670 E. BAYER, It. I-IAGENlgAIEI~, W. K6NIG, H. PAVSCtI~IANlV U. W. SAUTTER:

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Dr. B. D. Da~JA~ ivied. Fakulteta, Pato-Fiziol. Institut Ljubljana 5, Jugoslawien

Automation analytischer Methoden, Statistik und Qualittitskontrolle

MSglichkeiten der Massenspektrometrie bei der Sequenzanalyse von Peptiden

E. BAYV, R, H. IIAov, N~AIV,~, W. K6Nm und H. PAUSCHMANN

Lehrstuhl f. Org. Chemie, Universitat Tfibingen

W. SAUTT~R

t~eehenzentrum, Universit/~t Tfibingen

Eingegangen am 13. Mai 1968

Possibilities o] Mass Spectrometry is the Sequence Analysis o/Peptides. The possi- bilities of sequence analyses have been analyzed by computers assuming the presence of 5-20 amino acids using di- to pentapeptides as fragments. For separation and identification of peptide fragments liquid chromatography as well as combined gas chromatography--mass spectrometry of the TFA-peptide

~assenspektrometrie bei der Sequenzanalyse yon Peptiden 671

esters are recommended. Serine and Cysteine peptides ought to be O-acetylated and S-benzylated. These protected peptide derivatives can be analyzed by mass spectro- metry up to pentapeptides and by gas chromatography up to tripeptides. Aspara- gine and glutamine containing peptide derivates were investigated for the first time by mass spectrometry.

Wie grundlegende Arbeiten yon STWNHAGV~N [7] und vor allem yon WEYGA~D U. Mitarb. [8] gezeigt haben, lassen sich Peptide in Form yon TFA-Peptidestern massenspektrometrisch untersuchen. Aus den typi- sehen Fragmentionen in den Massenspektren kann meist ohne groI3e Schwierigkeiten die Aminos/~uresequenz abgeleitet werden. Im allgemei- nen sind die TFA-Derivate bis zu Penta- oder Hexapeptiden flfichtig und damit ffir die Massenspektrometrie geeignet. In Ausnahmef/~llen konnten auch hShere Peptide (bis zu Nonapeptiden) untersucht werden. Allerdings dfirfen in diesen Peptiden dann keine leieht zersetzlichen, trifunktionellen Aminos/~uren enthalten sein. Um die Sequenz yon grSl3eren Peptiden oder gar Proteinen zu erhalten, mul~ der massenspektrometrischen Arbeit eine ttydrolyse der Peptide vorausgehen. Ffir eine erfolgreiehe Sequenzanalyse mfissen folgende Bedingungen erffillt werden: 1. Es mfissen bei der Hydrolyse genfigend sieh fiberlappende Teilsequen- zen erhalten werden. 2. Die erhaltenen Peptidbruehstfieke mfissen getrenn~ werden. 3. Die Peptide mfissen sich, unabh/~ngig yon ihrer Aminoss setzung, in stabile, genfigend flfichtige und damit ffir die Massenspektro- metrie geeignete Derivate fiberffihren lassen. Zur mathematisehen Behandlung der MSgliehkeiten einer Sequenzbe- stimmung aus kurzen Bruehstficken werden insowei~ idealisierte Ver- h/~ltnisse angenommen, als eine Peptidkette nur in Bruchstiieke gleicher GrSl~e zerlegt wird und alle dabei mSglichen Bruchstficke much zum Sequenzaufbau zur Verffigung stehen. Eine hiervon abweichende mathematisehe Behandlung des Problems unter der theoretischen Annahme einer gleiehm/~Bigen Spaltung aller Peptidbindungen hat EcK [3] gegeben. Der Sequenzaufbau (Abb. 1) erfolgt bei den Dipeptiden vSllig analog dem Dominospiel, w~hrend die Verwendung yon Tripeptiden eine abge- wandelte Spielregel, die Forderung naeh ]~bereinstimmung zweier Felder eines dreiteiligen Spie]steins mit der sehon vorhandenen Kette, verlangt. Dadurch wird der Aufbau sehwieriger, man erh/~lt seltener eine Sequenz und damit eher Eindeutigkeit derselben, d.h., der Informationsgehalt der Tripeptide ist hSher als der der Dipeptide. Bei kurzen Ketten, z. B. Octapeptiden, kann sehon ein manuelles Durehprobieren der Bruch- stiicke zur Sequenzaufkl/~rung ffihren, bei nur wenig l~ngeren Peptiden ist jedoeh die Benutzung einer digitalen Reehenmaschine erforderlich.

672 E. BAYE~, H. HAGE~)XV~R, W. K61~IG, H. PAuse~ANN U. W. SAUTTE~:

Um einen quanti tat iven ~berblick zu erhalten, wurden Computer (Siemens 2002 und Control Data 3200) mit dem Ziel programmiert, die Anzahl der jewefls mSglichen Sequenzen s als Funktion der Kettenls n, der GrSBe der Bruehstficke z und der Anzahl der versehiedenen Amino-

Abb. 1. NKbgliche Di- und Tripepticle bei der Spaltung einer Ke~te mit 7 Gliedern

siiurebausteine a zu erhalten (Abb.2). Die l~ngste noch eindeutig be- s t immbare Ket te wird als n ' bezeichnet. Da jedoeh bei kurzen Ket ten noch nicht der vorgegebene Wert yon a erreicht wird, mul~ die Zahl der verschiedenen Aminosiiurebausteine vor allem bei n ' bekannt sein. Das hierzu gehSrige a wird nunmehr als a ' bezeichnet./V ist die Anzahl der Bruchstficke, welche zur n-gliedrigen Ket te zusammengesetzt werden.

Es ist N ---- n -5 1--z.

Ffir die Programmierung werden ferner benStigt:

A(x) Reihenfolge der vorhandenen Bruchstfieke I ---- I . . . N

P(z~ Reihenfolge der sehon aufgebauten Sequenz I ~ 1 . . . K

Q~z~ Reihenfolge der noch fibrig gebliebenen Bruchstficke I ----- 1 . . . L

K Anzahl tier schon in die Sequenz eingebauten Bruchstficke

L Anzahl der noch fibrig gebliebenen Bruchstfieke

Es ist also K -5 L ---- N.

Massenspektrometrie bei der Sequenzanalyse von Peptiden 673

Urn einen Vorrat an Bruchstiicken ffir Kettenl&ngen yon bis zu 100 und mehr Gliedern zur Verfiigung zu haben, wurden vier lange Zufallsketten ffir 5, 10, 15 und 20 Aminosiiurebausteine gleicher H/tufigkeit durch lu hergestellt, und jede Ket te in Di-, Tri-, Tetra- und Penta- Peptide zerlegt. Die so erha]tenen Bruchstfieke k6nnen nun in der Reihenfolge der urspr/ingiiehen Sequenz gespeieher~ werden. Zuerst werden dabei nur die ersten Bruchstiieke fiir eine sehr kurze Ket te bei einer definierten Ausgangslage z. B. a ---- 5, z =- 2, n ~ 4 durehgeprfift.

!:A(J) I

Rest[. Bruchst - - Q )

Abb, 2, Programm der digit)alen Reehenmasehine

P(K)in Q ein- ordnen und best mmen

+ IK:=K-1, L:=L+I

Hierzu wird das erste Bruchstiiek als Kopf der Ket te eingesetzt und die fibrigen der Reihe nach auf die MSglichkeit eines Ansetzens an dieses untersucht. Mi6]ingt dies, so Mrd das zweite Bruchstiick als Kopf vor- gesehen usw. Gelingt das Ansetzen, so wird der verbleibende Vorrat auf die MSglichkeit einer weiteren Ke~enverls geprfift, solange, bis schlieBlich alle Bruehstfieke verbraucht sind uad sich eine Sequenz ergibt. Es wird so die Anzahl der Sequenzen ffir eine Kettenl/inge n be-

43 Z. Anal. Chem., Bd. 243

674 E. BAYER, ]-I. HAGEN~AI~R, W. K()NIG, H. PAuscm~ANN U. W. SAUTTER:

s t i m m t und ausgedruckt , danach scha l te t die Maschine durch I t inzu- nahme eines wei teren Bruchstf ieks aus dem Vor ra t zu de r u m ein Glied ]hngeren K e t t e welter. Man erhiil t so die Anzah l der Sequenzen als F u n k - t ion der Ket ten l~nge , wobei die in teress ierenden Sequenzen selbst auf Wunsch ausgedruek t werden kSnnen. Das in A b b . 3 wiedergegebene R e s u l t a t zeigt z .B. die Chancen, eine aus 5 verschiedenen Aminosaure- baus te inen bes tehende P e p t i d k e t t e mi t 18 Gliedern wieder aus den Bruch- stricken e indeut ig zu rekons t ru ie ren : D ipep t ide k o m m e n hier k a u m in Frage , da bei ihnen die E indeu t igke i t berei ts bei 6 Gliedern ende t (n' = 6), dagegen b ie ten Tr ipep t ide gute (n' = 19) und Te t r apep t ide ausgezeich- nete (n' = 36) Auss ichten zu einer Sequenzbes t immung.

200

100

50

20

10

~su a /DJpeptJd

I

5 ~.:~ - - -

I .~::;) t o 20

..~..

Fripeptide Tetrapeptide

/ ++++

+/

Anzah[ der verschiedenen /+++ Aminos~iure - Bausteine ~/++++

///] Pentapeptide n [ T ~ r r [ f ] I

40 60 80 100 Abb. 3. Anzahl der m6glichen Sequenzen s ( ) und der in der Kette vorhandenen Aminos~urebausteine a ( . . . . ) als Funktion der KettenlEnge n ffir a ~ 5. Gr6Be der Bruchstficke: z = 2:A; .- = 3:0; z ~ 4 : + ; z = 5:v. Singul~re Punkte durch l~ingstrukturen: Q

Auffa l lend sind einige wel t fiber den Geraden l iegende singuliire P u n k t e mi t der gemeinsamen Eigenschaf t , be im Divid ieren durch N einen Quo- t i en ten zu liefern, welcher in die Gerade paint.

Sie s ind ein sicheres Kennze iehen fiir eine mSg]iche R ings t ruk tu r , welches en ts teh t , weft die Rechenmasch ine jedes Bruchs~fick e inmal als K o p f einer Sequenz e rp rob t und ein Ring also ebensoviele Sequenzen wie Ringgl ieder liefert.

Eine Fehlerquel le mul~ hierbei noeh beach te t werden: x ident ische Bau- steine im Vorra~ liefern be im Ausdrucken ffir das s der K e t t e einen W e r t s �9 2 x, welcher erst noeh durch entsprechendes Divid ieren kor r ig ie r t werden mu6.

Massenspektrometr ie bei der Sequenzanalyse von Pept iden 675

Eine Verschiebung zu l/ingeren n' bei Vermehrung der Zahl der Amino- s~urebausteine n erkennt man in Abb. 4. Tr/~gt man n' als Funktion yon a' auf (Abb.5), so erkennt man den Gewinn an Information, welcher sich aus 1/ingeren Bruchst/icken ergibt. Der schraffierte Bereich ist nieht mehr existent, da in einer Kette nicht mehr verschiedene Aminos~urebausteine auftreten k6nnen, ats diese Glieder enth~It.

- / / 200 Dipeptide Tripeptide

100 rt ? ccco~c~ :su.a / /

20 - / e- ./--~- . . . . -~ ~.ot- --4 "5"0--] ~ /

lo F , - t 7 o

I ! o / n ~ Tetrapeptide / 1 .... _ L ~ I I I 1 I I I + ~ + ~ 0 20 40 60 80 100

Abb.4. s u n d a als Funk t i on von n wie in Abb.3, jedoch fiir a ~ 20

Anzahl der verschiedenen Aminos~iure- Bausteine

Es ist naheliegend, den Kopf einer Kette dureh Substitution zu markie- ren und damit festzulegen, wodurch eine zus/itzliche Information erhalten wird. Unter diesen Bedingungen wurden alle Berechnungen wiederholt und die Ergebnisse in Tab. 1 zusammengefaBt. Die dort gebfldeten Quotienten n'/a' geben an, um wieviel real 1/~nger die noch eindeutig bestimmbare Kette ist als die Zahl ihrer verschiedenen Aminos/iurebausteine. Bei den Di- und Tri-Peptiden sind zwischen fest- gelegtem und beliebigem Kopf der Kette keine Unterschiede feststellbar, lediglich bei den Tetrapeptiden sind Verbesserungen ersiehtlich. Die Daten aus Tab. 1 k6nnen auch zu einer Faustregel zusammengezogen werden (Tab.2). Multipliziert man nun die bekannte Zahl der verschiedenen Aminos/iure- bausteine mit n'/a', so erh/ilt man die kleinste und gr6gte noch sicher in der Sequenz bestimmbare Kettenl/inge, z. B. fiir Tripeptide und 8 ver- schiedene Aminosgurebausteine ohne fes~gelegten Kopf der Kette :

n' ----- 8 �9 1,94 ~ 16 als kleinste eindeutige L/~nge der Kette, n' = 8 �9 3,8 ~ 31 als gr6Bte eindeutige L/inge.

43*

676 E. BAYER, H. HAGE~MAIER, W. K6NIG, H. PAUSCtI]gANN U. W. SAUTTER:

Diese Ergebnisse sind jedoch keineswegs als exakte und universell an- wendbare Werte anzusehen, da in der Praxis weder gleJch groBe Bruch- stiicke anfallen, noch Mle Aminos~urebausteine in gleicher H~ufigkeit auftreten. Ferner kSnnen die Ketten dutch bestimmte Eigenschaften ihrer Sequenz, z. B. Redundanz, die Analyse erleichtern oder erschwe- ren.

t 13 t

+ 100 ~ ^ 4

80

..4.

60 ~=2 /

Z,O z = 3

+ ~ / :

20 ~ , / e ~, ; ~ ~:J

5 10 15 20

Abb.5.n' Ms Funktion von a' fiir die Bruchstiicke z = 2, 3, 4 und 5. Die mit Pfeilen versehenen Punkte sind Werte, welche noch nicht das Ende der Eindeutigkeit anzeigen, sondern sie nur bis zur angegebenen Stelle anzeigen

Trotzdem scheinen hiermit einige Anhaltspunkte zur Beurteflung des notwendigen Informationsgehaltes und damit der erforderlichen Mindest- gr5~3e der Bruchstiicke fiir die jeweilige Situation gegeben zu sein. Zur pr~parativen Trennung eines Peptid-Hydrolysats in seine Kompo- nenten wurden bisher haupts~chlich die Ionenaustauscher-Chromato-

�9 ~'

~. 0

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I

0 o s C~

| 9a

o

678 E. BAYER, I-I. I-I-~oENMAIER, W. KbmG, H. PAvsemuA~ u. W. SAVTT~a:

anwendbar. In Form der TFA-Peptidester konnten jedoeh viele Dipep- tide und Tripeptide, in Ausnahmef/fllen aueh Tetra- und Pentapeptide, gas-chromatographiseh untersucht werden. Wiihrend die meisten Aminos~uren, die in natfirlichen Peptiden auftreten, keine Sehwierigkeiten bei der Derivatbildung machen, erfordern Peptide mit den leieht zersetzliehen Aminos/iuren Cystein oder Serin eine Sonder- behandlung. Besonders Cystein ist wegen der leiehten H:S-Eliminierung

Tabelle 3. Charakteristische Ionen ]fir N-terminales, C-terminales sowie innerhalb der Sequenz stehendes S-Benzyl-Cystein in den Massenspektren yon TFA-Peptidestern

N-terminales Cys m/e 172 (CF~--C0--NH = CI-I--CI-I2--SH)+ m/e IVI-113 Eliminierung yon CF~CONH~ m/e M-204 Eliminierung yon CFaCONH 2 ~- C6HaCH 2

C-terminales Cys (C6H~--CH2--S--CH = CH--COOR)+ (S--CH = CH--C00R)+

Cys in der Sequenz (C6II~--CH2--S--CH = CH--C0--(NH--CH--CO)n OR) +

] R

(S--CH = CI-I--C0--(NH--CH--C0)n OR) + i

R

Tabelle 4. Au/ den S-Benzylrest zur~tckzuJi~hrende Ionen in den Massenspelctren von Cys(Bzl)-Derivaten

m/e Fragmention

91 123 124 137 149 166 176 177

(CTW) + (CsHsCH2S) + (CsHs--CH~--SH)+ (C6Hs--CH~--S--CH2) + (CBH 5-- CH = S --- CH--- CH2)+ (C6Hs---CH~---S=CH~CH = NHs)+ (C6Its---CH---S---CH--- CH-- C ~= 0)+ (C~Hs- CH2--S =CH=CH=C ==_-0)+

und Oxydation zum Disulfid mit einer Schutzgruppe zu versehen. Dabei erwies sich die S-Benzyl-Gruppe als besonders gut geeignet [2]. Die Mas- senspektren einer grSBeren Anzahl der TFA-Derivate yon S-Benzyl- Cysteinpeptiden sind untersucht worden. Besonders wiehtig f/it die Ableitung der Sequenz aus dem Massen- spektrum sind die Ionen, die bei N-terminaler bzw. C-terminaler Stellung yon Cystein auftreten, sowie die ,,sequenzspezifisehen" Ionen bei der

~[assenspektrometrie bei der Sequenzanalyse yon Peptiden 679

Stellung yon Cystein innerhalb einer Peptidektte (Tab. 3). In den Massen- spektren fallen die Ionen, die auf den S-Benzylrest zurtiekzufiihren sind, besonders auk Dabei ist der Peak bei m/e 91 meist der intensivste (Tab. 4).

Durch Vergleich der Massenspektren einiger S-Benzyl-Cysteinpeptid- Derivate mit den entspreehenden p-Chlor-Benzyl-Derivaten konnten die wiehtigsten Fragmentionen zugeordnet werden (Abb.6 und 7, Tab.5). Die Chlor enthaltenden Bruchstfieke waren in den Massenspektren wegen der chrakteristisehen Isotopenverteilung leieht auffindbar.

% REL. H.

100'

?0

50"

30

9t

TFA -or -GLU- CYS (BZL) - GLY-(OlViE) 2

14901462 133"/ 1323 130912811266 I TM 188 173 159 131 H C-04CO~CHJCH4CH4COWH[-CH-'CO~NHJ, CHJCOtOCH 3 AIH 2 2 CH 2 3

311-591C'0/ 1JJ 21:12J"'li 21:~i448] &6'21 z,,j Ic51 I ,~., / I%/

2551 Z, O5|

MG 521

174

152 180 341 430

44 65 124 2{2 265 283 309 I 366 399

I I J l , , I , , I I I [ H , , [ I I i ,, ,I 1 ~~ ~ . . . . , d J 40 50 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 m I e

Abb.6. Massenspektrum von TFA-F-Gly-Cys(Bz])-Gly-(OMe)2. LKB 9000 Massen- spektrometer, Direkteinlagsystem, 50 eV, 250~ Ionenquellentemperatur, 150~ t~robenhalter

% REL. H. ~ TFA - ~ - GLU- CY5(p-CI-BZL)-GLY- (OME)2

125 I00

MG 555

7 0

5 0

3 0 �84

Io

I 44 ~ t74 !

~' 200 299 , 555

40 60 80 100 120 140 160 180 200220 240 260280300320 340360380 400420 440460480 500 520540 560

Abb.7. Massen@ektrum yon TFA-y-Glu-Oys(p-O]-Bzl)-Gly-(OMe)2 LKB 9000 ZVIassenspektrometer, Direkteinla6system, 50 eV, 250~ Ionenquellentemperatur, 150 ~ C Probenhalter

680 E. BAYER, H. HAGENMAIER, W. K6NIG, H. PAUSCtt-~ANlV U. W. SAUTTER:

Tabelle 5. Interpretation der Ionen in Abb. 6

m/e MSgliche Formulierung tier Fragmentionen Ent- sprechendes Ion in Abb.7

521 M 555 490 M--CH30 524 489 ~[--CHaOH 523 461 M--COOCH~ 430 M--C~Hs--CH 2 399 M--C6Hs--CH : S 398 M--C6Hs--CH~--S 367 ~--(CHaO ~ C6Hs--CH~--S ) 366 M--(CHsOH ~- C6Hs--CH2--S ) 341 HaC--O--CO--CH--Clq2--CH2--CO--NH--C : C = 0

l I NH--CO--CF 3 CH2--S

309 HaC--O--CO--CH--CH2--CH~--CO--NH--C ~ CH 2

NH--CO--CF 8 CO 283 CFa--CO--NH : CH--CH2--CH2--CO--NH--C ~ C ~ O

CH2--SII 265 C6H~--CH2--S--CH -- CH--CO--NH--CH2--COOCH a 299 240 HaCO--CO-- CH--CH~--CH2--CO

F NH--CO--CFa

212 HaCO--CO--CH--CH2--CH ~ - [

NH--CO--CF 3 180 212--CHaOH 174 265--C6Hs--CH2 152 18O--CO 176] 166] 149] 137~ 124| 123| 91) 9O

Siehe T~b. 4

H2N = CH--COOCH 8

210 200 183

158 157 125

Eine gro•e Hilfe ffir die Sequenzable i tung is t das Auf t r e t en von in ten- siven Molekfilpeaks, die au f den a romat i schen Molekfi lantei l zuri ick- zuf/ ihren sind. Auch gas -chromatographisch sind S-Benzy l -Cys te inpep t ide bis zu Tri- p e p t i d - D e r i v a t e n ge t renn t worden (Abb. 8). Ffir Ser in-Pept ide erwies sich eine O-Acety l ie rung besonders bei hSheren Pep t iden als g/instig. Die Unte r suchung der Massenspek t ren ergab auch hier charakter i s t i sche Ionen in Abh~ngigkei t yon der S te l lung des O- Acety l -Ser ins in der P e p t i d k e t t e [4].

Massenspektrometrie bei der Sequenzanalyse yon Peptiden 681

Erstmals wurde auch eine Anzahl yon Asparagin- und Glutamin- Peptiden untersueht, die sieh in Form ihrer TFA-Peptidester bis zu Pentapeptiden unzersetzt verdampfen lassen und massenspektrometriseh untersueht werden k6nnen.

L

q

]0 I

--0 5 20 25 min 30

5

\ ]5

Abb. 8. Gas-Chromatogramm eines Gemisehes yon TFA-Peptid-Estern: L LSsungs- mittel; 1 TFA-AIa-Gly-GIy-OMe; 2 TFA-Cys(Bzl)-Ala-OEt; 3 TFA-Cys(Bzl)-Gly- OEt; 4 TFA-Cys(Bzl)-Val-OEt; 5 TFA-Gly-Phe-Ala-O~e; 6 TFA-Ala-Cys(Bzl)-Ala- OMe; 7 TFA-Cys(Bzl)-Pro-Val-OIYIe. LKB 9 000 Gas-Chromatograph-Massenspektro- meter, Sgule: 5~ SE 30, 5' 1/s', Stahl, 170 ~ C, 6 rain isotherm, dann 6~ bis 235 ~ C; Detektor: Totalionenstrom; Ionenquelle: 290 ~ C; Separator: 280 ~ C; Ein- spritzblock: 320 ~ C; 50 ml He/rain

Tabelle 6

Cys(Bzl)-Tyr-Ile~Ser-Asp-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly Tyr-Ile

Ile-Ser Ser-Asp

Cys(Bzl)-Pro Cys(Bzl)-Pro-Leu

Pro-Leu Pro-Leu-Gly

Leu-Gly

Die Erfahrungen, die bei der Untersuchung yon Cystein-Peptiden gemacht wurden, sollten erstmals bei der Analyse eines yon HAG~SMAIEI~ [1] nach Mr~RISI~LD [5] synthetisierten Nonapeptides iiberpr/ift werden (Tab. 6). Nach dreit~giger Hydrolyse des Peptides in konz. HC1 bei 37~ wurde ein Teil des Ansatzes mit Diazomethan verestert und mit Triituor- essigs~uremethylester trifluoracetyliert [2]. Das Gas-Chromatogramm (Abb. 9) ergab die in Tab. 6 angegebenen Peptid-Druchstficke.

682 E. BAYER, H. HAGENI~IAIER, W. K6NIO, H. PAUSCJ~ANN U. W. SAUTTER :

Der Rest des Peptidhydrolysats wurde einer ss schen Trennung unterworfen. Als Triigermaterial diente Sephadex G 15 (Korngr6Be 50--75 [~). Wegen der SchwerlSslichkeit der S-Benzyl-Cystein- Peptide in Wasser wurde die Trennung in einem LSsungsmittelgemisch aus Butanol/Propanol/Essigs~ure/Wasser (600 : 300 : 10,25 : 890) als Ver- teilungs-Chromatographie durchgefiihrt. Die Sgule wurde zun/~chst mit der w~ii3rigen Phase des LSsungsmittelgemisches, dann mit der organischen Phase equi]ibriert und dann das in organischer Phase gelSste Peptid- Hydrolysat aufgetragen. Die Elution erfolgte mit organischer Phase.

7

3 6

5

5 10 15 20 25 30 35 40 rain

Abb. 9. Gas-Chromatogr~mm yon TFA-Peptidestern des Hydrolysats yon Cys(Bzl)- Ser4-Oxytocin. LKB 9000. Siiule: 50/0 SE 30 auf Chromosorb P, 5', 1:8, Stahl 130 ~ 3~ bis 250 ~ C; Detektor: Totslionenstrom; Ionenquelle: 290 ~ C; Separator: 285 ~ C; Einspritzblock 300 ~ C. L LSsungsmittel; 1 TFA-LEU-Gly-OMe; 2 TFA- Cys(Bzl)-OMe; 3 TFA-Pro-Leu-OMe; d TFA-Ile-Ser-OMe; 5 TFA-Ser-Asp-(O1Y[e); 6 TFA-Pro-Leu-Gly-OMe; 7 TFA-Cys(Bzl)-Pro-OMe; 8 TFA-Tyr-Ile-OMe; 9 TFA- Cys(Bzl)-Pro-Leu-O~e

Das Trenn-Chromatogr~mm, bei 254 nm mit einer Durchflu]~kfivette yon einem Uvicord ~ufgenommenen, ist in Abb. 10 d~rgestellt. Nach Auf- arbeitung der einzelnen Fraktionen ergaben die massenspektrometrischen Untersuchungen der TFA-Peptides~er die in der Abbfldung ungegebenen Peptide. Zusammen mit den gas-ehromatographiseh-massenspektrometriseh iden- tifizierten Peptiden lie~ sich die Sequenz des Nonapeptides ableiten (Tab.7). Zu erw~hnen w~re noah, da;~ das im urspriinglichen Peptid enthaltene Asparagin bei der t tydrolyse quanti tat iv zu Asparaginss verseift wird.

Massenspektrometrie bei der Sequenzanalyse von Peptiden 683

Die Untersuchungen an diesem Nonapeptid zeigen, dab auch Peptid- Sequenzen mit so empfindlichen Aminos/iuren wie Cystein dutch geeig- nete Derivatisierung und durch Kombinat ion yon Gas-Chromatographie, Flfissigkeits-Chromatographie und Massenspektrometrie aufgekl/irt wer- den k6nnen.

T 25/, nm ~

70

80

~

�9 ,~ , , , 6 7 HF

1o Is 10 is 30 3s ~o ~s s'o ss FRAKTION NR.

Abb. 10. Trenn-Chromatogr~mm des Cys(Bzl)-Ser~-Oxytocin-Hydrolysates. Seplm- dex G 15 Verteilungs-Chromatographie. S~ule: 120 x 1,5 cm. L6sungsmittelgemisch: Butanol-Propanol-EssigsS~ure-Wasser. 1 Asp-Cys(Bzl)-Pro-Leu; 2 Asp-Cys(Bzl)- Pro-Leu; 3 Cys(Bzl)-Tyr-Ile; g 3; 5 Cys(Bzl)-Pro-Leu; 6 5; 7 Cys(Bzl)-Pro-Leu- Gly; 8 Cys(Bzl)-Tyr; 9 Cys(Bzl)-Pro; 10 Ser-Asp-Cys(Bzl), Tyr-Ile, Pro-Leu

Tabelle 7

Cys(Bzl)-Tyr-Ile-Ser-A.sp-Cya(Bzl)-Pro-Leu-Gly Cys(Bzl)-Tyr-Ile Cys(Bzl)-Tyr

Tyr-Ile Ile-Ser

Ser-Asp Ser-Asp-Cys(Bzl)

Asp-Cys(Bzl)-Pro-Leu Cys(Bzl)-Pro Cys(Bzl)-Pro-Leu Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly

1)to-Lea Pro-Leu-Gly

Leu-Gly

Experimentel ler Teil

1. S-Benzylierung yon Cystein-Peptiden 10 mg Peptid werclen in einem 50 ml-K61bchen in 10 ml fliissigem NII~ gel6st (~gnetrfihrer). Darauf wird vorsichtig in fliissigem NH~ gel6s~es N~ zugetropft,

684 E. BAu et al. : Massenspektrometrie bei der Sequenzanalyse von Peptiden

bis die bIaue Farbe 2 min konstant bleibt und die doppelte, dem Peptid ent- sprechende molare Meng e Benzylchlorid zugegeben (ca. 3 Tropfen!). Das NHs wird langsam unter Rfihren verdampft und das Reaktionsgefiil] bei 18 Torr kurz evakuiert. Das mSglicherweise vorhandene fiberschiissige Benzylchlorid wird zwei- mal mit Ather extrahiert und der Riickstand in Methanol aufgenommen und mit Eisessig auf einen pH yon 6--6,5 gebracht. Nach demselben Verfahren wurden die p-C1-Benzylierungen vorgenommen.

2. Partial-Hydrolyse yon Peptiden 100 mg Peptid werden in 5 ml konz. Salzs~ure gelSst und in einem thermostati- sierten Reaktionsgef~B 72 h bei 37 ~ C gerfihrt. Es empfiehlt sich dabei, das Reak- tionsgef~13 abzudunkeln. Danach wird die fiberschfissige Salzs~ure bei 20~ im Vacuum abgedampft. Die zurfickbleibenden Peptidhydroehloride kSnnen weiter- verarbeitet warden.

3. Sephadex- Verteilungs-Chromatographie a) Vorbehandlung des Tr~tgermaterials. Das k~ufliche Tr~germaterial Sephadex G 15 (Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden) hat eine KorngrSBe yon 40--120 ~. Da eine so unterschiedliche KorngrSBe erfahrungsgemgB die Durchflu•eigenschaften und damit dig Trennwirksamkeit einer Sgule ungfinstig beeinfluBt, wurden Teilchen der KorngrS~e kleiner als 50 ~ und grSl3er als 75 ~ durch Aussieben abgetrennt. Zur Entfernung yon Sehwermetallionen wurde das Material mit bidest. Wasser, 0,5 N Natronlauge, bidest. Wasser bis zu pH 7--8, 0,5 N Salzs~iure, bidest. Wasser bis zu pi t 6--7 gewaschen und mit 0,1 N Essigs~ure ~quilibriert. b) S~tule. Die Glasrohrs~ule (120• era) war am unteren Ende mit einer Glas- fritte G 2 und einem Teflonhahn mit feinregulierbarem Nadelventil, am oberen Ende mit einem Sehliff NS 14,5 versehen. Das 1 1 fal~ende Vorratsgef~B mit Teflon- hahn war dureh Schliffe und einen Teflonschlauch mit der Sgule verbunden. Das in 0,1 N Essigs~ure ~tquilibrierte Tr~germaterial wurde in einem GuB in die S~ule eingeffillt. c) Chromatographie. Die S~ule wurde zun~chst mit 250 ml der w~rigen Phase des LSsungsmittelgemisches Butanol-Propanol-Essigs~ure-Wasser (600:300:10,25:890) i~quilibriert. Darauf wurde die wi~l~rige Phase fiber der S~iulenffillung entfernt und solange mit organischer Phase ~quilibriert, bis die w~13rige Phase aus der S~ule verdrgngt war und die organisehe Phase im Eluat erschien. Nun wurde das in mSglichst wenig (3--5 ml) organischer Phase gelSste Peptidgemisch auf die S~ule gegeben und mit organischer Phase chromatographiert. Die Extinktion des Eluats wurde yon einem Uvicord (LKB) bei 254 nm gemessen und yon einem Schreiber aufgezeichnet. Die 5,3 ml-Fraktionen wurden von einem Fraktionssammler (LKB) automatisch gesammelt.

Zusammenfassung Die Aussichten einer Sequenzbes t immung werden in digi talen Rechen- anlagen ffir 5 - -20 Aminos~urebauste ine bei Verwendung yon Di- bis Pen tapep t iden un te rsuch t a n d die Anzahl der mSglichen Sequenzen als F u n k t i o n der Ket tenl / inge ermitte]t . Zur T rennung und Identif izierung empfiehlt sich neben der Flfissigkeits- Chromatographie auch die kombinier te gas-chromatographisch-massem spektrometrische Unte r suchung der TFA-Pept ides ter . Das Vorhanden-

J. A. CLEMV,~TS: Theorie und Praxis der dynamischen analytischen Technik 685

sein yon Serin und Cystein er forder t eine Sonderbehandlung . Serin- Pep t ide s ind als 0 - A e e t y l d e r i v a t e und Cys te in -Pep t ide als S-Benzyl- de r iva te fiir die Massenspek t romet r ie mindes tens bis zu P e n t a p e p t i d e n und ftir die Gas -Chromatograph ie bis zu T r ipep t iden best/ indig. Auch einige Aspa rag in und Glu t amhi en tha l t ende Der iva te s ind zum ers tenmal massenspek t romet r i sch un t e r such t worden.

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tide Symposium, Orsay, April 1968. 2. -- G. Jlr~G u. W. KO~m: Z. Naturforsch. 22b, 924 (1967). 3. ECK, l~. V.: Nature 198, 241 (1962). 4. KO~IG, W. : Dissertation, Univ. Tiibingen 1968. 5. MAI~SHALL, G. R., and 1~. B. MERRIFIELD: Biochemistry 4, 2394 (1965). 6. PI~OX, A., and F. W~YGA~I) : Proc. VIII th Europ. Peptide Symposium Nordwijk,

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Prof. Dr. E. BAY~t~ Lehrstuhl f. Org. Chemie der Universit~Lt 7400 Tiibingen, WilhelmstraBe 33

Letzte Entwicklungen in der Theorie und Praxis der dynamischen analytischen Technik (Continuous Flow Analysis)

J. A. CLEME2gTS

Technicon GmbH., Frankfurt a.M.

Eingegangen am 25. September 1968

Latest Developments in the Theory and Practice o/Continuous Flow Analysis. In the last few years there has been an increased interest in developing a theoretical basis for continuous flow analysis. These theoretical considerations have lead to the development of improved and simplified analytical systems. Two such systems are already commercially available and are described. The first is a multiple system for the routine clinical examination of blood serum for 12 different parameters. The second is a fully automated chromatographic system for the determination of amino acids in protein hydrolysates and physiological fluids.

Der S t a n d a r d - A u t o A n a l y z e r wurde e rs tmal ig i in J a h r e 1957 yon SKv, oas beschr ieben [1]. W e n n wir die P robenzu le i tung eines solchen Auto- Ana lyze r s eine gewisse Zeit in de r S tandard lSsung belassen, e rha l t en wir