MODIFICARI SI MUTAGENEZA

7.1 Introducere

Pană în prezent am vazut cum se cloneaza anumite secvente şi cum se identifică. Cu toate acestea, de multe ori este necesar să modificam anumite secvente înainte de a le utiliza. Aici avem doar 3 situaţii în care trebuie să procedam astfel:

a) Încercăm să identificăm promotorii şi segvenţele de reglementare, şi trebuie să se facă o probabilă mutaţie sau secventă de reglementare pentru a vedea daca afectează eficienţa de transcriere-deschidere.

b) Suntem interesaţi în ce ordine structura unei proteine determina funcţia sa. Prin urmare este necesar să se modifice codonul unui aminoacid, noi credem că este site-ul activ al unei enzime şi apoi evaluarea efectelor acelor schimbari ale activităţii catalitice. O schimbare trimisă unei parţi particulare unei proteine ca o modalitate de sondare între structură şi funcţie sau modificarea funcţiei în mod controlat se numeşte ingineria proteinelor.

c) Genele sunt adesea clonate fară a inţelege adesea pe deplin rolul pe care proteinele le au în codarea celulelor. Evaluând acest rol poate fi posibil prin inactivarea genei endogen în organism să genereze o tulpină mutant. Această abordare este numită adesea genetică inversă, pentru a sublinia contrastul cu abordarea tradiţionala prin care o tulpină transportă o mutatie cu efecte specifice, gena clonată relevant este întâi caracterizată şi analizată ulterior.

Dar ce fel de mutatie este necesara , stergere, inserare, substituire, etc, va depinde de problemele biologice particulare urmărite. Au constitui o mutaţie , este foarte important de verificat prin tehnici adecvate, dacă întradevar au fost făcute corect mutaţiile şi de asemenea ca nu au mai fost create altele ca rezultat a tehnicilor folosite. Aprobarile pentru a face mutaţii pot fi împartite în 2 clase: cei care se bazează pe enzime de restricţie şi cei care se bazează pe oligonucleotide adresate sintezei AND. Ne vom ocupa mai întai de categoria mai veche.

7.2. Metode bazate pe enzime de restricţie

Putem exploata enzime de restricţie, AND polimeraza si alte enzime pentru a face o varietate de modificari. Acestea includ introducera site-urilor de restricţie şi generarea de inserari sau deletii.

Cosorianu Dana (Cimpoesu)

Ghergut Fabiana

Trasnea Ioana Alexandrina (Susan)

7.2.1. Îndepărtarea site-urilor de restricţie

Site-urile pot fi mutate cu ajutorul procedurii subliniat în figura de mai jos. AND-ul este taiat cu enzima de restricţie al carui sites dorim sa eliminam capetele esalonate. Acestea sunt interpretate aliniate şi umplute cu AND polimeraza sau degradate cu exonucleaze. Capetele sunt apoi religated. Rezultatul net este o inserare mica sau stergere care distruge site-ul de recunoaştere. Repetarea cu enzime de restrictie va lineariza orice moleculă în care site-ul nu a fost cu succes perturbat. O serie de probleme pot fi întâlnite în această abordare.

Fig. 7.1 Deleţia unui site de restricţie

1. Pot exista mai multe site-uri de restricţie. Pot exista mai multe site-uri ţintă pentru enzima în moleculă. În acest caz , asimilarea iniţală ar trebui să fie parţială astfel încât moleculele sunt în reducere medie pe un singur amplasament. Va fi necesar să se faca un plan cu moleculele generate pentru a se gasi un site distrus corect.

1. Enzima nu da capete esalonate . În acest caz este necesară o deletie mică a site-ului care utilizează exonucleaze sau o mica inserţie utilizand oligonucleotide sintetice.

2. Ne poate perturba o secvenţă functională. Daca site-ul de restricţie apare într-o secvenţă funcţională ca un promotor sau o proteină de codificare , eliminarea site-ului poate avea consecinţe nedorite. Acest lucru este în special succeptibil de a fi adevarat în cazul în care sunt implicate proteine care codifică regiunea, deoarece procedura prezentată în figura 7.1 în mod normal, generează inserările sau ştergerile a 2 sau 4 perechi de bază. Procedura va introduce o mutaţie într-un cadru de lectura deschis. Această problemă poate fi evitată prin inserare sau deletie. O alternativă ar putea fi folosirea oligonucleotidei specifice mutagenezei pentru a schimba secvenţa site-ului de restricţie fără introducerea frameshift.

7.2.2 Introducerea site-ului de resStricţie

Site-uri de restricţii suplimentare pot fi introduse lângă un site existent de restricţie prin inserarea unei nucleotide sintetizate adecvat şi transportarea secventei corespunzatoare. Un exemplu important este construcţia secventei polylinkerin pUC si vectorul M13. Acest lucru sa realizat initial prin inserarea oligonucleotidei în EcoRI site in lacZ minigene. De asemenea, este posibilă introducerea site-urilor de restricţie de catre oligonucleotidele ghidate mutagenetic ca urmare a unei regiuni ce contine o secventă asemanatoare dar nu identică cu un site de restricţie.

7.2.3. Generarea inserţiei

Inserţiile sunt destul de uşor generate de obicei prin taierea unui site de restricţie potrivit iar apoi incarcarea cu AND polimeraza, sau oligonucleotide sintetizate chimic, sau un fragment de restricţie potrivit din alta parte.

7.2.4 Formarea de deleţii

Mici deleţii la site-ul de restricţie pot fi generate prin tăierea şi degradarea capetelor mononucleare cu o exonucleotidă. Uneori ştergerea unor regiunie este înlocuita de catre un alt fragment de AND de lungime egala, astfel încât să nu se perturbe spaţierea dintre alte regiuni de control, care poate fi importante. Aceastea se numesc linker-ul de scanare.

7.3 Oligonucleotide induse mutagenetic

Utilizarea metodei oligonucleotidelor induse a fost un eveniment important în acest domeniu. Inainte ca acesta metodă să se utilizeze sau exploatat tehnici care includ folosirea ionilor de bisulfit la reziduurile de aminate Cin single-stranded regions to U residues, si eruarea predispusa sintezei AND.

7.3.1 Mutageneză fără utilizarea de PCR

Aceasta este rezumată in figura 7.2. Vom începe cu ADN-ul clonat pentru regiunea care va suferi mutaţii, care va fi un şablon pentru sinteza ADN-ului.putem folosi o singură împletitură preparată de AND (single-stranded) folosind unul din vctorii filamentosi, sau dsDNA preparat de un vector conventional. O oligonucleotidă care este sintetizată şi a carei secvenţă conţine o mutaţie se vrea să se realizeze dar este complementară sablonului ADN. Oligonucleotidei ii este permis să işi refacă şablonul. Dacă şablonul este dublu rasucit mai întâi trebuie să fie separat prin incalzire sau prin denaturare alcalină. După reincalzirea oligonucleotidei este adaugat AND polimeraza si dNTPs . O molecula dublu rasucită este inchisă covalent cu ligaze şi şi conţine o nepotrivire de la site-ul de mutaţie. Acesta este reintrodus apoi In E. coli. Replicarea va genera doua tipuri de molecule: una cu secvenţă de tip sălbatic şi una cu secvenţa mutant. În cazul în care reparaţia are loc înaintea replicarii atunci moleculele vor fi de tip salbatic sau toate mutante în functie de direcţia de reparaţie.

Fig. 7.2 Oligonucleotide mutagenetice: racţia de baza. Mutaţiile care trebuiesc facute sunt notate cu *

Mutaţie fixată sau tipul sălbatic generat

Dubla transformare a nepotrivirilor care are loc în EcoliRepararea şi/sau replicarea are loc

Catena secundară sintetizată

Oligo greşită legată la ADN monocatenar

Dacă această reparaţie nu are loc şi o populaţie mixtă de molecule poate să fie prezentă în fiecare celulă gazdă atunci moleculele trebuiesc separate prin scoaterea repetată din celula gazda a coloniilor unice. Secvenţierea AND poate fi folosită pentru a verifica dacă mutaţia dorită a fost incorporată sau dacă au fost generate si alte mutaţii nedorite. Există mai multe modificări la această abordare de bază.

a) Mai mult de un site poate fi modificat la timp folosind o oligonucleotidă cu mai mult decat o nepotrivire a secventei ţintă.

b) Mai multe mutaţii diferite pot fi facute în acelaşi site folosind o oligonucleotidă cu un site combinat. Secvenţierea AND molecular mutant reizolat de gazdă poate fi folosit pentru a verifica ce mutaţii au fost generate. Folosirea unui site combinat într-o oligonucleotidă pentru a genera mai multe mutatii se numesc cassette mutagenesis. Este posibil sa genereze un număr mare de mutaţii foarte rapid în acest fel. De exemplu, o oligonucleotidă cu două site triplu mixte ar putea genera 15 secvenţe mutante diferite (6 mutatii simple si 9 mutatii duble).

c) Daca secventa ţintă este de la o genă mare atunci va fi mai usor de a substitui o clonă un fragment de restricţie de la ea, verificarea mutaţiei de catre secvenţă iar apoi reasamblarea genei prin înlocuirea fragmentului de restricţie cu un mutant. Aceasta reduce schimbarile nedorite a mutaţiilor suplimentare la alte situsuri la gena ţintă.

7.3.2 Mutageneza utilizand PRC

Dacă folosim un singur ciclu din sinteza ADN mutant, putem folosi PRC pentru a efectua mai multe cicluri de sinteză. Ca înainte, principiul este de a utiliza un grund care transportă mutaţiile necesare. Abordarea este numită metoda "megaprimer". Aceasta este o abordare în două etape şi foloseşte trei oligonucleotide iniţiale. Două dintre ele sunt manevre initiale, revenind la capetele genei tintă. A treia ardere a site-ul ţintă şi conţine mutaţiile necesare. PRC utilizează un mutagen primar si unul de prima generatie un produs care corespunde genei. Acesta este megaprimer. Al doilea PRC este apoi efectuat utilizând mega-primer si un al doilea primer. Produsul acesta este între gena cu mutaţie încorporată, şi poate fi clonat şi ordonat în acelasi fel. Cea de a doua este similară cu metoda întalnită in capitolul 7.3.1. rezultă că ampificarea PCR a secvenţei ţintă clonate ce utilizează dubla legatură a AND si doua primers . Aceasta ardere a site-ul transportă mutaţiile necesare si sinteza directă în directia opusă ce reiese din imaginea 7.4.dupa repetarea sintezei moleculele sunt introduse în celulele gazdă. Majoritatea AND-ului este din nou sintetizat si contine primeri transportaţi de secvenţa mutant. AND-ul recuperat după transformarea din celulele gazdă ar trebui să fie adecvat secventei dorite.

Fig.7.3.Mutageneza cu ajutorul primerilor.Pentru simplificare, este arătat doar produsul care conține secvența mutantă.Asterixul indicămutația care trebuie făcută.

PCR este uneori folosit pentru a obține molecule de ADN cu una sau mai multe mutații aleatoare decât molecule cu mutații specifice. Acestea se numesc erori PCR. Un PCR se realizează cu primeri care sunt complet adaptați la șablon, dar în condiții în care există este o rată ridicată de eroare în sinteza ADN-ului. Aceasta include utilizarea de concentrații crescute de ioni de magneziu și mangan, și concentrații inegale de dNTP-aze. Este folosită frecvent enzimaTaq-polimeraza.

7.3.3 Creșterea recuperării secvențelor mutante

În abordările descrise în secțiunile 7.3.1 și 7.3.2, ar fi de așteptat ca majoritatea moleculelor produse să fie mutante. Cu toate acestea, multe ori în mod empiric se

reface secvența de tip sălbatic după transformare mai des decât se așteaptă. O serie de factori pot contribui la această prejudecată în care moleculele sunt refăcute. Materialul nou sintetizat obținut prin metoda prezentată în figura 7.4 poate să mai conțină încă crestături și să fie susceptibil la degradare într-o celulă gazdă. De asemenea, unele molecule pot fi în măsură să se reproducă mai repede decât altele, sau pot afecta diferit viabilitatea gazdă. În cele din urmă, refacerea nepotrivită ar putea fi influențată într-o anumită direcție. Prin urmare, frecvența cu care sunt obținute mutante ar putea fi atât de scăzută încât trebuie luate măsuri pentru a o îmbunătăți. Există două abordări. Una este de a oferi o selecție pentrusecvența mutantăiar cealaltă este de a degrada moleculele de tip sălbatic.Întâi ne vom ocupa deutilizarea selecției.

PCR cu megaprimer și al doilea primer flancat

Secvența mutantă

Produsul PCR cu secvența mutantă, constituirea megaprimerului

Primul PCR cu primer cu secvența mutantă și flancarea primerului

Gene cu reper pentru mutație

Fig 7.4 Mutageneza folosind doi primeri mutageni. Printre produși sunt molecule care poartă mutația dorită pe ambele părți.Materialul nou sintetizat poate conține crestături.

1. Selecția secvenței mutante. Această abordare (Figura 7.5) este potrivită pentru metode care nu sunt bazate de PCR. Se folosește un vector care conține (în plus față de o genă rezistentă la un antibiotic convențional,de exemplu rezistența la ampicilină) o genă pentru rezistența la un al doilea antibiotic, dar care nu este funcțional din cauza unei mutații punct (res în figura 7.5). Pe lângă primerulmutagenicpentru a direcționa mutația de interes este folosită a douaoligonucleotidămutagenică care va reda genei mutante rezistență la antibiotice și o va face funcțională. Ambele oligonucleotide sunt utilizate simultan în reacția de sinteză a celei de-a doua componente. După sinteza și ligarea celei de-a doua componente pentru a închide orice crestături, produșii sunt introdușiîntr-unE.coligazdă de transformare. Aceasta gazdă poartă mutația mutS, deci oreparare a nepotrivirilor nu are loc.Odată ce transformanții au fost selectați (în acest caz, folosind ampicilina) aceștia sunt selectați pentru rezistența la cel de-al doilea antibiotic. Plasmidele din acești transformanțiau fost derivate din a doua componentăși sintetizate folosindoligonucleotidemutagenice. Plasmidele ar trebuie de asemenea să aibă secvența mutantă la locul țintă. (O procedură similară folosește o genă mutantă lacZ în locul celei de-a doua gene rezistentă la antibiotic, permițând selecția cromogenică, mai degrabă decât selecția directă a antibioticului). Folosind două oligonucleotide în acest mod necesită un control atent al condițiilor de normalizare, astfel încât,cât mai multe molecule șablon să aibă ambeleoligonucleotide legate.

PCR folosind primerimutagenici

Fig 7.5 Mutageneza oligonucleotidei

Fig 7.5Mutageneza oligonucleotidei care încorporează selecția pentru moleculele mutante. Secvența capabilă de a conferi rezistența la antibiotice este indicată de res, iar asteriscul indică mutațiace trebuie făcută.

Selecția pentru rezistența antibiotică prin urmare selectează de asemenea mutația.

Replicarea cu prima componentă ca șablon dă molecule cu secvența de tip sălbatic și gena rezistenta la antibiotice nefuncțională

Replicarea cu a doua componentă ca șablon oferă molecule cu secvență mutantă și gena rezistentă la antibiotice funcțională

Transformarea în Ecolia mutantei pentru mutS.Molecule replicate

Catena secundară sintetizată

Oligonucleotidemutage și rezistente la antibiotice (catena șablon nu are gena rezistentă la antibiotic)

2. Utilizarea de nucleotidephosphorothioratepentru a influența repararea nepotrivirilor în vitro. Această abordare este potrivită pentru a fi utilizată cu metoda simplă de sinteză a componentei secundare. Aceasta folosește o formă de reparație a nepotrivirilor in vitro, care se bazează pe folosirea nucleotidelor analoage phosphorothiorate. Structura generală a acestor analogii este prezentată în Figura 7.6. Înlocuirea unui atom de oxigen cu un atom de sulf în aceste nucleotideredă ADN-ul care conține astfel de reziduuri rezistente la atacul unui număr de nucleaze, incluzând endonucleaza de restricție NciI și exonucleaza III. Acest fapt este exploatat în modul următor. ADN-ul țintă și oligonucleotida mutagenă sunt recoapte (normalizate) ca de obicei și sinteza componentei secundare este apoi realizată utilizând cel puțin o nucleotide phosphorothiorată. Apoi se va trata ADN-ul cu NciI. Acest lucru reduce prima componentă, care rezultă în crestături, dar nu poate tăia a doua componentă din cauza prezenței de nucleotide phosphorothiorate în acea componentă. Crestăturile din prima componentă sunt apoi extinse prin tratamentul cu exonucleaza III. Prima componenta este astfel în mare măsură degradată. Acesta este apoi resintetizată prin adăugarea de ADN polimerază și dNTPs, folosind a doua component (care are secvența mutantă) ca matriță.Prin urmare, ambele componente vor ajunge să aibă secvența mutantă. Materialul rezultat cu ambele componente este apoi reintrodus într-o gazdă.

Fig. 7.6. Structura unei nucleotide phosphorothiorate.

3. Folosirea șablonului care conține uracil pentru a viza molecule de tip sălbatic.

Pentru a înțelege această metodă trebuie să avem mai întâi unele informații cu privire la modul cum uracilul poate fi încorporat în ADNsi modul in care celulele îi fac față. Uracilul poate fi format în ADN prin dezaminarea spontană acitozinei, și într-o rundă ulterioară a replicării uracilul ar direcționa încorporarea unui reziduu A pe componenta opusă în care inițial a existat G.

Prin urmare, prezența uracilul în ADN, este potențial mutagen și E. coli are un mecanism pentru eliminarea acestuia. Aceasta se bazează peung genă, care codifică uracil - N - glicozilază. Această enzimă elimină uracilul din deoxiriboză, lăsând o poziție apirimidinică (de exemplu, un loc în care lipsește baza, dar structura fosfodiesterului este intactă). Componenta ADN-ului care conține locul apirimidiniceste apoi crestat de o endonuclează și regiunea defectă este degradată și înlocuită de ADN-polimeraza I, folosind cealaltă componentă ca șablon. În afară de dezaminarea citozinei,reziduurile U pot fi, de asemenea, încorporate în ADN prin utilizarea dUTP și nu dTTP în timpul replicării de către ADN-polimeraza. Celulele în mod normal conțin numai niveluri scazute de dUTP, care funcționează caun intermediar în sinteza dTTP. Nivelul este menținut scăzut deprezența unui dUTP-ază. Aceasta hidrolizează dUTP(catalizând următorul pas în sinteza dTTP). Este produsul genei dut. U care este încorporat în ADN-ul de la dUTP va fi în mod normal îndepărtat în același mod

în care U provenit din dezaminarea C este îndepărtat. Celulele care sunt dut – ung –-, prin urmare,au un nivel ridicat de uracil în ADN-ul lor (de fapt, aproximativ 1 din 100 T este înlocuit de U).Aceste funcții ale genelor dut și ung pot fi exploatate în mutageneza (Figura 7.7). Matrița ADN –ului este formată din celule dut șiung. Acesta conține un nivel ridicat de U. Această matriță este utilizată cu oligonucleotida mutagenă așa cum s-a descris mai înainte (folosind dATP,dCTP,dGTP și dTTP), în sinteza componentei secundare sau o reacție PCR, iar produșii transformațidin nou în E. coli. Cu toate acestea, în acest timp, tulpina gazdă este ung+, iaractivitateaglicozilazeiși endonucleazei dinpozițiaapirimidinică provoca degradarea pe scară largă a ADN-ului inițial, deoarece conținea reziduuri U. Materialul nou sintetizat (care poartă secvența mutantă) este păstrată, deoarece nu conține reziduuri U. Această metodă are dezavantajul că gazdele dut– ung–- utilizate pentru prepararea matriței au o rată crescută de mutație spontană.

4. Utilizarea metilării pentru a viza molecule de tip sălbatic.

In exemplul precedent s-a folosit sistemul ung pentru a direcționa selectiv degradarea matriței inițiale. Se poate folosi un sistem dependent de metilare într-un mod similar. Există un număr de variante ale acestui sistem, dar ele se bazează pe utilizarea de ADN metilat ca șablon și apoi tratarea produșilor cu enzyme care degradează în mod specific ADN-ul metilat sau hemimetilat. Matrița de ADN metilat poate fi obținută prin izolarea dintr-o tulpină gazdă care are activitate metilazică. Alternativ, ADN-ul poate fi metilat in vitro prin tratarea cu metilază. După sinteza componentei secundare sau PCR, molecule de ADN care cuprind două dintre componentele matriței originale sunt complet metilate, de exemplu metilarea pe ambele componente. Moleculele de ADN care conțin o singura componentă șablon sunt hemimetilate. ADN-ul nou sintetizat nu este metilat deloc. ADN-ul este apoi tratat în așa fel încât să se deterioreze componentele metilate. Aceasta se poate face prin introducerea acestuia într-o tulpină gazdă care conține enzimele MCR și Mrr, care degradează în mod specific ADN-ul metilat.Alternativ, acesta poate fi tratat in vitro cu o enzimă de restricție cum ar fi DpnI, care taie în mod specific componentele metilate. ADN-ul este apoi introdus în E. coli. Indiferent de abordarea folosită, ADN-ul metilat și hemimetilat este distrus în gazda,lăsând ADN-ul nemetilat care ar trebui să conțină mutațiile dorite.

Fig 7.7Mutageneza folosindșablon pregătit din celule dut– ung– (cerc punctat).Asterixulindică mutația ce trebuie realizată

7.4 Alegerea mutației corecte

Cel mai important aspect al oricărui proiect de mutageneza direcționată nu este generarea de mutanți, care ar trebui să fie simplă ci de a decide ce mutații trebuie facute. O analiză atentă trebuie să se acorde nu doar nucleotidei care este supusă mutației, ci mai ales ce ar trebui sa sufere mutații. Pentru a face acest lucru necesită cunoștințe detaliate a funcției secvenței țintă. Dacă secvența codifică o proteină , atunci o idee despre structura proteinei și a reziduurilor este necesară. În mod ideal structura tridimensională a moleculei va fi cunoscută. De asemenea, este important să se recunoască faptul că modificări minore în secvența aminoacizilor poate avea un efect profund asupra

Toate moleculele rezultate sunt mutante

Duble nepotriviri transformate în celule tip sălbatic cu ajutorul dutși ung

Componenta care conține Uracil este parțial degradată de gazdă pentru îndepărtarea reziduurilor U și resintetizarea cu altă componentă ca șablon

Catena secundară sintetizată

Șablon monocatenar alcătuit din celule mutante dut și ung, care, conțin reziduuri U (linia punctată)

întregii structuri tridimensionale, poate chiar desființarea activității, chiar dacă nu are loc nici o schimbare în secvența primară la locul activ. De exemplu,chiar si o mutatie mică ar putea interfera cu plierea și să producă schimbări structurale pe scară largă. Modelarea pe calculator poate permite predicția efectelor anumitor mutații în structura tridimensională. Odată ce o proteină mutantă a fost făcută, modificărilepot fi detectate prin analiza de rezonanță magnetică nucleară, dicroism circular sau urmărindu-se legarea anticorpilor și rezistența proteazei (care poate fi redusă în proteinele care nu au fost pliatecorect).

7.5 Dezactivarea genelor

Adesea este util pentru a inactiva genele endogene într-un organism.Aceasta ar putea ajuta pentru a afla rolul fiziologic al genei de tip sălbatic, sau pentru a dirija expresia unei gene mutante în absența unuifundal de expresie agenei de tip sălbatic. Într-o abordare biotehnologică, ne-am putea dori să inactivăm o genă nedorită. Există un număr de moduri prin care acest lucru poate fi realizat cel mai rezonabil, implicând fie perturbarea secvenței de ADN fie inactivarea ARN-ului relevant. Vectorii, sistemele de transformare și așa mai departe, care sunt folosite depind de organismul implicat, dar principiile sunt în mare parte aceleași și vor fi prezentate aici. De reținut că, înainte de a încerca inactivarea unei gene (indiferent de metoda folosită), este important să se ia în considerare dacă rezultatul este posibil fie letal pentru organism. Dacă este letal, tehnica este eșuată deoarece organismele cu gene inactive nu vor fi recuperate, toate fiind moarte!

7.5.1 Baze de date cu linii mutante

Pentru multe specii, există baze de date cu tulpini mutante. Aceste tulpini pot fi produse în programe sistematice de mutageneză sau în experimente individuale. În funcție de modul în care este organizată baza de date, poate fi posibilă căutarea de tulpini cu mutații ale anumitor gene si se poate comanda tulpini adecvate de la un centru de stoc. Este recomandabil de a se verifica dacă tulpina primită are mutația specificată (și nu altele),această abordare fiind, de obicei, mult mai rapidă decât realizarea de novo a unei linii mutante.

Fig. 7.8 Dislocarea genelor. Înlocuirea cu o copie dislocată.

7.5.2 SCINDAREA GENEI

Principiul de scindare a genei este acela de a utiliza recombinarea omoloagă pentru a înlocui copia cromozomiala endogenă a unei gene cu o copie inactivata. Gena ce urmeaza a fi scindata este clonata și este introdus in ea un marker de selectie. Markerul de selecție trebuie să facă ca gena țintă sa fie nefuncționala, fiind necesara verificarea daca va fi cazul. Gena scindata este apoi excizata din vectorul său ( sau cel puțin constructia este liniarizata ) și ADN-ul liniar este introdus în organismul țintă. Selecția este apoi aplicată pentru insertia rezistentei la antibiotice sau markerul nutritional. Molecula de intrare care poartă markerul nu va fi stabil replicat daca molecula este lineara. Achiziția stabilă a markerului poate avea loc numai în cazul în care un dublu-încrucișat peste secvențele cromozomiale provoacă integrarea markerului în cromozom, înlocuind copia cromozomală endogena a genei cu cea perturbatoare. Deci, persoanele care au dobândit markerul ar trebui să aibă copia cromozomala a obiectivului înlocuita de copia perturbatoare .

Nu este întotdeauna necesar să se furnizeze copia perturbatoare pe o molecula liniara. Poate fi livrata pe o moleculă circulară, cu condiția ca aceasta să fie în imposibilitatea de a se replica în gazda utilizată și poate fi menținuta stabila numai prin integrare cromozomală. Exista trei posibile rezultate:

a) o dubla încrucișare poate înlocui copia cromozomala cu copia scindata utilizata anterior.

Cromozomul acum conține copia dislocată

Recombinarea omoloagă înlocuiește copia cromozomial - cu copiadislocată2

Copie cromozomială a genei țintă

Transformarea in celule țintă Selecția markerului

Marker de selecție ADN inserat liniarizat

Gena supusă dislocării este prima clonată

b) o singura incrucisare este o posibila copie functionala adiacenta a unei copii perturbatoare.

c) o singură inscrucisare ce rezulta din integrarea ADN- ului cu copia endogena ramasa intacta.

Este posibila selectarea impotriva rezultatelor (b) și (c) dacă este necesar. De retinut că, în ambele, întreaga plasmida de intrare este integrata în cromozomul gazdă. Dacă această plasmidă cuprinde un marker a cărei absență pot fi selectata, atunci o putem folosi împotriva integrarii întregii plasmide. În afară de problema generală de mortalitate, perturbarea genei are anumite limitări. În cazul în care organismul țintă conține mai mult de o copie a genei , atunci poate fi dificila estimarea că toate copiile sunt perturbate. Acest lucru este valabil mai ales în cazul în care markerul selectabil este dominant, deoarece o copie a markerului va avea același efect ca majoritatea. Mai multe copii ale genei sunt susceptibile a fi prezente în cazul în care organismul nu este haploid sau în cazul în care există mai multe copii ale genei pe genom haploid (adică gena este parte dintr-o familie multigenă ). Un sistem eficient de recombinare în gazdă este necesar pentru integrarea directa a copiei genei perturbatoare in locul genei endogene decât în altă parte a genomului. Perturbarea genei este utilizata pe scară largă în bacterii , drojdie de bere și animale .

7.5.3 Gena silentioasa post- transcriptionala

Un grup de metode importante sunt bazate pe metode celulare care duc la inactivarea expresiei genelor prin afectarea ARN- ului post transcriptional. Procesele implicate sunt bine puse la punct. Prima metoda dezvoltata este bazata pe antisensul ARN , prin modificarea celulei gazda pentru sintetizarea moleculei ARN cu o secventa complementara transcriptiei geneipentru a fi inactivata. Acest lucru este realizat prin prin plasarea unei secvente de ADN care codifica un ARN complementar pentru ca ARN sa fie inactivat sub controlul unui promoter puternic si insertia lui in organismul de interes. Expresia din partea promoterului ce genereaza antisensul ARN si nivelul expresiei genei endogene este diminuata. Este dificila obtinerea unei inactivari complete in acest fel in comparatie cu consecintele genei perturbatoare, dar nivelurile expresiei pot fi reduse la cateva procente sau chiar mai putin. Tehnica nu sufera de dezavantajele genei perturbatoare mentionate mai sus. Aceasta abordare a fost cu succes folosita la plante. S-a descoperit ca expresia genei poate fi redusa si la alte organisme prin folosirea oligonucleotidelor antisens mai scurte decat folosirea antisensului ARN . In acest caz, oligonucleotidele sunt introduse direct in celulele tinta. Mecanismul pentru suprimarea expresiei genelor folosind antisensul ARN sau antisensul oligonucleotidelor nu a fost initial foarte clar. S-a presupus ca ARN-ul monocatenar si antisensul ARN au format un hibrid care nu s-a putut traduce sau a fost degradat de dublu-irecuperabilele ARN nucleaze specifice.

O observatie neasteptata in activitatea antisensului ARN la plante a fost co-supresia. Aceasta este reglementarea expresiei a genelor endogene prin transformarea cu constructie care ar putea genera sensul ARN decat antisensul ARN . La acel moment s-a presupus ca fenomenul a fost generat de productia de antisens ARN din constructie prin promoterii endogeni situati langa insertia de ADN din

genom. Alte cauze, cum ar fi metilarea genei endogene au fost deasemenea segerate. In aceasta perioada a fost demonstrat faptul ca microinjectia de ARN in Caenorhabditis elegans ar putea suprima expresia genei. Oricare sens sau antisens ARN poate fi folosit. A fost demonstrat ca efectul a fost din cauza unei mici cantitati de ARN dublu catenar care a fost deasemenea prezent.

Este recunoscut ca intr-o gama larga de organisme prezenta ARN- ului dublu catenar duce la descompunerea ARN-ului monocatenar . La plante si posibil si la alte organisme aceasta este considerata a fi un mecanism de protectie impotriva atacurilor virale, asa cum numeroase virusuri produc dublu-replicarea ARN-ului. Sistemul poate fi important ca parte a unui mecanism pentru protectia genomului impotriva elementelor transpozabile si pentru reglarea expresiei genei endogene de micro ARN. In general ARN-ul dublu catenar este scindat de o nucleaza numita Dicer in fragmente scurte de aproximativ 22 nucleotide, numite ARN-uri scurte de interferenta. Acestea sunt apoi recrutate de un complex multisubunitar numit ARN- complex indus la tacere. Acest complex separa cele doua ARN-uri si foloseste una ca substat- ghid pentru a identifica corespondenta ARN- ului multicatenar care se degradeaza. ARN-ul multicatenar scurt poate deasemenea conduce la tacere si alte mecanisme cum ar fi metilarea ADN-ului. Remarcabil este faptul ca la plante efectul pare a fi unul sistemic. Prezenta siARN-ului in virus intr-o anumita parte a unei plante poate duce la rezistenta si a celorlalte parti ale plantei. Fenomenul inactivarii ARN- ului de siARN este numit ARN de interferenta (ARNi). Este folosit la o scara larga de organisme pentru inactivarea genei prin introducerea ARN- ului dublu catenar scurt pentru gena in cauza. Altenativ se poate introduce in organismul gazda o constructie de ADN care atunci cant este transcris va genera un scurt ARN care este auto- complementar. Acest ARN se va retrage pentru a genera o scurta specie dublu- catenara capabila sa activeze efectul ARNi.

7.5.4 Excizia Cre-lox

Proteina Cre recominaza a bacteriofagului P1 mediaza specific recombinarea la secventa 34 bp, lox P. Putem exploata acest sistem pentru a controla excizia seventelor particulare. Primul pas este de a flanca secventa tinta cu seventele loxP repetate direct. Aceasta poate fi facuta prin inlocuirea copiei endogene a secventei tinta cu elemente loxP ce ar trebui sa nu opreasca expresia secventei tinta. Atunci se va alimenta Cre- recombinaza. Aceasta va putea fi realizata prin integrarea separata a genei CRE sub un promotor controlabil urmat de inducerea promoterului. Inductia rezulta in expresia Cre, recombinarea peste loxP si excizia intre secvente. Putem deasemenea sa introducem Cre prin incrucisarea cu o tulpina care sa contina gena sau infectia care sa contina un virus. Aceasta este folositoare deoarece se evita potentiala perturbare a expresiei genei cauzata prin activarea markerului la locul de interes. Cu toate ca secventa Lox este lasata este putin probabil ca aceasta sa aiba efect asupra expresiilor din jur. Deletiile generate in acest fel sunt uneori denumite ca mutatii subtile. Acest sistem este deasemenea folositor pentru inlaturarea markerilor de selectie care ar putea face subiectul unei preocupari publice pentru cultura plantelor transgenice. Abilitatea de a controla expresia Cre ne permite sa controlam unde sau cand excizia poate avea loc. Daca putem controla timpul sau tesutul specific expresiei Cre atunci putem achiziona similar excizia tinta. Aceasta ar putea si foarte folositoare daca inactivarea tintei printr-un organism este letala. Excizia ADN-ului

de catre secventele LoxP este uneori cunoscuta sub numele de floxing. Alte sisteme specific recombinante pot fi deasemenea folosite.

7.5.5 Ribozimele

In unele circumstante moleculele de ARN pot avea activitate catalitica directa cum ar fi inlaturarea anumitor introni din ARN prin self- splicing.Termenul de ribozime este des folosit pentru a descrie orice tip de molecule de ARN care prezinta activitate catalitica. Cu toate acestea, termenul este adesea folosit mai exact pentru a face referire la moleculele de ARN care realizeaza o reactie de auto- clivaj. Multe dintre exemple vin de la ARN care sunt asociate cu virusuri si viroizi cum ar fi virusul tobacco ringspot sau viroidul avocado unblotch. Cu toate acestea cazuri similare au fost raportate si la alte sisteme cu ar fi virusul hepatitei delta precum si transcrieri a ADN-ului de la animale. Reactia catalizata este un atac intern nucleofil de 2- hidroxil a ARN-ului a grupului fosfat a lantului pe partea de clivaj. Pentru ca este inclus 2 hidroxil aceasta reactie este necesar limitata la ARN decat la ADN. In vivo aceasta reactie este utilizata probabil pentru clivarea monomerilor care sunt produse ca concatemeri de un mecanism de rulare in cerc; monomerii sunt ulteriori transformati in monomeri circulari de ligare. Cerintele pentru clivare sunt relativ putine dar sunt mereu gasite intr-o regiune care este capabila de formarea unei structuri de tip „ciocan’’. Este pobil ca molecula se substrat sa fie una separata de restul „ciocanului’’ atata timp cat imperecherea bazelor este corecta. Cu alte cuvinte cerintele secventei pentru substratul moleculei sunt intr-adevar foarte mici. Prin urmare, daca stim secventa unei molecule de ARN ar trebui sa sa putem adapta o molecula catalitica care poate forma un ciocan cu prima molecula si sa o clivam. O gena care va directiona sinteza acestei molecule catalitice poate, prin urmare sa fie construita si introdusa in organismul gazda si orice substrat de molecula de ARN trebuie clivata. Este deasemenea posibila furnizarea de ARN in functie de speciile studiate. Aceasta tehnologie este de interes medical deosebit ca modalitate de inactivare a agentilor patogeni cum ar fi virusii, sau modelarea expresiei genelor endogene.