioni antigeniche, blocco dellasintesi di componenti macromolecolari, e alterazioni del controllo del ciclo celulare.• la presenza di un virus in un tappeto cellulare, al suo moltiplicarsi, determinerà l'effettocitopatico, che induce: arrotondamento delle cellule che perdono la normale morfologia; lecellule si distaccano dalla superficie del vetro, si raggrinzano.• possono formarsi anche dei sincizi: cellule polinucleate. la formazione di sincizi avviene a causadella fusione di membrane cellulari dovute alle proteine fusogene che usano i batteri perpenetrare nella cellula.• per avere tappeti cellulari monostratificati tra le cellule che adoperiamo in laboratorio hannomolta importanza le cellule ila, che sono cellule tumorali che provengono da una donna che avevaun carcinoma uterino. queste cellule ancora si mantengono in tutti i laboratori del mondo. questevengono adoperate per coltivare materiali clinici da cui vogliamo isolare virus.• anche il trattamento con tripsina di reni di scimmia ci permette di avere tappeti cellularimonostratificati• possono formarsi inclusioni nucleari o citoplasmatiche, e possono formarsi in vivo. sono statidi grande aiuto nelle sezioni istologiche per la diagnosi di infezione virale• sono molto importanti le inclusioni date dal virus della rabbia, che si formano nelle cellulenervose (corpi del negri), nelle cellule epiteliali (corpi del guarneri); le inclusioni da herpesviruspossono verificarsi nelle cellule epiteliali• i poliribosimo cellulari sono occupati a tradurre proteine virali, e viene meno la sintesi dimacromolecole, in alcuni casi anche di dna e proteine (come negli herpesvirus). in altri casi siimpedisce il trasferimento del rna messaggero dal nucleo al citoplasma• il virus inserirà proteine o glicorpoteine virus-modificate, modificando la componente antigenicadella cellula.• la cellula, che per difendersi esporra complessi mhc1, verrà inibita dal virus in questa espressioneper evitare la apoptosi.• molti virus che hanno rilevanza patologica negli umani impediscono l'apoptosi: un processo che ilsistema immunitario mette in moto per proteggersi dai virus.• un altro meccanismo è quello di interferire conla proliferazione cellulare: la cellula va incontro aimmortalizzazione o trasformazione (cancerogenesi)____

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Microbiologia - Azione patogena dei virus PROF FERRAROApril 23, 2012

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Microbiologia - Azione patogena dei virus PROF FERRAROApril 23, 2012

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generalitàinterazionali virus- ospite____

• un virus, diversamete dai microrganismi cellulari gia studiati, è un parassita endocellulareobbligato ed in quanto tale puo avere un rapporto con l'ospite solo se riesce a portare avanti la suareplicazione, cioè un processo infettivo.• il processo infettivo può essere portato avanti solo se una volta penetrato nell'organismoospite riesce a trovare delle cellule, sensibili e permissive, in cui potersi replicare.• ogni virus ha uno spettro d'ospite: ci sono virus che possono infettare piu specie, ed altro conuno spettro d'ospite ristretto.• l'infezione virale dipende dall'ospite che mette in gioco la sua patogenicità, e l'ospite risponde conla sua suscettibilità. cosi comprendiamo perchè se prendiamo in considerazione due soggetti ugualiche incontrano lo stsso virus in uno osserviamo segni clinici di malattia in un altro no.• la malattia, se si manifestasse, dipenderebbe dal rapporto che il singolo virus è in grado di instaurarecon le cellule di questo ospite, questi rapporti sono molto variegati, e come l'ospite con le sue difese èin gado di contrastare il virus.____

concetto iceberg____

• un virus è in grado di avere un contatto con un ospite, ma non è capace di entare nella cellula, enon potrà replicari: questa condizione, che non porta a infezione, è la piu comune ed èschematizzata come la base dell'iceberg.• se il virus ha un raporto piu stabile con l'ospite, ed è almeno capace di replicarsi, senza peròindurre danni qualitativi e quantitativi avremmo una infezione, ma questa non comportera perl'individuo l'insorgere di una malattia:infezione asintomatica.• la malattia clinicamente evidente si avra quando il virus potra interagire con la cellulainfettandola e provocando in essa danni funzionali ed eventuale lisi: questo procurerà la lisi ed èschematizzabile con la cima dell'iceberg. i casi in cui un infezione virale porta alla morte del virussono rari, infatti il virus ha bisogno dell'ospite per vivere: ecco perchè il virus non ha comeobbiettivo la morte dell'ospite.____

questitifondamentalidell'infezioone____

• se parliamo di interazione virus-cellula ci poniamo dei quesiti:• come penetra?• dove si replica?• si replica solo in quella sede o può diffondere?• come si elimina il viru all'esterno?• attraverso questi quesiti possiamo capire molte cose.____

penetrazione____

• gli apparati prediletti dal virus per la replicazione sono apparati con cellule vitali in attivareplicazione: le mucose dei diversi apparati.• ad esempio una delle mucose piu utilizzate è la mucosa respiratoria: perchè ha contatto con l'esterno eperchè vi sono molte cellule vitali da infettare.• il contatto del virus non è diretto e la trasmissione può avvenire per via aerogena tramitesecrezioni respiratorie: virus influenza, morbillo, riovirus.• un'altra modalità di trasmissione è quella fecale-orale (virus enterici rotavirus, epatite a)• trasmissione sessuale (contatto diretto con secrezioni genitali) utilizzata da patogeni imporanti(papilloma, hiv, herpes simplex epatite b)• altri organismi usano una trasmissione per via cutanea, seppure non sia la via prediletta diinfezione dei virus. ma se attraverso la puntura di un vettore, o di un morso di animale, o se la cutedovesse presentare anche pccole lesioni il virus potrebbe approfittarne.• la trasmissione parenterale: quando si entra in contatto con sangue infetto (epatite b e c, hiv)• la trasmissione verticale: trasmissione dalla madre al feto nel periodo gestazionale, cheprovocano per il nascituro il toxoplasma, il citomegalovirus, la rosolia ecc..• quanto puo avvenire la trasmissione verticale? durante il periodo gestazionale perattraversamento della placenta e durante il parto (perinatale), perchè il bambino durante il partopuò ingerire secrezioni o sangue della madre infetta.• durante l'allattamento può avvenire la trasmissione detta trasmissione neonatale.• da cosa dipende il fatto che un virus dia una malattia o meno? inananzi tutto dalla contagiosità:dalla quantità di virus che ci viene trasmesso, dalla modalità con la quale si trasmette e anche dallacapacità del virus di sopravvivere nell'ambiente (che in genere sopravvivono poco, soprattuttoquelli senza envelope).____

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infezionelocalizzata____

• il virus deve quindi trovare le cellule sensibili e permissive dell'ospite. l'ospite rispondeall'infezione con le sue risposte immunitarie: risposte innate (barriere fisiche, cellule nk,produzione di interferone).• le infezioni virali che si traducono in malattia sono caratterizzate da un periodo di incubazione, ilperiodo che intercorre tra l'infezione ela presentazione clinica della malattia.• vi sono delle infezioni che compaiono in tempi molto brevi (2,3 gg) e altre con tempi molto lunghi(50, 150 gg). perchè?• i virus che giungono dall'esterno, ad esempio sulla mucosa respiratoria, se vi trovano cellulesensibili e permissive potranno replicarsi, determinando danno cellulare, e da questa sede non siallontanano. possono al limite diffondere nelle vicinanze, ma non può di tanto: questa è dettainfezione localizzata, che corrisponde a quelle malattie caratterizzate da un breve periodo diincubazione.• il virus del raffreddore comune si replicano nelle cellule dell'epitelio nasale, provocando undanno cellulare, che attua un richiamo del sistema immunitario. di questa situazione neapprofittano in genere gli altri microganismi, e all'infezione virale si sovrappone l'infezionemicrobica. in questi casi vi è una infezione autolimitante, perchè si esaurisce da sola.____

infezione sistemica____

• molti virus hanno la capacità di diffondere nell'ospite, dando una infezione sistemica.• dopo essersi replicati nelle cellule del sito di ingresso, attraverso il sistema linfatico, arrivano nelsangue dando una viremia primaria, e tramite il sangue raggiungono gli organi reticolo-endotelialiinterni (fegato milza) che sono permissivi. li si replicano e si riversano nel sangue, provocando unaviremia secondaria.• quest'ultima è essenziale per il virus, perchè in questa fase il virus ha raggiunto un ideale dielementi per infettare vari organi (ricordare: ogni virus ha un certo trofismo, certi viruspreferiscono certi organi).• come fanno i virus a passare dal sangue senza essere distrutti dalla risposta immunitaria?• la gran parte dei virus utilizzano propriole cellule effettrici della risposta immunitaria per farsiveicolare al loro interno: vi sono virus che prediligono i linfociti b, o t, o cellule della seriemacrofagica.• alcuni circolano all'esterno di qualsiasi cellula, seppure sia la condizione piu rischiosa per il virus.• c'è un altra modalità imporante di infezione cioè la diffusione per via nervosa: il virus che hainfettato una mucosa, sfrutta gli assoni che innervano quella mucosa, entrandovi, viaggiando alsuo interno fino ad arrivare all'organo bersaglio: l'encefalo (varicella zoster, herpes simplex).• la presenza del virus nel sangue si verifica solo se si parla di malattie sistemiche, mai nel caso diinfezioni localizzate.• infezione sistemica: acquisizione di una immunità importante contro quel virus.• infezione localizzata: è piu facile infettarsi piu volte anche con lo stesso virus.____

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vie di eliminazionedei virus____

• dipende dal singolo virus, ma per alcuni virus esiste un unica via di eliminazione.• fattore eziologico della mononucleosi: il virus di Epstein-Barr: trasmissione con il bacio perchè ilvirus è eliminato con la saliva• citomegalovirus: eliminato con il latte di una donna, con le urine e le secrezioni respiratorieperchè il virus si comporta in un certo modo nell'ospite.• per capire come si comporta dobbiamo conoscere la patogenesi di ogni singolo virus.• le malattie sono variegate, e dipendono dalla interazione del virus con la cellula: citpoatogenesi• quando un virus incontra una cellula può fare cose diverse:• cellula non permissiva: il virus non può replicarsi efficacemente a causa sua o dell'ospite=l'infezione inizia ma non va a termine= infezione abortiva (non lascia traccia di se)• cellula permissiva: virus che si replicano, causando la lisi della cellula• la malattia è data dalla risposta della cellula. nell'ultimo caso avremo una infezione litica (lisidella cellula).• nel caso dell'infezione persistente il virus infetta la cellula e ne mantiene un rapporto duraturonel tempo, che non si esaurisce.• l'infezione persistente è definita infezione produttiva (o cronica) quando nel suo corso c'è unacontinuativa produzione di particelle virali; l'infezione persistente può essere anche latente se nel lungoperiodo non vi è produzione di nuove particelle virali; può esserci anche un caso di infezione trasformante, incui indipendentemente dalla produzione o meno di elementi virali, si avrà la formazione di un processooncogenetico.• la malattia può anche essere causata da virus che non sono citopatogeni (non fanno morire la cellula),ma il loro effetto sulle cellule è un danno indiretto: la risposta immunitaria del'ospite riconosce le celluleinfette, e le elimina: il virus ha quindi solo il ruolo di induttore.• quindi i danni di una malattia possono formarsi da un processo infiammatorio o da un processoimmunopatologico.• un esempio classico di un virus non citopatogeno, la cui malattia correlata è la conseguenzadell'attacco del sistema immunitario è la malattia cronica dell'epatite b, in cui si osservano segni diformazione di immunocomplessi: un epatite, con in associazione glomerulonefrite ed eritemi,quindi anche altri sintomi oltre l'epatite, frutto della risposta immunitaria.• la risposta immunitaria risale al fatto che i virus vengono riconosciuti dal sistema immune grazie a dellecellule apc che presentano l'antigene ai linfociti t cd4 che matureranno in th1 e th2 che influenzeranno larisposta umorale e cellulomediata.• gli anticorpi servono a neutralizzare il virus che esce dalla cellula, i linfociti ti citotossici riconosce le celluleinfette e colpiscono il virus all'interno della cellula stessa.• naturalmente la reazione dell'ospite varia a secondo dell'età, del sesso, della razza e del patrimonio hla.____

infezioniproduttive____

• infezioni produttive: infezione acuta, malattia acuta= dopo il momento dell'infezione il virus sireplica creando il danno cellulare e la malattia. dopo l'intervento della risposta l'infezione siaffievolisce. questo tipo di infezione è data dagli enterovirus, che vengono trasmessi per ingestioneo trasmissione aerogena, conseguente replicazione nel dotto orofaringeo, viremia primaria esecondaria e in fine trofismo cellulare. alla fine il virus viene eliminato con le feci e l'ospiteguarisce.• i poliovirus hanno un comportamento identico, ma hanno un tropismo per i neuroni spinali, equindi si provocherà lisi di quelle cellule. quando l'individuo non è piu infetto quelle celluleinfettate e danneggiate non possono piu essere ricreate.• nel caso del morbillo vi è la formazoine di esantemi rush cutanei, causate dall'attacco dei linfocitit ai virus che attaccano le cellule endoteliali dei piccoli vasi, (potrebbero esserci delle complicanze)e quindi l'infezione non avviene per contatto erchè il problema è sottocutaneo.____

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infezionipersistenti____

• infezioni persistenti: episodi di malattia intervallati da periodi in cui il virus non si replica senzacausare sintomi (herpesviridae): nella prima infezione il virus si prelica in abbondanza perhcèl'organismo non conosce il virus. pian piano lo controlla e il virus scompare, per poi ritornare dopotempo. si presenterà però con sintomi minori perchè la risposta immunitaria conoscie già il virus.• l'herpes simplex, dopo la prima infezione della mucosa dell'area peribuccale, entra nei neuroni,percorrendo l'assone con un moto retrogrado, e rimane all'interno del pirenoforo del neuronestesso, che non è una cellula permissiva. durante periodi di stress questo virus può percorrerel'assone (ALL'INTERNO DEL QUALE IL VIRUS NON è RICONOSCIBILE DAL SISTEMA IMMUNITARIO)di nuovo verso l'area della mucosa buccale per infettarla di nuovo.• l'herpes labialis è ua infezione secondaria, una infezione endogena. l'infezione primaria è spessoasintomatica, ma possono presentare nei bambini vescicole della mucosa nell'area peribuccale.• ogni volta che il virus si replica, anche dopo l'infezione latete, anche senza la malattia, il virusviene eliminato all'esterno attraverso vari metodi; infatti questi virus vircolano molto liberamente,e probabilmente ne siamo affetti.• nel caso della varicella, che agisce similmente agli herpesviridae, dopo laprima infezione si puòavere una riattivazione del virus che causa il cosiddetto fuoco di sant'antonio;• varicella: esantema vescicolare in tutto il corpo; Zoster: esantema solo nell'area innervata daineuroni in cui il virus della varicella rimane latente.____

infezioni croniche____

• infezione cronica tipica: sostenuta dal virus dell'epatite b, che comporta una infezione dallaquale si guarisce, e una dalla quale non si guarisce.• questo virus durante l'infezione persistente si replica sempre, alternando fasi replicativesfruttando gli epatociti a fasi non replicative in cui la replicazione avviene lentamente, o quantomeno il dna virale si integra nel dna dell'ospite, e che continua a esprimere geni del virus chevanno nell'organismo. queste due fasi possono stare in equilibrio, e l'alternanza può essere dovutaal sistema immunitario dell'ospite. se il virus si replica ci può essere un danno al tessuto, dato dallalisi delle cellule, che èuò essere di piccole quantà, o può dare un danno tale da dare da darel'epatite cronica che può evolvere in cirrosi epatica e poi in epatocarcinoma.• infezione cronica a latenza clinica: dopo il contagio, e la replicazione, la malattia compare dopoun lunghissimo periodo di rapporto virus-cellula: esempio HIV. questo virus infetta l'ospite, subitopotremmo forse osservare una sindrome acuta, successivamente una viremia, e un'infezione deilinfociti t, che vanno in lisi. in circolo vi sono però gli effettori dell'immunità che potrebberoeliminarlo. quindi il virus va in latenza clinica nascondendosi nel tessuto linfoide. lì il viruscontinua a replicarsi sempre, distruggendo i linfociti delle stazioni linfonodali, e ne blocca lanascita di nuovi. questo provocherà una immuno depressione per il calo dei linfociti, e a questopunto il virus potrà tornare in circolo, provocando AIDS: malattia da accumulo di danno al sistemaimmunitario intero, che espote l'organismo a tutte le malattie, che non possono essere ostacolatedal sistema immunitario ormai compromesso.• infezione lenta: il soggetto si infetta, e sta bene per molto tempo, finquando insorgera la malattia(poliomavirus: del tratto respiratorio, danno una infezione sistemica, si localizzano a livello renale,seconda viremia, e l'ospite diventa competente e lo tiene a bada nel rene. se l'ospite dovesseandare in contro ad una immuno depressione per altr fattori, il virus potrà replicarsi e potràandare ad accumularsi nel snc causando enefalopatia multifocale infettiva).____

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infezionitrasformanti____

• infezione trasformante: rapporto cellula-virus che può portare all'insorgenza di un tumore. ivirus che hanno questa proprietà si chiamano virus oncogeni. la relazione tra infezione virale emalattia oncogena è evidenziata da dati epidemiologici che mettono in evidenza come un tumore èfrequente in una popolazione in cui circola un certo tipo di virus. si può andare a vedere se il virusè presente nelle cellule tumorali, cercando il virus nella sua interezza o nelle sue componenti comeil suo genoma o le sue proteine. in genere in chi ha un tumore di origine virale vi sono alti titoliantivirali contro quel tipo di virus. quando furono fatte queste osservazioni furono fatte, si stabilìquale rapporto determinasse queli virus: infettare le cellule con un virus oncogeno fa si che lacellula cambi la morfologia, perda l'inibizione da contatto, e aquista immortalità. si fannoesperimenti su animali per vedere se il virus ha le stesse proprietà; e si vede se, vaccinando unapopolazione contro un certo virus oncogeno, diminuisca l'incidenza del tumore nella stessapopolazione.• questi virus sono prevalentemente a dna (poxviridae, herpesviridae), ma possono essere virus arna come il virus dell'epatite c e il virus rv1 (retrovirus).• un virus a dna oncogeno è il virus di Epstein-Barr, virus della mononucleosi, è associato a moltitumori. gli herpesvirus hanno un grande genoma, che contiene geni replicativi (espressi durantel'infezione produttiva) e geni di latenza (geni espressi durante l'infezione latente). da cosadipende?• il virus della mononucleosi viene trasmesso con la saliva, e infetta le cellule della mucosa buccalee della faringe, e va a infettare i linfociti b che sono nella sottomucosa. il virus fa si che questilinfociti proliferino eccessivamente, che iniziano a produrre anticorpi non rivolti verso unospecifico antigene. a questo punto il virus esprime i geni replicativi.• il virus da infezione latente nei linfociti b perchè questi impediscono al virus di andare inreplicazione. se questo ospite va in contro a malattie immunodepressive (aids, malaria) vengonoespresse dal virus altre proteine (ebna e mp).• il linfoma di burkitt è un tumore mandibolare che si osserva nei bambini delle regionisubsahariane, associato al fatto che si è visto che il tumoe è particolarmente presente in regionigeografiche in cui è presente la malaria, che da una parte tende a far proliferare i linfociti b, e haun ruolo immunodepresssivo nei confronti dei linfociti t.• i linfociti b proliferano, e a causa di questa alta proliferazione vi è una traslocazione cromosomicasu un gene oncogenico del cromosoma 8 del genoma dell'ospite.____

papillomavirus____

• agenti eziologici delle verruche. si tratta sempre di infezione localizzata a livello di cute o di unamucosa. ma la malattia ha un lungo periodo di incubazione (3,4 mesi) perhcè il virus èstrettamente dipendente dallo stato di diffeerenziazione delle cellule epiteliali: il virus infetta lecellule dello strato basale che non sono permissive. quando la cellula maturerà e differenzierà,questa cellula diventerà man mano piu permissiva, permettendo al virus di replicarsi. quandoquesto avviene si ha una iperproliferazione cellulare, provocando la verruca.• le verruche sono il risultato del ciclo produttivo delle cellule epiteliali permissive. se il virusinfetta cellule non permissive, viene a trovarsi in condizione di stress, in cui tende a integrare ildna virale a quello cellulare. questo induce la cellula a iperproliferare, con possibile nascita delcarcinoma.• se viene sintetizzata la proteina e2, che controlla l'espressione di altre due proteine virali e6 e e7,che sono proteine oncogene, si viene a creare il carcinoma;• se non viene sintetizzata e2 vi è la verruca.• vi sono dei cofattori imporanti che variano a seconda dello stile di vita (fumo), razza, numero dipartner sessuali, sesso ecc..____

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Microbiologia - Farmaci antivirali PROF MILICIMay 5, 2012

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Microbiologia - Farmaci antivirali PROF MILICIMay 5, 2012

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fattoricondizionantil'attività deifarmaci antivirali____

• un farmaco antivirale per essere definito tale deve avere la capacità di entrare nella cellulaospite, perche è li che il virus si replica. se usiamo un farmaco che inibisce la capacità replicativadel irus dobbiamo agire all'interno della cellula. questo non è semplice perche la cellula si avvale disistemi trasporto specifici.• i famarci devono essere specifici per il virus, che sono in grado di interagire con speifichestrutture o funzioni virali.• questi farmaci devono essere attivi per un tempo sufficientemente lungo per andare insintonia con il ritmo replicativo del virus (alcuni si replicano lentamente).• questi farmaci quindi hanno una serie di limiti, cioè funzionano su virus in attiva replicazione(fase di infezione latente, questi farmaci nn funzionano).• hanno uno spettro d'azione ristretto (ogni farmaco agisce solo su un tipo di virus, al massimoqualche altri tipo.• sono farmaci che inevitabilmente sono tossici per le nostre cellule (i virus utilizzano le nostrecellule per replicarsi), e purtroppo, i virus, in risposta all'qzione del farmaco, tendono a mutare perdiventare resistenti alla pressione selettva operata dal farmaco.____

fattori diresistenza____

• la resistenza è il problema piu grande per gli antimicrobici, ed è dovuta a fenomeni correlati alvirus, al farmaco e all'ospite.• per cio che riguarda il virus il fatto consiste che il virus puo selezionare mutanti resistenti, inquanto i virus hanno una elevata variabilità genetica; alcuni, come per esempio il virusdell'epatite b o HIV, si replicano molto (10^12 virioni al giorno).• la polimerasi virale che controlla la replicazione di questi virus è una trascrittasi inversa (senzacorrettore di bozze), quindi c'è un altra possibilità di inserire o eliminare nucleotidi, dando moltemutazioni puntiformi: fino a 10 miliardi di mutazioni al giorno, in qualsiasi sito del genomavirale, anche nei i siti interessati nell'interazione tra farmaco e virus.• la barriera genetica è la capacità di modificarsi in quei geni su cui vanno ad agire i farmaci.• la barriera genetica per un virus è bassa (capacità del virus di divenire resistente ad uno specificofarmaco grazie ad una sola mutazione ) o alta (per divenire resistente ad uno specifico farmaco, il virus,deve accumulare piu mutazioni).• la resistenza ha altri problemi: pressione farmacologica incongrua; concentrazione nonottimale, aderenza alla terapia e potenza del farmaco.• quando ad un soggetto viene somministrato una altra concentrazione del farmaco, il virus èinibito nella replicazione.• quando la concentrazione va riducendosi, tra una dose di assunzione e l'altra, viene lasciato spazioal virus per replicarsi: se utilizzo un farmaco con una potenza elevata (sopprime energicamente lareplicazione virale)posso bloccare la replicazione del virus e di conseguenza bloccarne lapossibilità di diventare resistente.• se uso un farmaco che inibisce solo parzialmente la replicazione virale, può accadere che il viruspuò mutare, e potrà sfuggire all'azione del farmaco (fallimento terapeutico).____

aderenza____

• si intende la rigorosità del paziente nell'assunzione dei farmaci, perche ogni volta che il farmaconon si prende, i virus possono replicare (ed acquisire resistenza).• bisogna avere la capacità di dimostrare se il fallimento terapeutico è dovuto alla sospensione della terapiadal paziente, o dalla capacità del virus di resistere alal capacità inibitoria del virus.• vi sono test diagnostici che valutano la resistenza dei virus ai farmaci.• in virologia non c'è l'antibiogramma, e bisognoa quindi sequenziare il genoma virale, e vedere sein specifiche porzioni del genoma vi sono mutazioni correlate alla resistenza farmaceutica.____

farmaci____

• oggi esistono farmaci inibitori delle diverse tappe di replicazione dei virus, che sonoassorbimento, penetrazione, trasduzione, traduzione, assemblaggio.____

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assorbimento -inibitori deicorecettori____

• il virus hiv è inviluppato, che presenza delle spicole sulla superficie, con delle porzioni globoseche servono all'assorbimento del virus, e la porzione transmembranaria, proteina fusogena (GP41),serve alla fusione delle membrane. quando il virus incontra la cellula sensibile, si lega con la suaparte globosa (antirecettore: molecole ccr5); e poi il virus deve interagire con dei corecettori, cheservono a far avvenire una modificazione strutturale della struttura in maniera che la strutturaglobosa si metta da parte e la membrana virale si avvicini alla membrana dell'ospite.• MAVIROC è una molecola che è stata individuata da ricercatori farmacologici, che si lega ad uncorecettore ccr5 virale utilizzato da hiv, e viene inibito nell'assorbimento. questo farmaco funzionasolo su virus hiv che utilizza solo ccr5.____

penetrazione -inibitori delleproteine fusogene____

• ENFURIORTIDE (T-20) agisce , come nel caso precedente, solo sul virus dell’HIV; è un analogodella GP41, proteina fusogena dell’HIV. Il T-20 si lega a quest’ultima e ne impedisce la funzione.____

denudamento -inibitori deldenudamento____

• Sono rappresentate da due ammine tricicliche che sono l'AMANTADINA e la RIMANTADINA, cheagiscono esclusivamente sul virus dell'influenza A.• se ricordiamo l'interazione virus-cellula di questo virus, ricorderemo che questo virus possiede laproteina M2 sull'envelop. questa proteina serve a far penetrare il virus per endocitosi, che vieneportato in un lisosoma, e l'ambiente acido scioglie l'envelop che fa uscire il virus. l’amantadina e larimantadina si posizionano proprio nel canale di questa proteina, bloccando l’ingresso degli ioniH+. Questo porta alla non attivazione della proteina fusogena, impedendo così la penetrazione delvirus.• questi farmaci devono essere somministrati subito, per questo vengono usati per la maggior parteper la profilassi di soggetti immunocompromessi che non possono permettersi di infettarsi con ilvirus del'inlfuenza. viene dato quindi a scopo preventivo.____

trascrizione -inibitori degli acidinucleici____

• vi sono 3 categorie: analoghi dei nucleosidi, analoghi dei nucleotidi, e analoghi non nucleotidici.• gli analoghi nucleosidici (base azotata + zuccheri) hanno la capacità di inibire l'attività dellepolimerasi virali (rna e dna polimerasi virali). vengono utilizzati al posto delle basi azotatefisiologiche, e fungono da terminatori di cantena: un nucleoside, per essere utilizzato nella sintesidegli aicidi nucleici, deve essere sotto forma di nucleotide. se somministriamo un analogonucleosidico, questo deve entrare nella cellula, ed andare in contro a 3 processi di fosforilazione.quando questo avviene, il virus in replicazione, viene utilizzato questo analogo (che è diventatonucleotidico). questo analogo manca del gruppo OH in 3', che consente di legare l'altro nucleotide.quindi la catena viene terminata.____

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analoghinucleosidici____

• ACICLOVIR (herpes labbiali) è UN ANALOGO NUCLEOSIDICO. questi analoghi nucleosidici nonfunzionano su tutti i virus.• l'Aciclovir, per esempio, che è un analogo nucleosidico della guanosina, è attivo nei confrontidell'jerpes simplex e della varicella zoster. perche ciò avvenga è necessario che la ciclovir vengafosforilato. in questo caso una timido-chinasi opera la prima fosforilazione. dopo di che gli altridue sono operati dalle chinasi cellulari. questo significa che l'aciclovir funzionerà solo nelle cellulecon il virus, e questo si traduce in una tossicità selettiva. quando questo aciclovir è diventato unaciclovir trifosfato, viene incorporato nel dna che si va formando. dopo questo nucleotide si creaun blocco irreversibile della sintesi della catena di dna.• il Valaciclovir è un aciclovir modificato chimicamente, per fornirlo di maggiore biodisponibilità:si mantiene attivo nella cellula per un tempo piu lungo. e posso utilizzarlo in un soggetto coninfezioni di virus a replicazione molto lenta, come quello della varicella, per i quali mi srevonoparticelle che si replicano molto lentamente.• il Ganciclovir è un altro antivirale, analogo nucleosidico della guanosina. ha delle differenzechimiche, e la concentrazione intracellulare che il g. riesce a raggiungere nella cellula è 10 voltemaggiore rispetto a quanto non lo faccia l'aciclovir, e si mantiene attivo per un tempo maggiore.• per queste sue caratteristiche il Ganciclovir si è dimostrato efficace contro l'infezione di un altroherpes: il citomegalovirus, che ha un ciclo replicativo molto lungo.• perche funziona meglio dell'aciclovir? perche il primo evento di fosforilazione è piuefficentemente portato avanti da unachinasi del citomegalovirus, che ha una affinità maggiorerispetto a quanto non ce l'abbia la chinasi dell'herpes virus o della varicella zoster.• la Ribavirina ha una importante appliazione clinica, analogo strutturale dela guanosina.determina la riduzione della sintesi della guanidina, e di conseguenza inibisce la sintesi di aicidinucleici: inibisce l'enzima inosinamonofosfatodeidrogenasi che serve alla sintesi dei nucleotidiguanidinici. è un farmaco che può essere utilizzato nella polmonite, nel trattamento delle infezionidate dal virus dell'influenza, e viene utilizzato per il trattamento dell'epatite cronica da virusdell'epatite c. questo farmaco funziona bene, ma ha molti effetti tossici.• il Fosfarnet è un analogo del pirofosfato, utilizzato inibisce la scissione del gruppo pirofosfato deinucleotidi trifosfato: da questi eventi deriverebbe il ricavo di energia da parte della dna polimerasivirali. questo farmaco funziona sugli herpes e su hiv.• la Lamuvidina (CC3) è un analogo della citosina, ed è un farmaco attivo sull’epatite B e sull’HIV.L’impiego di questo farmaco sull’HBV si è rivelato inizialmente un successo: infatti, nei pazientiaffetti da epatite cronica di tipo B il farmaco ha portato alla soppressione della replicazione virale.Purtroppo, però, già il 25 % dei pazienti dopo circa un anno ha iniziato a sviluppare resistenza;dopo quattro anni, lo stesso è capitato al 67%.• La ragione del fallimento terapeutico del farmaco è da ricercare nel fatto che il farmaco agiscasull’attività di trascrittasi inversa, andandosi a legare al sito catalitico della polimerasi, YMMD: il virusmutato, infatti, presenta mutazione a carico dell’ aa. metionina, il quale nei ceppi mutati diventa valina oisoleucina. Questo significa che la Lamivudina è un farmaco a bassa barriera genetica, in quanto il virusè diventato resistente tramite una sola mutazione.____

analoghinucleotidici____

• l' Adefovir, approvato nel 2002, è un analogo nucleotidico di adenosina (non necessita difosforilazione!).• E’ atto alla soppressione delle replicazione virale sia del virus non mutato che del virus già resistente allaLamivudina.• La farmaco resistenza dell’Adefovir è sicuramente un evento meno pressante e diffuso (dopo 4anni, solo il 18% dei pazienti ha sviluppato resistenza). Talvolta la mutazione da farmaco resistenzapuò dare resistenza non soltanto al farmaco che l’ha indotta ma anche ad altri.____

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farmaciantiretrovirali diHIV____

• Inibitori Nucleosidici• AZIDOTIMIDINA: E’ un inibitore nucleosidico, quindi necessita di essere fosforilatodalle chinasi cellulari. Agisce come sopradetto.

• Inibitori Non Nucleosidici- Sono molecole con meccanismo d’azione; agiscono in quanto presentano un’alta affinità neiconfronti della trascrittasi inversa dell’HIV, che modificano dal punto di vistaconformazionale impedendone quindi il funzionamento.

• Inibitori delle Proteasi- Questi inibitori sono sequenze aminoacidiche di sintesi analoghe alle sequenze sullequali agiscono le proteasi virali. Si legano al sito d’azione dell’enzima, bloccandolo inmaniera irreversibile. Quando l’azione della proteasi viene bloccata, il virus si replica ma nonriesce a raggiungere la forma definitiva che gli permette di diventare un virione infettante.Quindi in questo caso la replicazione virale viene bloccata in fase tardiva. Nel caso dell’HIV, questifarmaci vengono utilizzati in un protocollo terapeutico che prevede 2 inibitori nucleosidici e 1inibitore delle proteasi. Tale protocollo è definito con la sigla HAART ( Highly ActiveAnti-Retroviral Therapy). Il protocollo HAART, che prevede la combinazione di farmaci cheagiscono sul virus su punti diversi, è quello attualmente usato perché di maggiore successo.Questo non significa che il virus non diventi resistente, ma lo diventerà quantomeno moltopiù tardi.

____farmaci inibitoridelleneuroaminidasi____

• Esistono inoltre farmaci che inibiscono la fase terminale del ciclo replicativo del virusinfluenzale.• Questo, una volta uscito per gemmazione, si libera dalla cellula tramite la sua neuroaminidasi. Ilvirus, infatti, rompe il legame con l’acido sialico e il recettore cellulare grazie alla neuroaminidasi.• Esistono due inibitori per la neuroaminidasi, quali ZONAMIVIR e OSELTAMIVIR.• Sono analoghi dell’acido sialico, perciò sono atti a bloccare l’attività della neuroaminidasi. Non sonocompetitivi tra di loro e funzionano esclusivamente sul virus influenzale. Questi farmaci devonoessere somministrati molto rapidamente, ma funzionano. E’ stato dimostrato che l’impiegodell’Oseltamivir e dell’Amantadina sul virus influenzale per una durata di due giorni induce laresistenza nel virus. L’unica arma per combattere la resistenza dei virus è rappresentatadall’uso di farmaci particolarmente potenti.____

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Microbiologia - Disinfezione e sterilizzazione PROF GIAMMANCOApril 24, 2012

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Microbiologia - Disinfezione e sterilizzazione PROF GIAMMANCOApril 24, 2012

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Generalità____

• pulizia: rimozione di sporcizia• disinfezione: distruzione o riduzione numerica di microrganismi patogeni• asepsi: disinfezione chimica sulla cute o tessuti viventi per rimuovere microrganismi patogeni,senza provocare danni irritanti• sterilizzazione: rimozione di tutti i microrganismi patogeni e non, incluse le spore• fattori che influenzano l'efficacia della pratica: scelta del metodo e corretta applicazione• non tutti i disinfettanti possono essere applicati suttessuti viventi senza danneggiarli. quelli chepossono sono detti antisettici, una sottocategoria dei disinfettanti.• tutti gli antisettici sono disinfettanti, non tutti i disinfettanti sono antisettici.• la disinfezione viene applicata dopo la pulizia affinche sia piu efficace.____

sterilizzazione____

• la pratica che elimina tutti i microrganismi• posso utilizzare diverse forme:• agenti fisici: il calore e le radiazioni. sono i metodi piu utilizzati per la sterilizzazione. (fiamma,vapore, calore secco) (radiazioni UV radiazioni ionizzanti)• agenti chimici. piu che altro sono disinfettanti, alcuni disinfettanti, ad alte concentrazioni sonosterilizzanti.• filtrazione (agente meccanico)____

sterilizzazione concalore____

• incenerimento:• eliminazione di cadaveri, di animali. il metodo piu semplice per eliminare il rischio di infezioni.• efficacia ottima, impieghi molto limitati. utilizzata per strumenti di laboratorio metallici,distruzioni di tessuti, materiale cartaceo o carogne contaminanti.• quando elementi metallici diventano rossi, grazie ai bruciatori bunsen, vuol dire che il metallo haragiunto diversi gradi, ed è sterile. e a contatto con qualsiasi tessuto può sterilizzarlo.• naturalmente un oggetto di plastica non può essere sterilizzato alla fiamma.• calore secco:• aria calda: una qualunque struttura chiusa che riesce a riscaldare l'aria all'interno. in laboratoriolo strumento è detto stufa a secco, e quello che fa è scaldare l'aria al suo interno, che viene portataad una elevata temperatura, e se viene applicata per un tempo elevato, tutti i microrganismipossono essere eliminati, insluse le spore.• piu elevata è la temperatura a cui portiamo la nostra stufa a secco, minore sarà il tempo diesposizione necessario alla sterilizzazione. questo dipende dal tipo di oggetto che vogliosterilizzare, a seconda della possibilità dell'oggeto di resistere.• se si tratta di materiali anidri, può andare bene.• il vapore sotto pressione:• un metodo piu delicato, che usa un calore umido. il vapore viene utilizzato in uno strumentodetto autoclave.• Autoclave: apparecchio che fa aumentare la pressione all'interno di una camera chiusa. perche?un liquido diventa vapore ad una certa temperatura a secoda della pressione. a pressioneatmosferica il vapore ha temperatura di 100 gradi. aumentando la pressione il vapore avrà unatemperatura piu alta, e potrà sterillizzare piu efficacemente.• è utile per sterilizzare oggetti in goma, garze, terreni di coltura in brodo o agarizzati, purche prividi sostanze deperibili ad alte temperatura.• standard si considerano 121° per quindici minuti ad 1atm in piu a quella basale.• all'interno dell'autoclave prima deve uscire tutta l'aria, e deve essere sostituita dal vapore, percreare un ambiente di vapore saturo (solo vapore). l'aria, infatti, non riesce a trasmettere il calorecome può un liquidoo o un fluido.____

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sterilizzazione conradiazioni____

• radiazioni UV:• stiamo parlando di lunghezze d'onda brevi (240-260 nanometri), proprie degli UVC, chedanneggiano molto la materia vivente, al contrario degli UVA.• gli UVC vengono generalmente schermati dall'ozono, sebbene sia proprio l'esposizione a UVC aprovocare i tumori della pelle.• la luce non oltrepassa la materia (le luci proiettano imbre) quindi, oltre ad essere tossici, nonriscono ad attraversare la materia. quindi si ha una sterilizzazione superficiale, o qualcosa colpitadirettamente dalla radiazione ultravioletta.• nelle sale operatorie vi sono tubi uv, che vengono usate per sterilizzare l'ambiente: aria esuperficie.• radiazioni ionizzanti:• i raggi gamma possono attraversare la materia, anche sono a pieno le materie molto dense.• quindi gli oggetti possono sterilizzati anche al loro interno, e possono essere utilizzati persterilizzare gli alimenti.• come impiego medico possono essere usati sugli strumenti di plastica: tutto il materiale plasticomonouso viene generalmente sterilizzato con raggi gamma.• la data di scadenza infatti è riferita alla degradabilità della carta, che può degradarsi.• le radiazioni ionizzanti sono molto efficaci.• le radiazioni ionizzanti non rendono radioattivi gli oggetti irraggiati.• si espone un materiale ad una fonte radioattiva (cesio o cobalto), non rendendo l'oggettosterilzzato radioattivo.____

filtrazione____

• chiamata impropriamente sterilizzazione, ma è basata dal passggio di liquidi attraverso filtri conpori molto piccoli.• ma i virus sono molto piccoli, e non vi possono essere pori abbastanza piccoli per i virus (porositàminore 0,2micron).• i materiali usati sono amianto, porcellana porosa, polimeri sintetici.• è una tecnica molto pratica per la sua rapidità, benche non assicuri l'eliminazione dei virus.____

disinfezione____

• un grado meno rispetto alla sterilizzazione, elimina solo i microrganismi patogeni, riducendo lacarica microbica in generale.• è una tecnina che mi toglie la gran parte dei microrganismi. come?• attraverso il calore, ma soprattutto sostanze chimiche.• il calore, a temperature inferiori a quelle della sterilizzaizone, può risultare disinfettante.• se non ho necessità di eliminare ad esempio le spore, posso utilizzare temperature basse,eliminando gli altri agenti patogeni.• quando parliamo di disinfezione non eliminiamo i tutti i microrganismi: quelli piu resistentirimangono sono elencati in ordine di resistenza• 1 prioni• 2 spore• 3 micobatteri• 4 piccoli virus non inviluppati• 5 gram negativi• 6 miceti• 7 grandi virus non inviluppati• 8 batteri gram positivi• 9 virus inviluppati• i prioni sono proteine infettanti, senza acido nucleico. causano la malattia della mucca pazza, puòanche coinvolgere l'uomo.• i virus inviluppati sono infettanti solo se regano il recettore cellulare. il loro antirecettore èsull'envelope, che è un elemento fragile. se si rompe l'envelope il virus non può entrare nellacellula e non può fare danni. se non hanno l'envelope, e hanno un capside proteico, meglio se sonopiccoli, perche sono piu concentrati, piu densi, e piu resistenti all'esterno.• i gram negativi sono piu resistenti dei gram positivi, in quanto la membrana esterna può essereri-sintetizzata, e soprattutto la membrana esterna non è essenziale quanto quella interna: quindi inattesa di condizioni ambientali favorevoli, al contario del virus, il batterio può risintetizzarla.____

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disinfezione con ilcalore____

• bollitura:• disinfezione e potabilizzazione dell'acqua, bollitura per 15-20 minuti• le malattie da infezione fecale-orale vengono evitate bollendo l'acqua.• pastorizzazione:• louis pasteur, studia i problemi dei vari alimenti, tra cui il latte, e nota che il problema del latte èla presenza di microrganismi.• se il latte viene bollito perde le capacità nutritiva.• se viene riscaldato senza arrivare a temperature elevate, 30 minuti a 62-65 gradi vengonoeliminati i patogeni.• se viene riscaldato a temperature elevate, per poco tempo può anche essere efficace senzacausare problemi nei confronti delle componenti del latte.• uperizzazoine UHT Ultra High Temperature:• risaldamento indiretto: il latte passa velocissimamente su piastre di metallo a 140° con un flussolaminare• riscaldamento diretto: insufflazione di getti di vapore sul latte che scorre• alte temperature e tempi molto bassi non• tyndalizzazione:• un metodo che venne impiegato per risolvere il problema delle spore, specialmente nei succhi difrutta.• viene anche detto sterilizzazoine (perche elimina anche le spore) frazionata (perche avviene inpiu fasi), che si basa sulla proprietà del calore che induce la germinazione delle spore (60-100 gradiper 30 minuti intervallati da esposizione a 37°= shock termico porta alla germinazione.l'eliminazione di batteri germinati è piu semplice dell'eliminazione di spore).____

agenti chimicidisinfettanti____

• utilizzati per la maggior parte delle disinfezioni.• dobbiamo tenere conto di alcuni fattori limitanti:• esposizione per un tempo che sia adeguato• temperatura con cui si applica il composto chimico (piu efficace se c'è caldo)• concentrazione (piu concentrazione, piu efficacia, facendo attenzione alla tossicità residua)• presenza di sostanze organiche (la sporcizia inibisce l'efficacia della sostanza)• struttura del microrganismo (vari gradi di resistenza alla disinfezione)• non tutti i disinfettanti eliminano le spore o i micobatteri.• grado di disinfezione per tipo di disinfettante: si distinguono tre livelli di disinfettanti e trecategorie di sterilizzazione:• alto livello: eliminano anche le spore batteriche= sterilizzanti• medio livello: non eliminano necessariamente le spore, ma eliminano i micobatteri• basso livello: batteri in forme vegetative e i virus meno resistenti• perche si usano disinfettanti di basso o di alto livello? a seconda della possibilità di usare uncomponente che può indurre una tossicità sulla cosa da sterilizzare.• alti e medi livelli: oggetti inanimati.____

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categorie di agentichimici____

• ossidanti:• acqua ossigenata (3%-6% antisettico; al 10-30% ha attività sporicida sterilizzante)• può causare ustioni, si usa per ferite ed abrasioni come antisettico; necessita di catalasi cellulareper formare ossigeno molecolare gassoso e ioni idrossido.• acido peracetico: a concentrazioni anche minore del 1% è sporicida, battericida. è ottimo peroggetti anche inanimati, in quanto non necessita di catalasi cellulare. può danneggiare i tessuti seusato a concentrazione maggiore di 0,3%.• alogeni:• composti di cloro e iodio• ipoclorito di sodio NaOCl - candeggina - amuchina disinfettante per acqua e superfici (inattivato damateriale organico)• cloroamina, meno irritante, utilizzabile anche per antisepsi (2%).• Meccanismo d'azione: fosforilazione ossidativa, ossida enzimi essenziali.• Iodio• soluzione acquosa in ioduro di potassio - collutori• soluzione alcolica - tintura di iodio - antisettico• Meccanismo d'azione: lega proteine e molecole inibendole• iodofori• composti di iodio con un carrier, meno tossici per i tessuti.• Meccansimo d'azione: precipita le proteine ed enzimi essenziali.• alcoli:• alcool etilico (70%)• alcool isopropilico (90%)• spiccata attività sui batteri e virus inviluppati. non sporicidi, bassa attività contro funghi e virusnudi.• Meccanismo d'azione: determinano danni soprattutto alle membrane e denaturano le proteine.• l'alcool puro non è molto efficacie, perche serve almeno una piccola quota di acqua percoadiuvare la degradazione di molecole idrofiliche.• aldeidi:• ottimi disinfettanti• formaldeide, gas a temperatura ambiente, o liquido in soluzione acquosa (37-40%) dettaformalina. è un ottimo disinfettante a quelle concentrazioni. anche se è tossico a quellaconcentrazione. a minor concentrazione acquosa si ottiene il lisoformio.• glutarlaldeide a concentrazioni piu basse (2%) è anche sporicida, ma è tossica e cancerogena• ossido di etilene: impieghi medico chirurgici che non sopportano alte temperature. è un gasaltamente penetrante, pttimo per strumenti complessi.• fenoli:• tossici a concentrazioni elevate. a concentrazioni basse si possono utilizzre come antisettici.____