Modulation der Genexpression durch das virale Interleukin ... file1 Modulation der Genexpression durch das virale Interleukin-6 in PEL Zellen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

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Modulation der Genexpression durch das virale

Interleukin-6 in PEL Zellen

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

Der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Nadine Rohland

aus Bad Langensalza

2

Als Dissertation genehmigt von der

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 11.06.2010

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Lars Nitschke

Zweitberichterstatter: PD Dr. Frank Neipel

3

Inhaltsverzeichniss

1 Zusammenfassung ......................................................................................................................... 4

2 Einleitung ....................................................................................................................................... 7

2.1 Das Humane Herpesvirus-8 .................................................................................................. 7

2.2 Das viruskodierte Interleukin-6 ........................................................................................... 10

2.3 RNA-Interferenz ................................................................................................................... 13

3 Material und Methoden .............................................................................................................. 16

3.1 Zellkulturverfahren .............................................................................................................. 16

3.2 Rekombinante DNA Methoden ............................................................................................ 17

3.3 Transfektion eukyoter Zellen ............................................................................................... 19

3.4 Promotor-Analysen durch Luziferase-Assay ....................................................................... 20

3.5 Hemmmung der Genexpression durch RNAi ....................................................................... 21

3.6 RNA-Nachweis ..................................................................................................................... 23

3.7 Proteinnachweis .................................................................................................................. 25

3.8 Expression und Aufreinigung von rekombinanten vIL-6 ..................................................... 28

3.9 Bestimmung der Zellproliferation ....................................................................................... 29

4 Ergebnisse .................................................................................................................................... 30

4.1 Expression des endogenen vIL-6 in PEL Zellen .................................................................. 30

4.2 Biologische Aktivität des rekombinaten vIL-6 ..................................................................... 32

4.3 Effekte der vIL-6 Inhibierung durch RNA-Interferenz in PEL Zellen .................................. 34

4.4 Induktion der hIL-6 Expression durch RTA ......................................................................... 40

4.5 Aktivierung der Genexpression durch RTA in PEL Zellen .................................................. 42

4.6 Rekonstitution der RNAi bedingten Effekte in PEL Zellen .................................................. 43

4.7 Gegensätzliche Wirkung von rvIL-6 und rhIL-6 in PEL Zellen ........................................... 45

5 Diskussion .................................................................................................................................... 48

6 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. 56

7 Literaturverzeichnis.................................................................................................................... 59

Eigene Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ............................................................................ 65

Lebenslauf ............................................................................................................................................. 67

Danksagung ........................................................................................................................................... 68

Zusammenfassung

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1 Zusammenfassung Das Humane Herpesvirus-8 (HHV-8), auch Kaposi-Sarkom assoziiertes Herpesvirus

genannt (KSHV), ist bisher der einzige identifizierte, humanpathogene Vertreter der

Rhadinoviren. Seit seiner Entdeckung 1994 konnte HHV-8 mit allen Formen des Kaposi`s

Sarkoms (KS) sowie dem Primären Effusionslymphom (PEL) und der Multizentrischen

Castleman-Erkrankung (MCD) assoziiert werden. Ein wichtiges Merkmal vieler

Herpesviren ist, dass sie im Lauf der Evolution mehrere zelluläre Gene in ihr Genom

integriert haben. Besonders deutlich wird diese sogenannte molekulare Mimikry an dem

durch HHV-8 kodierten viralen Interleukin-6 (vIL-6), welches Homologie zum zellulären

Interleukin-6 (hIL-6) aufweist. hIL-6 ist ein essentieller Wachstumsfaktor für eine

Vielzahl B-lymphoider Tumore und spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der

HHV-8 assoziierten Erkrankungen. Dies legt die Vermutung nahe, dass auch das vIL-6

von pathogener Bedeutung sein könnte. Wie bisherige Studien belegten, induzieren

sowohl vIL-6 als auch hIL-6 dieselben Signaltransduktionswege. Des Weiteren konnten

die Expression beider Zytokine in allen mit HHV-8 assoziierten Erkrankungen

nachgewiesen werden. Trotzdem ist die relative Bedeutung der beiden verwandten

Zytokine für die Pathogenese der HHV-8 Infektion im Einzelnen nicht vollständig geklärt.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion des vIL-6 mit Hilfe der RNA-Interferenz

(RNAi) in PEL Zellen untersucht werden. Da HHV-8 infizierte PEL Zellen die IL-6

induzierte Signaltransduktion für eine uneingeschränkte Proliferation benötigen, führte

die effiziente Hemmung der vIL-6 Expression zu einer zwar geringen aber dennoch

signifikanten Verminderung des Wachstums. Zudem konnte eine erhöhte Produktion des

hIL-6 in den vIL-6 knock-down Zellen nachgewiesen werden, was auf eine verstärkte

Expression des viruskodierten replication and transcription activator (RTA), dem

Hauptregulator der lytischen HHV-8 Replikation, zurückgeführt werden konnte. Die

Induktion der lytischen Genexpression konnte durch den Nachweis des viralen

Glykoproteins K8.1 bestätigt werden. Erst die gleichzeitige Inhibierung des viralen und

zellulären Zytokins führte zu einer starken Reduzierung der Proliferation dieser PEL

Zellen. Um die Spezifität der beobachteten Effekte nachzuweisen, wurden die vIL-6

knock-down Zellen mit rekombinant aufgereinigten vIL-6 (rvIL-6) oder hIL-6 (rhIL-6)

behandelt. Die externe Zugabe von rvIL-6 resultierte im Gegensatz zu rhIL-6 in einer

Rekonstitution des durch die vIL-6 Suppression bedingten Phänotyps. Diese Daten

deuteten auf einen negativen Rückkopplungmechanismus des vIL-6 in den verwendeten

Zusammenfassung

5

PEL Zellen hin. Zudem führte die Behandlung der PEL Zellen mit rvIL-6 zur Hemmung

der lytischen HHV-8 Genexpression, während die Zugabe des rhIL-6 eine Induktion zur

Folge hatte. Zusammenfassend weisen diese gegensätzlichen Wirkungen des zellulären

und viruskodierten Zytokins auf eine - zumindest in PEL Zellen - teilweise

unterschiedliche Signaltransduktion hin.

Zusammenfassung

6

Summary

The human herpesvirus-8 (HHV-8) also termed Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus

(KSHV) is the first known human member of the genus rhadinovirus. Since its discovery

in 1994 KSHV is known to be associated with all forms of Kaposi´s sarcoma (KS) as well

as primary effusion lymphoma (PEL) and multicentric Castleman disease (MCD). A

hallmark of many herpesviruses is the incorporation of cellular genes in the genome

during evolution. This so called molecular mimicry is especially obvious by the virus

encoded interleukin-6 (vIL-6), a protein with homology to human interleukin-6 (hIL-6).

As hIL-6 acts as an essential growth factor in several B-lymphoid malignancies and has

also been implicated in the pathogenesis of KS, the viral interleukin-6 (vIL-6) is likely to

be of pathogenetic importance. However, as signal transduction cascades induced by vIL-

6 and hIL-6 are thought to be essentially identical and both cytokines are produced in

KSHV-associated malignancies, the relative importance of these related cytokines in

KSHV-induced malignancies is still not clear. In the present work, RNA-interference was

used to examine the function of vIL-6 in primary effusion lymphoma (PEL) cells.

Because PEL cells are dependent on (v)IL-6 induced signal transduction, a nearly

complete knock-down of vIL-6 expression was accompanied by a moderate, but

significant reduction of PEL cell proliferation. In addition, expression of both KSHV lytic

genes (RTA and gpK8.1) and of hIL-6 was increased. Inhibition of both vIL-6 and hIL-6

resulted in a marked decrease of cell proliferation. The specificity of the observed effects

could be proven by the addition of recombinant vIL-6 and/or hIL-6 to the cell culture

media. Addition of rvIL-6, but not rhIL-6 resulted in a reconstitution of the siRNA-

mediated phenotype. At least in KSHV-infected PEL cells, a negative feed-back loop

exists for vIL-6, but not hIL-6 expression. In addition, whereas vIL-6 reduced the

expression of vIL-6 and RTA thus promoting KSHV latency, addition of hIL-6 resulted in

increased gene expression from lytic viral promoters. In summary, although both vIL-6

and hIL-6 signal via the same cellular receptor, the signal cascades induced in PEL cells

are - at least in part - distinct.

Einleitung

7

2 Einleitung

2.1 Das Humane Herpesvirus-8

Das Humane Herpesvirus-8 (HHV-8) wurde erstmals 1994 in den Gewebeproben eines an

einem Karposi-Sarkom (KS) erkrankten AIDS Patienten nachgewiesen 1. Die Endeckung

erfolgte durch Isolierung und Amplifikation viraler DNA-Fragemente mit Hilfe der

representational difference analysis (RDA), einem auf der Polymerase-Kettenreaktion

basierenden Verfahren 2. Seitdem belegen zahlreiche Publikationen einen

epidemiologischen Zusammenhang zwischen einer HHV-8 Infektion und dem Auftreten

eines KS 1, 3. Aus diesem Grund wird das HHV-8 auch als Kaposi-Sarkom-assoziiertes

Herpesvirus (KSHV) bezeichnet.

HHV-8 gehört wie das Epstein-Barr Virus (EBV) zur Gruppe der humanpathogenen γ–

Herpesviren. Allerdings zeigte eine Analyse der HHV-8 Sequenz, dass dieses Virus näher

mit Herpesvirus saimiri (HVS), einem klassischen Vertreter der Rhadinoviren, verwandt

ist und daher als γ2-Herpesvirus eingeordnet werden muss 4, 5.

HHV-8 trägt als tumorassoziiertes Virus zu den weltweit 15-20 % der Krebserkrankungen

viralen Ursprungs bei. Die Übertragung erfolgt vermutlich über Körperflüssigkeiten wie

Samenflüssigkeit und Speichel 6, während die parenterale Übertragung des Virus durch

Blut eher selten ist 7. Des Weiteren belegte eine Studie von Barozzi 8 die Möglichkeit der

HHV-8 Infektion nach Organtransplantation.

Beim Menschen sind verschiedene maligne Erkrankungen bekannt, bei denen HHV-8

regelmäßig nachgewiesen werden kann: neben allen Formen des KS 1 betrifft dies das

Primäre Effusionslymphom (PEL) 9 und die plasmablastische Variante der

Multizentrischen Castleman-Erkrankung (MCD) 10, 11, 12.

KS ist ein multifokaler Tumor endothelialen Ursprungs, der besonders durch dunkle, stark

pigmentierte Hautregionen charakterisiert ist. Neben den typischen Spindelzellen finden

sich im KS Gewebe auch infiltrierende inflammatorische Zellen und Endothelzellen bei

ausgeprägter Neovaskulierung 13. Im frühen Stadium des KS sind nur ca. 10 % der

Spindel- und Endothelzellen HHV-8 positiv. Dies deutet auf die Beteiligung eines

parakrinen Mechanismus in der Progression dieser Erkrankung hin 14. Im späten Stadium

kann in bis zu 90 % der Spindelzellen die virale DNA nachgewiesen werden, was einen

Wachstumsvorteil der infizierten Zellen nahe legt 15, 16. Neben diesen Hautläsionen kann

Einleitung

8

sich der Tumor auch in zahlreichen inneren Organen manifestieren. Epidemiologisch

kann man vier verschiedene Formen des KS unterscheiden: Das klassische KS tritt

gehäuft bei Männern aus dem mediteranen Raum nach dem 50. Lebensjahr auf. Diese

ohne klare Immunsuppression auftretende Form des KS schreitet nur langsam, über

mehrere Jahre fort und bleibt zunächst meist auf die unteren Extremitäten beschränkt 17.

Das endemische KS betrifft Patienten aller Altersgruppen aus Zentral- und Ostafrika und

ist deutlich aggressiver. Es befällt oft die Lymphknoten sowie die inneren Organe und ist

mit einer erhöhten Sterblichkeit verbunden 18. Eine dritte Form, das iatrogene KS, wurde

bei Transplantationspatienten und Immunsuppression beschrieben 19. Das sogenannte

AIDS-assoziierte oder epidemische KS ist die aggressivste Form. Die Manifestation der

Tumore in den inneren Organen tritt besonders häufig auf und führt zu schweren

Komplikationen. Durch die Behandlung der HIV-Infektion mit hoch-aktiver anti-

retroviraler Therapie (HAART) hat das Auftreten des AIDS-assoziierten KS in den

westlichen Staaten abgenommen 20.

PEL, auch als body cavity based lymphoma (BCBL-1) bezeichnet, ist eine seltene

hochmaligne B-lymphoproliferative Erkrankung, die zu den Non-Hodgkin-Lymphomen

zählt und vor allem immunsupprimierte Patienten betrifft. Es manifestiert sich als maligne

Effusionen der pleuralen, perikardialen und peritonealen Körperhöhlen. Im Gegensatz

zum KS ist das PEL mono- oder polyklonalen Ursprungs 21. Aufgrund des Nachweises

von Immunglobulinketten-Umlagerungen sowie der Expression von typischen Markern

der späten B-Zelldifferenzierung wird vermutet, dass PEL Zellen phänotypisch als

Plasmazellen eingestuft werden müssen 22, 23. Bei der Hälfte der Fälle findet man in den

PEL Zellen gleichzeitig das Genom des EBV.

MCD ist eine atypische, lymphoproliferative Erkrankung, die mit HHV-8 assoziiert wird

und ebenfalls vorrangig bei HIV-infizierten Patienten auftritt 10. Charakteristisch für

MCD sind vergrößerte Lymphknoten, die Infiltration von Plasmazellen sowie

Wucherungen der Gefäße und Fieber. Des Weiteren konnte in den Keimzentren der

hyperplastischen Lymphknoten von Patienten, die an MCD erkrankt sind eine erhöhte

Konzentration des multifunktionellen IL-6 nachgewiesen werden. Da hIL-6 die

Differenzierung von B-Zellen stimuliert, lieferte die Überexpression dieses Zytokines eine

Erklärung für die große Anzahl an Plasmazellen in diesen Lymphknoten.

Wie die anderen Herpesviren ist HHV-8 ein umhülltes DNA Virus mit einem

ikosaedrischen Kapsid. Es besitzt ein 165 kb großes, doppelsträngiges DNA-Genom.

Dieses besteht, analog zum Genom anderer Rhadinoviren, aus einem zentralen

Einleitung

9

kodierenden Bereich mit niedrigem GC-Gehalt (L-DNA, 53,5 % GC), flankiert von zwei

Tandem-Repititionen mit hohem GC-Gehalt (H-DNA, 84,5 % GC). Die H-DNA besteht

aus einer variablen Anzahl (5–20) an 801 bp langen Elementen in Tandem-Orientierung 5.

Bis heute wurden in der L-DNA 89 open reading frames (ORF) identifiziert, von denen

die meisten homolog zu den ORFs anderer Herpesviren sind. Diese konservierten

Bereiche sind durch HHV-8 spezifische Genomabschnitte unterbrochen. Die meisten in

diesen Abschnitten vorhandenen Gene sind homolog zu zellulären Genen. Dies lässt

vermuten, dass im Laufe der Evolution einige zelluläre Gene in das Virusgenom integriert

wurden 24. Soweit bisher untersucht, kodieren diese Gene für funktionelle Agonisten der

zellulären Homologen. Gerade diesen Wirtszell-homologen Genen wird eine wichtige

Rolle in der Pathogenese von HHV-8 zugeschrieben, da sie es dem Virus ermöglichen in

die zellulären Signaltransduktionkaskaden der Immunantwort, Zellzyklusregulation und

Apoptose einzugreifen.

HHV-8 kann durch die Expression verschiedener Proteine sowohl das angeborene als

auch das adaptive Immunsystem beeinflussen. Die Makrophagen-inflammatorischen

Proteine vMIP-I, vMIP-II und vMIP-III (ORF K6, K4, K4.1) kodieren für Chemokine der

CC-Chemokin-Familie. Sie wirken als spezifische Agonisten der Wirtszell-

Chemokinrezeptoren und führen zu einer Verschiebung der zellulären TH1- zur

Antikörper-dominierten TH2-Immunantwort, welche für die Bekämpfung intrazellulärer

Pathogene weniger effektiv ist 25, 26. Des Weiteren exprimiert HHV-8 auch einen

Chemokinrezeptor aus der CXC-Chemokinrezeptor-Familie 27. Dieser virale G-Protein-

gekoppelte Rezeptor (vGPCR; ORF 74) besitzt die größte Ähnlichkeit zum Interleukin-8

Rezeptor. Er wird nur von wenigen Zellen während der lytischen HHV-8 Replikation

exprimiert 28 und fördert die Angiogenese des Tumors durch Sekretion des vascular

endothelial growth factors (VEGF) 29. Die viralen Proteine MIR1 und MIR2 (ORF K3,

K4) bewirken eine Herunterregulierung des Haupthistokompatibilitätskomplex I (MHCI),

einem zellulären Oberflächenrezeptor der die Erkennung und Vernichtung virusinfizierter

Zellen durch zytotoxische T-Zellen vermittelt. Diese Inhibierung der Antigenpräsentation

beruht auf einer erhöhten Endozytoserate, gefolgt von der Degradierung des Rezeptors

über den Ubiquitinweg 30, 31. Die Funktion der Killerzellen kann zusätzlich durch das

viruskodierte FADD-like IL-1 converting enzyme (FLICE)-inhibitorische Protein (vFLIP,

ORF K13) beeinflusst werden. Es fungiert als dominant-negativer Kompetitor des

zellulären FLICE und verhindert somit die Fas-Rezeptor vermittelte Apoptose 32. Zudem

fördert vFLIP das Tumorwachstum und aktiviert den nuclear factor of κB (NFκB) 33.

Einleitung

10

Weitere anti-apoptotisch wirkende Proteine sind das virale B-Zell-Lymphomprotein-2

(vBcl-2, ORF 16) sowie der virale inhibitor of apoptosis (vIAP, ORF K7). Analog zum

zellulären Bcl-2 inhibiert das viruskodierte Protein das pro-apoptotische Protein Bax 34,

welches die Freisetzung von Zytochrom C aus den Mitochodrien vermittelt. In diesen

sogenannten intrinsischen Apoptoseweg greift auch vIAP durch Hemmung von Caspase-3

ein 35. Zudem kodiert HHV-8 für Proteine, die den p53-indizuzierten Apoptoseweg

inhibieren. Das Latenz-assoziierte nukleäre Antigen-1 (LANA-1, ORF 73) interagiert mit

dem Tumorsuppressor p53 und inhibiert dessen Aktivität 36. Des Weiteren verankert

LANA-1 die zirkuläre, virale DNA während der Interphase und Mitose mit dem

zellulären Chromatin und ist somit, als latent exprimiertes Gen, für die Aufrechterhaltung

des viralen Episoms verantwortlich 37. Ein weiteres während der Viruslatenz exprimiertes

Gen ist das virale Cyclin (vCyc, ORF72). Als Homolog des zellulären Cyclin D greift es

in die Zellzyklusregulation ein. vCyc hemmt irreversibel den G1-S Kontrollpunkt, da es

von den cyclin dependent kinase (CDK) Inhibitoren nicht reguliert werden kann 40.

Wie bei anderen Herpesviren ist die virale Genexpression stark reguliert. Da ein

geeignetes Zellkultursystem für die Transformation durch HHV-8 fehlt, wurden die

meisten in vitro Studien in von PEL-abgeleiteten Zelllinien durchgeführt. Diese Zellen

sind latent mit HHV-8 infiziert und können mit Hilfe verschiedender Chemikalien wie

Natriumbutyrat (NaB) oder dem Phorbolester 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Azetat

(TPA) zur Induktion des lytischen Replikationzyklus stimuliert werden. Basierend auf der

Expression der HHV-8 Gene in nichtinduzierten und chemisch induzierten PEL Zellen

können diese in drei Kategorien unterteilt werden: Klasse I (konstitutiv exprimiert),

Klasse II (konstitutiv exprimiert, aber hochreguliert nach Induktion) und Klasse III (nur

nachweisbar nach Induktion) 41. Bislang wurden nur vier HHV-8 Gene eindeutig der

latent exprimierten Klasse I zugeordnet: vFLIP, vCyc, LANA-1 und -2. Nach dem

gängigen Modell der Transformation, wie für EBV angenommen, bewirken vor allem die

latenten Gene die genetischen Veränderungen, welche für das Tumorwachstum

verantwortlich sind. Des Weiteren tragen sowohl Zytokine als auch angiogenesefördernde

Faktoren zur Tumorprogression und der beteiligten Entzündungsreaktion bei.

2.2 Das viruskodierte Interleukin-6

Die sogenannte molekulare Mimikry im HHV-8 Genom wird besonders deutlich durch

das virale Interleukin-6 (vIL-6, ORF K2). Es besitzt 24,7 % Sequenzidentität auf

Aminosäureebene zum humanen Interleukin-6 (hIL-6) 42. hIL-6 ist ein Zytokin mit einem

Einleitung

11

weiten Spektrum an biologischen Aktivitäten. Es induziert die Differenzierung von B-

Zellen zu Antikörper sezernierenden Plasmazellen 43 und wirkt als Wachstumsfaktor für

Plasmazytom- und Myelomzellen 44, 45. Darüber hinaus ist hIL-6 an der Regulation der

Akute-Phase-Protein-Synthese 46, 47, der Hämatopoese 48 und der Differenzierung von

Makrophagen 49 beteiligt. Produziert wird das zelluläre Zytokin hauptsächlich von

Fibroblasten, Endothelzellen und Monozyten/Makrophagen. Schon vor der Entdeckung

des HHV-8 bestand die Annahme, dass hIL-6 in der Pathogenese des KS und der

lymphoproliferativen Erkrankungen, welche heute klar mit HHV-8 assoziiert werden

können, eine wichtige Rolle spielt. Studien belegen, dass hIL-6 das Wachstum von

kultivierten KS Zellen verstärkt und es in erhöhten Konzentrationen im Serum von MCD

Patienten nachweisbar ist. Bei MCD konnten außerdem die hIL-6 Expressionslevel mit

der Schwere der Erkrankung korreliert werden 50, 51, 52, 53. Zahlreiche Publikationen

belegen bisher, dass vIL-6 ähnliche biologische Aktivitäten wie hIL-6 aufweist. Beide

Zytokine spielen eine wichtige Rolle für das Wachstum und Überleben von murinen und

humanen Myelomzellen (z.Bsp: INA-6, B9) 54, 42, 55. Des Weiteren induziert vIL-6 die

entzündungsfördernde Zytokinproduktion in kultivierten KS Zellen 56 und stimuliert

sowohl Angiogenese als auch Hämatopoese im Mausmodell 57. Studien in PEL-

abgeleiteten Zelllinien beweisen, dass vIL-6 vor allem während des lytischen

Replikationzyklus von HHV-8 exprimiert wird 58. Im Gegensatz dazu kann die vIL-6

Expression aber auch ohne die RTA-abhängige, lytische Replikation durch den zellulären

Faktor Notch induziert werden 59. Zudem ist vIL-6 in Gewebeproben von an PEL oder

MCD erkrankten Patienten in Abwesenheit anderer viraler Gene, welche typischerweise

während der lytischen Replikation exprimiert werden, nachweisbar: In vivo exprimieren

10-20 % der PEL und MCD Zellen vIL-6 60. Diese Daten deuten darauf hin, dass vIL-6 in

der HHV-8 Pathogenese auch ohne Reaktivierung der produktiven Virusreplikation eine

Rolle spielen könnte.

Wie die anderen Zytokine aus der IL-6 Familie, vermitteln sowohl vIL-6 als auch das

hIL-6 die Signaltransduktion über die gp130 Untereinheit des Interleukin-6 Rezeptors (IL-

6R) 61. Dieser besteht, neben der signalübertragenden 130 kDa großen β-Kette (gp130, IL-

6Rβ) aus einer zweiten 80 kDa großen α-Kette (gp80, IL-6Rα). Im Verlauf der

Signaltransduktion durch gp130 kommt es zur Phosphorylierung der Janus Kinase (JAK).

Dies führt zur Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren STAT1 und 3 sowie zur

Aktivierung des Ras-Map-Kinase Signalwegs. Das hIL-6 kann erst im Komplex mit dem

löslichen gp80 an die gp130 Untereinheit des IL-6R binden 62. Im Gegensatz zum

Einleitung

12

zellulären Homolog bildet vIL-6 auch in Abwesenheit von gp80 einen Komplex mit

gp130 und aktiviert die Signaltransduktion 63, 64 (Abb. 1).

Abbildung 1: IL-6R Signalübertragung vIL-6 und hIL-6 aktivieren den IL-6R durch Bildung eines tetrameren gp80:gp130 Komplexes, während vIL-6 die Signaltransduktion auch durch Bildung eines hexameren gp130:gp130 Komplexes alleine induzieren kann. Beide Rezeptorkomplexe führen zur Phosphorylierung der STAT-Transkritionsfaktoren und zur Aktivierung des Ras-MAPK Wegs. Diese Signaltransduktionswege resultieren in der Translokation der TF in den Zellkern und führen zur Induktion der Genexpression. JAK = Janus Kinase STAT = signal transducers and activators of transcription MAPK = mitogen-activated protein kinase

TF = Transkriptionsfaktor

Einige Studien belegen zudem, dass vIL-6 nicht an die gp80 Untereinheit des IL-6R

bindet 57, 65, während eine Vielzahl von Veröffentlichungen diese Bindung eindeutig

belegen 63, 66, 67, 58, 68. Allerdings konnte nur in einer Studie eine Hemmung der vIL-6

Aktivität durch Blockierung des gp80:vIL-6 Interaktion gezeigt werden 54. Da die

Signalübertragung durch die gp130 Untereinheit des IL-6R erfolgt, wurden bislang in

Zellen welche beide Rezeptorketten exprimieren keine Unterschiede in der durch vIL-6

und hIL-6 induzierten Signaltransduktion gefunden 69. Eine kürzlich veröffentlichte

Arbeit der Gruppe um J. Nicholas zeigte allerdings, dass sich die Signaltransduktion im

Vergleich zu Zellen, welche nur die gp130 Untereinheit des IL-6R exprimieren, nach

Bindung von vIL-6 an gp80 verändert 66. Für kultivierte PEL Zellen ist die Aktivierung

der Signaltransduktion via gp130 überlebenswichtig 70, 54, 71, 72. Da diese Zellen sowohl

vIL-6 als auch hIL-6 produzieren, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden, welches

der beiden Zytokine für die uneingeschränkte Proliferation von Bedeutung ist. Einige

Studien belegen die Abhängigkeit der PEL Zellen von hIL-6, was zudem auch im

Einleitung

13

Tiermodell nachgewiesen werden konnte 70, 71. Im Gegensatz dazu zeigten andere

Veröffentlichungen die Wachstumsabhängigkeit der kultivierten Zellen von vIL-6 72, 73, 74.

Neben diesen proliferationsfördernden Eigenschaften kann vIL-6 zugleich latent mit

HHV-8 infizierte Zellen vor der Interferon-α (IFN-α) induzierten Apoptose schützen.

IFN-α ist ein antiviral wirkendes Zytokin, das zu einer Inhibierung der gp80 Expression

auf der Zelloberfläche führt und somit die hIL-6 vermittelte Signaltransduktion hemmt.

Da vIL-6 auch in Abwesenheit von gp80 einen Komplex mit der signalvermittelten gp130

Untereinheit des IL-6R bilden kann, führt dies zu einer partiellen Blockierung der

antiviralen Funktionen von IFN-α 75.

Obwohl klar gezeigt werden konnte, dass HHV-8 ein funktionelles Zytokin mit ähnlichen

biologischen Eigenschaften zum hIL-6 kodiert, ist die Bedeutung des vIL-6 in der

Pathogenese der HHV-8 Infektion noch nicht geklärt. Zudem sind die publizierten Daten

aufgrund der verwendeten experimentellen Systeme teilweise widersprüchlich. Da bisher

kein Zellkultur- oder Tiermodellsystem für die de novo Transformation durch HHV-8 zur

Verfügung steht, war die Überexpression einzelner Gene in verschiedenen, meist HHV-8

negativen, Zellkultursystemen oder transgenen Mäusen die einzige Möglichkeit, die

Funktionen der Gene zu untersuchen. Seit Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi) steht

aber eine neue Methode zur Verfügung, um einzelne HHV-8 Gene in HHV-8 infizierten

PEL Zellen auszuschalten und somit deren Funktion zu untersuchen.

2.3 RNA-Interferenz

Das Phänomen der RNA-Interferenz (RNAi) wurde erstmals 1998 in dem Nematoden

Caanorhabditis elegans als zelluläre Antwort auf fremde, doppelsträngige (ds) RNA

entdeckt 76. Sie dient seitdem als wirkungsvolle Methode, um gezielt die Expression

bestimmter Gene auf Ebene der mRNA zu inhibieren. Nach einem gängigen Modell 77

wird der Mechanismus der RNAi durch ein hochkonserviertes Mitglied der RNase III

Ribonuklease Familie, dem sogenannten DICER, initiiert. Dieses Enzym erkennt und

bindet lange ds RNA-Moleküle und prozessiert diese in 21 - 23 Nukleotide lange short

interfering RNAs (siRNAs). Die Spaltung erfolgt in einer ATP-abhängigen Reaktion. Die

so prozessierten siRNAs sind am jeweiligen 5`-Ende phosphoryliert und können so in den

Multiproteinkomplex, genannt RNA-induced silencing complex (RISC) inkorporiert

werden. Nach Aktivierung der Helikaseaktivität des RISC-Komplexes unter Verbrauch

von ATP erfolgt die Entwindung des RNA-Doppelstrangs. Mit Hilfe des antisense

Strangs der siRNA bindet der RISC-Komplex an die komplementäre mRNA-Sequenz,

Einleitung

14

was zur Degradation der mRNA und somit zur Inhibierung der Expression des

kodierenden Proteins führt (Abb. 2) 77, 78, 79.

Abbildung 2: Mechanismus der RNAi. (A) Struktur einer siRNA. siRNAs sind 21 - 23 nt lange ds RNA-Moleküle, welche von einem phosphorylierten 5 `-Ende und einem zwei nt langen und ungepaarten, nichtphosphorylierten 3`-Überhang flankiert werden. Dieser 3`-Überhang ist charakteristische für ein RNase III Spaltprodukt. (B) RNAi Reaktionsweg. Lange ds RNAs werden durch die Ribonuklease DICER erkannt und in einer ATP-abhängige Reaktion in siRNAs gespalten. Diese siRNAs werden in den RISC-Komplex inkorporiert. Nach Aktivierung der Helikaseaktivität des RISC-Komplexes durch Spaltung von ATP erfolgt die Entwindung der siRNAs. Der nichtkodierende Strang der siRNA dient dem RISC-Komplex als Zielsequenz für die endonukleolytische Spaltung der komplementären Ziel-mRNA. (modifiziert aus Dykxhoorn 77)

Experimentell kann dieser Mechanismus auf verschiedene Weise genutzt werden. Um die

Expression bestimmter Gene für kurze Zeit zu inhibieren, kommt vorrangig die transiente

Transfektion von Zellen mit in vitro synthetisierten siRNAs zur Anwendung. Diese

führen im Gegensatz zu längeren ds RNA-Molekülen (mehr als 30 nt) in Säugetierzellen

in der Regel nicht zu einer Induktion des Interferonsystems 80, 81. Um Proteine mit langen

Halbwertszeiten oder zellulären Regulationsmechanismen zu untersuchen ist ein

dauerhaftes Abschalten der Zielgene durch die stabile Expression der siRNAs notwendig.

Dies kann durch die Verwendung sogenannter short haipin RNAs (shRNAs), welche sich

aus einer 19 nt lange komplementären Stammsequenz und einer kurzen Schleifensequenz

zusammensetzen, erreicht werden. Mit Hilfe eines Vektors können die shRNAs unter der

Kontrolle eines RNA-Polymerase II oder III Promotors in den Zielzellen exprimiert

Einleitung

15

werden. Diese shRNAs werden ebenfalls durch das DICER-Enzym erkannt und in

funktionelle siRNA-Moleküle prozessiert 82. Da sich gerade die Transfektion lymphoider

Zellen als schwierig erweist, kann die shRNA-Expressionskassette durch Verwendung

eines retroviralen Vektorssystems stabil in das Genom der Zielzelle integriert werden.

Zielstellung

Um die pathogene Bedeutung des vIL-6 in den HHV-8 transformierten PEL Zellen zu

untersuchen, sollte in der vorliegenden Arbeit die Expression des viralen Zytokins mit

Hilfe der RNAi unterdrückt werden. Nach Etablierung eines effizienten knock-downs des

viruskodierten Zytokins, sollten die resultierenden Effekte auf den Phänotyp der PEL

Zellen, wie Veränderungen im Wachstumsverhalten, in den Signaltransduktionswegen

sowie der zellulären und viralen Genexpression näher charakterisiert werden.

Material und Methoden

16

3 Material und Methoden

3.1 Zellkulturverfahren

Zellkulturbedingungen. Die Suspensionszellen BJAB, Akata, INA-6, BCBL-1, JSC-1 und

BC-3 wurden alle zwei bis drei Tage 1:3 bis 1:5 mit dem entsprechenden

Zellkulturmedium verdünnt (Tab. 1).

Zelllinie Beschreibung Medien Referenz

HEK293T Humane, embryonale Nierenfibroblastenzelllinie, die durch Adenovirus Typ 5 transformiert wurde; enthält ein Expressionsplasmid für SV40 (Simian

Virus 40) T Antigen

DMEM, Glu, Pen/Strep, 10 % FKS

83, 84

GP2-293 HEK293-abgeleitete Verpackungszelllinie (Clontech); Zellen produzieren stabil ein von MMULV abgeleitetes gag-pol und ein amphotrophes Hüllprotein

DMEM, Glu, Genta, 10 % FKS

85

INA-6 IL-6 abhängige, humane Myeloma-Zelllinie RPMI 1640, Pen/Strep, β-ME, NaB, 10 % FKS, hIL-6 (Strathmann)

50

BJAB HHV-8 und EBV negative Burkitt-Lymphom-Zelllinie

RPMI 1640, Genta, β-ME, NaB, 10 % FKS,

86

Akata HHV-8 und EBV negative Burkitt-Lymphom-Zelllinie

RPMI 1640, Pen/Strep, β-ME, NaB, 10 % FKS

87

BCBL-1 HHV-8 positive und EBV negative, humane, primäre Effusionslymphomzelllinie

“ 88

LCL EBV transformierte, lymphoblastoide Zelllinie (Kinderklinik, Erlangen)

„ 89

JSC-1 HHV-8 und EBV positive, humane, primäre Effusionslymphomzelllinie

RPMI 1640, Pen/Strep, β-ME, NaB, 20 % FKS

90

BC-3 HHV-8 positive und EBV negative, humane, primäre Effusionslymphomzelllinie

“ 91

U937 EBV transformierte, hematopoetische Zelllinie RPMI 1640, Glu, Genta, 15 % FKS

92

Tab. 1: Beschreibung der verwendeten Zelllinien und Kulturmedien. DMEM: Dulbecco`s Modified

Eagle Medium (Invitrogen, Karlsruhe); RPMI 1640: Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (Invitrogen, Karlsruhe); Glu: L-Glutamin; Pen/Strep: Streptomycin/Penicillin (Invitrogen, Karlsruhe); Genta: 100 µg/ml Gentamycin; β-ME: (Invitrogen, Karlsruhe); NaB: Natrium-butyrat (Invitrogen, Karlsruhe); FKS: fötales Kälberserum (Gibco, Karlsruhe); hIL-6: 500 U/ml humanes Interleukin-6 (Strathmann Biotech GmbH, Hamburg)

Die adhärent wachsenden Zelllinien HEK293T und 293-GP wurden alle zwei bis drei

Tage durch Abschaben von der Zellkulturflasche bzw. durch Trypsinieren gelöst und 1:5

bis 1:10 mit Medium verdünnt. Fötales Kälberserum (FKS), als Bestandteil der


17

Zellkulturmedien, wurde grundsätzlich eine halbe Stunde bei 56 °C inaktiviert. Alle

Zelllinien wurden im Brutschrank bei 37 °C, 7 % CO2 und 80 % relativer Luftfeuchtigkeit

kultiviert. Zur längeren Aufbewahrung der Zellen wurden Einfrierkulturen angelegt.

Hierzu wurden die Zellen (4 °C, 250 g, 5 min) abzentrifugiert und in 1,2 ml kalten FKS

aufgenommen. Nach zehnminütiger Inkubation auf Eis erfolgte die Zugabe von 800 µl

Einfriermedium (RPMI 1640, 12 % Glukose (w/v), 40 % DMSO (v/v)). Anschließend

wurde die Zellsuspension bei – 80 °C gelagert.

3.2 Rekombinante DNA Methoden

Klonierungen. Die stabile Expression der shRNAs erfolgte mit Hilfe des Vektors

pSIREN-EGFP-RetroQ, welcher zuvor aus den Plasmiden pSIREN-RetroQ und pIRES2-

EGFP (Clontech, Saint.-Germain-en-Lay, France) konstruiert wurde 93. Je zwei

komplementäre Oligonukleotide (Tab. 2), welche für die entsprechenden shRNAs

kodieren, wurden nach dem Anealing bei 95 °C über die EcoRI und BamHI

Restriktionsschnittstellen in den Ausgangsvektor pSIREN-EGFP-RetroQ kloniert. Die

resultierenden shRNA-exprimierenden Vektoren wurden pSIREN-EGFP-RetroQ-shvIL-6

und –shN genannt (Tab. 3). Die Expression der shRNA erfolgt durch den U6 RNA-

Polymerse III Promotor. Des Weiteren kodiert dieser Vektor ein Puromyzinresistenzgen

als Selektionsmarker und EGFP. Die Sequenz der als Kontrolle dienenden Nonsense-

shRNA (shN), weist keine Homolgie zur mRNA eines bekannten zellulären oder viralen

Gens auf.

Oligonukleotid Bezeichnung Sequenz

shN shNBamHI shNEcoRI

fwd 5`GATCCCGACTACCGTTGTATAGGTGTTCAAGAGA CACCTATACAACGGTAGTTTTTTTG3` rev 5ÀATTCAAAAAAACTACCGTTGTATAGGTGTCTCT TGAACACCTATACAACGGTAGTCGG3`

shvIL-6 shvIL-6BamHI shvIL-6EcoRI

fwd 5`GATCCGTTGGATGCTATGGGTGATCTTCAAGAGA GATCACCCATAGCATCCAATTTTTTGG3` rev 5ÀATTCCAAAAAATTGGATGCTATGGGTGATCTCT CTTGAAGATCACCCATAGCATCCAACG 3

vIL-6 vIL-6BamHI vIL-6HindIII

fwd 5ÀGCTGGATCCATGTGCTGGTTCAAGTTGTGGTC3` rev 5ÀGCTAAGCTTACTTATCGTGGACGTCAGGAGTCAC3`

hIL-6 Promotor hIL-6pHindIII hIL-6pXmaI

fwd 5`GGAAAGCTTCTCCTGCAAGAGACACCATCCTGAG3` rev 5`CGGCCCGGGAGGGCAGAATGAGCCTCAGAGACAT3`

Tab. 2: Für die Klonierung verwendeten Oligonukleotide. Komplementäre Sequenzen der shRNA-Sequenzen sind unterstrichen, die entsprechenden Restriktionsschnittstellen sind fett hervorgehoben.

Zur Klonierung des vIL-6 Expressionsplasmid wurde aus einer Phagenbibliothek mittels

PCR ein DNA Fragment amplifiziert, welches für das vIL-6 kodiert (Tab. 2). Die


18

Phagenbibliothek enthält die genomische DNA des HHV-8 einer KS-Gewebeprobe.

Anschließend wurde das vIL-6 kodierende DNA-Fragment über die BamHI und HindIII

Restriktionsschnittstellen in den Ausgangvektor pcDNA3.1myc/his(A) ligiert. Das

entstandene vIL-6 Expressionsplasmid wird im Folgenden pcvIL-6myc/his genannt (Tab.

3). Um Analysen am hIL-6 Promotor durchführen zu können, wurde ein Luziferase-

Reporterplasmid hergestellt. Dazu wurde aus genomischer BCBL-1 DNA mittels PCR ein

1,2 bp großes Fragment amplifiziert, welches die gesamte Sequenz des hIL-6 Promotors

kodiert 94 (Tab. 2) und über die HindIII und XmaI Restriktionsschnittstellen in den

promotorlosen Luziferasevektor p19Luc-basic (StratageneInc., La Jolla, USA) ligiert. Das

resultierende Plasmid wurde als phIL-6pLuc bezeichnet (Tab. 3).

Plasmid Beschreibung

pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ-shN

Eukaryotes Expessionsplasmid, welches eine shRNA gegen kein zelluläres oder virales Gen exprimiert

pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ-shvIL-6

Eukaryotes Expessionsplasmid, welches eine shRNA gegen vIL-6 exprimiert

pcvIL-6myc/his Eukaryotes Expessionsplasmid, mit der DNA-Sequenz des vIL-6 phIL-6pLuc Eukaryotes Expessionsplasmid, mit der DNA-Sequenz des hIL-6

Promotors vor dem firefly-Luziferasegen Tab. 3: In der vorliegenden Arbeit klonierten Plasmide Für alle Klonierungs-PCRs wurde die Expand High Fidelity DNA-Polymerase (Roche,

Mannheim) verwendet, da sie eine proofreading-Funktion besitzt und somit Mutationen

vermieden werden können. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung der amplifizierten

DNA-Fragmente im Agarosegel erfolgte die Reinigung mit Hilfe des Perfect Prep Gel

Cleanup Kit (Eppendorf, Hamburg). Durch Restriktionsverdau mit den entsprechenden

Restriktionsenzymen ((New England Biolabs, Frankfurt) konnten die DNA-Fragmente in

den jeweiligen Ausgangvektor ligiert werden (TaKaRa-DNA-Ligation-Kit, BioWhittaker,

Taufkirchen). Dies war möglich, da die in der PCR verwendeten Oligonukleotide die

entsprechenden Restriktionsschnittstellen enthielten. Die Expressionsplasmide für RTA

und LANA-1 (cDNA-Sequenz des jeweiligen Gens in pcDNA3.1myc/his(A)) wurden

freundlicherweise von der Arbeitsgruppe M. Stürzl zur Verfügung gestellt 95.

Sequenzierung. Zur Kontrolle der erhaltenen Vektoren wurden die ligierten DNA-

Fragemente im Anschluß sequenziert um Mutationen ausschließen zu können. Die

Sequenzierung nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Methode nach Sanger 96 wurde mit

Vektor-spezifischen Oligonukleotiden (Tab. 4) anhand des BigDye Terminator v3.1 Cycle


19

Sequenzing Kit (Applied Biosystems, Weiterstadt) auf einem Kapillar-Sequenziergerät

(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt. Die

Bearbeitung der Sequenzrohdaten und Sequenzvergleiche erfolgte mittels Phred/

Phrap/Consed (University of Washington) und Vector NTI (Invitrogen).

Oligonukleotid Bezeichnung Sequenz

pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ

pSIREN_78 pSIREN_6370

fwd 5`GAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGC3` rev 5`CTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG3`

pcDNA3.1myc/his(A) pcDNA3.1_T7 pcDNA3.1_1045

fwd 5`TTAATACGACTCACTATAGGG3` rev 5ÀGGGGCAAACAACAGATGGCTG3`

p19Luc-basic p19Luc_905 p19Luc_226

fwd 5ÀGAAAGTAAAGGAAGAGTGG3` rev 5`TCAAAGGAGGACCTTGTGGC3`

Tab. 4: Für die Sequenzierung verwendeten Oligonukleotide.

Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien. Die Plamid-DNA-Präparationen erfolgten

aus 250 ml LBAmp-Übernachtkulturen (LB-Medium: 1 % NaCl (w/v); 1 % Bacto-Trypton

(w/v); 0,5 % Hefeextrakt (w/v), pH 7,0) mit Hilfe des PureLinkTM HiPure Plasmid

Maxiprep Kit (Invitrogen, Karlsruhe). Diese Methode beruht auf einer modifizierten

alkalischen Lyse. Die Plasmid-DNA wurde hierbei zuerst unter Niedrigsalzbedingungen

an eine Silica-Anionenaustauschsäule gebunden und nach mehreren Waschschritten unter

Hochsalzbedingungen eluiert. Anschließend erfolgte die Fällung der Plasmid-DNA mit

Isopropanol und ein Waschschritt mit 70 %-tigem Ethanol. Nach Lösen der DNA in H2O

wurde diese photometrisch gemessen.

3.3 Transfektion eukyoter Zellen

Lipid-basierte Transfektionen. HEK239T Zellen wurden mittels Lipofektamin und Plus

Reagenz (Qiagen, Hilden) transfiziert. Hierzu wurden die Zellen am Vortag in 12-Loch-

Schalen ausgesät, so dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Wachstumsdichte von 70

% aufwiesen. Pro Ansatz wurden zwischen 0,2 µg und 2 µg DNA eingesetzt. Zur

vorgelegten DNA wurde der Transfektionsmix I, bestehend aus jeweils 50 µl Optimem

und 2 µl Plus Reagenz pro Ansatz zugesetzt und anschließend für 15 min bei

Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach Zugabe des Transfektionmix II, bestehend aus

jeweils 50 µl Optimem (Gibco, Karlsruhe) und 2 µl Lipofektamin erfolgte eine erneute

Inkubation für 15 min bei RT. Während dieser Inkubationsschritte wurde das Medium der

HEK293T Zellen durch vorgewärmtes Optimem ausgetauscht. Nach Zugabe von 300 µl

Optimem zum Transfektionsansatz wurde dieser vollständig, nach Abziehen des


20

Waschmediums, auf die HEK293T Zellen pipettiert. Anschließend erfolgte eine

Inkubation im Brutschrank für 3 Stunden mit folgender Zugabe von 400 µl

Zellkulturmedium mit 20 % FKS. Am Tag nach der Transfektion wurde ein

Mediumwechsel durchgeführt und nach 48 h die Zellen für weitere Analysen geerntet.

Kalzium-Phosphat-Transfektion. Zur Herstellung pseudotypisierter Retroviren oder des

rvIL-6 wurden die entsprechenden Zellen am Tag vor der Transfektion in 10 cm

Zellkulturschalen ausgesät, so dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine optimale Dichte

von 60-70 % aufwiesen. Die benötigten Puffer und Reagenzien wurden vor der

Transfektion auf RT gebracht. Kurz vor der Transfektion erfolgte ein Austausch des

Zellkulturmediums gegen Chloroquin-haltiges Medium, welches eine Endkonzentration

von 25 µM Chloroquin (Sigma, Taufkirchen) aufwies. Da bei dieser

Transfektionsmethode die Aufnahme der DNA über Endozytose erfolgt, erhöht die

Zugabe von Chloroquin die DNA-Stabilität und somit die Transfektionseffizienz. Die

jeweiligen Expressionsplasmide wurden mit 500 µl CaCl2 (2 M CaCl2 in PBSo ) und

500 µl HBS-Puffer (0,28 M NaCl; 0,05 M HEPES; 1,5 mM Na2HPO4 pH 7,05) vermischt

und nach einer 15-minütigen Inkubation tropfenweise zu den Zellen gegeben. Am Tag

nach der Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel und nach 48 h wurde der

Zellkulturüberstand geerntet.

Elektroporation. Die Transfektion der HHV-8 infizierten PEL Zellen erfolgte durch

„Nukleofektion“ mittels Amaxa-Nukleofektionstechnik (Nucleofector II, Amaxa, Köln).

Pro Ansatz wurden jeweils 2x 106 Zellen mit 10 µg des RTA Expressionsplasmids bzw.

des Leervektors pcDNA3.1myc/his(A) (Invitrogen, Karlsruhe) entsprechend der

Anleitung des B cell line Nucleofactor Kits V (Amaxa, Köln) mit dem Programm Q-01

elektroporiert. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden 10 µg des Plasmids

pmaxEGFP (Amaxa, Köln) „nukleofektiert“. Dieses Plasmid kodiert für das enhanced

green fluorescent protein, wobei die Fluoreszenz 48 h nach Transfektion im FACS

gemessen wurde. Am Tag nach Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel und nach 48 h

wurden die Zellen für weitere Analysen geerntet.

3.4 Promotor-Analysen durch Luziferase-Assay

Mit Hilfe des Luziferase-Assays wurde die Aktivität des hIL-6 Promotors (hIL-6p) unter

den Einfluß der viralen Proteine RTA und LANA-1 analysiert. Die Analysen erfolgten


21

durch transiente Transfektion von HEK293T Zellen mittels Lipofektamin und Plus

Reagenz (Invitrogen, Karlsruhe). Hierzu wurden jeweils 200 ng des Reporterkonstrukts

phIL-6pLuc mit 1 µg des RTA oder LANA-1 Expressionsplasmids bzw. dem Leervektor

pcDNA3.1myc/his (A) kotransfiziert.

Puffer und Lösungen Zusammensetzung

Lysispuffer 100 mM Tris pH 7,8; 1M DTT; 0,139 % DCTA (w/v); 2 % Triton X-100 (v/v); 20 % Glycerol (w/v)

ATP-Lösung 100 mM rATP; 18,2 % 1 M Tris pH 8,8; D-Luziferinstock D-Luiferin (PJK, Kleinbittersdorf) gelöst in 770 µl Assaypuffer KPO4-Lösung 1 M KPO4 pH 4,3 und 1 M KPO4 pH 9,1 eingestellt auf pH 1 Assaypuffer 100 mM KPO4-Lösung ; 15 mM MgSO4 ; 5 mM rATP Luziferinlösung 2 % D-Luziferinstock in Assaypuffer

Tab. 5: Für den Luziferase-Assay verwendete Puffer und Lösungen Die Transfektionsansätze wurden 48 h nach der Transfektion geerntet, mit PBSo

gewaschen und in Lysispuffer (Tab. 5) resuspendiert. Nach anschließender Zentrifugation

für 5 min bei 4 °C (10000 g) wurden die Lysate in eine Luminometer-96-Loch Platte

überführt und ständig auf Eis gehalten. Die Luziferaselösung (50 µl) und der Assaypuffer

(50 µl) wurden vor der Messung durch das Orion Microplate Luminometer (Berthold

Technologies GmbH & Co KG, Bad Wildbad) zugeführt und gemessen. Die Messung der

Proteinkonzentration in dem jeweiligen Lysat erfolgte mit Hilfe des BioRad Protein Assay

(BioRad, München). Die Luziferase-Aktivität der einzelnen Transfektionsansätze wurde

auf die entsprechende Proteinkonzentration abgeglichen und ist als Vielfaches der

Kontrolltransfektion (phIL-6pLuc kotransfiziert mit pcDNA3.1myc/his(A)) dargestellt.

3.5 Hemmmung der Genexpression durch RNAi

Retrovirale Transduktion von shRNAs. Zur Herstellung pseudotypisierter Retroviren

wurden 293-GP Zellen mit je 10 µg des jeweiligen pSIREN-IRES-EGFP-RetroQ-

Konstrukts und 5 µg des vesikulären Stomatitis Virus (VSV)-G Expressionsplasmids

(pVSG-G, Clontech, Saint.-Germain-en-Lay, France) durch die Kalzium-Phosphat-

Methode transfiziert. Nach 48 h wurde der Viren-enthaltende Zellkulturüberstand

geerntet, mittels FKS-abgesättigter Filter (0,45 µM Porengröße) gefiltert und durch

Ultrazentrifugation (Beckmann L755 Ultrazentrifuge, SW28-Rotor, 24000 rpm, 4 °C, 2 h)

konzentriert. Das Zentrifugationssediment wurde anschließend in 2 ml Zellkulturmedium

unter Zusatz von 2 µg/ml Polybren resuspendiert. Polybren ist ein kationisches Polymer,

dass die Ladungsabstoßung zwischen Zellmembran und Virushülle verringert und somit


22

die Transduktionseffizienz erhöht. Das Viruskonzentrat wurde genutzt, um jeweils 1x 106

PEL Zellen zu infizieren. Nach 48 h wurde die Transduktionseffizienz anhand der EGFP-

Expression mittels FACS-Analyse bestimmt und die infizierten Zellen durch Zugabe von

2 µg/ml Puromyzin (Sigma, Taufkirchen) für 10 Tage selektioniert bis ca. 90 % der

Zellen EGFP positiv waren. Mit diesen einheitlich infizierten PEL Zellen wurden die

weiteren Analysen durchgeführt.

Fluorescence activated cell sorter (FACS)-Analysen. Zur Bestimmung der Effizienz

retroviral transduzierter bzw. mit synthetischen siRNAs transfizierter PEL Zellen wurden

jeweils 500 µl der jeweiligen Zellsuspension entnommen und für 5 min bei 4 °C (250 g)

abzentrifugiert.

Parameter Einstellung

FSC: 10-1; Verstärkung 3,86

SSC: 335

FL1: (grün) 505

FL2: (rot) 458

Kompensation: FL2 – 36,3 % FL1

FL1 – 0,9 % FL2

Tab.5: FACS Einstellungen

Alle folgenden Schritte erfolgten bei 4 °C. Nach zweimaligen Waschen in FACS-Puffer

(PBSo, 5 % FKS) wurden die Zellpellets in 500 µl FACS-Puffer resuspendiert, mit 25 µl

einer 0,1 mg/ml konzentrierten Propidiumjodidlösung (PI; Sigma, Taufkirchen) versetzt

und in Falcon-2052 Röhrchen überführt. Da sich PI in toten Zellen einlagert, kann anhand

dieser Färbung die Anzahl der lebenden Zellen bestimmt werden. Nach Inkubation der

Zellsuspension für 10 min auf Eis wurden diese der FACS Analyse unterzogen und

jeweils die rote (FL-2) und die grüne (FL-1) Fluoreszenz detektiert. Die Messung der

Proben erfolgte am Durchflußzytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg)

und die Auswertung anhand des Programms FACS-Express V3.

Transfektion synthetischer siRNAs. Um gleichzeitig die Expression zweier verschiedener

Gene zu inhibieren, kamen synthetische siRNA Oligonukleotide (Tab. 6, IBA, Göttingen)

zur Anwendung. Die Transfektion von PEL Zellen mit diesen siRNAs erfolgte mit Hilfe


23

des HiPerFect Transfektionsreagenz (Qiagen, Hilden) anhand den Angaben des

Herstellers. Hierzu wurden die Zellen im voraus zwei bis drei Tage bei einer Dichte von

200000 Zellen/ml gehalten.

Bez. Sequenz

siN sense 5`GACUACCGUUGUAUAGUAGdTdT3` antisense 5`CUACUAUACAACGGUAGUCdTdT3`

sivIL-6 (597) sense 5ÙUACUUAUCGUGGACGUCAtt3` antisense 5ÙGACGUCCACGAUAAGUAAtt3`

sihIL-6 (863) sense 5`GCUGAGUUAAUUUAUGUAAtt3` antisense 5ÙUACAUAAAUUAACUCAGCtt3`

Tab. 6: Überblick über die verwendeten synthetischen siRNAs Pro Ansatz wurden je 10 µl der entsprechenden siRNA, 8 ml HiPerfect und 300 µl

Optimem (Gibco, Karlsruhe) vermischt und 10 min bei RT inkubiert. Im Anschluss

erfolgte die Transfektion von jeweils 1x 106 Zellen resupendiert in 500 µl Otimem mit

diesem Reaktionsmix. Als Kontrolle wurde ein Ansatz mit einer EGFP markierten siRNA

mitgeführt und die Transfektionseffizienz nach 48 h im FACS ermittelt. Am Tag nach

Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel und nach 48 h wurden die Zellen für weitere

Analysen geerntet.

3.6 RNA-Nachweis

Isolierung gesamtzellulärer RNA und Reverse Transkription. Gesamtzelluläre RNA

wurde mit Hilfe des NukleoSpin RNA II Kit (Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Düren)

anhand den Angaben des Herstellers isoliert. Dabei erfolgt die Aufreinigung der RNA

über eine Silica-Säule. RNA-Degradation durch die Aktivität von RNAsen ist aufgrund

des hohen Anteils an chaotropen Salzen im Lysispuffer minimiert. Unter Hochsalz-

Bedingungen wurden die Nukleinsäuren (DNA, RNA) an die Säulen gebunden und die

DNA mittels DNase I-Inkubation verdaut. Nach mehreren Waschschritten erfolgte die

Elution der RNA in RNAse-freien Wasser. Zum spezifischen Nachweis der Expression

verschiedener Gene wurde die RNA mit Hilfe der SuperscriptTM

II Reversen

Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe) in cDNA umgeschrieben. Im ersten Schritt wurden

je 1 µg der isolierten RNA, 1 µl Random-Hexamer-Oligonukleotid (Bioline,

Luckenwalde) und 1 µl 10 mM dNTPs (Bioline, Luckenwalde) eingesetzt und 5 min bei

65 °C inkubiert. Nach Abkühlen des Reaktionsansatz für 2 min auf Eis erfolgte die

Zugabe von 4 µl 5x First-Strand-Puffer und 2 µl 0,1 M DTT (Invitrogen, Karlsruhe) und

eine weitere Inkubation für 2 min bei 25 °C. Anschließend wurden dem Reaktionsansatz


24

100 U SuperscriptTM

II Reversen Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe) zugesetzt, gefolgt

von einer Inkubation von 10 min bei 25 °C. Die Reverse Transkription erfolgte bei 42 °C

für 50 min. Nach Inaktivierung des Reaktionsansatzes für 15 min bei 72 °C wurde die

synthetisierte cDNA photometrisch gemessen und 1:5 in DEPC Wasser verdünnt.

Quantitative realtime-PCR. Um die mRNA-Expression der viralen (vIL-6, RTA, K8.1,

LANA-1) und zellulären (hIL-6) Gene exakt quantifizieren zu können, wurde eine

realtime-PCR unter Verwendung genspezifischer Oligonukleotide und dem DNA-

Farbstoff SYBR green in einem ABI PRISM 7500 Thermocycler (Applied Biosystems,

Foster City, USA) durchgeführt. In die realtime-PCR-Reaktionen wurde jeweils 10 µl der

verdünnten cDNA eingesetzt. Der Reaktionsansatz beinhaltete 0,2 µM Rox-K Puffer (6-

carboxy-X-rhodamine, Invitrogen, Karlsruhe), 0,6-fach Puffer II (100 mM Tris-HCl

pH8,3; 500 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP (2,5 mM, Bioline, Luckenwalde),

0,1-fach SYBR green (1:1000 in Puffer II verdünnt, Invitrogen, Karlsruhe), je 10 pmol fwd

und rev Oligonukleotid (Biomers, Ulm; Tab. 7) und 0,25 µl Taq-Polymerase (3 U) in

einem Gesamtvolumen von 50 µl. Die Quantifizierung der jeweiligen Transkripte erfolgte

anhand von Standardeichgeraden. Diese wurden durch Verdünnungen von

Expressionsplasmiden (cDNA der zu analysierenden Gene im Vektor

pcDNA3.1myc/his(A)) oder aufgereinigter PCR-Fragmente (PCR aus BCBL-1 cDNA,

Tab. 2) mit bekannter Konzentrationen und Kopienzahl hergestellt.

Oligonukleotid Sequenz

β-Aktin fwd 5`CCATCTACGAGGGGTATGC3` rev 5`CGTGGCCATCTCTTGCTC3`

β-Aktin Standard fwd 5`CCATCTACGAGGGGTATGC3` rev 5`CGTGGCCATCTCTTGCTC3`

vIL-6 fwd 5`GTTTGAAAAGGATCTTCTCATTCAGA3` rev 5`CAGAGGTCGCGGAAGCA3`

vIL-6 Standard fwd 5`TGTGGTCTATCTTGCTGGTAG3` rev 5ÀGATGAAAAATAGCAGCGGG3`

RTA fwd 5`GGTACAGACCCGGCGTTTATT3` rev 5`CGGTGGATGTGTTGTACACCAT3`

K8.1 fwd 5`CCACACAGATTCGCACAGAAA3` rev 5`GGCACGCCACCAGACAA3`

LANA-1 fwd 5`CCAGGAAGTCCCACAGTGTTC3` rev 5`GCCACCGGTAAAGTAGGACTAGAC3`

hIL-6 fwd 5`GTACATCCTCGACGGCATCTC3` rev 5`GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC3`

hIL-6 Standard fwd 5`TTCTGCCCTCGAGCCCACCG3` rev 5`GCAGCTTCGTCAGCAGGCTG3`

Tab. 7: Überblick der in den realtime-PCRs verwendeten Oligonukleotide


25

Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 5 min (initiale Denaturierung); 45

Zyklen: 95 °C für 15 sec (Denaturierung), 60 °C für 35 sec (Annealing), 72 °C für 30 sec

(Extension). Die Auswertung der realtime-PCR erfolgte mit Hilfe der 7000 System SDS

Software (Applied Biosystems, Foster City, USA).

3.7 Proteinnachweis

Gewinnung von gesamtzellulären Protein. Für die Analyse der endogenen Expression

viraler und zellulärer Proteine wurden jeweils 2x 106 der PEL Zellen 5 min bei 4°C

abzentrifugiert (250 g) und das Zellpellet in 100 µl Lysispuffer (Tab. 9) resuspendiert. Zur

Hemmung von Proteasen und Phosphatasen wurde dem Lysispuffer zuvor die in Tab. 8

aufgelisteten Inhibitoren zugesetzt.

Inhibitor Zielenzym Stammlösung Endkonzentration

PMSF Serinproteasen 100 mM in Ethanol 1 mM

Leupeptin Cysteinproteasen 1 mg/ml 10 µg/ml

Pepstatin Aspartatproteasen 1 mg/ml 1 µg/ml

Aprotinin Serinproteasen 1,4 mg/ml 10 µg/ml

NaVO3 / Na3VO4 Tyrosinphophatasen 1 M 10 mM

Tab. 8: Überblick über die verwendeten Protease- und Phosphataseinhibitoren

Nach einer Inkubation für 30 min auf Eis erfolgte die Sonifizierung der Proteinlysate mit

Hilfe des Branson Sonifier® (Emerson, London) für 3 min bei 4 °C. Die

Proteinkonzentration wurde anschließend photometrisch mit Hilfe des BioRad Protein

Assay (BioRad, München) am BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) bestimmt.

Puffer und Lösungen Zusammensetzung

Lysispuffer 0,5 NaCl; 1 % Triton X-100 in PBSo; 10 mM EDTA SDS-Probenpuffer 120 mM Tris/HCl pH 6,8; 20 % Glycerin (w/v); 4 % SDS (v/v); 10

% β-ME (v/v); 0,1 mg/ml Bromphenolblau PBSo 137 mM NaCl; 2,68 mM KCl; 7,3 mM Na2PO4; 1,47 KH2PO4 Proteingel-Laufpuffer 25 mM Tris; 250 mM Glycin; 0,1 % SDS (v/v) Transferpuffer 25 mM Tris; 192 mM Glycin; 20 % Methanol (v/v) Stripp-Puffer 6,25 % Tris pH 6,6; 2 % SDS (v/v), 0,8 % β-ME (v/v) Blocklösung 5 % Magermilchpulver (w/v); 0,3 % Tween20 (v/v) in PBSo ECL-Lösung: SolA SolB H2O2

0,1 M Tris pH 8,6; 25 % Luminol 0,11 % Parahydroxycoumarinsäure 30 % H2O2

Tab. 9: Zur Isolierung gesamtzellulärer Proteine und im Immunblot verwendete Puffer und Lösungen


26

Immunblot. Mit Hilfe des Immunblots können die isolierten Proteine gelelektrophoretisch

anhand ihrer Größe aufgetrennt und durch Antikörper spezifisch nachgewiesen werden.

Jeweils 50 µg der gemessenen Proteinkonzentration wurden mit SDS-Probenpuffer (Tab.

9) versetzt, bei 95 °C für 5 min denaturiert und auf ein 10 %- bzw. 12 %-iges SDS-

Polyacrylamidgel bei 120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Zusätzlich wurde ein

Molekulargewichtsstandard in Form einer vorgefärbten Proteinleiter aufgetragen

(Prestained Protein Ladder, Fermentas Life Science, St. Leon Rot).

Antikörper Isotyp/Ursprung Referenz Verdünnung

vIL-6 IgG monoklonal/Kaninchen Tebu-Bio, Offenbach 1:1000

K8.1 (BS555) IgG monoklonal/Maus Biotest AG, Dreieich 1:1000

P-STAT1 (Tyr 701) IgG polyklonal/Kaninchen New England Biolabs; Frankfurt am Main

1:1000

STAT1 IgG monoklonal/Kaninchen New England Biolabs; Frankfurt am Main

1:1000

P-STAT3 (Tyr 705) IgG monoklonal/Maus Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg

1:1000

STAT3 IgG polyklonal/Kaninchen Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg

1:1000

Aktin IgG monoklonal/Maus Sigma, Taufkirchen 1:5000

Tubulin IgG monoklonal /Maus Sigma, Taufkirchen 1:1000

anti-Maus IgG/Ziege, HRP-markiert DAKO, Hamburg 1:1000

anti-Kaninchen IgG/Ziege, HRP-markiert DAKO, Hamburg 1:1000

Tab. 10: Im Immunblot verwendete Antikörper

Nach dem Gellauf erfolgte der Transfer der Proteine mittels Elektroblot auf eine Protran®

Nitrozellulose-Transfer-Membran (0,2 µM Porengröße; Hartenstein, Würzburg). Um freie

Bindestellen auf der Membran abzusättigen, wurde diese 1 h bei RT in Blocklösung

(Tab. 9) inkubiert. Anschließend erfolgte eine weitere Inkubation der Membran mit dem

spezifischen Primärantikörper (Tab. 10) für 1 h bei RT oder über Nacht (ü. N.) bei 4 °C.

Nach dem Waschen der Membran mit PBSo wurde diese mit dem horseradish peroxidase

(HRP)-gekoppelten Sekundärantikörper (Tab. 10) für 1 h bei RT inkubiert. Im Anschluss

erfolgte ein wiederholtes Waschen der Membran mit PBSo und die Detektion der

gebundenen Antikörper mittels Chemolumineszenz. Mit Hilfe des ECLTM-Systems (Tab.

9, Amersham Pharmacia Biotechnologies, Freiburg) konnte die Chemolumineszenz im

Fuji LAS-1000 Image Reader (Fujifilm, Tokio) nachgewiesen werden. Die Auswertung

erfolgte mit Hilfe des Adobe Photoshop CS (Adobe Systems GmbH, München). Danach

wurden die gebundenen Antikörper durch eine 30-minütige Inkubation der Membran in


27

Stripp-Puffer (Tab. 9) entfernt, um in weiteren Immunreaktionen andere Proteine

spezifisch nachweisen zu können.

Silberfärbung. Es wurde die modifizierte Silberfärbung nach Yan verwendet 97.

Enzyme-linked-immunosorbent Assay (ELISA). Die humane IL-6, IL-1β und IFN-α

Sekretion in das Zellkulturmedium der PEL Zellen wurde mittels eines kommerziell

erhältlichen ELISA Kits (BD Biosciences, Heidelberg) anhand den Angaben des

Herstellers gemessen. Eine 96-Loch Mikrotiterplatte (MaxiSorb ELISA Mikrotiterplatte,

NuncTM) wurde mit dem entsprechenden Capture-Antikörper beschichtet und über Nacht

bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Mikrotiterplatte mit Assay-Puffer

blockiert und anschließend die Standardverdünnungen bzw. die zu messenden

Zellkulturüberstände aufgetragen. Nach Zugabe der Detektions-Antikörper-Enzymlösung,

der Substratlösung und der Stopplösung konnten die einzelnen Reaktionsansätze in der

Mikrotiterplatte im ELISA-Reader (E-Max precisionmicroplate reader, MWG Biotech

AG, Ebersberg) bei einer Wellenlänge von 450 - 560 nm gemessen werden. Zwischen den

einzelnen, zugegebenen Lösungen erfolgten Waschschritte.

Immunfluoreszenz (IF). Zum Nachweis der endogenen Expression und zellulären

Lokalisation viraler Proteine erfolgte mit Hilfe der IF. Hierzu wurden PEL Zellen durch

Zentrifugation (RT, 250 g, 5 min) geerntet, zweimal mit PBSo gewaschen, in 100 - 200 µl

PBSo aufgenommen und auf markierte Objekträger aufgetropft. Nach kurzem Antrocknen

der Zellen erfolgte die Fixierung mittels 3 % PFA in PBSo (w/v) für 10 min bei RT.

Anschließend wurden die Objektträger mit PBSo gewaschen, die Zellen mit Hilfe von

0,2 % Triton X-100 in PBSo (v/v) permeabilisiert und für 1 h mit der Blockierlösung (1 %

BSA (v/v), 5 % FKS (v/v) in PBSo) inkubiert. Nach Zugabe des spezifischen

Primärantikörpers (Tab. 11), erfolgte die Inkubation der Objektträger über Nacht bei RT

in einer feuchten Kammer. Der entsprechende Farbstoff-konjugierte Sekundärantikörper

(Tab. 11) wurde nach Waschen der Objektträger mit PBSo zugegeben und eine 1 h bei RT

unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Im Anschluss wurde der Objektträger erneut

mit PBSo gewaschen, die Waschpufferrückstände mit Hilfe einer Vakuumpumpe entfernt

und der Objektträger mit Eindeckmedium (Vectashield mit DAPI, Vector Laboratories)

eingedeckt. Nach Trocknen der Objektträger ü. N. erfolgte die Auswertung am

Fluoreszenzmikroskop.


28

Antikörper Isotyp/Ursprung Referenz Verdünnung

vIL-6 IgG monoklonal/Kaninchen Tebu-Bio, Offenbach 1:1000

K8.1 (BS555) IgG monoklonal/Maus Biotest AG, Dreieich 1:1000

LANA-1 IgG polyklonal/Ratte Tebu-Bio, Offenbach 1:1000

anti-Maus IgG/Ziege, Cy3-markiert Invitrogen, Karlsruhe 1:200

anti-Kaninchen IgG/Ziege, Alexa555-markiert Invitrogen, Karlsruhe 1:200

anti-Ratte IgG/Ziege, Alexa488-markiert Invitrogen, Karlsruhe 1:200

Tab. 11: In der IF verwendete Antikörper

3.8 Expression und Aufreinigung von rekombinanten vIL-6

Zur Herstellung des rekombinanten vIL-6 (rvIL-6) wurden HEK293T Zellen in 10 cm

Zellkulturschalen ausgesät und anhand der Kalzium-Phosphat-Methode mit 10 µg des

vIL-6 Expressionsplasmids transfiziert. Die Zellen wurden anschließend für vier Tage

kultiviert, wobei täglich ein Mediumwechsel erfolgte und die Zellkulturüberstände von

Tag 2 bis 4 gesammelt und bei – 20 °C gelagert wurden. Ein Aliquot jedes Überstandes

wurde mit 5x SDS-Probenpuffer versetzt, über SDS-PAGE aufgetrennt und die

Expression des vIL-6 im Westernblot mittels eines gegen das myc-Epitop gerichteten

Antikörpers überprüft. Im Anschluss wurden die gesammelten Überstände

zusammengegeben, für 10 min bei 4 °C zentrifugiert (800 g), das Sediment verworfen und

der Überstand steril filtriert (Porengröße 0,22 µm). Anschließend erfolgte die Einstellung

des pH-Wertes durch Zugabe von 1 M Tris Puffer (maximale Endkonzentration: 10 mM

Tris). auf pH 8. In einem ersten Schritt zur Aufreinigung des myc/his-gekoppelten

Proteins wurde der Überstand durch Affinitätschromatographie über eine 1 ml HisTrap-

Säule (GE Healthcare) unter Verwendung des Äkta high performance liquid

chromatography (HPLC) Systems (GE Healthcare) gereinigt. Da nach diesem

Reingungsschritt kein rekombinantes Protein gewonnen werden konnte, erfolgte eine

zweite Aufreinigung des vIL-6-haltigen Durchflusses mittels Zugabe von 7 ml Ni-

nitrilotriacetic (NTA) Agarose (Qiagen, Hilden) und einer Inkubation unter leichten

Schütteln für 2 Tage bei 4 °C. Anschließend wurde die Matrix geerntet und in ein

Omniprep-Säulchen (Biorad) überführt, mit 30 ml PBS und 30 ml 500 mM NaCl und 10

mM Tris pH 8 gewaschen. Das rekombinante vIL-6 wurde im Anschluss durch Zugabe

eines Puffers (500 mM Imidazol; 200 mM NaCl; 10 mM Tris pH 8) in 5 ml Fraktionen

eluiert. Aus jeder Fraktion wurden 10 µl mit SDS-Probenpuffer versetzt,

gelelektrophoretisch über ein 12 %-iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und


29

anschließend mit Hilfe einer Silberfärbung oder eines Immunblots analysiert. Die

Fraktionen, die das rvIL-6 enthielten, wurden zusammengegeben und mittels eines

Amicon-Filters (Milipore; Molekulargewichtdurchlass von 3 kDa ) gegen 1 M HEPES-

Puffer dialysiert. Die Lagerung des aufgereinigten, rvIL-6 mit einer Konzentration von 1

mg/ml erfolgte in 50 µl Aliquots bei - 80°C.

3.9 Bestimmung der Zellproliferation

Die Messung der Wachstumsrate verschiedener Zellen erfolgte mit Hilfe der 3H-

Tyhmidin-Markierung. Hierzu wurden die entsprechenden Zellen dreimal mit sterilem

PBSo gewaschen, im jeweiligen Zellkulturmedium aufgenommen und 5x 104 Zellen in

eine 96-Loch Platte mit rundem Boden überführt. Es wurden jeweils

Dreifachbestimmungen der einzelnen Ansätze durchgeführt. Anschließend erfolgte die

Zugabe von 2 µCi 3H-Thymidin (Amersham, Braunschweig) verdünnt in 48 µl

Zellkulturmedium pro Ansatz (Endkonzentration 0,5 µCi pro Ansatz). Nach einer

Inkubation für 16 h im Brutschrank wurden die markierten Zellen auf einen Glasfaserfilter

mit Hilfe eines Multi-Harvester überführt und mit einer Szintillatorplatte (Wallac Oy,

Turku) bei 95 °C überschichtet. Der 3H-Thymidin-Einbau in die zelluläre DNA wurde mit

Hilfe eines MicroBeta TriLux Zählers (Perkin Elmer, Wellesley) gemessen.

Ergebnisse

30

4 Ergebnisse

4.1 Expression des endogenen vIL-6 in PEL Zellen

PEL Zelllinien wurden von primären Effusionslymphomen oder sog. body cavity-based

lymphoma (BCBL) etabliert. Diese Zellen können unbegrenzt kultiviert werden und sind

stets mit HHV-8 infiziert. In etwa 50 % der PEL Zelllinien findet man darüberhinaus das

Genom des EBV. Charakteristisch für die überwiegend latente Infektion der PEL Zellen

ist das Vorhandensein des HHV-8 Genoms als Episom im Zellkern, sowie die Expression

einer begrenzten Anzahl viraler Gene. Nur ein geringer Prozentsatz der HHV-8 positiven

Zellen geht spontan in die lytische Replikationsphase des Virus über. Erst durch die

Behandlung mit TPA und NaB 88, 98, kann die lytische Genexpression in einem größeren

Prozentsatz der PEL Zellen induziert werden. Das vIL-6 wird von den meisten Autoren

als ein frühes, lytisches HHV-8 Gen eingestuft. Die Expression dieses Gens ist zwar in

latenten PEL Zellen nachweisbar, wird aber durch die Induktion der lytischen Replikation

drastisch erhöht 55, 60. Um die Expression und zelluläre Lokalisation von vIL-6

nachzuweisen, erfolgte eine Immunfluoreszenzfärbung (IF) von vIL-6 in Kombination mit

einem typischen latenten HHV-8 Gen (LANA-1) und einem späten, lytischen Gen (K8.1)

in der PEL-abgeleiteten Zelllinie BCBL-1. Hierzu wurden die BCBL-1 Zellen für zwei

Tage mit 0,3 M NaB und 25 ng/ml TPA induziert. Als Kontrolle dienten nichtstimulierte

BCBL-1 Zellen sowie HHV-8 und EBV-negative Akata Zellen. Die Expression des

viralen Zytokins war sowohl in nichtinduzierten (Abb. 3A Reihe 4), als auch in TPA und

NaB induzierten BCBL-1 Zellen mittels IF nachweisbar (Abb. 3A Reihe 1).

Allerdings war die Anzahl der vIL-6 positiven Zellen durch die chemische Induktion der

lytischen Replikation um das Dreifache erhöht (Abb. 3A Reihe 1 vgl. mit Reihe 4).

Gleichzeitig konnte in den vIL-6 positiven Zellen auch die Expression des Glykoprotein

K8.1 detektiert werden (Abb. 3B). Die Expression dieser lytischen, viralen Proteine

erfolgte sowohl im Zytoplasma als auch am endoplasmatischen Retikulum (ER) der

induzierten BCBL-1 Zellen 95. Bei den BCBL-1 Zellen, die auch ohne vorherige

Induktion mit TPA und NaB, vIL-6 und K8.1 positiv sind, handelt es sich um die 1 % der

kultivierten PEL Zellen, welche spontan den lytischen Replikationszyklus durchlaufen.

Ergebnisse

31

Ergebnisse

32

Abbildung 3: Expression und zelluläre Lokalisation von endogenem vIL-6 in latent oder lytisch infizierten BCBL-1 Zellen. Nichtinduzierte, für 48 h mit TPA und NaB induzierte BCBL-1 Zellen und HHV-8 negative Akata Zellen wurden mit PFA fixiert und mittels IF untersucht. Die Bilder jeder horizontalen Reihe stellen jeweils den selben Bildabschnitt dar. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen einem repräsentativen Versuch. (A) Die Färbung der Zellkerne mit DAPI (blau) ist in der ersten Spalte dargestellt. Die zweite Spalte repräsentiert den Nachweis von LANA-1 mit einem Alexa 488-konjugierten Zweitantikörper (grün). Die dritte Spalte zeigt die Detektion des vIL-6 mit einem Alexa 555-gekoppelten Zweitantikörper (rot). Ganz rechts ist jeweils der Overlay der drei Bilder dargestellt. Die Bilder entsprechen einer 20-fachen Vergrößerung, während die mit I und II gekennzeichneten Bilder eine 40-fache Vergrößerung des markierten Bildabschnitts darstellen. (B) Die erste Spalte repräsentiert die Färbung der Zellkerne mit DAPI (blau). In der zweiten Spalte ist der Nachweis von K8.1 mit einem Cy5-konjugierten Zweitantikörper (gelb) dargestellt. Die dritte Spalte zeigt die Detektion des vIL-6 mit einem Alexa 555-gekoppelten Zweitantikörper (rot). Ganz recht ist jeweils der Overlay der drei Bilder dargestellt. Die Bilder entsprechen einer 20-fachen Vergrößerung, während die mit I gekennzeichneten Bilder eine 40-fache Vergrößerung des markierten Bildabschnitts darstellen.

Mit der Immunfluoreszenz war das latent exprimierte LANA-1 Protein als unregelmäßig

geformte, punktartige Strukturen im Zellkern nachweisbar (Abb. 3A Reihe 4). Bei

Reaktivierung des lytischen Zyklus der HHV-8 Genexpression wich diese diskrete

nukleäre Anfärbung einer diffusen sowohl nukleären als auch zytoplasmatischen

Verteilung (Abb. 3A Reihe 1).

4.2 Biologische Aktivität des rekombinaten vIL-6

Die RNA-Interferenz ist eine sehr effektive Methode um spezifisch die Expression

bestimmter Gene zu hemmen und dadurch deren Funktion in der Zelle zu untersuchen.

Um mögliche unspezifische Nebeneffekte der verwendeten siRNAs ausschließen zu

können, ist die Rückführung des beobachteten Phänotypes durch die Expression einer

resistenten Form des entsprechenden Zielgens eine wichtige Kontrolle 99. Als Kontrolle

der siRNA-Experimente in dieser Arbeit wurde ein rekombinant produziertes vIL-6

verwendet. Wie verschiedene Veröffentlichungen belegten, ist das aus Bakterienzellen

gewonnene vIL-6 überwiegend nicht korrekt gefaltet und weist daher eine stark

verminderte funktionelle Aktivität auf 54, 73. Aus diesem Grund erfolgte die Expression

des vIL-6 in der vorliegenden Arbeit in eukaryotischen Zellen. Nach transienter

Transfektion von HEK293T Zellen mit einem myc- und hexahistidine-gekoppelten vIL-6

Expressionsplasmid (pcDNA3.1vIL-6myc/his(A)) konnte die Sezernierung des viralen

Zytokins in den Zellkulturüberstand mittels Westernblot nachgewiesen werden. Die

anschließende Reinigung erfolgte mit Hilfe einer modifizierten Ni-NTA

Affinitätschromatographie. Eluiert wurde das gereinigte Protein in einen imidazolhaltigen

Puffer. In Abb. 4A ist das Ergebnis der Reinigung dargestellt. Sowohl in der

Silberfärbung als auch der Westernblot Analyse des aufgereinigten Proteins zeigte sich

Ergebnisse

33

eine Doppelbande von 24 bis 28 kDa. Dies ist vermutlich auf unterschiedliche

Glykosilierungsformen des viralen Zytokins zurückzuführen und wurde schon von

anderen Arbeitsgruppen beobachtet 65. Des Weiteren konnte eine zusätzliche

Doppelbande bei ca. 72 kDa nachgewiesen werden, die anhand der Größe einem vIL-6

Dimer entspricht. Wie aus dem in Abb. 4A dargestellten Silbergel (I) ersichtlich ist, war

das gereinigte rekombinante vIL-6 (rvIL-6) weitgehend frei von Kontaminationen. Nach

Dialyse des analysierten Proteins gegen 1 M HEPES-Puffer wurde die Konzentration des

gereinigten rvIL-6 bestimmt.

Abbildung 4: Expression und Charakterisierung des rekombinanten vIL-6 (rvIL-6). (A) Die Expression des myc/his-gekoppelten rvIL-6 erfolgte in HEK293T Zellen mit anschließender Reinigung über eine modizierte Ni-NTA Affinitätschromatographie. Zur Überprüfung der Reinheit des Proteins wurden jeweils 2 µg über ein 12 % SDS-Poylacrylamid-Gel aufgetrennt und einer Silberfärbung (I) oder einer Westernblot Analyse (II) mit einem gegen das myc-Epitop gerichteten Antikörpers unterzogen. (B) Induktion der Proliferation von INA-6 Zellen durch Zugabe von rhIL-6 und rvIL-6. INA-6 Zellen wurden unter Zusatz von ansteigenden Konzentrationen von rhIL-6 (I; Strathmann Biotech) oder rvIL-6 kultiviert. Die Messung der Wachstumsrate erfolgte durch 3H-Thymidine-Markierung der Zellen. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen einem repräsentativen Experiment.

Um die biologische Aktivität des rekombinant hergestelltem vIL-6 zu überprüfen, wurde

die IL-6 abhängige Myelomzelllinie INA-6 unter Zugabe von ansteigenden Mengen an

viralen bzw. humanen IL-6 kultiviert und die Zellvermehrung anhand der 3H-Thymidin-

Markierung ermittelt. Wie in Abb. 4B zu sehen ist, wachsen INA-6 Zellen bei einer hIL-6

Konzentration von weniger als 1 ng/ml (I), wohingegen zwischen 50 und 100 ng/ml des

Ergebnisse

34

gereinigten rvIL-6 (II) nötig waren, um vergleichbare Proliferationsraten zu erzielen.

Diese relativ geringe spezifische Aktivität des vIL-6 stimmt sehr gut mit den Ergebnissen

mehrerer anderer Arbeitsgruppen überein 100, 73, 65.

4.3 Effekte der vIL-6 Inhibierung durch RNA-Interferenz in PEL Zellen

Wie viele andere Post-Keimzentrum B-Lymphozyten benötigen PEL Zellen zum

Überleben und zum Wachstum unter anderem die Signaltransduktionswege, welche durch

die Zytokine der IL-6 Familie aktiviert werden 71. Um die biologische Rolle des durch

HHV-8 kodierten Zytokins für die PEL Zellen zu bestimmen, wurde die Expression des

endogenem vIL-6 mit Hilfe der RNAi gehemmt. Um eine dauerhafte Expression der

shRNAs in den PEL Zellen zu gewährleisten wurden BCBL-1 Zellen mit einem

pseudotypisierten Retrovirus transduziert. Der selbstinaktivierende, retrovirale Vektor

pSIREN-EGFP-RetroQ ist vom Murinen-Leukemie-Virus (MLV) abgeleitet. Nach

Transduktion der Zellen können diese über die retroviral exprimierte Puromyzinresistenz

selektioniert werden. Die Kontrolle der Transduktionseffizienz erfolgte mit Hilfe der

EGFP Expression. Die Ergebnisse einer repräsentativen FACS-Analyse sind in der Abb.

5A dargestellt. Die initiale Transduktionseffizienz der BCBL-1 Zellen lag bei ca. 20 %.

Durch Kultivierung dieser Zellen in puromyzinhaltigen Nährmedium ab dem zweiten Tag

nach der Transduktion für zehn Tage konnte die Anzahl der EGFP-exprimierenden Zellen

auf nahezu 100 % gesteigert werden. Alle folgenden Experimente wurden mit diesen

selektionierten BCBL-1 Zellen durchgeführt.

Wachstumsminderung der BCBL-1 Zellen und Induktion von K8.1. Die Proteinexpression

des vIL-6 in den transduzierten BCBL-1 Zellen wurde mittels Westernblot nachgewiesen.

Ein Teil der Zellen wurde zuvor für 48 h mit TPA und NaB behandelt um den lytischen

Replikationszyklus von HHV-8 zu induzieren. Wie in Abb. 5B zu sehen ist, war die

Detektion der vIL-6 Expression im Westernblot nur nach vorangegangener, chemischer

Induktion des lytischen Zyklus möglich. Im Vergleich dazu konnte die Expression des

viralen Zytokines in den nichtinduzierten BCBL-1 Zellen mittels Westernblot nicht

nachgewiesen werden. Dies war jedoch mit der sensitiveren realtime-PCR auf der Ebene

der Transkription möglich (Abb. 12). Auch mit der Immunfluoreszenz konnte die

Expression des vIL-6 in Kulturen nichtinduzierter PEL Zellen nachgewiesen werden

(Abb. 3). BCBL-1 Zellen, welche mit der vIL-6 spezifischen shRNA (shvIL-6)

transduziert wurden, zeigten eine effiziente Reduzierung der vIL-6 Expression im

Ergebnisse

35

Vergleich zu den mit einer unspezifischen shRNA (shN) transduzierten bzw.

unbehandelten Zellen.

Abbildung 5: Inhibierung der vIL-6 Expression induziert K8.1 und reduziert das Wachstum von BCBL-1 Zellen. BCBL-1 Zellen wurden mit dem shRNA exprimierenden, retroviralen Vektor pSIREN-EGFP-RetroQ transduziert und ab Tag 2 nach Infektion mit Puromyzin selektioniert. (A) Repräsentative Analyse der EGFP Expression durch FACS-Analyse. 48 h nach Transduktion der BCBL-1 Zellen waren ca. 20 % EGFP positiv. Dieser Prozentsatz steigerte sich unter Puromyzinselektion schnell bis zehn Tage nach Infektion fast alle BCBL-1 Zellen EGFP positiv waren. Diese einheitlich transduzierten BCBL-1 Zellen wurden in den weiteren Experimenten verwendet. (B) Westernblot Analyse der BCBL-1 Zellysate, die zuvor mit den shRNA exprimierenden Vektor transduziert wurden. Da die geringe konstitutive Expression des vIL-6 in den BCBL-1 Zellen mittels Westernblot nicht nachgewiesen werden konnte, wurden die Zellen zuvor mit TPA und Natriumbutyrat für 48 h induziert. Akata Zellen und nichtinduzierte BCBL-1 Zellen dienten als Negativkontrollen. Oberer Blot: Monoklonale Anti-vIL-6 Antikörper zur Detektion des vIL-6. Mittlerer Blot: Monoklonale Anti-K8.1 Antikörper (BS555) zum Nachweis der lytischen Replikation nach chemischer Induktion der BCBL-1 Zellen mit TPA und Natriumbutyrat. Unterer Blot: Anti-β-Aktin Antikörper um eine gleichmäßige Proteinbeladung nachzuweisen. Ein repräsentativer Blot aus 5 unabhängigen Versuchen wurde dargestellt. (C) Messung der Wachstumsrate der transduzierten BCBL-1 Zellen durch 3H-Thymidin-Markierung. Die shvIL-6 transduzierten BCBL-1 Zellen wurden für 24 h mit jeweils 10 µg/ml rvIL-6, 100 ng/ml rhIL-6 oder einer entsprechenden Menge an 1 M HEPES-Puffer behandelt. Die gezeigten Werte entsprechen den Mittelwerten und Standardfehler von 6 unabhängigen Experimenten (* T-Test mit verbundenen Stichproben).

Ergebnisse

36

Überraschenderweise führte der knock-down von vIL-6 zu einer verstärkten Induktion des

späten, lytischen Glykoproteins K8.1, wohingegen das Expressionsniveau des zellulären

Aktins unverändert blieb. Wie in Abb. 5C dargestellt, ist die starke Reduktion der vIL-6

Expression in den mit shvIL-6 transduzierten BCBL-1 Zellen mit einer leichten, aber

signifikanten Wachstumsverminderung dieser Zellen verbunden. Im Vergleich dazu

wachsen sowohl die mit shN transduzierten als auch die nichttransduzierten BCBL-1

Zellen unvermindert weiter. Die exogene Zuführung von rvIL-6 oder rhIL-6 zu den vIL-6

reprimierten Zellen konnte die Wachstumsminderung vollständig aufheben (Abb. 5C).

Diese Rekonstitution zeigt, dass die Wachstumsreduktion in shvIL-6 exprimierenden

Zellen tatsächlich auf die Reduktion der vIL-6 Expression und nicht auf unspezifische

oder sogenannten off-target Effekte zurückzuführen ist.

Phosphorylierung der STAT1/3 Transkriptionsfaktoren. vIL-6 vermittelt, ähnlich wie das

zelluläre Gegenstück hIL-6, die Signaltransduktion über die gp130 Untereinheit des

Interleukin-6 Rezeptors 100. Dies führt unter anderem zur Aktivierung der

Transkriptionsfaktoren STAT1 und STAT3 69. Es ist bekannt, dass die Phosphorylierung

von STAT3 eine wichtige Rolle für das Überleben von PEL Zellen spielt 101. Um den

Effekt der vIL-6 Suppression auf die Phosphorylierung dieser Transkriptionsfaktoren zu

untersuchen, wurde das gesamtzelluläre Protein der transduzierten BCBL-1 mittels

Westernblot analysiert (Abb. 6A).

Abbildung 6: Reduktion von vIL-6 in BCBL-1 Zellen induziert Phosphorylierung von STAT1 (A) Westernblot Analyse retroviral transduzierter BCBL-1 Zellen zum Nachweis der Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren STAT1 (P-STAT1Tyr705) und STAT3 (P-STAT3Tyr701). Als Kontrollen wurden jeweils die Proteine STAT1 bzw. STAT3 detektiert. Zur Demonstration einer gleichmäßigen Proteinbeladung erfolgte der Nachweis des zellulären β–Aktin. Gezeigt ist ein repräsentativer Blot aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) Messung der IFN-α Konzentration im Zellkulturüberstand der transduzierten BCBL-1 Zellen 24 h nach Mediumwechsel mittels ELISA. Dargestellt ist ein Kontrollexperiment.

Ergebnisse

37

Die mit shvIL-6 transduzierten BCBL-1 Zellen zeigten im Vergleich zu shN

transduzierten oder unbehandelten Zellen einen Anstieg der STAT1-Phosphorylierung bei

unveränderter STAT1 Expression. Im Gegensatz dazu blieb die Phosphorylierung des

Transkriptionsfaktors STAT3 weitgehend unverändert. Um auszuschließen, dass die

verstärkte Aktivierung des STAT1 Transkriptionsfaktors durch eine unspezifische

Induktion des Interferonsystems hervorgerufen wurde, erfolgte die Messung der IFN-α

Konzentration im Überstand der retroviral transduzierten BCBL-1 Zellen. Die vIL-6

knock-down Zellen wiesen aber im Vergleich zu den Kontrollzellen keine erhöhte

Sekretion von IFN-α auf (Abb. 6B).

Induktion der hIL-6 Expression. Sowohl in vitro als auch in vivo konnte für PEL Zellen

gezeigt werden, dass hIL-6 und vIL-6 in das umgebende Zellkulturmedium bzw. Gewebe

sezerniert wird 71, 102. Wie in Abb. 5C dargestellt, hatte die Verminderung der vIL-6

Expression nur eine geringe Wachstumsminderung zur Folge. Eine mögliche Erklärung

zeigt die Messung der hIL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand der transduzierten

Zellen mittels ELISA in Abb. 7A.

Abbildung 7: Knock-down des vIL-6 in BCBL-1 Zellen induziert hIL-6. Zeitabhängige Akkumulierung des hIL-6 (A) und hIL-1β (B) in den Zellkulturüberständen von retroviral transduzierten BCBL-1 Zellen. Das Zellkulturmedium wurde zum Zeitpunkt 0 vollständig ausgetauscht und nach 3, 6, 12 und 24 h geerntet. Die Messung der Zytokinspiegel erfolgte mit Hilfe eines ELISA. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten und SE aus 4 unabhängigen Experimenten (A) bzw. einem Kontrollexperiment (B).

In den BCBL-1 Zellen, welche die shRNA gegen das virale Zytokin exprimieren (shvIL-

6) und somit in ihrer vIL-6 Expression gehemmt waren, kam es zu einem 2,5-fachen

Anstieg der Produktion von hIL-6 im Vergleich zu unbehandelten (Mock) oder mit der

Kontroll-shRNA (shN) transduzierten BCBL-1 Zellen (Abb. 7A). Die externe Zugabe des

gereinigten rvIL-6 konnte die verstärkte hIL-6 Sekretion auf das Ausgangsniveau

zurückführen (shvIL-6 + rvIL-6). Des Weiteren konnte eine Kreuzreaktion, des für hIL-6-

spezifischen ELISA mit dem viruskodierten Zytokin ausgeschlossen werden, da die

Ergebnisse

38

Zugabe von rvIL-6 nicht zu einem weiteren Anstieg der hIL-6 Konzentration im

Zellkulturüberstand führte (Abb. 7A, shvIL-6 + rvIL-6). Das Auftreten einer

Kreuzreaktion wurde aufgrund der geringen Sequenzidentität beider Zytokine, welche auf

Aminosäureebene nur 24,8 % beträgt 104, auch nicht erwartet. Die Expression eines

anderen, entzündungsspezifischen Zytokins, wie die des humanen Interleukin-1β (hIL-

1β), war durch keine der verwendeten shRNAs beeinflusst (Abb. 7B).

Abbildung 8: Effekte des vIL-6 knock-downs in JSC-1 Zellen JSC-1 Zellen wurden mit dem shRNA exprimierenden retroviralen Vektor pSIREN-EGFP-RetroQ transduziert und ab Tag 2 nach Infektion mit Puromyzin selektioniert. (A) Westernblot Analyse der JSC-1 Zellysate 48 h nach Transduktion. Zum Nachweis der vIL-6 Expression wurden die Zellen für 48 h mit TPA und NaB stimuliert. Oberer Blot: Monoklonale Anti-vIL-6 Antikörper zur Detektion des vIL-6. Unterer Blot: Anti-β-Aktin Antikörper um eine gleichmäßige Proteinbeladung nachzuweisen. Dargestellt wurde ein repräsentativer Blot aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) Messung der Wachstumsrate der transduzierten JSC-1 Zellen durch 3H-Thymidin-Markierung. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert und Standardfehler von drei unabhängigen Versuchen. (C) Nachweis der zeitabhängigen hIL-6 Produktion im Zellkulturüberstand der transduzierten Zellen mittels ELISA. Dargestellt wurden die Mittelwerte und Standardfehler aus drei unabhängigen Experimenten

Die Stimulierung der hIL-6 Expression nach vIL-6 Suppression in PEL Zellen sowie die

leichte Reduktion der Wachstumsrate konnte auch in der sowohl HHV-8 als auch EBV

positiven PEL-Zelllinie JSC-1 nachgewiesen werden (Abb. 8).

Gleichzeitige Inhibierung der vIL-6 und hIL-6 Expression mittels RNAi. Um zu

überprüfen, ob die kompensatorische Produktion des hIL-6 die Ursache für die geringe

Wachstumshemmung in den vIL-6 supprimierten BCBL-1 Zellen ist, wurde im folgenden

Experiment die Expression der beiden Zytokine einzeln und in Kombinantion mittels

Ergebnisse

39

RNAi gehemmt. In Vorversuchen zeigte sich, daß die simultane Inhibition beider

Zytokine ab besten nach Transfektion zweier synthetischer siRNAs in geringen

Konzentrationen erreicht werden konnte. Durch Verwendung fluoreszenzmarkierter

siRNA Oligonukleotide und Bestimmung der Fluoreszenz der PEL Zellen mittels FACS-

Analyse konnte eine Transfektions-Effizienz von mehr als 90 % nachgewiesen werden

(Daten nicht gezeigt).

Abbildung 9: Gleichzeitige Inhibierung von vIL-6 und hIL-6 in BCBL-1 Zellen. BCBL-1 Zellen wurden mit synthetischen siRNAs gegen vIL-6 (si597), hIL-6 (si863) oder beiden siRNAs gleichzeitig (si597 / si863) transfiziert und für 48 h kultiviert. Als Kontrollen wurden unbehandelte und mit einer Kontroll-siRNA transfizierte (siN) BCBL-1 Zellen mitgeführt. Ein Teil der vIL-6 und hIL-6 supprimierten BCBL-1 Zellen wurden gleichzeitig für 48 h mit 10 µg/ml rvIL-6 (si597 / si863 + rvIL-6) bzw. der entsprechenden Menge an 1 M HEPES (si597 / si863) behandelt. (A) Westernblot Analyse der BCBL-1 Zellysate 48 h nach Transfektion. Zum Nachweis der vIL-6 Expression wurden die Zellen für 48 h mit TPA und NaB stimuliert. Nichtinduzierte BCBL-1 und HHV-8 negative Akata Zellen dienten als Negativkontrolle. Obere Hälfte: Monoklonale Anti-vIL-6 Antikörper zur Detektion des vIL-6. Untere Hälfte: Anti-β-Aktin Antikörper zur Überprüfung der Proteinbeladung. Die Abbildung zeigt einen repräsentativer Immunblot von insgesamt 3 unabhängigen Experimenten. (B) Nachweis der hIL-6 Produktion im Zellkulturüberstand der transfizierten Zellen mittels ELISA. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler aus 3 unabhängigen Experimenten. (C) Messung der Wachstumsrate der transfizierten BCBL-1 Zellen durch 3H-Thymidin-Markierung. Die angegebenen Werte entsprechen den Mittelwert und Standardfehler von 3 unabhängigen Versuchen.

BCBL-1 Zellen wurden mit den synthetischen siRNAs gegen vIL-6 (si597), hIL-6 (si863)

oder beiden siRNAs (si597 / si863) transient transfiziert. Als Kontrollen wurden

unbehandelte und mit einer Nonsense-siRNA (siN) transfizierte BCBL-1 mitgeführt.

Zeitgleich wurde den mit beiden siRNAs transfizierten BCBL-1 Zellen jeweils 10 µg/ml

Ergebnisse

40

rvIL-6 (si597 / si863 + rvIL-6) oder die entsprechende Menge an 1 M HEPES (si597 /

si863) zum Zellkulturmedium zugesetzt. Nach zweitägiger Kultivierung der Zellen

erfolgte die Messung der Wachstumsrate sowie die Bestimmung der hIL-6 Konzentration

im Zellkulturüberstand. Um die Expression des vIL-6 im Westernblot nachweisen zu

können, wurde ein Teil der transfizierten Zellen für 48 h mit TPA und NaB induziert. Wie

im Westernblot (Abb. 9A) zu sehen, führte die Transfektion der synthetischen si597 allein

oder in Kombination mit si863 zu einer starken Reduktion der vIL-6 Expression. Die

Zugabe des rvIL-6 hatte keinen Einfluss auf die Reduktion der vIL-6 Transkripte durch

RNAi. Nach Transfektion der synthetischen siRNA gegen hIL-6 (si863) oder siN konnte

wie in den unbehandelten BCBL-1 Zellen keine Hemmung der vIL-6 Expression

nachgewiesen werden. Die Expression des als interne Kontrolle verwendeten β-Aktin

blieb in allen Ansätzen im Wesentlichen unverändert.

Der Nachweis der Inhibierung des zellulären Zytokins erfolgte anhand der Messung der

hIL-6 Konzentration im Überstand der Zellen mittels ELISA (Abb. 9B). Die Transfektion

von si597 führte, ähnlich der retroviral exprimierten shRNA, zu einem Anstieg der hIL-6

Produktion. Im Vergleich dazu hatte die Transfektion der gegen hIL-6 gerichteten si863

einzeln und in Kombination mit si597 eine Verminderung der hIL-6 Sekretion zur Folge.

Dies konnte auch durch Zugabe des rvIL-6 nicht rekonstituiert werden (Abb. 9B). Der

knock-down von vIL-6 bzw. hIL-6 alleine resultierte jeweils in einer mäßigen

Wachstumsminderung im Vergleich zu unbehandelten oder mit siN- transfizierten Zellen

(Abb. 9C). Dagegen hatte die gleichzeitige Suppression beider Interleukine eine starke

Wachstumsstörung der Zellen zur Folge, die durch Zugabe des rvIL-6 wieder aufgehoben

werden konnte.

4.4 Induktion der hIL-6 Expression durch RTA

Wie bereits veröffentlicht kann sowohl das Latenz-assozierte nukleäre Antigen-1 (LANA-

1) 105 als auch der replication and transcription activator (RTA), der Hauptregulator der

lytischen HHV-8 Replikation 94, den hIL-6 Promotor transaktivieren. Basierend auf der

Veröffentlichungen von Deng et al. 94 erfolgte die Herstellung eines Reporterkonstruktes,

welches das firefly-Luziferasegen unter der Kontrolle des hIL-6 Promotors enthält (phIL-

6pLuc). Dieses Reporterkonstrukt wurde zusammen mit einem Expressionsplasmid für

LANA-1 bzw. RTA in HEK293T Zellen transfiziert und im Anschluß einem Luziferase-

Aktivitätstest unterzogen.

Ergebnisse

41

Abbildung 10: RTA induziert die Expression von hIL-6 (A) Aktivierung des hIL-6 Promotors durch die viralen Gene LANA-1 und RTA. HEK293T Zellen wurden mit 0,2 des phIL-6pLuc Reporterkonstruktes und je 1 µg der Expressionsplasmiden für LANA-1- oder RTA kotransfiziert und einem Luziferase-Aktivitätstest unterzogen. Die gezeigten Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten mit SE aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) Quantitative realtime-PCR Analyse zum Nachweis der RTA (I) und LANA-1 (II) Expression in mit retroviralen Vektoren transduzierten (shN: nonsense shRNA; shvIL-6: shRNA gegen vIL-6) oder unbehandelten (Mock) BCBL-1 Zellen. Angegeben ist die relative Kopienzahl (shN = 100 %), welche durch Abgleich der RTA und LANA-1 Transkripte auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Die Werte entsprechen den Mittelwerten mit SE aus 3 unabhängigen Experimenten.

Wie in Abb. 10A dargestellt führt die Expression von LANA-1 zu einer 12-fachen

Induktion des hIL-6 Promotors, während die Expression von RTA in einer 150-fachen

Aktivierung resultiert. Aufgrund dieser starken Wirkung auf den hIL-6 Promotor sowie

der Beobachtung, dass die Inhibition von vIL-6 mit einer verstärkten Induktion des

späten, lytischen Glykoproteins K8.1 verbunden war (5B), wurde vermutet, dass die RTA

Expression als Reaktion auf die Verminderung der vIL-6 Expression ansteigt.

Aus diesem Grund erfolgte mit Hilfe der realtime-PCR eine Bestimmung der RTA- und

LANA-1 Expressionslevel in den transduzierten BCBL-1 Zellen (Abb. 10B). Während

die RTA mRNA Transkripte in den Zellen, welche unbehandelt waren oder die Kontroll-

shRNA exprimierten, weitgehend unverändert waren, stieg die Expression des RTA nach

der Inhibierung des vIL-6 an (Abb. 10B I). Im Vergleich hierzu blieben die LANA-1

Expressionslevel in allen Zellen gleich (Abb. 10B II).

Ergebnisse

42

4.5 Aktivierung der Genexpression durch RTA in PEL Zellen

Die Ergebnisse unter Abs. 4.4 führten zu der Hypothese, dass die erhöhte RTA

Expression in den vIL-6 supprimierten Zellen für die Induktion des hIL-6 verantwortlich

ist. Um nachzuweisen, dass RTA zu der verstärkten Expression des hIL-6 sowie der

lytischen viralen Gene vIL-6 und K8.1 führt, wurde RTA in PEL Zellen überexprimiert.

Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurde ein Ansatz mit einem EGFP

Expressionsplasmid mitgeführt. Die Rate der EGFP-exprimierenen Zellen wurde nach 48

h mit Hilfe des FACS bestimmt. Durch Verwendung der „Nukleofektion“ konnte auch bei

PEL Zellen eine Transfektionsrate von ca. 80 % erreicht werden (Daten nicht gezeigt).

Ebenfalls 48 h nach der Transfektion wurden mit der quantitativen realtime-PCR die

Transkripte von RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 gemessen (Abb. 11A). Die Überexpression

von RTA in BCBL-1 Zellen resultierte in einer verstärkten Expression des hIL-6 im

Vergleich zur Vektorkontrolle. Gleichzeitig wurden auch die beiden viralen, lytischen

HHV-8 Gene vIL-6 und K8.1 hochreguliert. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass der

Regulator der lytischen HHV-8 Replikation, RTA, auch in PEL Zellen zu einer Induktion

der hIL-6 Expression führt. Eine ähnliche hIL-6 Stimulierung konnte ebenfalls nach der

Behandlung verschiedener PEL Zelllinien mit TPA und NaB für 48 h nachgewiesen

werden. Nach Messung der hIL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand mit Hilfe eines

ELISA wurde im Vergleich zu unstimulierten Zellen eine erhöhte Sekretion des zellulären

Zytokins nachgewiesen (Abb. 11B).

Abbildung 11: RTA aktiviert hIL-6 und die lytischen HHV-8Gene vIL-6 und K8.1 (A) BCBL-1 Zellen wurden jeweils mit 10 µg des RTA Expressionsplasmids pAB45(ORF50)myc/his (A) bzw. dem Leervektor pcDNA3.1myc/his (A) elektroporiert. Nach 48 h Inkubation der Zellen erfolgte die Isolation der gesamtzellulären RNA und die Bestimmung der mRNA-Transkriptlevel für RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 mit Hilfe der quantitativven realtime-PCR. Angegeben wurden relative mRNA-Transkriptlevel der verschiedenen Gene bezogen auf nur mit dem Leervektor (pcDNA3.1myc/his(A) = 1) transfizierte Zellen. Bei der Berechnung erfolgte zunächst ein Abgleich auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten mit Standardfehler aus 2 unabhängigen Experimenten. (B) Die HHV-8 positiven Zelllinien BCBL-1, BC-3 und JSC-1 sowie die HHV-8 negativen BJAB Zellen wurden für 48 h mit frischem Medium kultiviert bzw. mit TPA und NaB-haltigen Medium induziert. Die Bestimmung der hIL-6 Konzentration im Zellkulturüberstand erfolgte mittels ELISA. Die gezeigten Werte entsprechen einem Versuch.

Ergebnisse

43

4.6 Rekonstitution der RNAi-bedingten Effekte in PEL Zellen

Obwohl RNAi eine effektive Methode zum Ausschalten bzw. Herunterregulieren

gewünschter Zielgene ist, besteht potentiell die Gefahr gleichzeitig unspezifische

Nebeneffekte zu induzieren. Um die Spezifität der beobachteten Effekte zu überprüfen, ist

ein wichtiges Kontrollexperiment die Rekonstitution des RNAi-bedingten Phänotypes 99.

Die Spezifität der beobachteten Effekte in der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe des

rekombinant hergestellten, gereinigten rvIL-6 überprüft. Wie bereits in Abs. 4.3 erläutert,

konnte sowohl die Reduktion des Wachstums (Abb. 5C) als auch die Induktion der hIL-6

Produktion (Abb. 7A) nach Inhibierung des endogenem vIL-6 durch die externe Zugabe

des rvIL-6 aufgehoben werden. Im folgenden Experiment sollten die Spezifität der

shRNA- bedingten Effekte auf die virale und zelluläre Genexpression in BCBL-1 Zellen

durch die Behandlung mit gereinigteem rvIL-6 bzw. rhIL-6 untersucht werden. Hierzu

wurde ein Teil der transduzierten BCBL-1 Zellen für 48 h mit TPA und NaB inkubiert,

während der andere Teil der Zellen unstimuliert blieb. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte

die Zugabe von 20 µg/ml des rvIL-6, 100 ng/ml des rhIL-6 bzw. die entsprechende

Menge Puffer. Anschließend wurde die gesamte zelluläre RNA isoliert, mit Hilfe der

Reversen Transkriptase in die komplementäre cDNA Sequenz umgeschrieben und mittels

realtime-PCR quantifiziert (Abb. 12). Die Expression der gegen vIL-6 gerichteten shRNA

(shvIL-6) führte im Vergleich zu unbehandelten (Mock) und mit einer shN transduzierten

BCBL-1 Zellen zu einer wesentlichen Reduktion der vIL-6 Expression (Abb. 12, Reihe

1). Dies konnte sowohl in nichtinduzierten als auch in TPA und NaB induzierten Zellen

nachgewiesen werden. Die Behandlung der vIL-6 supprimierten Zellen mit rvIL-6 oder

rhIL-6 hatte keinen Einfluss auf das Niveau der vIL-6 Transkription. Der knock-down von

vIL-6 führte zu einer erhöhten Expression von RTA, K8.1 und hIL-6 (Abb. 12) sowohl in

latent infizierten (Abb. 12, linke Spalte) als auch und lytisch induzierten BCBL-1 Zellen

(Abb. 12, rechte Spalte). Diese Aktivierung der viralen und zellulären Genexpression

durch den vIL-6 knock-down konnte durch den Zusatz von rvIL-6 zum Zellkulturmedium

der shvIL-6 transduzierten Zellen (shvIL-6 + rvIL-6) wieder auf die ursprünglichen Werte

zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung dieser Zellen mit rhIL-6

(shvIL-6 + rhIL-6) eher einen verstärkenden Effekt auf die Expression von RTA, K8.1

und hIL-6. Diese Ergebnisse bestätigten auf der einen Seite die Funktionalität des

rekombinant produzierten vIL-6, auf der anderen Seite demonstriert die Rekonstitution

Ergebnisse

44

der shRNA-bedingten Effekte durch die Behandlung mit rvIL-6 die Spezifität des

beobachteten Phänotypes.

Abbildung 12: Wiederherstellung der RTA, K8.1 und hIL-6 Expressionslevel nach Inhibierung des vIL-6 durch Zugabe von rvIL-6. Die retroviral transduzierten BCBL-1 Zellen verblieben unbehandelt (linke Spalte) oder wurden für 48 h mit TPA und NaB stimuliert (rechte Spalte). Die vIL-6 supprimierten BCBL-1 Zellen wurden zusätzlich mit 20 µg/ml rvIL-6 (shvIL-6 + rvIL-6), 100 ng/ml rhIL-6 (shvIL-6 + rhIL-6) oder der entsprechenden Menge 1 M HEPES (shvIL-6) für 24 h inkubiert. Anschließend erfolgte die Isolierung der gesamtzellulären RNA, die reverse Transkription in cDNA und die Bestimmung der vIL-6, RTA, K8.1 und hIL-6 Expression mit Hilfe der realtime-PCR. Angegeben wurden relative mRNA-Transkriptlevel der einzelnen Gene (shN = 1), welche durch Abgleich auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler aus 3 unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

45

4.7 Gegensätzliche Wirkung von rvIL-6 und rhIL-6 in PEL Zellen

Die Ergebnisse von Abs. 4.6 deuteten darauf hin, dass die Expression des viralen

Zytokins in PEL Zellen über eine negative Rückkopplung reguliert wird. Im Vergleich

dazu konnte für das zelluläre Homolog in Übereinstimmung mit anderen Arbeitsgruppen

eine postive Rückkopplung nachgewiesen werden 50. Um die unterschiedlichen Effekte

beider Zytokine näher zu untersuchen, wurde zunächst den Zellkulturmedien HHV-8

positiver und negativer B-Zelllinien entweder das rekombinante vIL-6 oder hIL-6

zugesetzt und die Zellen für 24 h kultiviert. Anschließend erfolgte eine Bestimmung der

hIL-6 Expressionslevel mittels realtime-PCR und ein Westernblot zum Nachweis der

Phosphorylierung von STAT1 und STAT3 (Abb. 13).

Abbildung 13: Effekt von rvIL-6 und rhIL-6 in verschiedenen B-Zelllinien Den angegebenen HHV-8 positiven B-Zellen BC-3 und BCBL-1 und die HHV-8 negativen BJAB, INA-6, U937 und LCL Zellen wurde jeweils 10 µg/ml rvIL-6 oder 100 ng/ml rhIL-6 zum Zellkulturmedium zugesetzt. Als Negativkontrolle wurden die jeweiligen Zellen mit der entsprechenden Menge an Puffer (1 M HEPES) behandelt (Mock). (A) Bestimmung der hIL-6 mRNA-Transkripte mittels realtime-PCR. Nach Kultivierung der Zellen für 24 h erfolgte die Isolierung der gesamtzellulären RNA und Transkription in cDNA. Die angegebenen Werte zeigen die relative hIL-6 Expression (Mock = 1) in der jeweiligen Zelllinie, welche durch Abgleich der hIL-6 Transkriptmengen auf die des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Dargestellt ist ein Experiment. (B) Westernblot von BC-3 Zelllysaten zum Nachweis der Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren STAT1 (P-STAT1Tyr705) und STAT3 (P-STAT3Tyr701). Als Kontrollen wurden die endogenen Expressionlevel von STAT1 und STAT3 detektiert. Zur Demonstration einer gleichmäßigen Proteinbeladung erfolgte der Nachweis des zellulären β–Aktins.

Wie in Abb. 13A dargestellt, führte die Zugabe des viralen Zytokins – aber nicht des

humanen Homologs - in den beiden getesteten, HHV-8 positiven PEL Zelllinien BCBL-1

und BC-3 zu einer verminderten Expression von hIL-6. Darüber hinaus konnte nach

Zugabe des rvIL-6 zum Zellkulturmedium der BC-3 Zellen im Westernblot eine leichte

Verminderung der Phosphorylierung STAT1 und STAT3 nachgewiesen werden, während

die rhIL-6 Behandlung besonders bei STAT3 zu einen Anstieg der Phosphorylierung

führte (Abb. 13B). Für die HHV-8 negative humane Leukemiezelllinie U937 konnte eine

Ergebnisse

46

verstärkte hIL-6 Expression nach Behandlung mit rvIL-6 und hIL-6 nachgewiesen

werden, wie bereits von Mori et al. beschrieben 103. Der Zusatz von rvIL-6 und rhIL-6

hatte bei allen anderen getesteten B-Zellen keinen Einfluss auf die hIL-6 Produktion

(Abb. 13A).

Abbildung 14: Gegensätzliche Wirkung von rvIL-6 und rhIL-6 auf die virale und zelluläre Genexpression in PEL Zellen. BCBL-1 Zellen wurden mit ansteigenden Konzentrationen von rhIL-6 (A), rvIL-6 (B) oder rFC (C) behandelt und für 24 h inkubiert. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit der entsprechenden Menge an Puffer (1 M HEPES) behandelt (Mock). Nach Isolation der gesamtzellulären RNA und Umschreibung in cDNA erfolgte eine quantitative realtime-PCR zur Bestimmung der RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 mRNA Expression. Angegeben wurden die relativen mRNA-Level der einzelnen Gene (Mock = 1), welche durch Abgleich auf die Transkriptmengen des housekeeping Gens β–Aktin berechnet wurden. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler aus 4 unabhängigen Experimenten (A, B ausgenommen qRT-PCR für K8.1) bzw. einem Versuch (C).

Des Weiteren wurden die Auswirkung ansteigender Konzentrationen beider Zytokine in

der PEL-abgeleiteten Zelllinie BCBL-1 untersucht. Nach einer 24-stündigen Inkubation

der Zellen erfolgte die Messung der endogenem Expression von RTA, vIL-6, hIL-6 und

K8.1 mittels realtime-PCR. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abb. 14 dargestellt.

Die exteren Zugabe des rhIL-6 führte zu einer dosisabhängigen Induktion der Expression

Ergebnisse

47

aller vier Gene (Abb. 14A). Im Gegensatz dazu führte die ansteigende Konzentration des

rvIL-6 zu einer Reduktion der RTA, vIL-6, hIL-6 und K8.1 Expression (Abb. 14B). Die

Zugabe des rekombinanten Fc-Kontrollproteins (rFc) hatte auch in höheren Mengen

keinen Einfluß auf die Transkriptionslevel der vier untersuchten Gene (Abb. 14C). Wie

bereits in Abs. 4.2 erläutert, resultierte die bis zu 100-fach höhere Konzentration an

eingesetzten rvIL-6 aus der geringeren, spezifischen Aktivität des viralen Zytokins im

Vergleich zu rhIL-6 73, 100, 54

Diskussion

48

5 Diskussion Das vIL-6 steht seit seiner Entdeckung unter dem Verdacht, zur Pathogenese aller HHV-8

assoziierten Erkrankungen beizutragen. 42. Bereits vor der Entdeckung des HHV-8

erschienene Publikationen wiesen auf eine mögliche Beteiligung des pro-

inflammatorischen hIL-6 an der Pathogenese von KS und MCD hin. Obwohl das

viruskodierte Zytokin nur eine geringe Sequenzähnlichkeit zum zellulären Pendant

aufwies, zeigte es vergleichbare biologische Aktivitäten 54, 64, 55. Da die beiden

verwandten Zytokine sowohl in HHV-8 assoziierten Erkrankungen als auch von in

Zellkultur gehaltenen PEL Zellen auf hohen Niveau exprimiert werden, ist die Bedeutung

der zusätzliche Expression eines viruskodierten IL-6 unklar. Bemerkenswert sind die

unterschiedlichen Rezeptorbindungseigenschaften. Während das vIL-6 auch ohne die

lösliche gp80 Untereinheit an die signalvermittelnde gp130 Untereinheit des IL-6R bindet 63, 64, kann das hIL-6 nur im Komplex mit gp80 die Signaltransduktion aktivieren 62. Im

Gegensatz zu gp80, dessen Expression auf wenige Zelltypen beschränkt ist, wird die

gp130 Kette des IL-6R auf nahezu allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert. Des

Weiteren wird die Expression der gp80 Untereinheit durch Typ I Interferone (IFN-α, -β)

herunterreguliert. Aufgrund dessen kann vIL-6 im Vergleich zu hIL-6 auf ein breiteres

Spektrum an Zelltypen wirken und bedingt zumindest teilweise eine Resistenz der HHV-8

infizierten Zellen gegenüber der IFN-induzierten Apoptose 75.

Da bisher kein geeignetes Zellkultursystem oder Tiermodell zur Untersuchung der de

novo Transformation durch HHV-8 zur Verfügung steht, wurden die meisten in vitro

Studien in den von PEL-abgeleiteten Zelllinien durchgeführt. Diese latent mit HHV-8

infizierten B-Zellen exprimieren sowohl beide Untereinheiten des IL-6R als auch das

virale und zelluläre IL-6. Des Weiteren kann in den kultivierten PEL Zellen keine

detektierbaren Mengen an Typ I Interferonen nachgewiesen werden. Trotzdem belegen

eine Reihe von Publikationen, dass vIL-6 für das uneingeschränkte Wachstum der PEL

Zellen von Bedeutung ist 70, 72, 73.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher die Funktion des vIL-6 in den PEL

Zellen näher charakterisiert und von der Wirkung des zellulären IL-6 abgegrenzt werden.

Hierzu wurde die Expression sowohl des viralen als auch des zellulären Zytokins mit

Hilfe der RNAi supprimiert und die daraus resultierenden Effekte in Bezug auf

Proliferation, Signaltransduktion sowie Genexpression untersucht. Um zunächst die

Diskussion

49

endogene Expression und zelluläre Lokalisation des vIL-6 in den vorwiegend

verwendeten BCBL-1 Zellen nachzuweisen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung

durchgeführt. Die Expression des viralen Zytokins war sowohl in latenten als auch zur

lytischen Replikation stimulierten BCBL-1 Zellen nachweisbar. Nach Induktion konnte

jedoch eine deutlich erhöhte Anzahl vIL-6 positiven Zellen beobachtet werden. Dies

korreliert zumindest teilweise mit der bestehenden Einstufung des vIL-6 als frühes,

lytischen HHV-8 Gen 55, 60. Die Kofärbung mit dem viralen Glykoprotein K8.1, einem

späten lytischen HHV-8 Gen, zeigte zudem, dass es sich bei den vIL-6 postiven BCBL-1

Zellen ohne vorherige chemische Stimulation um jene wenigen PEL Zellen handelt, die

spontan den lytischen Replikationszyklus durchlaufen. Eine Gegenfärbung mit dem latent

exprimierten HHV-8 Gen LANA-1 bestätigte diese Beobachtung. Die typische

punktartige, nukleäre Expression von LANA-1 in den latenten BCBL-1 Zellen 106 war in

den lytisch induzierten Zellen nicht mehr nachweisbar.

Die Hemmung der endogenen vIL-6 Expression erfolgte zunächst mit Hilfe der

Transduktion eines pseudotypisierten Retrovirus, welches eine shRNA-

Expresssionskassette in das Genom der Zelle einschleust. Dies ermöglichte die stabile

Expression der shRNA. Der verwendete Vektor enthielt zudem sowohl ein Puromyzin-

Resistenzgen, um die Zellen nach der Infektion zu selektionieren, als auch einen

Fluoreszenzmarker, um die Tranduktionseffizienz abschätzen zu können. Daneben kam

die transiente Transfektion synthetischer siRNAs zum Einsatz. Mit Hilfe beider Methoden

konnte eine Suppression des viralen Zytokins von bis zu 90 % in verschiedenen PEL-

abgeleiteten Zelllinien (BCBL-1, JSC-1) erreicht werden. Interessanterweise korrelierte

der effiziente knock-down des vIL-6 nicht mit einer starken Wachstumsminderung der

Zellen, sondern war mit einer erhöhten Expression des zellulären Homologs hIL-6

verbunden. Zudem zeigte sich, dass die shRNA-bedingte Inhibierung des vIL-6 keinen

Einfluß auf die Aktivierung von STAT3 hatte, aber im Vergleich zu den Kontrollen in

einer erhöhten Phosphorylierung von STAT1 resultierte. Beide Transkriptionsfaktoren

können sowohl durch Bindung des vIL-6 als auch des hIL-6 an den IL-6R über die

signalvermittelte gp130 Untereinheit aktiviert werden, wobei die konstitutive

Phosphorylierung von STAT3 eine wichtige Rolle für das Überleben der PEL Zellen

spielt 101. STAT1 stellt gleichzeitig einen bedeutenden Transkriptionsfaktor dar, der an

der zellulären Interferonantwort vom Typ I und II beteiligt ist 107. Die verstärkte

Aktivierung von STAT1 konnte nach Ausschluß einer unspezifischen Aktivierung des

Diskussion

50

Interferonsystems durch Bestimmung der IFN-α Werte im Zellkulturüberstand auf die

erhöhte hIL-6 Produktion in den vIL-6 knock-down Zellen zurückgeführt werden. Einen

vergleichbaren Effekt der Suppression des vIL-6 mit Hilfe von RNAi bezogen auf das

Wachstum der PEL Zellen konnte auch in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung

der Gruppe von J. Nicholas nachgewiesen werden 108.

Diese Beobachtungen erschienen zunächst widersprüchlich im Hinblick auf bereits

publizierte Daten von K. Jones 72 und A. Kovaleva 73. Beide Gruppen verwendeten

Antikörper um die Aktivität des viralen Zytokins in kultivierten PEL Zellen zu

neutralisieren, was in beiden Arbeiten einem weitaus stärkeren hemmenden Effekt auf das

Wachstum der Zellen hatte. Diese offensichtliche Diskrepanz der Ergebnisse kann auf die

unterschiedliche Kinetik der Neutralisation des vIL-6 mit Hilfe von Antikörpern im

Vergleich zum knock-down der vIL-6 Expression durch die Verwendung von siRNAs

bzw. shRNAs zurückgeführt werden. Während ein neutralisierender Antikörper in einer

sofortigen, vollständigen Blockierung des vorhandenen vIL-6 resultiert, inhibiert die

siRNA-vermittelte Gensuppression nur die de novo Biosynthese des viralen Zytokins.

Aufgrund dessen verbleibt den Zellen genügend Zeit, um mit einer verstärkten hIL-6

Produktion auf die verringerten vIL-6 Proteinlevel zu reagieren und der

Wachstumsminderung entgegenzuwirken. Erst die gleichzeitige Suppression des viralen

und zellulären Zytokin durch Transfektion synthetischer siRNAs resultierte in einer

starken Wachstumsstörung der Zellen. Diese Beobachtung zeigte klar, dass beide

Zytokine für das Wachstum der HHV-8 infizierten Zellen von Bedeutung sein können.

Dies steht im Kontrast zu einer Veröffentlichung von Zhang 74. In dieser Arbeit genügte

die Inhibierung des vIL-6 durch modifizierte Antisense-Oligonukleotide, um eine starke

Wachstumsbeeinträchtigung der PEL Zellen hervorzurufen. Zudem führte die

Suppression des viralen Zytokins zu einer reduzierten Expression des hIL-6. Da die

verwendeten Oligonukleotide in ihrer Sequenz aber mehrere CpG Motive enthielten, kann

eine unspezifische Induktion des Interferonsystems als Ursache für die von Zhang et al.

beobachteten Effekte nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren wurden in früheren

Arbeiten unter Verwendung derselben Technik gegenteilige Ergebnisse veröffentlicht 70.

Die kompensatorische Induktion des hIL-6 nach Suppression des vIL-6 steht nur

scheinbar im Gegensatz zu bereits veröffentlichten Daten. Sowohl für das zelluläre 109, 110

als auch das virale IL-6 103 wurde von anderen Arbeitsgruppen die Existenz eines

positiven Rückkopplungsmechanismus in Bezug auf die Expression des hIL-6 gezeigt.

Diese positive Rückkopplung wurde aber ausschließlich in HHV-8 negativen Zelllinien

Diskussion

51

nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass vIL-6 in PEL Zellen

sowohl die eigene Expression als auch die des zellulären IL-6 inhibiert. Um zunächst die

Ursache für die Induktion des hIL-6 in den vIL-6 knock-down Zellen aufzuklären, wurde

die Aktivierung eines Reporterkonstruktes, welches das firefly-Luziferasegen unter der

Kontrolle des hIL-6 Promotors enthielt, in HEK293T Zellen untersucht. Wie bereits in der

Literatur beschrieben, bewirkten sowohl LANA-1 105 als auch RTA 94 eine Induktion des

hIL-6 Promotors. Nach Bestimmung der RTA und LANA-1 Expressionslevel in den vIL-

6 supprimierten PEL Zellen mittels realtime-PCR, konnte die erhöhte hIL-6 Produktion

eindeutig auf eine verstärkte RTA Expression zurückgeführt werden. Dies deutet darauf

hin, dass vIL-6, im Unterschied zu hIL-6, die Aktivität des RTA Promotors inhibiert. Auf

diesem Weg reduziert vIL-6 die Expression des zellulären Zytokins in den latent mit

HHV-8 infizierten Zellen, aber nicht in Zellen, die das virale Genom nicht besitzen. Da

RTA auch als der Hauptregulator der lytischen HHV-8 Replikation bekannt ist, lieferte

dieses Ergebnis auch eine Erklärung für die Induktion des späten, lytischen HHV-8 Gens

K8.1 nach Inhibierung des vIL-6 durch RNAi. Nach Überexpression von RTA in PEL

Zellen konnte zudem gezeigt werden, dass dieses Protein sowohl die Expression der

lytischen, viralen Gene K8.1 und vIL-6 als auch des zellulären hIL-6 induziert. Eine

Stimulierung der hIL-6 Produktion in PEL Zellen kann des Weiteren auch durch die

Behandlung mit TPA und NaB erreicht werden. Im Überstand dieser chemisch

induzierten PEL Zellen wurden, im Vergleich zu unbehandelten Zellen, erheblich höhere

Konzentrationen des zellulären Zytokins nachgewiesen. Dies ist auf die Aktivierung des

RTA Promotors nach Induktion der PEL Zellen mit TPA zurückzuführen 111.

Die Anwendung der RNAi stellt eine sehr effektive Methode dar um die Expression der

viralen Gene und deren Funktion innerhalb der latent mit HHV-8 infizierten Zelle zu

untersuchen. Um unspezifische Nebeneffekte der verwendeten siRNAs auszuschließen, ist

die Rekonstitution des RNAi-bedingten Phänotyps eine wichtige Kontrolle. Da die

Expression eines, in der siRNA-Zielsequenz mutierten, vIL-6 in den PEL Zellen nicht in

ausreichenden Mengen möglich war, wurde die Spezifität der beobachteten Effekte mit

Hilfe eines rekombinant hergestellten vIL-6 überprüft. Wie verschiedene Arbeiten

belegen, besitzt ein in Bakterienzellen exprimiertes vIL-6 im Vergleich mit eukaryont

exprimiertem vIL-6 nur eine um den Faktor 10 bis 100 verminderte spezifische Aktivität 54, 73. Aus diesem Grund erfolgte die Gewinnung des rvIL-6 in der vorliegenden Arbeit

aus eukaryonten Zellen. Die Reinigung aus dem Zellkulturüberstand erfolgte unter nicht-

Diskussion

52

denaturierenden Bedingungen mit Hilfe einer modifizierten Ni-NTA

Affinitätschromatographie. Die Reinheit des rvIL-6 konnte durch Westernblot und

Silberfärbung bestätigt werden. Die biologische Aktivität des aufgereinigten Zytokins

wurde anhand von Wachstumsraten der IL-6 abhängigen Myelomzelllinie INA-6 nach

Zugabe von rvIL-6 im Vergleich zu einem kommerziell erworbenen rhIL-6 ermittelt. Um

eine vergleichbare Proliferation der INA-6 Zellen zu erreichen, musste das virale Zytokin

in 50 bis 100-fach höherer Konzentration als das zelluläre IL-6 eingesetzt werden.

Ähnliche Ergebnisse wurden in bereits bestehenden Veröffentlichungen anderer

Arbeitsgruppen belegt 73, 65, 100 und sprechen sowohl für eine korrekte Faltung als auch für

die Funktionalität des in der vorliegenden Arbeit verwendeten Proteins. Die externe

Zugabe dieses rvIL-6 zum Zellkulturmedium der vIL-6 supprimierten PEL Zellen hatte

keinen Einfluß auf die RNAi-bedingte Inhibierung der vIL-6 Transkription. Allerdings

konnte die Reduktion des Wachstums der Zellen sowie die verstärkte Produktion des hIL-

6 nach dem knock-down des endogenem vIL-6 aufgehoben werden. Ein weiterer Effekt

der vIL-6 Suppression mittels RNAi war die erhöhte Expression der viralen (RTA, K8.1)

und zellulären (hIL-6) Gene auf Ebene der mRNA sowohl in latenten als auch durch TPA

und NaB stimulierten PEL Zellen. Durch die Behandlung dieser vIL-6 knock-down Zellen

mit dem aufgereinigten rvIL-6 konnte die erhöhte Expression dieser Gene wieder auf die

ursprünglichen Werte zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu resultierte die externe

Zugabe des rhIL-6 zu kultivierten PEL Zellen in einer erhöhten Expression dieser Gene..

Diese Ergebnisse demonstrieren auf der einen Seite die Spezifität des RNAi-bedingten

Phänotyps in den PEL Zellen. Auf der anderen Seite weisen sie für vIL-6, im Gegensatz

zu hIL-6, auf das Vorhandensein eines negativen Regulationsmechanismus in den latent

mit HHV-8 infizierten Zellen hin. Zudem sind diese Befunde der erste klare Anhaltspunkt

dafür, dass vIL-6 auch über andere Signaltransduktionswege wirken kann als das zelluläre

Homolog.

Um die unterschiedlichen Effekte des viralen und zellulären Zytokins näher zu

untersuchen, wurden sowohl die HHV-8 positiven PEL Zellen als auch verschiedene

HHV-8 negative B-Zelllinien mit rvIL-6 oder rhIL-6 behandelt. Anhand der hIL-6

Expressionlevel, welche mit Hilfe der quantitativen realtime-PCR ermittelt wurden, sind

die Auswirkungen der beiden, verwandten Zytokine in den verschiedenen Zellen sehr

deutlich zu erkennen. Während die Behandlung der PEL-abgeleiteten Zelllinien BCBL-1

und BC-3 mit rvIL-6 zu einer verminderten Expression des hIL-6 führte, hatte der Zusatz

Diskussion

53

von rhIL-6 den gegenteiligen Effekt. Diese unterschiedliche Wirkungweise der beiden

verwandten Zytokine in den BC-3 Zellen konnte auch in Bezug auf die Phosphorylierung

der Transkriptionsfaktoren STAT1 und STAT3 nachgewiesen werden. Während die

Zugabe des vIL-6 zu einer leichten Verminderung der Phosphorylierung von STAT1 und

STAT3 führte, hatte der Zusatz von hIL-6 eine Aktivierung besonders von STAT3 zur

Folge. Diese Beobachtungen stehen in Kontrast zu einer Publikation der Gruppe um J.

Nicholas. In der Studie konnte gezeigt werden, dass die Zugabe des vIL-6 zu einer

verstärkten und länger anhaltenden Phosphorylierung von STAT1 im Vergleich zu hIL-6

führt 64. Allerdings wurden die Untersuchungen wiederum in HHV-8 negativen Zellen

durchgeführt. Der inhibierende Effekt des viralen Zytokins auf diese STAT

Transkriptionsfaktoren in PEL Zellen könnte durch eine verstärkte Aktivierung von

zellulären Inhibitoren des JAK-STAT Signaltransduktionswegs, wie SOCS3 112, 113

hervorgerufen werden. Im Vergleich zu den PEL Zelllinien bewirkten sowohl vIL-6 als

auch hIL6 in der HHV-8 negativen humanen Leukämiezelllinie U937 eine Induktion der

hIL-6 Expression. Letzteres ist in guter Übereinstimmung mit publizierten Daten der

Arbeitsgruppe um Y. Mori 103. Des Weiteren konnte in den latent mit HHV-8 infizierten

PEL Zellen eine dosisabhängige Suppression der viralen (RTA, vIL-6, K8.1) und

zellulären (hIL-6) Genexpression nach Behandlung der Zellen mit ansteigenden

Konzentrationen an rvIL-6 nachgewiesen werden, während rhIL-6 zu einer Induktion

dieser Gene führte. Das als Kontrolle dienende und in den gleichen Konzentrationen wie

rvIL-6 eingesetzte Fc-Protein hatte keinen Effekt auf die Genexpression.

Basierend auf diesen Ergebnissen kann folgende Schlußfolgerung gezogen werden.

Während für die beiden verwandten Zytokine in HHV-8 negativen Zellen ein positiver

Rückkopplungsmechanismus nachweisbar ist, liegt in den latent mit HHV-8 infizierten

PEL Zellen ein inhibierender Effekt des vIL-6 auf die Expression einiger viraler und

zellulärer Gene vor. Im Gegensatz dazu induziert hIL-6 auch in HHV-8 infizierten Zellen

die Transkription dieser Gene. Die unterschiedliche Wirkungweise des vIL-6 in den

verschiedenen Zelllinien ist dabei auf das Vorhandensein des HHV-8 Genoms

zurückzuführen. Dem positiven Rückkopplungsmechanismus, welcher normalerweise

durch die gp130 Untereinheit des IL-6R vermittelt wird, wirkt in diesen Zellen eine

Inhibierung des viralen RTA über einen bisher unbekannten Signalweg entgegen (Abb.

15). Die verminderte Expression des starken Transaktivators RTA wiederum vermittelt

die reduzierte Expression sowohl lytischer viraler Gene als auch des zellulären IL-6.

Diskussion

54

Zudem deuten die Ergebnisse der untersuchten Signaltransduktionswege auf eine

Beteiligung des STAT1 Transkriptionsfaktors hin. Die Bedeutung dieses negativen

Regulationsmechanismus für HHV-8 kann wie folgt erklärt werden: eine Aktivierung der

viralen und zellulären Genexpression, wie es für hIL-6 beschrieben ist, würde zu einer

verstärkten Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes und einer Reaktivierung des

Virus in den benachbarten Zellen führen. Dies wäre mit der starkt regulierten, latenten

HHV-8 Infektion, welche in allen Zellen und Geweben besteht, nicht vereinbar. Die

Modulierung der gp130 Signalübertragung des IL-6R und Beeinflußung des RTA

Promotors durch vIL-6 ermöglicht es dem Virus dagegen, dem positiven

Rückkopplungsmechanismus entgegenzuwirken. Dadurch kann vIL-6 sowohl die

Aktivierung der lytischen HHV-8 Replikation als auch des zellulären Immunsystems

unterbinden und somit zur Aufrechterhaltung der latenten Infektion und dem Überleben

der HHV-8 infizierten Zellen beitragen.

Abbildung 15: Modulation der Genexpression durch hIL-6 and vIL-6 (A) Das hIL-6 bindet nur im Komplex mit der löslichen gp80 Untereinheit an die signalübertragende gp130 Untereinheit des IL-6R. Dies führt durch Signaltransduktion über den STAT und MAPK Weg zur Induktion der viralen und zellulären Promotoren. (B) Das vIL-6 kann in Abwesenheit des gp80 unter Bildung eines tetrameren Komplex mit gp130 oder wie hIL-6 durch Formation eines hexameren Komplexes, welcher gp80 enthält, den IL-6R aktivieren. Beide Komplexe können zur Induktion der STAT und Ras-MAPK Signaltransduktion führen, aber über eine bisher unbekannten Mechanismus kommt es zu einer Hemmung der RTA induzierten Aktivierung der zellulären und viralen Promotoren.

Diskussion

55

Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals klare Unterschiede zwischen vIL-6 und hIL-6

in Bezug auf die virale und zelluäre Genexpression in den latent mit HHV-8 infizierten

PEL Zellen gezeigt. Allerdings ist der zugrunde liegende Mechanismus noch nicht

vollständig aufgeklärt. Teilweise könnten diese Unterschiede auf die unterschiedlichen

Rezeptorbindungseigenschaften der beiden verwandten Zytokine zurückgeführt werden.

vIL-6 ist das bisher einzige bekannte Zytokin der IL-6 Familie, welches nur über die

gp130 Untereinheit des IL-6R die Signaltransduktion aktivieren kann. Im Hinblick auf die

in dieser Arbeit gezeigten gegensätzlichen Effekte des humanen und viralen Zytokins in

den HHV-8 transformierten PEL Zellen, muss in folgenden Studien der Einfluss der

Unterschiede in der induzierte Signaltransduktion auf die Regulierung des viralen RTA

Promotors näher untersucht werden. Zudem wären weitere Analysen der

Signaltransduktion, besonders der Inhibitoren des JAK-STAT Signalweges, durch vIL-6

in PEL Zellen wichtig um die Bedeutung dieses viruskodierten Zytokins in den HHV-8

infizierten Zellen vollständig aufzuklären.

Abkürzungsverzeichnis

56

6 Abkürzungsverzeichnis AIDS acquired immunodeficiency syndrome

Amp Ampizilin

AS Aminosäure

BCBL-1 body cavity based lymphoma

Bcl2 B-Zell-Lyphomprotein-2

Bez. Bezeichnung

β-ME β-Mercaptoethanol

bp Basenpaar(e)

CDK cyclin-dependent kinase

cDNA copy DNA

Cyc Cyclin

DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosid (Adenin, Zytosin, Guanosin, Thymidin)-Triphosphat

DTT 1,4-Dithiotreithol

EBV Epstein Barr Virus

ECL enhanced chemiluminescence

EGFP enhanced green fluorescent protein

ER Endoplasmatisches Retikulum

FACS fluorescence activated cell sorter

FKS fötales Kälberserum

FLICE FADD-like IL-1 converting enzyme

fwd forward

Genta Gentamyzin

Glu L-Glutamin

GPCR G-Protein gekoppelte Rezeptor

HAART hoch-aktive antiretrovirale Therapie

H-DNA High density DNA

HHV-8 humanes Herpesvirus-8

hIL-6 humanes Interleukin-6


57

HRP horseradish peroxidase

HVS Herpesvirus saimiri

IF Immunfluoreszenz

IAP inhibitor of apoptosis

IL Interleukin

IL-6R Interleukin-6 Rezeptor

IFN Interferon

JAK Janus Kinase

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

KS Kaposi`s Sarkom

KSHV Kaposi`s Sarkom assoziiertes Herpesvirus

LANA Latenz-assoziierte nukleäre Antigen

LB Luria Bertani-Medium

MAPK mitogen-activated protein kinase

MCD Multizentrische Castleman-Erkrankung

MIP Makrophagen inflammatorisches Protein

mRNA messenger RNA

NaB Natriumbutyrat

NF-κB nuclear factor of κB

ORF open reading frame

PAA Polyacrylamid

PBS phosphat buffered saline

PBSo phosphat buffered saline ohne Mg2+- und Ca2+-Ionen

PCR polymerase chain reaction

PEL primäres Effusionslymphom

PFA Paraformaldehyd

PI Propidiumiodid

PMSF Phenylmethylsulfoxid

rev reverse

RNA Ribonukleinsäure

RNAi RNA interference

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institut 1640-Medium

RT Raumtemperatur


58

RTA replication and transcription activator

SDS Sodiumdodecylsulfat

shRNA short hairpin RNA

siRNA short interfering RNA

STAT signal transducers and activators of transcription

Strep/Pen Streptomyzin/Penicillin

Tab. Tabelle

TF Transkriptionsfaktor

TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Azetat

Tris Trishydroxymethylaminomethan

ü. N. über Nacht

VEGF vascular endothelial growth factor

vIL-6 virale Interleukin-6

VSV-G vesikuläres Stomatitisvirus Protein G

Literaturverzeichnis

59

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Eigene Veröffentlichungen und Kongressbeiträge

65


Eigene Veröffentlichungen Rohland N., Hahn A., Chaipan C., Holzer A., Wies E., Neipel F. Oppossed effects of human and viral interleukin-6 on viral gene expression in KSHV infected primary effusion lymphoma cells. (Journal of Virology, in Revision) Wies E., Hahn A., Viehbahn C., Rohland N., Lux A., Schellhorn T., Holzer A., Jung J.U., Neipel F. The Kaposi-sarcoma associated herpesvirus encodes vIRF-3 inhibits the transcriptional activity of cellular IRF-5. (Journal of Biological Chermistry, im Druck)

Kongressbeitäge Rohland N., Hahn A., Chaipan C., Holzer A., Wies E., & Neipel F. Antagonistic effects of human and viral interleukin-6 on viral gene expression in KSHV infected primary effusion lymphoma cells. 33

rd Annual International Herpesvirus Workshop, July

25 – August 1, 2008, Estoril, Portugal. Wies E., Hahn A., Rohland N., Holzer A., Fleckenstein B., & Neipel F. The viral interferon regulatory factor-3 (K10.5, LANA-2) interacts with cellular interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and inhibits its transcriptional activity. 33

rd Annual

International Herpesvirus Workshop, July 25 – August 1, 2008, Estoril, Portugal. Wies E., Hahn A., Rohland N., Holzer A., Fleckenstein B., & Neipel F. The viral interferon regulatory factor-3 (K10.5, LANA-2) interacts with cellular interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and inhibits its transcriptional activity. Keystone Symposia on

Molecular and Cellular Biology, April 13-18, 2008, Victoria, BC, Canada. Rohland N., Hahn A., Chaipan C., Holzer A., Wies E., & Neipel F. Antagonistic effects of human and viral interleukin-6 on viral gene expression in KSHV infected primary effusion lymphoma cells. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, March 5-8, 2008, Heidelberg, Germany. Rohland N., Hahn A., Wies E., Fleckenstein B., & Neipel F. Differential effects of viral and human interleukin-6 on human herpesvirus-8 transformed primary effusion lymphoma cells. Third European Congress of Virology, September 1-5, 2007, Nürnberg, Germany. Wies E., Hahn A., Rohland N., Holzer A., Fleckenstein B., & Neipel F. The viral interferon regulatory factor-3 (K10.5, LANA-2) is required fort he proliferation of infected primary effusion lymphoma cells and counteracts cellular IRF-5. Third European

Congress of Virology, September 1-5, 2007, Nürnberg, Germany. Rohland N., Hahn A., Wies E., Fleckenstein B., & Neipel F. Differential effects of viral and human interleukin-6 on human herpesvirus-8 transformed primary effusion lymphoma cells. 10

th International Workshop on Kaposi`s Sarcoma Associated

Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, August 1-5, 2007, Portland, OR, USA.


66

Wies E., Chaipan C., Rohland N., Fleckenstein B., & Neipel F. Knock-down of K10.5 expression in cultured primary effusion lymphoma cells induces apoptosis. 8

th

International Workshop on KSHV and Related Agents, August 21-25, 2005, Wildbad Kreuth, Germany.

Lebenslauf

67

Lebenslauf Persönliche Daten

Name: Nadine Rohland

Geboren am: 12.01.1981

Geburtsort: Bad Langensalza (Thüringen)

Beruflicher Werdegang

Seit 06/05 Anstellung als wissenschaftliche Angestellte in der Arbeitsgruppe

von PD Dr. med. Frank Neipel zur Forschung am Kaposi`s

sarkoma assoziierten Herpesvirus (Virologisches Institut –

Klinische und Molekulare Virologie, Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg)

Themenschwerpunk der Promotion:

Modulation der Genexpression durch das virale Interleukin-6 in

PEL Zellen

06/05 - 05/08 GK1071 Stipendium der DFG in Kooperation mit Harvard Medical

School

Studium

10/99 - 02/05 Friedrich-Schiller-Universität Jena

Diplomstudiengang Biologie

Hauptstudium mit Schwerpunktfächern Mikrobiologie,

Medizinische Mikrobiologie und Genetik

Diplomarbeit:

„Charakterisierung der protektiven Nutzung von Vakzinen gegen

Influenza-A-Virus-Infektionen“

Schulbildung 09/90 – 07/90 Salza-Gymnasium Bad Langensalza

Abschluß: Allgemeine Hochschulreife mit den Leistungskursen

Mathematik und Biologie

09/86 – 07/90 Wiebeck-Grundschule Bad Langensalza

Danksagung

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. Fleckenstein danke ich für die Möglichkeit, diese Arbeit am

Virologischen Institut durchführen zu können, sowie für die hervorragenden

Arbeitsbedingungen.

Bei Herrn Prof. Dr. Nitschke möchte ich mich für die großzügige Bereitschaft bedanken,

diese Dissertation seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-

Nürnberg zu vertreten.

Mein besonderer Dank geht an meinen Arbeitsgruppenleiter PD Dr. Frank Neipel für die

gute wissenschaftliche Anleitung und Betreuung dieser Arbeit.

Für ihre Unterstützung, Diskussionsbereitschaft und vor allem für ihre Freundschaft weit

über den Laboralltag hinaus, möchte ich mich ganz herzlich bei Effi Wies, Alexander

Hahn, Katharina Schmidt und Angela Holzer bedanken.

Auch den Arbeitsgruppen Grassmann und Biesinger-Zwosta, den Mitgliedern des GK

1071 und allen anderen Mitarbeitern des Instituts möchte ich mich für die angenehme

Arbeitsatmosphäre und die großzügige Hilfsbereitschaft recht herzlich bedanken.

Ganz besonders liegt es mir am Herzen, mich an dieser Stelle bei meiner Familie für ihre

geduldige Unterstützung, Vertrauen und Motivation während meiner gesamten

Ausbildungszeit bedanken. Für die Hilfe meiner Freundinnen Isabelle, Ulrike und Luisa

möchte ich mich hiermit ganz herzlich bedanken und dass sie trotz der Entfernung immer

für mich da waren.

Bei meinem Freund Nenad möchte mich ganz besonders für seine Liebe, Geduld und die

vielen anderen Dinge während der letzten Phase meiner Promotion bedanken.

Documents

Modulation der Genexpression durch das virale Interleukin ... file1 Modulation der Genexpression durch das virale Interleukin-6 in PEL Zellen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät