Molecular genetics based subspecies identification in tigers · 2013-10-01 · งกอล (Panthera tigris tigris) และเสือโคร่งอินโดไชน ีส

การจาแนกสายพนธยอยของเสอโครงจากการเปรยบเทยบขอมลทางพนธกรรม Molecular genetics based subspecies identification in tigers

กณตา อยถาวร* จรรยาภรณ เพชรคง

* วรงรอง กรนทธญญกจ

* กฤตยาพร เพญชาต

* และบรรณฑวรรณ มาเฉยว*1

บทคดยอ

กณตา อยถาวร จรรยาภรณ เพชรคง วรงรอง กรนทธญญกจ กฤตยาพร เพญชาต และบรรฑวรรณ มาเฉยว. 2555. การจาแนกสายพนธยอยของเสอโครงจากการเปรยบเทยบขอมลทางพนธกรรม. หนา 13-25. ใน ผลงานวจย และรายงานความกาวหนางานวจย ประจาป 2554. กลมงานวจย สตวปา สานกอนรกษสตวปา กรมอทยานแหงชาต สตวปา และพนธพช. กรงเทพฯ.

ปจจบนเสอโครง (Panthera tigris) มสายพนธทยงคงมชวตอย (Extant subspecies) จานวนทงสน 6 สายพนธ การจาแนกสายพนธจากการดลกษณะภายนอกกระทาไดยากหรอไมสามารถทาได เนองจากมความคลายคลงกนมาก จงอาจทาใหเกดปญหากบสถานเพาะเลยงในการจดการเสอโครงในกรงเลยง โดยเฉพาะการจบคพอแมพนธทไมทราบสายพนธ ซงอาจทาใหเกดลกผสมในกรงเลยง ขอมลทางพนธกรรมจงไดเขามามบทบาทสาคญในการจาแนกสายพนธของเสอโครงทงในกรงเลยง และยงนามาใชในการตรวจพสจนวตถพยานซงเปนซาก หรอชนสวนอวยวะของเสอโครงได การศกษาในครงนมวตถประสงคในการจาแนกสายพนธของเสอโครง 3 ตว เพอพสจนความสมพนธความเปนแม-ลกในเบองตน จากตวอยางเลอดของลกเสอโครง 2 ตว และตวอยางมลจากเสอโครงเพศเมยทอางวาเปนแม 1 ตว โดยการศกษาลาดบนวคลโอไทดของยนบนไมโตคอนเดรยลดเอนเอ (Mitochondrial DNA) ตาแหนงยน Cytochrome b (Cyt b) และ NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) โดยนาตวอยางทไดมาเปรยบเทยบกบขอมลพนธกรรมของเสอโครง 6 สายพนธ คอ เสอโครงมลาย (Panthera tigris jacksoni) เสอโครงไซบเรย (Panthera tigris altaica) เสอโครงจนใต (Panthera tigris amoyensis) เสอโครงสมาตรา (Panthera tigris sumatrae) เสอโครงเบงกอล (Panthera tigris tigris) และเสอโครงอนโดไชนส (Panthera tigris corbetti) ดวยวธ Blastn, Multiple sequence alignment และ การสราง Phylogenetic tree พบวาลกเสอโครงทง 2 ตว เปนสายพนธเบงกอล (P. t. tigris ) และเสอโครงเพศเมยทอางวาเปนแมเปนสายพนธอนโดไชนส (P. t. corbetti) เนองจากการศกษานศกษายนในสวนของไมโตคอนเดรยลดเอนเอ ซงสบทอดผานทางแมเทานน จงสรปไดวา ลกเสอโครงทง 2 ตว และเสอเพศเมยทอางวาเปนแมไมมความสมพนธเปนแมลกกน วธการทใชในการศกษาครงนสามารถนาไปประยกตใชกบการจาแนกสายพนธของเสอโครงในกรงเลยง เชน สถานเพาะเลยง หรอฟารมเพาะเลยงเพอการจดการอนรกษพนธกรรมของเสอโครงได

* หนวยปฏบตการนตวทยาศาสตรสตวปา (DNP-WIFOS) กลมงานวจยสตวปา สานกอนรกษสตวปา

กรมอทยานแหงชาต สตวปา และพนธพช

……………………………………………………………………………………….. ผลงานวจย และรายงานความกาวหนางานวจย ประจาป 2554 Wildlife Yearbook 13 (2011)

‐ 14 ‐

Abstract Ouitavon K.; J. Phetkhong, W. Karinthanyakit, K. Penchart and B. Marcheaw.. 2012. Molecular

investigation for sex identification in tigers, Panthera tigris. Wildlife Yearbook 13, 13-25.

Nowadays, the extant subspecies of tigers “Panthera tigris” consist of six subspecies. Based on morphological characteristics, tiger subspecies designation is very difficult since their highly similar morphology and this may lead to a hybrid cross between different subspecies in captive tiger populations, such as in the DNP Wildlife Breeding Station. Genetic data is now becoming a key investigative tool to investigate an evidence sample including tiger subspecies identification. In this study, three tiger samples (two blood samples of tiger cubs and fecal sample of suspected mother) were identified based on the two markers of mitochondrial cytochrome b (cyt b) and NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene sequences. The result was used to preliminary verify the family relationships among them. These newly amplified sequences were compared to reference sequence data from six extant tiger subspecies through multiple sequence alignment and phylogenetic relationships reconstruction. The result from this study found that the genetic information of the two tiger cubs was specific for Bengal tiger (P. t. tigris) but the suspected mother was specific for Indochinese tiger (P. t. corbetti). Because mitochondrial DNA is passed through the maternal line, thus the DNA profile between mother and offspring should be exactly match. However, the result presented here revealed that the DNA profile between the two tiger cub samples did not match with the suspected mother, indicating that they did not familial related. This application of molecular technique in subspecies identification can be applied for the genetic conservation management of captive tigers.

คานา

เสอโครง หรอเสอลายพาดกลอน มชอสามญวา Tiger และมชอวทยาศาสตร Panthera tigris เปนสตวเลยงลกดวยนานม (Mammal) อนดบสตวกนเนอ (Order Carnivora) อยในวงศเสอและแมว (Felidae) โดยจดเปนสตวทมขนาดใหญทสดในวงศน ตามสถานภาพกฎหมายไทย เสอโครงจดเปนสตวปาคมครอง มสถานภาพเปนสตวทใกลจะสญพนธ (Endangered) และจดอยในบญชหมายเลข 1 (Appendix 1) ของอนสญญา CITES เสอโครงมการแพรกระจายพนธอยทวไปในทวปเอเชย รวมถงประเทศไทยซงปจจบนกาลงประสบกบปญหาการลดจานวนลงของประชากรเสอโครงเปนอยางมาก อนเปนผลมาจากการทาลายพนทปาซงเปนถนอาศยของเสอโครง และการลาเพอการคา

เสอโครงมสายพนธ (Subspecies) มากถง 9 สายพนธ แตสญพนธไปแลวถง 3 สายพนธ ไดแก เสอโครงแคสเปยน (Panthera tigris virgata) เสอโครงชวา (Panthera tigris sondaica) และเสอโครง


‐ 15 ‐

บาหล (Panthera tigris balica) สวนทเหลออยอก 6 สายพนธ ไดแก เสอโครงไซบเรย (Panthera tigris altaica) เสอโครงเบงกอล (Panthera tigris tigris) เสอโครงอนโดไชนส (Panthera tigris corbetti) เสอโครงสมาตรา (Panthera tigris sumatrae) เสอโครงจนใต (Panthera tigris amoyensis) และเสอโครงมลาย (Panthera tigris jacksoni) โดยในแตละสายพนธนน จะมความแตกตางกนทขนาด รปราง ลกษณะกะโหลก และลวดลายบนลาตว (Herrington, 1987) อยางไรกตาม เสอโครงแตละสายพนธมลกษณะภายนอกทใกลเคยงกนมาก โดยเฉพาะอยางยงเมอเสอยงไมโตเตมวย ดงนนการจาแนกสายพนธของเสอโครงจากลกษณะภายนอกเพยงอยางเดยวจงอาจยงไมมความนาเชอถอเพยงพอ และอาจทาใหเกดปญหากบการจดการเสอโครงในกรงเลยง โดยเฉพาะการเกดลกผสมซงเปนผลมาจากพอและแมพนธทตางสายพนธกน

ปจจบน ปญหาการลกลอบคาเสอโครงทผดกฎหมายมแนวโนมทจะทวความรนแรงมากยงขน การจบกมผกระทาผดนน ไดนามาซงภารกจเกยวกบการจดการเสอโครงทเปนของกลาง โดยเฉพาะอยางยงการจาแนกสายพนธ ทงนเพอใหทราบถงแหลงทมาของเสอโครง และสามารถโยงใยไปสการจบกมและดาเนนคดกบผทอยเบองหลงการลกลอบคาเสอโครงไดทงหมด อยางไรกตาม ของกลางทถกตรวจยดไดสวนใหญนนมกเปนซาก หรอชนสวนอวยวะสวนตางๆของเสอโครง อยางหนง กระดก และชนเนอ การจาแนกสายพนธเสอโครงจากลกษณะภายนอกจงไมสามารถทาได สงผลใหการดาเนนการขนตอไป หรอการพจารณาคดเปนไปอยางลาชา หรอไมสามารถกระทาได

ในปจจบนขอมลทางพนธกรรมไดเขามามบทบาทสาคญในการนามาใชจาแนกชนด และสายพนธของสงมชวต ทจดไดวามความแมนยาและมความนาเชอถอสง ทงนเนองจากสงมชวตโดยทวไป มขอมลทางพนธกรรม คอ ดเอนเอ ทประกอบไปดวยนวคลโอไทดสชนด ไดแก อะดนน (Adenine), ไทมน (Thymine), ไซโตซน (Cytocene) และกวานน (Guanine) ซงเปนลกษณะทเปนคาเดยวๆ (discrete character) อยางแทจรง และลกษณะดงกลาวไมมความผนแปรอนเปนอทธพลจากสงแวดลอมภายนอก (จรลธาดา, 2543) จงสามารถนามาใชเปนขอมลในการเปรยบเทยบความเหมอนหรอความแตกตางของสงมชวตไดอยางชดเจน แมวาสงมชวตทนามาเปรยบเทยบกนนนจะมลกษณะภายนอกทเหมอนหรอแตกตางกนมากเพยงใดกตาม การทสงมชวตทกชนดมความแตกตางกนนน กเนองมาจากการทสงมชวตมสารพนธกรรมหรอดเอนเอทแตกตางกน ซงความแตกตางของดเอนเอในทนหมายถง ชนดและการเรยงตวของลาดบนวคลโอไทด รวมทงความยาวของดเอนเอทแตกตางกน จงทาใหเกดความแตกตางและความหลากหลายของสงมชวต ซงสามารถใชความแตกตางนเปนตวแยกสงมชวตแตละชนดและสายพนธออกจากกนได (มนตา, 2547)

วตถประสงค 1. เพอจาแนกสายพนธของเสอโครงโดยการเปรยบเทยบขอมลทางพนธกรรม 2. เพอตรวจสอบความสมพนธความเปนแม-ลกกนในเบองตน 3. เพอจดเกบขอมลพนธกรรมของเสอโครงเขาสฐานขอมลพนธกรรมสตวปาของประเทศไทย


‐ 16 ‐

วธการศกษา 1. การสกดดเอนเอ

สกดจโนมคดเอนเอ (Genomic DNA) จากเลอดของลกเสอโครง 2 ตวอยาง (ตวอยาง Tigb1 และ Tigb2) โดยใชวธ Standard phenol-chloroform และจากมลของเสอโครงโตเตมวยเพศเมย 1 ตวอยาง (ตวอยาง TigM1) โดยใชชดนายาสาเรจรป QIAamp DNA Stool Mini Kit

2. การเพมปรมาณดเอนเอโดยปฏกรยา Polymerase Chain Reaction (PCR) เพมปรมาณดเอนเอในสวนของยน Cytochrome b (Cyt b) ทมความยาวของลาดบเบส

ประมาณ 440 คเบส โดยใชค Primer ชอวา C2339F และ T2893R (Luo et al., 2004) และเพมปรมาณดเอนเอในสวนของยน NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) ซงมความยาวของลาดบเบสประมาณ 442 คเบส โดยใชค Primer ชอวา C9366F และ T9882R (Luo et al., 2004)

3. ตรวจสอบผลการเพมปรมาณดเอนเอโดยปฏกรยา PCR และขนาดชนสวนของยน Cyt b และ ND2 โดยวธ Gel Electrophoresis

4. การแยกสกดดเอนเอใหบรสทธ (DNA Purification) นาชนดเอนเอทเพมปรมาณไดในสวนของยน Cyt b และ ND2 มากาจดเกลอและองคประกอบ

อนๆทปนเปอนออกโดยชด Nucleic Acid Purification Kit (GeneAid)

5. การหาลาดบนวคลโอไทด (DNA Sequencing) โดยสงตวอยางทแยกสกดใหบรสทธแลวไป วเคราะหหาลาดบนวคลโอไทด

6. การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และ ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และเสอโครงเพศเมยตวอยาง TigM1 กบลาดบนวคลโอไทดในฐานขอมล NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gor/Blast.cgi) (DNA Blast) เพอตรวจสอบวาเปนชนสวนนวคลโอไทดทตองการหรอไม

7. การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และ ND2 ของลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และเสอโครงเพศเมยตวอยาง TigM1 กบลาดบนวคลโอไทดในฐานขอมล NCBI (Multiple sequence alignment) เพอประเมนความเหมอนหรอความแตกตางทางพนธกรรม

8. การสรางความสมพนธเชงววฒนาการ (Phylogeny) โดยใชวธ Neighbor-joining (NJ) และ ประเมนระดบความเชอมนของความสมพนธดงกลาวดวยวธ bootstrap วเคราะหจานวน 1,000 ซา โดยใชโปรแกรม MEGA version 4.0 ซงแสดงผลออกมาในรปแผนภมตนไม (Phylogenetic tree) เพอพสจนการสบทอดทางพนธกรรมรวมกน


‐ 17 ‐

ผลการศกษาและวจารณผล

การเพมปรมาณดเอนเอในชนสวนของยน Cyt b และ ND2 โดยปฏกรยา PCR

ผลการเพมปรมาณดเอนเอในชนสวนของยน Cyt b และ ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 โดยใชค Primer C2339F และ T2893R สาหรบยน Cyt b และค Primer C9366F และ T9882R สาหรบยน ND2 ไดชนสวนดเอนเอของยน Cyt b ทมความยาวของลาดบเบสประมาณ 440 คเบส และยน ND2 มความยาวของลาดบเบสประมาณ 442 คเบส ดงผลปรากฏในภาพท 1

ภาพท 1 ผลการตรวจสอบการเพมปรมาณดเอนเอดวยวธ Gel electrophoresis โดย Lane 1-3 เปนชนสวนของ

ยน Cyt b ใชค Primer C2339F/T2893R มความยาวลาดบเบสประมาณ 440 คเบส โดย Lane 1 คอ ตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 และ Lane 2-3 คอ ตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 สวน Lane 4-6 เปนชนสวนของยน ND2 ใชค Primer C9366F /T9882R มความยาวลาดบเบสประมาณ 442 คเบส โดย Lane 4 คอ ตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 และ Lane 5-6 คอ ตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2

การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และ ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 กบขอมลลาดบนวคลโอไทดในฐานขอมลสากล NCBI (DNA Blast)

1. การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b จากการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b ของลกเสอโครง Tigb1 และ

Tigb2 กบขอมลลาดบนวคลโอไทดทมอยในฐานขอมล NCBI โดยใชวธ Blastn พบวาลาดบนวคลโอไทดของ

500 คเบส


‐ 18 ‐

ลกเสอโครงทง 2 ตวอยาง คลายกบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b ของเสอโครงสายพนธเบงกอล P.t. tigris (Accession number: JF357968) มากทสด ดวยคาความเหมอน (Max Identity) เทากบ 99 % สวนเสอโครงเพศเมย TigM1 มลาดบนวคลโอไทดทคลายกบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b ของเสอโครงสายพนธอนโดไชนส P.t. corbetti (Accession number: JF357971) มากทสด ดวยคาความเหมอนเทากบ 100 %

2. การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 จากการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ของลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2

กบขอมลลาดบนวคลโอไทดทมอยในฐานขอมล NCBI โดยใชวธ Blastn พบวาลาดบนวคลโอไทดของลกเสอโครงทง 2 ตว คลายกบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ของเสอโครงสายพนธเบงกอล P.t. tigris (Accession number: JF357968) มากทสด ดวยคาความเหมอนเทากบ 99 % สวนเสอโครงเพศเมย TigM1 นนมลาดบนวคลโอไทดทคลายกบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ของเสอโครงสายพนธอนโดไชนส P.t. corbetti (Accession number: JF357971) มากทสด ดวยคาความเหมอนเทากบ 99 %

การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และ ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 กบลาดบนวคลโอไทดในฐานขอมล NCBI (Multiple sequence alignment)

1. การทา Multiple sequence alignment ในสวนของยน Cyt b ผลจากการนาเอาลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ

Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 ไปเปรยบเทยบความเหมอน (Multiple sequence alignment) กบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b จากฐานขอมล NCBI ของเสอโครงสายพนธตางๆจานวน 6 สายพนธ ไดแก สายพนธมลาย (P.t. jacksoni) จานวน 5 ตวอยาง (Accession number: AY736634-AY736638) สายพนธไซบเรย (P.t. altaica) จานวน 1 ตวอยาง (Accession number: AY736639) สายพนธจนใต (P.t. amoyensis) จานวน 1 ตวอยาง (Accession number: AY736640) สายพนธสมาตรา (P.t. sumatrae) จานวน 8 ตวอยาง (Accession number: AY736641-AY736648) สายพนธเบงกอล (P.t. tigris) จานวน 6 ตวอยาง (Accession number: AY736649-AY736654) และสายพนธอนโดไชนส (P.t. corbetti) จานวน 4 ตวอยาง (Accession number: AY736655-AY736658)

ผลทไดพบวาลาดบนวคลโอไทดของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 มความคลายคลงกบลาดบนวคลโอไทดของเสอโครงสายพนธเบงกอล (P. t. tigris) มากทสด โดยลาดบนวคลโอไทดตาแหนงท 41 เปนนวคลโอไทดชนดไซโตซน (C) มความจาเพาะตอเสอโครงเบงกอล P. t. tigris สวนลาดบนวคลโอไทดของตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 มความคลายคลงกบลาดบนวคลโอไทดของเสอโครงสายพนธอนโดไชนส P. t. corbetti มากทสด โดยลาดบนวคลโอไทดทมความจาเพาะตอเสอโครงอนโดไชนส P. t. corbetti คอ นวคลโอไทดตาแหนงท 65 และ 257 ซงเปนนวคลโอไทดชนดอะดนน (A) (ตารางท 1)


‐ 19 ‐

เมอเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 ทถกอางวาเปนแมลกเสอโครงทง 2 ตวแลว พบวามความแตกตางกน 5 ตาแหนง คอ ตาแหนงท 41, 65, 68, 257 และ 418 โดยนวคลโอไทดของลกเสอโครงทง 2 ตวทตาแหนงดงกลาว คอ ไซโตซน (C) กวานน (G) ไทมน (T) กวานน (G) และไทมน (T) ตามลาดบ สวน นวคลโอไทดทง 5 ตาแหนงของเสอโครงเพศเมย TigM1 คอ ไทมน (T) อะดนน (A) ไซโตซน (C) อะดนน(A) และไซโตซน (C) ตามลาดบ (ตารางท 1)

2. การทา Multiple sequence alignment ในสวนของยน ND2 ผลจากการนาเอาลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 ไปเปรยบเทยบความเหมอน (Multiple sequence alignment) กบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ของเสอโครงสายพนธตางๆจานวน 6 สายพนธ ไดแก สายพนธมลาย (P. t. jacksoni) จานวน 5 ตวอยาง (Accession number: AY736709-AY736713) สายพนธไซบเรย (P. t. altaica) จานวน 1 ตวอยาง (Accession number: AY736714) สายพนธจนใต (P. t. amoyensis) จานวน 1 ตวอยาง (Accession number: AY736715) สายพนธสมาตรา (P. t. sumatrae) จานวน 8 ตวอยาง (Accession number: AY736716-AY736723) สายพนธเบงกอล (P. t. tigris) จานวน 6 ตวอยาง (Accession number: AY736724-AY736729) และสายพนธอนโดไชนส (P. t. corbetti) จานวน 4 ตวอยาง (Accession number: AY736731-AY736733) ผลทไดพบวาลาดบนวคลโอไทดตวอยางของลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 มความคลายคลงกบลาดบนวคลโอไทดของเสอโครงสายพนธเบงกอล P. t. tigris มากทสดโดยลาดบนวคลโอไทดทมความจาเพาะตอ P. t. tigris คอ นวคลโอไทดตาแหนงท 205 เปนนวคลโอไทดชนดอะดนน (A) (ตารางท 1)


‐ 20 ‐

ตารางท 1 แสดงลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และยน ND2 ในตาแหนงทมความแตกตางกนของเสอโครงแตละสายพนธ โดยเครองหมายยตภงค (-) แสดงความเหมอนของนวคลโอไทดเมอเปรยบเทยบกบลาดบนวคลโอไทดของเสอโครงไซบเรย P. t. altaica

Cyt b ND2

C2339F - T2893R C9366F - T9882R Sub species

Gene Primer Position Code

Accession Number

0 1 8

0 4 1

0 5 2

0 6 5

0 6 8

2 5 0

2 5 7

2 6 4

3 5 3

4 0 5

418

0 0 4

0 2 1

1 8 7

1 9 0

2 0 5

2 8 0

3 4 6

4 0 0

4 0 9

P. t. altaica ALT AY736639 T T T G C T G G C A C C T A G G C T G C P. t. amoyensis AMO1 AY736640 - - - - - - - - - - T T C - A - - C A - P. t. sumatrae SUM1 AY736641 - - - - - - - - - G T T - - - - T - - - SUM2 AY736643 - - - - - - - - - G T T - - - - T - - - SUM3 AY736642 - - - - - C - - - G T T - - - - T - - - SUM4 AY736644 - - - - - - - - - G T T - - - - T - - - SUM5 AY736645 - C - - - - - - - G T T - - - - T - - - SUM6 AY736646 C - - - - - - - - G T T - - - - T - - - SUM7 AY736647 C - - - - - - - - G T T - - - - T - - - SUM8 AY736648 C - - - - - - - - G T T - - - - T - - - P. t. jacksoni COR4 AY736637 - - - - - - - A T - T T - - - - - - - - (corbetti II) COR5 AY736638 - - - - - - - - T - T T - - - - - - - - COR6 AY736634 - - - - - - - - - - T T - - - - - - - -

COR7 AY736635 - - - - - - - - - - T T - G - - - - - - COR8 AY736636 - - C - - - - - - - T T - G - - - - - -


‐ 21 ‐

ตารางท 1 (ตอ) แสดงลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และยน ND2 ในตาแหนงทมความแตกตางกนของเสอโครงแตละสายพนธ โดยเครองหมายยตภงค (-) แสดงความ เหมอนของนวคลโอไทดเมอเปรยบเทยบกบลาดบนวคลโอไทดของเสอโครงไซบเรย P. t. altaica

Cyt b ND2

C2339F - T2893R C9366F - T9882R Sub species

Gene Primer Position Code

Accession Number

018

041

052

065

0 6 8

2 5 0

257

264

353

405

418

004

021

187

190

205

280

346

400

4 0 9

P. t. corbetti I AMO2 AY736655 - - - A - - A - - - - T - - - - - - - -

COR1/AMO3 AY736656 - - - A - - A - - - - T - - - - - - - -

COR2 AY736657 - - - A - - A - - - - T - - - - - - - -

COR3 AY736658 - - - A - - A - - - - T - - - - - - - -

P. t. tigris TIG1 AY736649 - C - - - - - - - - T T - - - A - - - T

TIG2 AY736651 - C - - - - - - - - T T - - - A - - - -

TIG3 AY736652 - C - - - - - - - - T T - - - A - - - -

TIG4 AY736653 - - - - - - - - - - T T - - - A - - - -

TIG5 AY736650 - C - - - - - - - - T T - - - A - - - -

TIG6 AY736654 - C - - - - - - - - T T - - - A - - - T

Unknown1 (ลกเสอ 1) Tigb1 - C - - T - - - - - T T - - - A - - - -

Unknown2 (ลกเสอ 2) Tigb2 - C - - T - - - - - T T - - - A - - - -

Unknown3 (เสอเพศเมยโตเตมวย) TigM1 - - - A - - A - - - - T - - - - - - - -


‐ 22 ‐

เมอเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 ทถกอางวาเปนแมลกเสอโครงทง 2 ตวแลว พบวามความแตกตางกน 1 ตาแหนง คอ ตาแหนงท 205 โดยเปนนวคลโอไทดอะดนน (A) ในลกเสอโครงทง 2 ตวและ ชนดกวานน (G) ในเสอโครงเพศเมย TigM1 (ตารางท 1)

การสรางความสมพนธเชงววฒนาการ (Phylogeny) โดยใชลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b และ ND2 ของตวอยางลกเสอโครง 2 ตว (Tigb1 และ Tigb2) และตวอยางเสอโครงเพศเมย (TigM1) เปรยบเทยบกบขอมลลาดบนวคลโอไทดของเสอโครงจานวน 6 สายพนธจากฐานขอมล NCBI

1. การสรางความสมพนธเชงววฒนาการ (Phylogeny) โดยใชลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน Cyt b ผลจากการวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการดวยวธ NJ โดยใชโปรแกรม MEGA version 4.0 แสดงผลออกมาเปนรปแผนภมตนไม (Phylogenetic tree) ดงภาพท 2 ซงแสดงใหเหนวาตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 รวมเขาเปนกลมเดยวกนกบเสอโครงสายพนธเบงกอล P. t. tigris (Accession number: AY736649-AY736654) สวนตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 ทถกอางวาเปนแมของลกเสอโครงทง 2 ตวนน ถกจดอยคนละกลมกบลกเสอโครงทง 2 ตว โดยพบวาเขาไปรวมอยในกลมของเสอโครงสายพนธอนโดไชนส P. t. corbetti (Accession number: AY736655-AY736658)

2. การสรางความสมพนธเชงววฒนาการ (Phylogeny) โดยใชลาดบนวคลโอไทดในสวนของยน ND2 ผลจากการวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการดวยวธ NJ โดยใชโปรแกรม MEGA version 4.0 แสดงออกมาเปนรปแผนภมตนไม (Phylogenetic tree) ดงภาพท 3 ซงแสดงใหเหนวาตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 รวมเขาเปนกลมเดยวกนกบเสอโครงสายพนธเบงกอล P. t. tigris (Accession number: AY736724-AY736729) สวนตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 ทถกอางวาเปนแมของลกเสอโครงทง 2 ตว พบวาเขาไปรวมอยในกลมของเสอโครงสายพนธอนโดไชนส P. t. corbetti (Accession number: AY736730, AY736733)


‐ 23 ‐

ภาพท 2 แผนภมตนไม (Phylogenetic tree) ทสรางจากขอมลลาดบนวคลโอไทดของยน Cyt b แสดง

ความสมพนธระหวางตวอยางลกเสอโครง 2 ตว (Tigb1 และ Tigb2) ตวอยางเสอโครงเพศเมย (TigM1) ทถกอางวาเปนแมของลกเสอโครงทง 2 ตว และเสอโครงอก 6 สายพนธ ทไดขอมลลาดบ นวคลโอไทดมาจากฐานขอมลสากล NCBI

เสอโครงสมาตรา

TigM1-Cytb

เสอโครงเบงกอล

เสอโครงมลายเสอโครงจนใต


เสอโครงมลาย

เสอโครงไซบเรย

ตวอยางเสอโครงเพศเมย

เสอโครงอนโดไชนส

Tigb1‐CytBTigb2‐CytB

ตวอยางลกเสอโครง 2 ตว



‐ 24 ‐

ภาพท 3 แผนภมตนไม (Phylogenetic tree) ทสรางจากขอมลลาดบนวคลโอไทดของยน ND2 แสดงความ

สมพนธระหวางตวอยางลกเสอโครง 2 ตว (Tigb1 และ Tigb2) ตวอยางเสอโครงเพศเมย (TigM1) ทถกอางวาเปนแมของลกเสอโครงทง 2 ตว และเสอโครงอก 6 สายพนธ ทไดขอมลลาดบนวคลโอไทด

มาจากฐานขอมล NCBI





ตวอยางลกเสอ 2 ตว


TigM1-ND2


เสอโครงอนโดไชนสเสอโครงไซบเรย


เสอโครงจนใต



Tigb1‐ND2

Tigb2‐ND2 ตวอยางลกเสอโครง 2 ตว


ตวอยางเสอโครงเพศเมย


‐ 25 ‐

สรปผลการศกษา

การศกษาในครงนประสบผลสาเรจในการเพมปรมาณดเอนเอในชนสวนของยน Cyt b และ ND2 ของตวอยางลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และตวอยางเสอโครงเพศเมย TigM1 โดยใชค Primer C2339F และ T2893R สาหรบยน Cyt b และค Primer C9366F และ T9882R สาหรบยน ND2 ผลจากการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดของทง 2 ยน ของลกเสอโครง Tigb1 และ Tigb2 และเสอโครงเพศเมย TigM1 ทกวธการ คอ การนาไปเปรยบเทยบกบฐานขอมลลาดบนวคลโอไทดสากล NCBI การทา Multiple sequence alignment และการสรางความสมพนธเชงววฒนาการ (Phylogeny) พบวาลกเสอโครงตวอยาง Tigb1 และ Tigb2 เปนเสอโครงสายพนธ Panthera tigris tigris หรอ “สายพนธเบงกอล” และเสอโครงเพศเมย ตวอยาง TigM1 เปนเสอโครงสายพนธ Panthera tigris corbetti หรอ “สายพนธอนโดไชนส”

เนองจากยน Cyt b และ ND2 ทใชในการศกษาครงนเปนยนในไมโทคอนเดรยลจโนม ซงตองไดรบการถายทอดผานมาทางสายแมเทานน การทลกเสอโครงตวอยาง Tigb1 และ Tigb2 และเสอโครงเพศเมยตวอยาง TigM1 มพนธกรรมทแตกตางกน จงสรปไดวา ลกเสอโครงทง 2 ตว คอ Tigb1 และ Tigb2 และเสอโครงเพศเมย TigM1 ไมมความสมพนธเปนแม-ลกกน

วธการทไดจากการศกษาครงน สามารถนาไปประยกตใชในงานพสจนหลกฐานอนๆ โดยเฉพาะอยางยงการตรวจพสจนชนดของสตวปาของกลางทไดจากการจบกมทเปนชนสวนอวยวะหรอซากสตวปา ทไมสามารถจาแนกชนดไดจากการใชลกษณะทางสณฐาน สวนผลของลาดบนวคลโอไทดทไดนนไดจดเกบเขาสฐานขอมลพนธกรรมสตวปา เพอนาไปใชประโยชนสาหรบเปนขอมลพนธกรรมเปรยบเทยบกบสตวปาทไมทราบชนดตอไป

เอกสารอางอง จรลธาดา กรรณสต. 2543. พนธกรรมของการกาเนดชนดพนธและการวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการ

ของชนดพนธ. สถาบนวจยและพฒนาพนธกรรมสตวนา. กรมประมง, กรงเทพฯ. มนตา ชยประสงคสข. 2547. ความสมพนธเชงววฒนาการของปรงในสกล Encephalartos (Zamiaceae) โดย

ใชเทคนค RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). วทยานพนธปรญญาโท,มหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

Herrington, S. 1987. Subspecies and the conservation of Panthera tigris. In: Tilson, R. L., Seal, U. S., editors. Tigers of the world: The biology, biopolitics, management and conservation of an endangered species. Park Ridge, NJ: Noyes Publications. pp. 51–60.

Luo, S. J., J. H. Kim, W. E. Johnson, J. van der Walt, J. Martenson, N. Yuhki, D. G. Miquelle, O. Uphyrkina, J. M. Goodrich, H. B. Quigley, R. Tilson, G. Brady, P. Martelli, V. Subramaniam, C. McDougal, S. Hean, S. Q. Huang, W. Pan, U. K. Karanth, M. Sunquist, J. L. D. Smith and S. J. O’Brien. 2004. Phylogeography and genetic ancestry of tigers (Panthera tigris). Plos Biology 2 (12): 2275-2293.

............................................................................................................................................................................................................

Documents

Molecular genetics based subspecies identification in tigers · 2013-10-01 · งกอล (Panthera tigris tigris) และเสือโคร่งอินโดไชน ีส