Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Roma 2-4

Moderne tecniche diagnostiche:dall’ematossilina-eosina alla proteomica

Moderne tecniche diagnostiche:dall’ematossilina-eosina alla proteomica

Roma 2-4 dicembre 2004Roma 2-4 dicembre 2004Roma 2-4 dicembre 2004Roma 2-4 dicembre 2004

Prof. Lorenzo Lo MuzioProf. Lorenzo Lo MuzioProf. Lorenzo Lo MuzioProf. Lorenzo Lo Muzio

CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E

DURI DEL CAVO ORALEDURI DEL CAVO ORALE

CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E

DURI DEL CAVO ORALEDURI DEL CAVO ORALE

Lakhani S.R. and Ashworth A.

NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7



Evoluzione della patologiaEvoluzione della patologia

1621 1660 1800 1940 1980 1990 2000

Debebele & Forsson:

Primo microscopio

Debebele & Forsson:

Primo microscopio

Malpighi:

Microcircolo capillare

Malpighi:

Microcircolo capillare

Virchow:

Basi cellulari delle malattie

Virchow:

Basi cellulari delle malattie

Primo paper su immunoistochimicaPrimo paper su immunoistochimica

PCRPCR

MicroarrayMicroarray

Genoma umanoGenoma umano

??





Microarray and histopathological analysis of tumours:

The future and the past?

Microarray and histopathological analysis of tumours:

The future and the past?

Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA.

Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:650-9


Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA.



Advanced diagnostic methods

in oral and maxillofacial pathology

Part I: Molecular methods

Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods

Advanced diagnostic methods

in oral and maxillofacial pathology

Part I: Molecular methods

Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods

Regezi JA.


Regezi JA.


Guest Editorial

Histopathology meets molecular pathology.

Guest Editorial


“Histopathology remains at the core of disease

diagnosis…..”

“……Don’t ask me to run a gel electrophoresis or extract

DNA from a specimen and amplify it by polimerase chain

reaction….”

“Histopathology remains at the core of disease

diagnosis…..”

“……Don’t ask me to run a gel electrophoresis or extract

DNA from a specimen and amplify it by polimerase chain

reaction….”

Regezi JA.


Regezi JA.


Guest Editorial


Guest Editorial


“Working together (surgical pathologists and molecular scientist), molecular tools can be applied to practical problems to better understand disease mechanisms and improve diagnostic skills, ultimately aiding in the development of rational therapeutic regimens…..”

“Working together (surgical pathologists and molecular scientist), molecular tools can be applied to practical problems to better understand disease mechanisms and improve diagnostic skills, ultimately aiding in the development of rational therapeutic regimens…..”

Definizione etiologica

Patogenesi

Terapia mirata

Prognosi

Definizione etiologica

Patogenesi

Terapia mirata

Prognosi

La biopsia diagnostica

quando e perché?

La biopsia diagnostica

quando e perché?

Membrana e parete

Antigeni parietali / capsulari / somatici / nucleici

Acidi nucleici (DNA / RNA)

Strutture citoplasmatiche

Recettori

Membrana e parete

Antigeni parietali / capsulari / somatici / nucleici

Acidi nucleici (DNA / RNA)

Strutture citoplasmatiche

Recettori

Identificazione di componentiin cito-istopatologia

Strutture identificabili

Identificazione di componentiin cito-istopatologia

Strutture identificabili

microscopia ottica

ematossilina ed eosina

colorazioni speciali

immunocito-istochimica

immunofluorescenza

microscopia elettronica

microscopia confocale

ibridazione molecolare

microscopia ottica




immunofluorescenza




Possibili metodiche istologiche e su tessutiPossibili metodiche istologiche e su tessuti


Esame morfologico (su preparati citologici o bioptici):alterazioni citopatiche nucleo-citoplasmatiche

presenza strutture esogene

Immunoistochimica/immunofluorescenza:antigeni di membrana/citoplasmatici/nucleari

(anche in assenza di evidenti manifestazioni cliniche e/o di alterazioni citomorfologiche)

Ibridazione molecolare:in situ

estrattiva (priva di dettagli morfologici)

Esame morfologico (su preparati citologici o bioptici):alterazioni citopatiche nucleo-citoplasmatiche

presenza strutture esogene

Immunoistochimica/immunofluorescenza:antigeni di membrana/citoplasmatici/nucleari

(anche in assenza di evidenti manifestazioni cliniche e/o di alterazioni citomorfologiche)

Ibridazione molecolare:in situ

estrattiva (priva di dettagli morfologici)

microscopia ottica




immunofluorescenza




microscopia ottica




immunofluorescenza





microscopia ottica colorazioni speciali• Van Gieson (collageno)

• Colorazione tricromica (collageno, fibre muscolari)

• impregnazione argentica (reticolina – collag tipo III, membrana basale – collag IV)

• acido Periodico di Schiff (membrana basale – collageno tipo IV, carboidrati….)

• Ematossilina di Verhoeff (elastina)

• Resorcina (elastina)

• Fucsina (elastina)

• Orceina (elastina)

• Metodo di Feulgen (DNA nucleare)

• Rosso Congo (amiloide)

• Metodo argentico di Masson-Fontana (melanina…)

• Sudan (lipidi)

• Argento-Metenamina di Jones (membrana basale glomerulare)

microscopia ottica colorazioni speciali• Van Gieson (collageno)

• Colorazione tricromica (collageno, fibre muscolari)

• impregnazione argentica (reticolina – collag tipo III, membrana basale – collag IV)

• acido Periodico di Schiff (membrana basale – collageno tipo IV, carboidrati….)

• Ematossilina di Verhoeff (elastina)

• Resorcina (elastina)

• Fucsina (elastina)

• Orceina (elastina)

• Metodo di Feulgen (DNA nucleare)

• Rosso Congo (amiloide)

• Metodo argentico di Masson-Fontana (melanina…)

• Sudan (lipidi)

• Argento-Metenamina di Jones (membrana basale glomerulare)

microscopia ottica colorazioni speciali per microrganismi

• Gram• Ziehl-Neelsen Giemsa• metodo di Wade-Fite (lebbra)

• metodo argentico di Grocott (miceti e Pneumocystis)

• acido Periodico di Schiff (miceti, protozoi, elminti….)

• Giemsa (protozoi, elminti….)

• metodi di Dieterle o Warthin - Starry (spirochete e legionelle)

• orceina di Shikata (HBV)

• colorazione di Lugol• Argento-Metenamina di Gomori

microscopia ottica colorazioni speciali per microrganismi

• Gram• Ziehl-Neelsen Giemsa• metodo di Wade-Fite (lebbra)

• metodo argentico di Grocott (miceti e Pneumocystis)

• acido Periodico di Schiff (miceti, protozoi, elminti….)

• Giemsa (protozoi, elminti….)

• metodi di Dieterle o Warthin - Starry (spirochete e legionelle)

• orceina di Shikata (HBV)

• colorazione di Lugol• Argento-Metenamina di Gomori

Immunoistochimica Immunoistochimica

Prevede il legame di anticorpi primari specifici con l’antigene, l’anticorpo o con il complesso antigene-anticorpo da ricercare.

La positività del test è evidenziato dall’impiego di un anticorpo secondario coniugato con un cromogeno

Prevede il legame di anticorpi primari specifici con l’antigene, l’anticorpo o con il complesso antigene-anticorpo da ricercare.

La positività del test è evidenziato dall’impiego di un anticorpo secondario coniugato con un cromogeno

CromogenoCromogenoCromogenoCromogenoAnticorpo Anticorpo secondariosecondarioAnticorpo Anticorpo secondariosecondario

Anticorpo Anticorpo primarioprimarioAnticorpo Anticorpo primarioprimario

ComplessoComplessoAnticorpo primario –Anticorpo primario –

secondario –secondario –cromogenocromogeno



Cellula targetCellula target

• fissazione in formalina tamponata neutra

(soluzioni acide riducono l’antigenicità tissutale)

• fissazione immediata

• processazione del campione fissato entro 24-48 ore

• sezioni di 4-5 micron

• smascheramento dell’antigene

• amplificazione dell’antigene

• fissazione in formalina tamponata neutra

(soluzioni acide riducono l’antigenicità tissutale)

• fissazione immediata

• processazione del campione fissato entro 24-48 ore

• sezioni di 4-5 micron

• smascheramento dell’antigene

• amplificazione dell’antigene

Standardizzazione della tecnica Standardizzazione della tecnica

La fissazione in paraffina provoca:

• legami proteine-proteine

• legami proteine-acidi nucleici

• legami con ioni calcio

con mascheramento o danneggiamento degli epitopi a causa dell’alterazione tridimensionale delle proteine

Smascheramento antigenico: digestione enzimatica (soluzione di proteasi, tripsina o pepsina), bollitura, forno a microonde….

La fissazione in paraffina provoca:

• legami proteine-proteine

• legami proteine-acidi nucleici

• legami con ioni calcio

con mascheramento o danneggiamento degli epitopi a causa dell’alterazione tridimensionale delle proteine

Smascheramento antigenico: digestione enzimatica (soluzione di proteasi, tripsina o pepsina), bollitura, forno a microonde….

Smascheramento antigenico Smascheramento antigenico

Coniugazione o attacco di un marker enzimatico ad un anticorpo secondario e formazione di un complesso terziario:

• Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC)

• Perossidasi-anti-perossidasi (PAP)

• Fosfatasi Alcalina/anti-Fosfatasi Alcalina (APAAP)

• Envision (Polymer detection)

Coniugazione o attacco di un marker enzimatico ad un anticorpo secondario e formazione di un complesso terziario:

• Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC)

• Perossidasi-anti-perossidasi (PAP)

• Fosfatasi Alcalina/anti-Fosfatasi Alcalina (APAAP)

• Envision (Polymer detection)

Amplificazione antigenica Amplificazione antigenica

CromogenoCromogenoCromogenoCromogenoAnticorpo Anticorpo secondariosecondarioAnticorpo Anticorpo secondariosecondario

Anticorpo Anticorpo primarioprimarioAnticorpo Anticorpo primarioprimario






• uso di sezioni tissutali routinarie

• sistema sensibile (bassi livelli di antigene)

• sistema specifico (dipende da specificità dell’anticorpo)

• uso di sezioni tissutali routinarie

• sistema sensibile (bassi livelli di antigene)

• sistema specifico (dipende da specificità dell’anticorpo)

Vantaggi Vantaggi

• stesso antigene presente in diverse patologie/neoplasie

• reazione con diversi antigeni

• no utile per differenziare lesioni benigne e maligne

• uso di più anticorpi per identificare un tipo specifico di lesione/neoplasia

• soggettività della valutazione per molti antigeni

• necessità di controlli positivi e negativi

• molti anticorpi funzionano solo su sezioni congelate

• stesso antigene presente in diverse patologie/neoplasie

• reazione con diversi antigeni

• no utile per differenziare lesioni benigne e maligne

• uso di più anticorpi per identificare un tipo specifico di lesione/neoplasia

• soggettività della valutazione per molti antigeni

• necessità di controlli positivi e negativi

• molti anticorpi funzionano solo su sezioni congelate

Svantaggi Svantaggi

Identificazione cellulare Identificazione cellulare

Epiteliali Citocheratine (CK)

Mesenchimali Vimentina

Muscolari Desmina

Actine

Mioglobina

miogenina

Neuronali S-100

GFAP

Neurofilamenti

CD57 (NK o tumori neuronali)

Endoteliali CD31

CD34

Fattore VIII

Melanociti HMB45

MART-1

S100

Linfoidi Kappa e lambda

CD3, 15, 20, 30, 45, 68, 79a

ALK-1

TdT

Salivari S100, actina

Antigeni associati ai tumori

Antigeni associati ai tumori

Carcinoma Citocheratine (CK)

Adenocarcinomi Citocheratine (CK)

Rabdomiosarcoma Desmina, Actina, Mioglobina, miogenina, actina muscolo-specifica

Leiomiosarcoma Actina muscolo liscio

neurosarcoma Neurofilamenti, S100

Melanoma HMB45, MART-1 (melan-A), S100

Angiosarcoma e S. Kaposi CD31, 34, fattore VIII

Tumore di Ewing e Neuroendocrini

CD99 (MIC2 gene product)

Cellule di Langerhans CD1a

Tumori Salivari S100, actina, calponina

Limfomi

a cellule B

a cellule T

a grandi cell anaplastiche (Ki-1)

CD45, CD45RB

CD20, CD791, CD45RA

CD3, CD43, CD45RO

CD30 (Ber-H2 clone), ALK-1

Limfoma di di Hodgkin CD15, CD30

Infiltrati leucemici TdT, mieloperossidasi

Mieloma Catene leggere kappa e lambda

Carcinoma neuroendocrino e paraganglioma

Neurofilamenti, cromogranina, sinaptofisina

Tumore a cellule di Merkel Cromogranina, sinaptofisina

Tumore fibroso solitario CD34, CD99, bcl-2

Profilo immunoistochimico

delle metastasi epiteliali

Profilo immunoistochimico

delle metastasi epiteliali

TUMORE PROFILO ANTIGENICO

Polmone (adeno) CK7+ CK20- VILLINA+

Polmone (SCC) CK7- CK20-

Colon CK7- CK20+ VILLINA+

Mammella CK7+ CK20- VILLINA-

Rene CK7- CK20- VILLINA-

Prostata CK7- CK20- PSA+

Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA.Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methodsOral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA.Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methodsOral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

microscopia ottica




immunofluorescenza




microscopia ottica




immunofluorescenza





L’immunofluorescenzaL’immunofluorescenza

Coons AH, Creech HJ, Jones RN

Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.

Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47:200-2.

Coons AH, Creech HJ, Jones RN

Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.

Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47:200-2.

FluorocromoFluorocromoFluorocromoFluorocromo

Anti-Auto AbAnti-Auto AbAnti-Auto AbAnti-Auto Ab

Auto AbAuto AbAuto AbAuto Ab

ComplessoComplessoAuto AbAuto Ab

Anti-Auto AbAnti-Auto AbFluorocromoFluorocromo

ComplessoComplessoAuto AbAuto Ab

Anti-Auto AbAnti-Auto AbFluorocromoFluorocromo

Immunofluorescenza direttaImmunofluorescenza direttaImmunofluorescenza direttaImmunofluorescenza diretta


Introdotta nel 1941 da Coons et al. è basata sul legame chimico tra il fluorocromo e l’anticorpo.

La positività del test è riconducibile all’intensità della colorazione.

Introdotta nel 1941 da Coons et al. è basata sul legame chimico tra il fluorocromo e l’anticorpo.

La positività del test è riconducibile all’intensità della colorazione.

ImmunofluorescenzaImmunofluorescenza

++++

++

IF DIRETTAIF DIRETTA IF INDIRETTAIF INDIRETTA

IgG anti-umane marcate IgG anti-umane marcate con fluorescina (FITC)con fluorescina (FITC)

Siero del pazienteSiero del paziente(con autoAb)(con autoAb) Tessuto di Tessuto di

controllocontrolloBiopsia del pazienteBiopsia del paziente(auto Ab in tessuto)(auto Ab in tessuto)

• identificazione di anticorpi o altre proteine flogistiche in patologie autoimmunitarie

(IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogeno)

• identificazione di antigeni esogeni (virus….)

• identificazione di antigeni o componenti della cellula

• identificazione di anticorpi o altre proteine flogistiche in patologie autoimmunitarie

(IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogeno)

• identificazione di antigeni esogeni (virus….)

• identificazione di antigeni o componenti della cellula

Applicazioni dell’immunofluorescenza diretta Applicazioni dell’immunofluorescenza diretta

Immunofluorescenza in lesioni orali Immunofluorescenza in lesioni orali

Patologia IgG IgA IgM C3 Fibrinogeno

Pemfigo Membr cell neg neg Membr cell neg

Pemfigoide benigno delle mucose

Memb bas lin

Memb bas lin

Memb bas lin

Memb bas lin

neg

Lupus orale Memb bas granul

neg Memb bas granul

Memb bas granul

Memb bas – Lamina superf

Lichen orale Neg Neg Neg Memb bas fin granul

Memb bas – Lamina superf

Eritema multiforme Neg Neg Neg Memb bas fin granul

neg

Malattia lineare a IgA Neg Memb bas Neg Neg Neg

Epidermolisi bollosa acquisita Memb bas wide

Memb bas wide

Neg Memb bas wide

neg

Stomatite ulcerativa cronica Nucleare Neg Neg Neg Memb bas – Lamina superf

Infiammazione cronica aspecifica

neg neg Neg Memb bas fin granul

neg

Immunoistochimica Immunofluorescenza

Vantaggi Buona conservazione del colore

Strutture tissutali facilmente identificabili

Maggiore sensibilità

Tecnica semplice

Migliore contrasto

Facile identificazione di elementi anche molto piccoli

Il risultato è visualizzabile subito dopo la reazione immunologica

Svantaggi Tecnica complessa

Contrasto mediocre

Non identifica l’enzima marcato ma i prodotti della reazione

La fluorescenza decade rapidamente

Strutture tissutali difficilmente identificabili

Necessità di microscopio a fluorescenza

Sezioni immediatamente congelate o trattate

Steroidi topici falsi negativi (1 mese)

Vantaggi e svantaggiVantaggi e svantaggi

IF

Ep

IHC

Laminina 5: immunoistochimica ed immunofluorescenzaLaminina 5: immunoistochimica ed immunofluorescenza

microscopia ottica




immunofluorescenza




microscopia ottica




immunofluorescenza





Microscopia confocale laserMicroscopia confocale laser

White JG, AmosWBand FordhamM.An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. Journal of Cell Biology 1987; 105: 41–48.

White JG, AmosWBand FordhamM.An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. Journal of Cell Biology 1987; 105: 41–48.

Sorgente laser

Monitor

Monitor

Preparato

Obiettivo

Digital ImagingSystem

Testa dello scanner

Introdotto negli anni 80 permette di ottenere:

• immagini prive di fluorescenze dovute a strutture non poste sul piano focale

• maggiori dettagli delle cellule• ricostruzione 3D delle immagini.

Introdotto negli anni 80 permette di ottenere:

• immagini prive di fluorescenze dovute a strutture non poste sul piano focale

• maggiori dettagli delle cellule• ricostruzione 3D delle immagini.

microscopia ottica




immunofluorescenza




microscopia ottica




immunofluorescenza





Microscopia ottica Microscopia elettronica

Osservazione diretta con colori originali Osservazione indiretta su schermo. Foto solo in bianco e nero

Modesto ingrandimento, fino a 1500x, ma ampio campo e facile orientamento

Notevole ingrandimento fino a 2,000,000x

Potere di risoluzione fino a 0.25 µm. Potere di risoluzione fino a 1 nm (0.001µm.)

Sezioni criostatate anche solo 20 minuti. Almeno 24 ore

Possibili artefatti Buona fissazione e preparazione assicurano alta risoluzione, notevole ingrandimento e pochi artefatti

Lo spessore delle sezioni (1-30 µm) permette una ridotta profondità di campo per poter avere 3D della struttura esaminata. Necessarie sezioni seriate.

Sezioni supersottili, ma le informazioni 3-D possono essere ottenute: (a) sezioni più spesse con ME as alto voltaggio; (b) SEM (scanning electron microscopy)

Le colorazioni sono usate selettivamente e la maggior parte dei materiali e delle strutture non può essere esaminata nello stesso momento

La colorazione con metalli pesanti permette una migliore comprensione delle strutture cellulari: membrane, granuli, filamenti, cristalli….

Campioni grandi e vivi Campioni molto piccoli, difficili da gestire

Costi ridotti Costi notevoli

microscopia ottica




immunofluorescenza




microscopia ottica




immunofluorescenza





Ibridazione molecolare

In situ:

Isotopica

Cromogenica (C.I.S.H.)

Fluorescente (F.I.S.H.)

Estrattiva:

Dot blotting

Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)


In situ:

Isotopica

Cromogenica (C.I.S.H.)

Fluorescente (F.I.S.H.)

Estrattiva:

Dot blotting


Ibridazione molecolare In situ

Ibridazione molecolare In situ

L'ibridazione in situ rivela acidi nucleici in campioni cito-istologici morfologicamente preservati.

La tecnica prevede la formazione di ibridi di acidi nucleici costituiti da DNA endogeno a catena unica (denaturata) o mRNA e da una sequenza complementare di acidi nucleici esogeni a singola catena marcata con radioisotopo, con tracciante fluorescente (FISH) o con cromogeni osservabili in microscopia ottica (CISH).

L'ibridazione in situ rivela acidi nucleici in campioni cito-istologici morfologicamente preservati.

La tecnica prevede la formazione di ibridi di acidi nucleici costituiti da DNA endogeno a catena unica (denaturata) o mRNA e da una sequenza complementare di acidi nucleici esogeni a singola catena marcata con radioisotopo, con tracciante fluorescente (FISH) o con cromogeni osservabili in microscopia ottica (CISH).

Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64:600-4. John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223:582-7.


Fissazione

Denaturazione

Ibridizzazione

Ibridazione molecolare - In situIbridazione molecolare - In situ

Applicazioni cliniche

Identificazione di • DNA o RNA estraneo

(virus, funghi, batteri e parassiti coltivabili con difficoltà o non coltivabili in vitro - es.: HPV e Pneumocystis carinii)

La metodica, inoltre, consente la definizione specifica di tipo e ceppo.

• Alterazioni del DNA cellulare

(amplificazione genica, traslocazioni…)• Mutazioni geniche• Espressione corretta o alterata di RNA cellulare (prodotti

genici)

Applicazioni cliniche

Identificazione di • DNA o RNA estraneo

(virus, funghi, batteri e parassiti coltivabili con difficoltà o non coltivabili in vitro - es.: HPV e Pneumocystis carinii)

La metodica, inoltre, consente la definizione specifica di tipo e ceppo.

• Alterazioni del DNA cellulare

(amplificazione genica, traslocazioni…)• Mutazioni geniche• Espressione corretta o alterata di RNA cellulare (prodotti

genici)

Ibridazione molecolare FISH

Ibridazione molecolare FISH

La FISH (Fluorescence in situ hybridization) è usata per mappare i geni sui cromosomi e caratterizzare le anomalie cromosomiche: una sonda di DNA, marcata con biotina e specifica per un segmento cromosomico o un intero cromosoma (metafase) è ibridizzata ai cromosomi.

Dopo il lavaggio si evidenzia la marcatura incubando con un anticorpo anti-biotina marcato con fluorocromo.

La FISH (Fluorescence in situ hybridization) è usata per mappare i geni sui cromosomi e caratterizzare le anomalie cromosomiche: una sonda di DNA, marcata con biotina e specifica per un segmento cromosomico o un intero cromosoma (metafase) è ibridizzata ai cromosomi.

Dopo il lavaggio si evidenzia la marcatura incubando con un anticorpo anti-biotina marcato con fluorocromo.




FISH


FISH

La FISH può essere usata per determinare:

• Delezioni cromosomiche

• Traslocazioni

• Riarrangiamenti

• Amplificazioni

La FISH può essere usata per determinare:

• Delezioni cromosomiche

• Traslocazioni

• Riarrangiamenti

• Amplificazioni

Glassman AB. Cytogenetics, in situ hybridization and molecular approaches in the diagnosis of cancer. Ann Clin Lab Sci 1998;28:324-30.

Okami K et al. Cyclin D1 amplification is independent of p 16 inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1999;18:3541-5.

Glassman AB. Cytogenetics, in situ hybridization and molecular approaches in the diagnosis of cancer. Ann Clin Lab Sci 1998;28:324-30.

Okami K et al. Cyclin D1 amplification is independent of p 16 inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1999;18:3541-5.

Ibridazione molecolare Estrattiva:

Non amplificata

Dot blotting

Southern Blot (DNA)

Northern Blot (RNA)

Western Blot (Proteine)

Amplificata


Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)


Non amplificata

Dot blotting

Southern Blot (DNA)

Northern Blot (RNA)


Amplificata



SOUTHERN BLOT per DNA

(Dr. Edward Southern, 1975)

• Taglio con enzimi di restrizione (frammentazione riproducibile del DNA)

• Separazione dei frammenti di restrizione tramite elettroforesi su gel

• Denaturazione del DNA e trasferimento (blotting) dal gel ad un substrato solido (filtro di nylon o nitrocellulosa)

• Incubazione del filtro con con una sonda molecolare specifica, marcata con radioisotopo

• Evidenziazione dei frammenti ibridizzati con la sonda tramite autoradiografia.

SOUTHERN BLOT per DNA

(Dr. Edward Southern, 1975)

• Taglio con enzimi di restrizione (frammentazione riproducibile del DNA)

• Separazione dei frammenti di restrizione tramite elettroforesi su gel

• Denaturazione del DNA e trasferimento (blotting) dal gel ad un substrato solido (filtro di nylon o nitrocellulosa)

• Incubazione del filtro con con una sonda molecolare specifica, marcata con radioisotopo

• Evidenziazione dei frammenti ibridizzati con la sonda tramite autoradiografia.

11

3322

44

55

66

77

88

Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:503-17.

Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:503-17.

NORTHERN BLOT per RNANORTHERN BLOT per RNA

• Linearizzazione delle molecole di RNA in agente denaturante (formaldeide)

• Separazione del RNA tramite gel elettroforesi

• Trasferimento su filtro di nitrocellulosa

• Incubazione con una sonda marcata

• Autoradiografia.

• Linearizzazione delle molecole di RNA in agente denaturante (formaldeide)

• Separazione del RNA tramite gel elettroforesi

• Trasferimento su filtro di nitrocellulosa

• Incubazione con una sonda marcata

• Autoradiografia.

Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. PNAS 1977;74:5350-4.

Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. PNAS 1977;74:5350-4.

WESTERN BLOT per proteine

• Separazione di molecole proteiche in base al peso molecolare (estensione dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide)

• Trasferimento dal gel a filtro di nitrocellulosa

• Incubazione con anticorpo specifico per la proteina in esame

• Visualizzazione del complesso antigene (proteina)/anticorpo legato alla proteina con sistema anti-immunoglobulina biotinilata e successiva rivelazione cromogena

WESTERN BLOT per proteine

• Separazione di molecole proteiche in base al peso molecolare (estensione dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide)

• Trasferimento dal gel a filtro di nitrocellulosa

• Incubazione con anticorpo specifico per la proteina in esame

• Visualizzazione del complesso antigene (proteina)/anticorpo legato alla proteina con sistema anti-immunoglobulina biotinilata e successiva rivelazione cromogena


Non amplificata

Dot blotting

Southern Blot (DNA)

Northern Blot (RNA)


Amplificata




Non amplificata

Dot blotting

Southern Blot (DNA)

Northern Blot (RNA)


Amplificata



Polymerase Chain Reaction

(P.C.R.)

Polymerase Chain Reaction

(P.C.R.)

Procedura elaborata da Kary Mullis (premio Nobel) nel 1985.

Metodica di amplificazione sequenziale ed evidenziazione del DNA (qualora presente in esiguo numero di copie) che permette di ottenere una quantità di acido nucleico misurabile e caratterizzabile.

Procedura elaborata da Kary Mullis (premio Nobel) nel 1985.

Metodica di amplificazione sequenziale ed evidenziazione del DNA (qualora presente in esiguo numero di copie) che permette di ottenere una quantità di acido nucleico misurabile e caratterizzabile.

• Denaturazione delle doppie eliche di DNA

• Incubazione con due primers (oligonucleotidi, 20 basi) che corrispondano alle estremità del tratto di DNA che si vuole amplificare (primer di avvio e di stop)

• Aggiunta di nucleotidi e DNA-polimerasi termostabile.

• Sequenza di cicli di riscaldamento (denaturazione, copiatura ed estensione della sequenza) e raffreddamento (accoppiamento della catena neo-sintetizzata con quella originaria/stampo)

• Ripetizione per un numero di cicli sufficienti ad ottenere un numero di copie identificabili

• Denaturazione delle doppie eliche di DNA

• Incubazione con due primers (oligonucleotidi, 20 basi) che corrispondano alle estremità del tratto di DNA che si vuole amplificare (primer di avvio e di stop)

• Aggiunta di nucleotidi e DNA-polimerasi termostabile.

• Sequenza di cicli di riscaldamento (denaturazione, copiatura ed estensione della sequenza) e raffreddamento (accoppiamento della catena neo-sintetizzata con quella originaria/stampo)

• Ripetizione per un numero di cicli sufficienti ad ottenere un numero di copie identificabili



(4 copie)

Riscaldamento

Riscaldamento

RiscaldamentoRaffreddamento

Raffreddamento

Raffreddamento

DenaturazioneDenaturazione

Aggiunta PrimersAggiunta Primers

Riassociazione PrimersRiassociazione Primers

Ciclo 1°

Sequenza target

DNA polimerasi, Nucleotidi

Allungamento primersAllungamento primers

P P

PP

P P

P

P

PP

P

P

P

P

Ciclo 2°

Ciclo 3°

(8 copie)

(2 copie)

Sequenza targetSequenza target

P

PP

• Semplificata ed impiegata su vasta scala dall’avvento di apparecchi

che effettuano automaticamente i cicli di denaturazione/ copiatura a

temperature variabili (DNA Thermal Cycler)

• Per scopi diagnostici, consente di individuare anche una singola

copia di acido nucleico

• Nuove tecniche derivate: RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, In

situ PCR, Quantitative PCR

• Semplificata ed impiegata su vasta scala dall’avvento di apparecchi

che effettuano automaticamente i cicli di denaturazione/ copiatura a

temperature variabili (DNA Thermal Cycler)

• Per scopi diagnostici, consente di individuare anche una singola

copia di acido nucleico

• Nuove tecniche derivate: RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, In

situ PCR, Quantitative PCR

Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)


Applicazioni

MICROBIOLOGIA L’uso della PCR ha rivoluzionato la diagnosi e lo studio delle patologie ad etiologia infettiva: la PCR ha risolto molti problemi connessi alle tecniche diagnostiche tradizionali (microscopia ottica, colture cellulari…) e l’individuazione di DNA o RNA appartenente all’agente biologico permette una diagnosi sicura e veloce.

L’esame di materiale di archivio ha permesso di stabilire il ruolo di alcuni agenti infettivi in molte neoplasie (HPV e ca della cervice uterina, Epstein-Barr virus e neoplasie post-trapianto, Human Herpesvirus 8 e sarcoma di Kaposi)

Applicazioni

MICROBIOLOGIA L’uso della PCR ha rivoluzionato la diagnosi e lo studio delle patologie ad etiologia infettiva: la PCR ha risolto molti problemi connessi alle tecniche diagnostiche tradizionali (microscopia ottica, colture cellulari…) e l’individuazione di DNA o RNA appartenente all’agente biologico permette una diagnosi sicura e veloce.

L’esame di materiale di archivio ha permesso di stabilire il ruolo di alcuni agenti infettivi in molte neoplasie (HPV e ca della cervice uterina, Epstein-Barr virus e neoplasie post-trapianto, Human Herpesvirus 8 e sarcoma di Kaposi)

Schneider A et al. Screening for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia and cancer by testing for high-risk HPV, routine cytology or colposcopy. Int J Cancer 2000;89:529-34.

Marchioli CC et al. Prevalence of human herpesvirus 8 DNA sequences in several patient populations. J Clin Microbiol 1996;34:2635-8.

Mathis A et al. Simplified sample processing combined with a sensitive one-tube nested PCR assay for detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35:1691-5.

Honda J et al. Clinical use of capillary PCR to diagnose Mycoplasma pneumonia. J Clin Microbiol 2000;38:1382-4.

Schneider A et al. Screening for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia and cancer by testing for high-risk HPV, routine cytology or colposcopy. Int J Cancer 2000;89:529-34.

Marchioli CC et al. Prevalence of human herpesvirus 8 DNA sequences in several patient populations. J Clin Microbiol 1996;34:2635-8.

Mathis A et al. Simplified sample processing combined with a sensitive one-tube nested PCR assay for detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35:1691-5.

Honda J et al. Clinical use of capillary PCR to diagnose Mycoplasma pneumonia. J Clin Microbiol 2000;38:1382-4.


GENETICA

La PCR è utile nell’identificazione di disordini cromosomiali e patologie ereditarie, come la fibrosi cistica, la malattia di Gaucher, il deficit della alfa-1-antitripsina, l’emofilia, la trisomia 21, la sindrome di Turner, la NBCCS.

Thomas MR et al. The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation. Prenat Diagn 1995;15:641-6.

Lo YM et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989;2:1363-5.

Tutschek B et al. Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation: molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy. Prenat Diagn 1995;15:951-60

Thomas MR et al. The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation. Prenat Diagn 1995;15:641-6.

Lo YM et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989;2:1363-5.

Tutschek B et al. Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation: molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy. Prenat Diagn 1995;15:951-60


ONCOLOGIA

La PCR ha rivoluzionato lo studio dei tumori: permette la detenzione di mutazioni in oncogeni associati al tumore (K-ras, N-ras….), geni soppressori del tumore (p53, p16), traslocazione cromosomiale (cromosoma Filadelfia, t(14;18) in LMC.

ONCOLOGIA

La PCR ha rivoluzionato lo studio dei tumori: permette la detenzione di mutazioni in oncogeni associati al tumore (K-ras, N-ras….), geni soppressori del tumore (p53, p16), traslocazione cromosomiale (cromosoma Filadelfia, t(14;18) in LMC.

Sarkar FH et al. A universal method for the mutational analysis of K-ras and p53 gene in non–small-cell lung cancer using formalin-fixed paraffin embedded tissues. Diagn Mol Pathol 1995;4:266-73.

Stenmark-Askmalm M et al. Cellular accumulation of p53 protein: an independent prognostic factor in stage II breast cancer. Eur J Cancer 1994;30A:175-80.

Shahnavaz SA et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol 2000; 190:417-22.

Liu L et al. Mutation of the CDKN2A 5´ UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet 1999;21:128-32.

Baker SJ et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 1989;244:217-21.

Sarkar FH et al. A universal method for the mutational analysis of K-ras and p53 gene in non–small-cell lung cancer using formalin-fixed paraffin embedded tissues. Diagn Mol Pathol 1995;4:266-73.

Stenmark-Askmalm M et al. Cellular accumulation of p53 protein: an independent prognostic factor in stage II breast cancer. Eur J Cancer 1994;30A:175-80.

Shahnavaz SA et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol 2000; 190:417-22.

Liu L et al. Mutation of the CDKN2A 5´ UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet 1999;21:128-32.

Baker SJ et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 1989;244:217-21.

Tecniche per identificare materiale genetico

Tecnica Campione Metodica Vantaggi Svantaggi

PCR 10-25 ng of DNA o meno

Gel e col. fluorescente

Radioattiva

Estremamente sensibile, specifica

Flessibile ed adattabile

Spesso troppo sensibile (falsi-positivi)

Contaminazione

RT-PCR <1 ng di RNA totale

<1 × 104 cells

Gel e col. fluorescente

Radioattiva

Estremamente sensibile, specifica

Flessibile ed adattabile

Spesso troppo sensibile (falsi-positivi)

Contaminazione

No informazioni su dimensioni mRNA

Southern blot

10-20 µg di DNA Radioattiva

Chemiluminescente

Colorimetrica

Notizie dimensioni DNA

Quantificazione del numero copie di gene

Tempo

Trasferimento su membrana

Ibridizzazione

Molto DNA alta qualità

Northern blot

5 µg di poly (A)+ mRNA

10-20 mg di RNA totale

Radioattiva

Chemiluminescente

Colorimetrica

Notizie dimensioni RNA

Quantificazione accurata espressione mRNA

Tempo

Trasferimento su membrana

Ibridizzazione

Molto RNA alta qualità

Target e metodo diagnostico

Target Identificazione Quantificazione Localizzazione

Molecola WB

Southern

Northern

Immunoprecipitazione

Agglutinazione

Radioimmunoassay

ELISA

Colorazione tessuto e microscopia(ottica, fluorescenza, confocale, elettronica…)

Cellula Citometria di flusso

Microscopia

Citometria di flusso

Videoanalisi di immagine

Colorazione tessuto e microscopia(ottica, fluorescenza, confocale, elettronica…)

Documents

Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Roma 2-4