Mirjam Assmann MIRJAM ASSMANN ERGأ„NZENDE geb.uni- Mirjam Assmann Konventionelle und molekulare Analysen

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    édition scientifique

    VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN

    Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de

    VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique

    9 7 8 3 8 3 5 9 6 2 6 4 4

    ISBN: 978-3-8359-6264-4

    Photo cover: © iLexx - iStockPhoto

    M I R

    J A

    M A

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    Mirjam Assmann

    Konventionelle und molekulare Analysen von

    Trachealsekret, Mekonium und Stuhl zur ergänzenden

    Sepsisdiagnostik von Frühgeborenen unter ©Anwendung der PCR/DHPLC (WAVE )

    Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines

    Doktors der Medizin

    des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen

  • Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt.

    Die rechtliche Verantwortung für den gesamten Inhalt dieses Buches liegt ausschließlich bei dem Autor dieses Werkes.

    Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen

    und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme.

    1. Auflage 2014

    All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted,

    in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior

    written permission of the Author or the Publishers.

    st1 Edition 2014

    © 2014 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany

    VVB LAUFERSWEILER VERLAG

    STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890

    email: redaktion@doktorverlag.de

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    édition scientifique

  • Konventionelle und molekulare Analysen von

    Trachealsekret, Mekonium und Stuhl zur ergänzenden

    Sepsisdiagnostik von Frühgeborenen unter Anwendung

    der PCR/DHPLC (WAVE©)

    INAUGURALDISSERTATION

    zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

    des Fachbereichs Medizin

    der Justus-Liebig-Universität Gießen

    vorgelegt von

    Mirjam Assmann aus Herborn

    Gießen 2014

  • ii

    Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie,

    Justus-Liebig-Universität Gießen,

    Leiter Prof. Dr. Trinad Chakraborty

    Gutachter: Professor Dr. rer. nat. E. Domann

    Gutachter: Professor Dr. med. K.P. Zimmer

    Tag der Disputation: 03.12.2014

  • iii

    meinen Eltern

    Volkmar und Renate Assmann

  • Inhaltsverzeichnis

    iv

    Inhaltsverzeichnis

    1. Erklärung laborspezifischer Begriffe ............................................................................ 1

    2. Einleitung ...................................................................................................................... 4

    2.1 Definition und Epidemiologie der Frühgeburt ....................................................... 4

    2.2 Problematik Frühgeborener .................................................................................... 5

    2.3 Infektionen als Ursache einer Frühgeburt .............................................................. 7

    2.4 Bakterielle Besiedelung von Darmtrakt und unteren Atemwegen bei

    Frühgeborenen ...................................................................................................... 12

    2.5 Sepsis des Frühgeborenen .................................................................................... 15

    2.6 16S-rDNA Approach zur Diagnostik der konnatalen Sepsis, kulturnegativer

    Proben und polymikrobieller Gemeinschaften ..................................................... 17

    2.7 Zielsetzung ........................................................................................................... 20

    3. Materialien und Methoden .......................................................................................... 22

    3.1 Untersuchungen am Menschen ............................................................................ 22

    3.2 Beschreibung des Patientenkollektivs .................................................................. 22

    3.3 Materialien und Geräte ......................................................................................... 25

    3.3.1 Kulturmedien ................................................................................................. 25

    3.3.2 Biochemische Identifikation ......................................................................... 26

    3.3.3 Identifikation durch Resistenzbestimmung ................................................... 26

    3.3.4 DNA-Extraktionsmethoden ........................................................................... 27

    3.3.5 Materialien für die Durchführung der PCR ................................................... 28

    3.3.6 Agarose-Gel und Gelelektrophorese ............................................................. 29

    3.3.7 DNA-Aufreinigung und Sequenzierung ........................................................ 30

    3.3.8 Überblick über die verwendeten Chemikalien und Geräte ........................... 30

    3.4 Methoden .............................................................................................................. 31

    3.4.1 Probengewinnung .......................................................................................... 31

    3.4.2 Verarbeitung der Proben ............................................................................... 32

  • Inhaltsverzeichnis

    v

    3.4.3 Molekulare Identifikation .............................................................................. 34

    3.4.4 Klonierung ..................................................................................................... 35

    3.4.5 PCR/DHPLC ................................................................................................. 36

    3.5 Extraktion von DNA aus Mekonium ................................................................... 39

    3.6 Standardkurven für PCR/DHPLC mit konventioneller PCR und Piko© Thermal

    Cycler ................................................................................................................... 39

    3.7 Statistische Methoden .......................................................................................... 39

    4. Ergebnisse ................................................................................................................... 40

    4.1 Extraktion von DNA aus Mekonium ................................................................... 40

    4.2 Untersuchung von Trachealsekret ........................................................................ 41

    4.3 Untersuchung von Mekonium .............................................................................. 45

    4.3.1 Wachstum auf Agarplatten ............................................................................ 45

    4.3.2 Analyse von Mekonium durch PCR und PCR/DHPLC ................................ 46

    4.3.3 Mikrobiom aus Mekonium der Frühgeborenen ............................................ 51

    4.4 Untersuchung von Stuhl ....................................................................................... 52

    4.4.1 Analyse des Bakterienwachstums auf den Kontrollplatten ........................... 52

    4.4.2 Analyse von Stuhl mit PCR und DHPLC ..................................................... 56

    4.4.4 Analyse aus Bakterienkulturen von Schaedleragar ....................................... 62

    4.5 Zusammenhang zwischen Sepsis bzw. Ursachen der Frühgeburt und

    Ergebnissen aus Mekonium, Trachealsekret und Stuhl ....................................... 64

    4.5.1 Ergebnisse aus Mekonium und Trachealsekret und deren Zusammenhänge

    mit konnataler Sepsis und Frühgeburtlichkeit ............................................... 64

    4.5.2 Ergebnisse aus der Untersuchung von Stuhl und Zusammenhänge mit

    späteinsetzender Sepsis ................................................................................. 67

    5. Diskussion ................................................................................................................... 69

    6. Zusammenfassung und Ausblick ................................................................................ 94

    7. Summary ..................................................................................................................... 97

    8. Liste der verwendeten Abkürzungen ......................................................................... 100

  • Inhaltsverzeichnis

    vi

    9. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ....................................................................... 102

    10. Literaturverzeichnis ................................................................