NAZLI A. ERC YES 200620102007 II

Molekler mark rlar genom zerindeki herhangi bir blgeyi i aretleyip belirlemede kullan lan yntemlerdir.MOLEKLER MARKIRLARIN MORFOLOJ K MARKIRLARDAN FARKI

ve ara t r c lar ndan kaynaklanabilecek hatalar n azl . 2) YKSEK ORANDA POL MORF K: Bir genomda bulunan toplam baz say s kadar polimorfiklik saptanabilir. 3) OKLUK: ok say da molekler mark r olmas na kar n morfolojik mark r say s azd r. 4) KO-DOM NANTLIK: Bir lotusta mmkn olabilecek genotip belirlenebilir. 5) GEN X GEN NTERAKS YONU: Epistatik ve pleotropik de ildir. 6) HIZLILIK VE EKONOMiKLiK 7) NiVERSALLIK

1) KAL TAT F VE KANT TAT F BA IMSIZLIK: evre, geli me dnemi

Molekler

aretleyiciler

RESTRiKSiYON ENZiM VE HiBRiDiZASYON TABANLI Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Lenght Polymorphism, RFLP) Minisatellit (Minisatellite) Nokta Hibridizasyonu (Dot Blot)

POLiMERAZ ZiNCiR REAKSiYONU VE RESTRiKSiYON ENZiM TABANLIRestriksiyon Uzunluk Polimorfizmi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Restriction Fragment Length PolymorphismPCR, RFLP-PCR) Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP) veya Blnerek- o alt lm Polimorfik DNA Dizileri (Cleavage Amplified Polymorphic Sequence, CAPS) Terminal Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) o alt lm Para Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

POL MERAZ Z NC R REAKS YONU TABANLI

Primere Tabi Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimorfizmi (Arbitrary Primed PCR, AP-PCR) Rastlant sal o alt lm DNA Polimorfizmi (Random Amplified Polimorphism DNA (RAPD) o alt lan DNA Parmakizi (DNA Amplification Fingerprinting, DAF) Mikrosatellitler veya Basit Tekrarl Diziler Polimorfizmi (Microsatelites (Simple Sequence RepeatsPolymorphism, SSRP)

o alt lan Sekans Polimorfizmi (Sequence Related Amplified Polymorphism, SRAP Belirli Dizileri o alt lan Blgeler (Sequence Characterised Amplified Region, SCAR) Basit Sekans Tekrarlar Aras Polimorfizmi (Inter simple sequence repeats, ISSR) Do rudan o alt lan Uzunluk Polimorfizmi (Direct Amplification of Length Polymorphism, DALP) Allele Ba l zgn Primerler (Allele-specific Associated Primers, ASAPs) Ligaz Zincir Reaksiyonu (LCR)

DNA D Z VE ENZ M TABANLIKlevaz K s m Uzunluk Polimorfizmi (Cleavase Fragment length polymorphism, CFLP) Kimyasal Misma Kesimi (Chemical cleavage of mismatches (CCM))

DNA D Z TABANLI

Tek Nkleotid Polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) Heterodupleks Analizi (Heteroduplex analysis, HA) Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi (Single stranded conformational polymorphism, SSCP) Do rudan Dizi Analizi (Direct Sequencing) Genler Aras Blgeler (Internal Transcribed Spacers, ITS) Rastlant sal o alt lm Mikrosatellit Polimorfizmi (Randomly Amplified Microsatellite Polymorphisms, RAMPO)

RFLP analizi Restriction para uzunlu u polimorfizmiRestriksiyon endonkleaz enzimlerinin kullan ld bu yntemde, Restriksiyon endonkleazlar, restriksiyon blgeleri olarak bilinen ift zincirli DNA'n n sadece spesifik baz dizilerini tan makta ve diziyi bu blgelerden kesmektedir. RFLP analizi viral su lardaki mutasyonlar saptamada, viral epidemileri belirlemede kullan lmaktad r.

RFLP n n a amalarBiyolojik materyalden genomik DNA izole edilir, ve bunlar bir RE ile kesilirler, Kesilmi DNA lar elektroforeze tabi tutulurlar, Polimorfik blge olup olmad na bak l r (EtBr ile i aretlendikten sonra; gzle ay rt edilemiyorsa veya do rulamak iin Southern Blot tan sonra) sonra)

o alt lm

AFLP para uzunlu u polimorfizmi

Bu teknik RFLP'den daha h zl al r ve DNA rneklerini o altmak iin PCR kullan r. De i ken say l biti ik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayal (VNTR) aleller ay rdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayr t r l r. Bantlar gm boyamas ile grlr. Analiz jelde yap ld iin, ok yksek say l tekrarlar jelin tepesinde s k abilirler ve birbirlerinden ay rdedilmeleri zor olabilir. AmpFLP analizi yksek oranda otomatikle tirilebilir. Bu yntemle ki isel DNA rnekleri kar la t r larak filogenetik a alar yarat labilir. D k maliyeti, haz rlanma ve al t rma kolayl gibi nedenlerden dolay AmpFLP hl az gelirli lkelerde yayg n olarak kullan l r .

PCRPolimeraz Zincirleme Tepkimesi ,DNA ierisinde yer ,DNA alan,dizisi bilinen iki segment aras ndaki zgn bir blgeyi enzimatik olarak o altmak iin uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. Metod basite tp ierisinde nkleik asitlerin uygun kosullarda o alt lmas esas na dayan r. Bir e it "in vitro "in klonlama" olarak da tan mlanan , PCR Reaksiyonu Denatrasyon; DNA n n iki zincirinin yksek s ile birbirinden ayr lmas (95C) (95 Annealing (yap ma); sentetik oligonkleotidlerin hedef DNA'ya ba lanmas (65C), (65 Elongasyon(uzama); zincirin uzamas ve ift iplikikli DNA n n sentezi (72C) a amalar n n belirli say da tekrar na (72 dayan r. Bu ad m bir PCR dngsn olu turur.

STR analizi K sa biti ik tekrarlarGnmzde kullan lan DNA profillemesi PCR ve k sa biti ik tekrarlara ( ng. short tandem repeats veya STR) dayal d r. Bu yntemde k sa tekrar eden DNA dizilerine sahip, son derece polimorfik blgelere bak l r (en yayg n olarak tekrar eden 4 bazl blgelere bak l r ama 3, 5 ve ba ka say da baz tekrarlar da kullan l r). Akraba olmayan ki ilerde bu tekrar eden birimlerden farkl say larda oldu u iin, bu DNA blgeleri birbirlerine akraba olmayan ki ilerin ay rdedilmesinde kullan labilir. Bu STR lokuslar (konumlar ) dizi-spesifik primerler dizikullan larak PCR ile o alt l r. Elde edilen DNA paralar sonra elektroforez ile ayr t r l r ve tespit edilir. Bu ama iin kullan lan iki elektroforez yntemi vard r, kapiler elektroforez ve jel elektroforezi

Kapiler elektroforezde, ii bir polimerlerle dolu elektroforezde, ince cam tbn (kapiler veya k lcal tbn) iine DNA paralar bir elektrik alan n n etkisiyle (elektrokinetik olarak) enjekte edilir. Sonra, gene bir elektrik alan n n etkisiyle DNA paralar bu tp iinde, kk paralar byk olanlardan daha h zl olmak zere, ilerler. PCR s ras nda kullan lan primerlere ba lanm flresan etiketler sayesinde kapiler tpte ayr t r lan DNA paralar n hangi tepkimenin rn oldu u anla labilir. Bu sayede birden ok DNA paras n n PCR ile o alt lmas ve beraber elektroforez edilmesi mmkn olur, buna multipleksleme denir.

Farkl byklkte ve i aretlenmi DNA standartlar n n her bir rne e dahil edilmesi ile paralar n byklkleri belirlenir, bu byklk bilinen tm alelleri listeleyen bir tablo ile kar la t r larak polimorfik tekrar say s bulunur. Bu yntem pahal olmakla beraber yksek kapasiteli makinalar kullan larak rnek ba na daha d k bir masrafa ula mak ve o u adli laboratuvardaki i ykn azaltmak mmkndr. Jel elktroforezi kapiler elektroforeze (KE) benzer bir prensibe gre al r ama DNA paralar n ayr t rmak iin kapiler tp yerine iki cam tabaka aras nda olu turulmu bir poliakrilamit jel kullan l r

SRAP SEKANS L SK L O ALTILAN POL MORF ZM17 ile 20 nt aras nda kullan lan zel primerlerle genomda kodlama yapan DNA paralar n ogaltamaya dayal bir metottur. Ko-dominantl k ve tekrarlanabilme zeli i, Komorfolojik karakterlerle ili kilerinin fazlal g avantajlar aras nda yer al rken zel primer iste i ise bir dezavantajd r SRAP iki zel primer kullan r (bir brimer ifti) bu primerlerin 13 ile 15 nt uzunlugundaki sol taraf (5.-) (5.de i ik bazlardan olu ur ve CCGG bazlar yla uzat l r. Di er primer ise yine benzer eklide olup 3.- ucu AATT 3.bazlar yla bitirilir.

ISSR BASIT SEKANS TEKRARLAR ARASI POLIMORFIZIM

Bu teknikte genellikle tek bir primer kullan l r. Primer uzunlu u 16-20 nt olup duruma gre 16primerin ular ndan biri 2-4 baz uzat l r. Primerin 2bu uzant lar ierisindeki k sm nda tekrarl bazlar bulunur. ISSR primerine rnek: 5.-ACACACACACACACACCTC-3. 5.-ACACACACACACACACCTCBurada CCTC ard k tekrar n 3.- ucuna eklenen 3.nkleotidleri gsterir ok say da lokus ayn anda izlenebilmektedir.

SSR BASIT SEKANS TEKRARLARI POLIMORFIZIMBasit tekrarli DNA dizileri genelde bir ile 6 nkleotit uzunlugunda bazlarin ardisik olarak bulunmasi olayidir. rnegin ikili tekrar ATATATATATATATATATAT eklindedir. Burada ard k olarak tekrar eden bazlar AT' dir ve bu rnekte AT 10 kez tekrarlanmaktad r. Herhangi bir DNA'nin basit tekrarli olarak isimlendirilebilmesi iin nce belirli bir motifin yukaridaki rnekte motif AT'dir ve bu motifin belirli bir sayida bulunmasi gerekir. Genelde ikili bir motifte motif sayisinin en az 8 olmasi bu sekansa basit tekrarli sekan olarak adlandirilmasini saglar

Bu teknik gnmzde olduka fazla kullanilan bir tekniktir. Nedeni ise polimorfizm orani olduka fazla olmasi yaninda tekrarlanabilirligi (farkli kisilerin farkli labaratuarlarda yapimis oldugu deneylerden ayni sonu almalari) olduka fazla olan bir yntemdir. Bir PCR metodu olmasi kolay uygulanabimesini saglar. Ancak bu markir sisteminin uygulanabilmesi iin alisilan organizmaya ait primerlerin yani SSR primerlerinin nceden bilimesi gerekmektedir

SSR primerlerinin retiminde genel olarak farkl yakla m tercih edilmektedir. Bunlar: (1) genomik DNA ktphanelerinin SSR oligonkleotidleri ile hibridizasyonu yoluyla gzlenmesi (2) DNA veri bankalar nda SSRler n ara t r lmas (3) akraba bitki trlerinde geli tirilmi olan SSR-spesifik primerlerin kullan m d r.

Mikrosatellitlerin en byk dezavantaj yeni markr geli tirilmesinin gl dr. Yeni markrlerin geli tirilmesi iin genomik DNA klonlar n n tekrarlanan oligonkleotid ieren problarla melezlenme yoluyla bulunmas , nkleotid dizili lerinin belirlenmesi ve yanyana tekrarlanan yap lar n ba lang ve biti yerlerinden zel ba lat c DNA lar geli tirilmesi gerekmektedir. Bu da olduka fazla i gc gerektiren pahal bir i lemdir.

SCAR D Z LER BEL R O ALTILAN BLGELER Bu mark r sistemi genellikle RAPD veya AFLP metotlar yla o alt lm tek bir amplikonun primer uzunlu unu yakla k ikiye katlayarak yeniden o alt lmas na dayan r. K saca tek fragmentini temsil eden lokus nce jel zerinden al n r, orijinal primerle tekrar o alt l r ve o alt lan DNA paras n n sekans yap l r. Yeni primerler eski primer sekanslar n ve ek olarak yeni DNA dizileri ierir.

Bu metodla RAPD veya AFLP teknikleri dominant zellikten ko-dominant zellige, kotekrarlanma zelligi art r lmaktad r. SCAR primerlere genelde 18-24 oligo 18uzunlugundad r. Avantajlar : PCR metodu oldugundan, Yksek kalite ve miktarda DNA.ya ihtiya yoktur. Tekrarlanabilme kapasitesi olduka yksektir. Dezavantaj : DNA sekanslamas na ihtiya duyar.

SSCP Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi

Ayn byklkteki DNA paralar n ay rmakta kullan lan bir metottur. Bu metotta tek sarmall DNA n n non-denatrasyon poliakrilamid jel nonelektroforezindeki hareketi izlenir. Bu tekni in temelini jel zerinde elektroforez olan bir DNA n n hareketi DNA n n bykl ve bu DNA y olu turan sekanslar n ieri ine ve bu ierikten dolay DNA parac n n kendi zerine ba lanma veya de i ik ekiller almas na dayan r.

Bu teknik 100 ile 400 nkleotid uzunlu undaki DNA.larda uygun sonular verebilmektedir. Bu teknik uygun byklkteki PCR amplikonlar na uygulan r ve PJE yntemiyle ayr t r l r. zotop, EB veya gm nitrat yntemiyle grntlenebilir.

RAPD Raslant sal o alt lm

DNA Farkl l

Bu teknikte genellikle 10 nkleotid uzunlu undaki primer (ba lat c ) tek sarlmall DNA lar kullan larak genom zerinde rastgele blgelerin DNA amplifikasyonu gerekle tirilir. Reaksiyon artlar n n spesifik olmamas rastgele o alt ma izin verir. Yayg n olarak di er PCR uygulamalar n n aksine iki de il tek bir primer kullan l r.

Ancak bu ba lat c her iki yndeki DNA retimi iin de kullan l r. Dolay s yla kullan lan ba lat c n n DNA zerinde birbirine yak n iki blgeye yap abildi i genom blgelerinin amplifikasyonu yap l r. retimi yap lan DNA paralar (amplikon) agaroz jel zerinde elektroforeze tabi tutuldu unda baz paralar n baz genotiplerde retilip baz lar nda retilmedi i gzlenir

RAPD Avantajlar1. RFLP.den daha fazla polimorfik 2. Basit ve h zl 3. Mark rlar evre arlar ndan ve geli me dnemlerinden etkilenmez 4. Radyoizotoplar kullanmaz 5. Mutasyona bagl amlifikasyon 6. Az genomik DNA 7. Primer ba na fazla mark r retebilir 8. niversal primerler kullan r

RAPD Dezavantajlar1. Tekrarlanabilirligi zay f 2. Dominant mark r 3. Polimorfizim oran di er baz mark rlardan az

VNTR(Minisatellitler)VNTR larde tekrar eden dizi 9 80 b aras nda olabilmektedir. Her lokusta ok say da alel olmas VNTR lar n ay r m gcn art rmakta, ancak alel boyutlar byk oldu undan ok iyi korunamam rneklerde amplifikasyon sorunlar ya anabilmektedir. Bundan dolay kullan m alan s n rl kalm t r.

Tah l rnnn en yayg n kullan lan marker sistemleri ile Kar la t rmas

zellik RFLPs DNA(mikrogram ) 10 DNA KAL TES yksek PCR TABANLI yok KULLANIM KOLAYLI I kolay de il OTOMASYON d k TEKRARLANAB L RL K yksek GEL T RME MAL YET d k ANAL Z BA INA MAL YET yksek

RAPDs 0,02 yksek evet kolay orta gvenilmez d k d k

AFLPs 0,5-0,1 0,5orta evet kolay orta yksek orta orta

SSRs 0.05 orta evet kolay yksek yksek yksek d k

ISSR 0,05 yksek evet kolay yksek yksek yksek d k

DNA SEKANSLAMA

DNA paras n n veya herhangi bir genomun tm nkleik asit dizisinin yani A, T, C, ve G.lerinin belirlenmesidir. Maxam & Gilbert, Kimyasal sekanslama Sanger, Dideoksinkleotit Yntemi Gnmzde Sanger metodunun prensipleri kullan larak sekanslama i lemleri gerekle tirilmektedir.

Sanger Yntemi in: 1) Kal p DNA kopyalar (DNA Sekans Belirlenecek olan) 2) Uygun bir primer kopyalar 3) DNA polimeraz 4) Normal deoksinkleotitler (dATP, dTTP dGTP, dCTP) 5) Dideoksinkleotitler ( zotop veya Floresan eteiketli ddTTP, ddATP, ddCTP, ddGTP) Teknik birbirlerine komplimentar olan tek sarmall DNA lar n uygun ortamlarda birbirleriyle baz ifti prensibine gre ba lanmalar prensibine dayan r.

http://www1.akdeniz.edu.tr/ziraat/tr/dersler/genetikmuh_07.pdf http://www.abgeder.org/Bio1Gonul.pdf http://www.abgeder.org/Bio1Behnan.pdf http://tr.wikipedia.org/wiki/DNA_profillemesi http://www.fao.org/biotech/docs/Korzun.pdf http://web.inonu.edu.tr/~iozerol/rdurmaz/UygMolMikr/149.pdf http://tr.wikipedia.org/wiki/Polimeraz_zincir_tepkimesi http://www.vtunnel.com/index.php/1010110A/bb8cfd09a195d37da6 046b345ba286ff1e154a5b9e249d7e0247b8b76edd23041ab94bd42f3 323e757969782556ecfeb69f4f41d3ee8e4e015650