Molekulare Analyse eines synthetischen Tetracyclin ... · Vertiefende Analysen durch isothermale Titrations-Kalorimetrie (ITC) zeigen ein ungewöhnliches Bindungsverhalten mit einem

Molekulare Analyse eines synthetischen

Tetracyclin-abhängigen RNA-Regulators

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Michael Müller

aus Passau

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2006

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder

Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. P. Dietrich

meiner Familie

Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen, an dessen Lehrstuhl diese Arbeit durchgeführt

wurde, für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen.

Besonders bedanke ich mich bei Dr. Beatrix Süß für die Möglichkeit an einem sehr

interessanten Thema frei arbeiten zu können, für ihren fachlichen Rat und die permanente

Unterstützung.

Bei Frau Prof. Dr. Petra Dietrich möchte ich mich für die Übernahme des Koreferats

bedanken.

Herzlich bedanken möchte ich mich bei Dr. Oliver Weichenrieder (NKI Amsterdam), der mir

mit allerlei praktischen Kniffen und hilfreichen Diskussionen das Arbeiten mit RNA näher

gebracht hat und für den freundlichen Empfang in Amsterdam.

Bei unserer Labor-Fee Barbara bedanke ich mich für die Hilfe bei der Lösung von allerlei

labortechnischen Problemchen.

Auch bei allen ehemaligen und derzeitigen Mitgliedern des Trixi-Labs (Shane, Gesine, Anke,

Bernd, Stefi, Sabrina, Linda, Martin, Ewald, Johannes, der Labor-Julia und all denen die ich

jetzt vergessen habe) bedanke ich mich für die stets lustige und freundliche Atmosphäre und

die permanente Hilfsbereitschaft. Insbesondere bei allen Kuchen- und Süßigkeitenlieferanten

dafür, dass immer was in der Schublade war.

Bei Dr. Chris Berens für die zahlreichen interessanten Anregungen und Diskussionen und bei

Dr. Matthias Görlach und Sabine Häfner (IMB Jena) bedanke ich mich dafür, dass sie mir

auch nach meiner Diplomarbeit mit Rat und Tat zur Seite standen.

Ein ganz großes Dankeschön gebührt auch unserem Werkstatt Düsentrieb Markus Müller, der

mit seiner Bastelei alle auftretenden technischen Probleme gelöst hat.

Vielen Dank auch an alle anderen Mitglieder des Lehrstuhls für die gute Zeit und die stete

Hilfsbereitschaft. Besonders möchte ich mich bei meinen Eltern und Großeltern für die

finanzielle Unterstützung bedanken, für den ständigen Nachschub im Kühlschrank und vieles

mehr. Ohne euch wäre das nicht möglich gewesen. Bei meiner Julia bedanke ich mich für die

Unterstützung in allen Lebenslagen, beim Kampf mit Word und dem Finden von

Rechtschreibfehlern.

Mein Dank gilt auch Herrn Dr. Rösch, Frau Cimander, Frau Hanuschik, Frau Storck, Frau

Ingram, Frau Prell, Frau Oliva und Frau Wehr die mit ihrer im Hintergrund geleisteten Arbeit

eine solide Basis für (meist) sorgenfreies Forschen an diesem Lehrstuhl bilden und gebildet

haben.

Inhaltsverzeichnis 1

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung............................................................................................................ 4

2 Einleitung .......................................................................................................................... 6

2.1 RNA-Faltung.............................................................................................................. 6

2.2 RNA-Aptamere .......................................................................................................... 9

2.3 Selektion von Aptameren mittels SELEX.................................................................. 9

2.4 Spezifität und Affinität von RNA-Aptameren ......................................................... 10

2.5 Anwendung von Aptameren..................................................................................... 10

2.5.1 Aptamere als Werkzeuge in der Diagnostik..................................................... 10

2.5.2 Aptamere als Bestandteil von hochempfindlichen Biosensoren für Toxine .... 11

2.5.3 Aptamere in der medizinisch-therapeutischen Anwendung............................. 11

2.5.4 Chemische Modifikation von Aptamer-RNA zum Schutz vor Degradation ... 12

2.6 Genexpression in Eukaryoten................................................................................... 13

2.6.1 Transkription und Prozessierung der prä-mRNA............................................. 13

2.6.2 Aufbau der eukaryotischen mRNA.................................................................. 14

2.6.3 Initiation der Translation von eukaryotischer mRNA...................................... 15

2.6.4 Alternative Möglichkeiten zur Initiation der Translation ................................ 15

2.7 Regulation der Translation ....................................................................................... 16

2.7.1 Regulation der Translation durch Riboswitche................................................ 16

2.7.2 Regulation der Translation durch konditionelle Systeme ................................ 18

2.8 Tetracyclin................................................................................................................ 21

2.9 Zielstellung der Arbeit ............................................................................................. 23

3 Material und Methoden ................................................................................................. 24

3.1 Bakterien- und Hefestämme, Plasmide und Oligonukleotide .................................. 24

3.1.1 Bakterien- und Hefestämme............................................................................. 24

3.1.2 Plasmide ........................................................................................................... 25

3.1.3 Oligonukleotide................................................................................................ 26

3.2 Puffer, Lösungen und Medien.................................................................................. 29

3.2.1 Bakterien- und Hefenährmedien ...................................................................... 29

3.2.2 Puffer und Lösungen ........................................................................................ 30

3.2.3 Enzymlösungen ................................................................................................ 37

3.3 Methoden.................................................................................................................. 37

3.3.1 Allgemeine Methoden ...................................................................................... 37


3.3.2 Anzucht von Bakterien..................................................................................... 37

3.3.3 Transformation von E. coli............................................................................... 38

3.3.4 Anzucht von S. cerevisiae ................................................................................ 38

3.3.5 Anzucht und Transformation von kompetenten S. cerevisiae.......................... 38

3.3.6 Nachweis und Präparation von DNA............................................................... 39

3.3.7 Nachweis und Präparation von RNA ............................................................... 41

3.3.8 Fluoreszenz Messungen ................................................................................... 47

3.3.9 Isothermale Titrationskalorimetrie................................................................... 48

3.3.10 Analytische Gelfiltration am SMART System................................................. 49

3.4 Aufreinigung der T7-RNA-Polymerase ................................................................... 49

3.5 Präparation eines Hefe Zellextrakts ......................................................................... 51

3.6 in vitro Spleißexperimente ....................................................................................... 24

4 Ergebnisse ....................................................................................................................... 54

4.1 in vitro Synthese von Aptamer-RNA....................................................................... 54

4.1.1 Das Hammerhead-Ribozym ............................................................................. 55

4.1.2 Der Klonierungsvektor pSP64 ......................................................................... 55

4.1.3 Konstruktion der Transkriptionsvektoren ........................................................ 56

4.2 Synthese und Aufreinigung der RNA ...................................................................... 57

4.3 Konformation und Stöchiometrie des RNA-Tc Komplexes .................................... 58

4.3.1 Analyse des molaren Verhältnisses im Tc-RNA Komplex über analytische

Gelfiltration ...................................................................................................................... 58

4.3.2 Visualisierung des Tc-Aptamer Komplexes .................................................... 61

4.4 Thermodynamische Charakterisierung des RNA-Tc Komplexes ............................ 63

4.4.1 Titrationsfluoreszenzspektroskopie.................................................................. 63

4.4.2 Isothermale Titrationskalorimetrie................................................................... 72

4.5 Regulation der gfp-Expression in vivo durch verschiedene Tc-Derivate................. 76

4.6 Das zweigeteilte Tc-Aptamer................................................................................... 77

4.7 Das CAA- Aptamer.................................................................................................. 80

4.8 Kontrollierte Regulation des Spleißens durch das Tc-Aptamer............................... 82

4.8.1 Integration von 5´-SS und bp in das Tc-Aptamer und Test auf Tc-Bindung.. 82

4.8.2 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von Aktin......... 85

4.8.3 In vitro Spleißen der Aktin RNA ..................................................................... 86

4.8.4 In vitro Spleißen der Aptamer enthaltenden Aktin Konstrukte........................ 88

5 Diskussion ....................................................................................................................... 89


5.1 Der Tc-Aptamer-RNA Komplex.............................................................................. 89

5.1.1 Komplexaufbau ................................................................................................ 89

5.1.2 Affinität des Tc-Aptamers zum Liganden Tc .................................................. 89

5.1.3 Aufbau der Tc-Bindetasche.............................................................................. 90

5.2 Spleißregulation in S. cerevisiae durch das Tc-Aptamer ......................................... 54

6 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 95

7 Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ 101

8 Anhang .......................................................................................................................... 104

8.1 Materialien und Geräte........................................................................................... 104

8.2 Fluoreszenzmessungen an Mutanten von Tc-Aptamer RNA................................. 110

8.3 Fluoreszenz-Messungen mit verschiedenen Tc-Derivaten .................................... 113

8.4 „Double mutant cycle“ Analyse nach Fersht ......................................................... 116

8.5 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von Aktin............... 118

9 Publikationen................................................................................................................ 120

10 Lebenslauf ................................................................................................................. 121

Zusammenfassung 4

1 Zusammenfassung

Das über in vitro Selektion gefundene Tc-bindende RNA-Aptamer kann zur Tc-abhängigen Regulation der Translation in Hefe eingesetzt werden. Dazu muß das Aptamer in den 5´-UTR eines Reporters inseriert werden. Zugabe von Tc führt dann zur Inhibierung der Translation, indem der Tc-Aptamer Komplex das Ribosom entweder an der Erkennung der cap-Struktur oder am scanning hindert. In dieser Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Tc an Aptamer-RNA biochemisch und thermodynamisch charakterisiert. Anhand von analytischen Gelfiltrationsexperimenten konnten die äquimolare Stöchiometrie des Komplexes und die konformationelle Homogenität der Aptamer-RNA gezeigt werden. Der Tc-RNA Komplex wurde durch native PAA-Gelelektrophorese visualisiert. Dazu wurde ausgenutzt, dass die Fluoreszenzintensität von Tc bei Anregung mit 370 nM UV-Licht beim Übergang in eine hydrophobe Umgebung stark ansteigt. Dieses intrinsische Verhalten von Tc ermöglichte es, die Dissoziationskonstante des Komplexes auf 0,73 nM zu bestimmen. Hierbei handelt es sich um eine außergewöhnlich starke Bindung. Vertiefende Analysen durch isothermale Titrations-Kalorimetrie (ITC) zeigen ein ungewöhnliches Bindungsverhalten mit einem starken enthalpischen Beitrag und hoher negativer Entropie. Die hohe Bindungsenthalpie weißt auf die Ausbildung zahlreicher neuer Bindungen hin. Die ungünstige Entropie zeigt eine Versteifung des Komplexes sowie die Fixierung kleinere Moleküle wie Tc und Mg2+. Diese Schaffung von Ordnung überwiegt die bei Bindungsreaktionen normalerweise auftretende Entropieerhöhung, die durch das Freisetzen von H2O bedingt ist. Die Analyse der Punktmutanten A09G, A13U und A50U zeigte einen drastischen Affinitätsverlust. Diese Positionen befinden sich in zwei voneinander unabhängigen Bereichen des Aptamers, welche die Tc-Bindetasche formen. Einer der beiden Bereiche allein ist dazu nicht in der Lage. ITC-Experimente ergaben für A13U und A50U, dass der hohe Affinitätsverlust von einer reduzierten Bindungsenthalpie begleitet wird, was auf den Verlust von mehreren Tc-RNA Kontakten hinweist. Im Falle von A50U zeigt der komplette Verlust des entropischen Terms, dass der Komplex deutlich weniger stark strukturiert ist. Dies weist auf eine „stacking interaction“ dieses Nukleotids mit den benachbarten Purinen hin, die bei der Mutante gestört ist. Der von der Mutation A09G erzeugte entropische Einbruch zeigt, dass hier mehr Bindungsenergie für die RNA-Faltung aufgewendet werden muss. Die Position A09 ist somit für die Vorstrukturierung der RNA von großer Bedeutung. Die Analyse des Bindungsverhaltens von mehreren RNA-Tc-Derivat-Paaren mittels der „double mutant cycle“ Methode ergab, dass die R6β OH-Gruppe von Tc mit dem Adenin an Position 13 in direkten Kontakt steht. Desweiteren bildet auch die R2 Amid-Gruppe am Tc einen direkten Kontakt zum Aptamer aus. In einem zweiten Projekt wurde versucht, das Tc-Aptamer zur Tc-abhängigen Spleißregulation einzusetzten. Dazu wurden 5´-Spleißstelle (SS) und Verzweigungspunkt in das Aptamer inseriert und in das Hefe Aktin-Intron integriert. In vitro Spleißexperimente zeigten jedoch, dass die Maskierung von 5´-SS bzw. Verzweigungspunkt bereits in Abwesenheit von Tc zur völligen Inhibierung der Spleißreaktion führen.

Zusammenfassung 5

Summary The tetracycline (tc)-binding RNA-aptamer was originally discovered by in vitro selection and can be employed for tc-dependent regulation of translation in yeast. Therefor the aptamer has to be inserted into the 5´-UTR of a reporter. Addition of tc leads to inhibition of translation by interference of the tc-aptamer complex with the formation of the 80S ribosom either by prevention of binding of the small ribosomal subunit to the cap-structure or by blocking the scanning process. The mode of tc-binding to the aptamer-RNA has been characterised in a biochemic and thermodynamic way. In analytical gelfiltration experiments the equimolar stoichiometry of the complex and the conformational homogeneity of the aptamer-RNA could be shown. The visualization of the tc-RNA complex was performed by native PAA gelelectrophoresis. For this purpose the intrinsic behaviour of tc to exhibit an increase in fluorescence upon transition into a hydrophobic environement was employed. This allowed the determination of the dissociation constant of 0.73 nM which indicates a remarkably strong binding. In-depht analysis was performd via isothermal titration calorimetry (ITC) and revealed a extraordinary binding behaviour with both a strong enthalpic and a negativ entropic contribution. The strong binding enthalpy points toward the formation of many new bonds. The unfavourable entropic contribution reflects a stiffening of the complex and the fixation of small molecules like Mg2+ and tc. This creation of order outnumbers the entropic increase which is usually caused by the release of H2O during binding reactions. Analysis of the point mutations A09G, A13U and A50U revealed a great loss in affinity. These positions are localized in two separate parts of the aptamer which are responsible for the formation of the tc-binding pocket. One single half is not able to bind tc. ITC experiments showed that the loss of affinity in the case of A13U and A50U is accompanied by a reduced binding enthalpy, indicating the loss of several tc-RNA contacts. In the case of A50U the complete disappearence of the unfavourable entropic term shows that the complex is much less structured. This points toward a stacking interaction of A50 with the adjacent purines, which is disturbed in the A50U mutant. In the case of A09G the entropic term is much more unfavourable than in the wildtype, showing the increased need of binding energy for RNA-folding. Double mutant cycle analysis revealed a direct contact between the tc R6β OH-group and the adenine at position 13. A further direct contact to the aptamer is formed by the R2 amide group of tc. In a second project we tried to utilise the aptamer for tc-dependent regulation of splicing. To do so, 5´-splice site and branchpoint, respectively, were integrated into the aptamer sequence and inserted in the yeast actin intron. In vitro splicing experiments showed that the masking of 5´-splice site or branchpoint cause the complete inhibition of the splicing reaction even in the absence of tc.

Einleitung 6

2 Einleitung

Die ersten biologischen Makromoleküle entstanden bei der Umsetzung von H2O und Gasen,

wie z.B. CH4, CO2, N2 und NH3 durch thermale Energie und Strahlung (Miller, 1953). Aus

biochemischen Bausteinen wie Zucker, Aminosäuren, Purinen und Pyrimidinen,

verschiedenen Nukleotiden, Thioestern und Fettsäuren entwickelten sich unter präbiotischen

Bedingungen erste Polypeptide und –nukleotide. Ein entscheidender Punkt in der Definition

von „Leben“ ist die Vermehrung. Diese Forderung kann bereits von der RNA erfüllt werden.

Viele RNA-Moleküle besitzen katalytische Funktion, womit die Existenz einer urzeitlichen

RNA-Welt, in der das erste Leben aus sich selbst replizierender RNA bestand, durchaus im

Bereich des Möglichen ist. Heute ist bekannt, dass die katalytische Funktion von RNA-

Molekülen auf ihrer hochkomplexen dreidimensionalen Struktur beruht.

2.1 RNA-Faltung

RNA kann vielfältige Sekundär- und Tertiärstrukturen annehmen, was die Grundlage für die

katalytische und regulatorische Funktion vieler RNAs bildet. Obwohl RNA Moleküle nur aus

vier verschiedenen Basen (den Purinen Adenin und Guanin und den Pyrimidinen Cytosin und

Uracil), einer Ribose und einer Phosphatgruppe aufgebaut sind, gibt es eine nahezu unendlich

große strukturelle Vielfalt, die auf intramolekularen Wechselwirkungen beruht. Basen

interagieren mittels Wasserstoffbrücken und Basenstapelungen und ergeben eine große

Bandbreite an Basenpaarungen: Watson-Crick-AU und –GC, das GU-Wobble-Basenpaar und

eine Vielzahl unüblicher Paarungen, z. B. GA, UU und GG Paare. Sie alle tragen zur

strukturellen und funktionellen Vielfalt gefalteter RNA bei.

Bei RNA-Faltungsvorgängen sind die aufgewendeten Energiebeiträge bei der

Sekundärstrukturausbildung höher als bei der Tertiärstrukturausbildung. RNA-Faltung ist also

ein Vorgang, bei dem die Sekundärstruktur die Tertiärstruktur wesentlich beeinflusst. Dies

ermöglicht auch, Algorithmen zur Strukturvorhersage zu entwickeln. Typische

Sekundärstrukturelemente in RNA (Abbildung 2.1) sind doppelsträngige Bereiche, Stamm-

Schleifen, Ausbuchtungen und Verzweigungen (Tinoco et al., 1999).

Eine RNA-Helix ist ein doppelsträngiger Bereich, bestehend aus Watson-Crick-AU, -GC und

GU-Wobble-Basenpaaren (Gesteland, 1999). RNA-Doppelstränge liegen in einer A-Form

vor, weil die 2´-OH-Gruppe der Ribose die Ausbildung einer B-Form aus sterischen Gründen

nicht zulässt. Die Bezeichnungen A-Form und B-Form stammen aus der DNA-Genetik und

Einleitung 7

Fehlpaarung symmetrischer und asymetrischer drei- und vierfach

interner Loop verzweigende Loops

interne Loops Junction (Verzweigung)

Ausbuchtung Ein-Basen

Ausbuchtung

Hairpin Loop (Schleife) Hairpin Stem (Stamm)

Hairpin (Haarnadel) Bulges (Ausbuchtungen)

Duplex Einzelstrang-Bereiche

RNA-Pseudoknoten

Abbildung 2.1

Sekundärstrukturelemente in RNA (Gesteland, 1999).

Einleitung 8

beziehen sich auf die geometrischen Strukturmerkmale von Doppelstrang-DNA bei

verschiedenen Bedingungen. Der Hauptunterschied zwischen A-Form und B-Form liegt im

Winkel zwischen der Helixachse und den Basenpaaren. Bei der A-Form beträgt dieser 71-77°,

bei der Standard-DNA-Form oder der B-Form ca. 90° (Blackburn, 1996; Knippers, 1997).

Haarnadel-Schleifen bilden sich bei der Rückfaltung von palindromischen RNA-Sequenzen

mit sich selbst. Die palindromen RNA-Sequenzen falten sich zu einem Stamm und schließen

so den offenen Loop-Bereich ab. Sie sind weit verbreitet und stehen oft in einem

regulatorischen Kontext. Die Stabilität einer Haarnadel-Schleife ist von der Schleifen-Größe,

der Schleifen-Sequenz und dem abschließenden kanonischen Basenpaar abhängig. Die 5´-

CUUCGG-3´ Tetranukleotid-Schleife (ungepaarte Nukleotide sind unterstrichen) besitzt eine

ausgesprochen hohe thermische Stabilität (Tuerk et al., 1988).

Als Ausbuchtungen werden Schleifen bezeichnet, die nur in einem Strang ein oder mehrere

ungepaarte Nukleotide enthalten. Diese sind oft für Proteinbindung (mit-) verantwortlich und

tragen zur Tertiärstrukturausbildung bei (Bloomfield, 2000).

Interne Schleifen entstehen, wenn die RNA-Helix durch das Fehlen von Basenpaarungen

unterbrochen wird. Je größer die Schleife, desto stärker wird die gefaltete RNA destabilisiert

(Weeks et al., 1993). Ursprünglich wurden alle Bereiche als „interne Schleife“ bezeichnet und

als ungepaart eingestuft, die bei Sekundärstruktur-Vorhersagen nicht-Watson-Crick-

Basenpaare ergaben. Mittlerweile sind viele nicht-Watson-Crick-Basenpaarungen

nachgewiesen.

Kreuzen drei oder mehrere Helices, so entstehen sich mehrfach verzweigende Schleifen oder

Verzweigungen. Der Begriff Schleife ist an dieser Stelle etwas irreführend, da diese

Strukturen auch ohne ungepaarte Nukleotide existieren können (Bloomfield, 2000).

Der RNA-Pseudoknoten ist trotz seines einfachen Aufbaus komplexer gestaltet als die oben

genannten Sekundärstrukturelemente und läßt sich als Übergang zur Tertiärstruktur sehen. Er

ist ein weit verbreitetes und funktionell wichtiges Motiv in viraler, zellulärer, ribosomaler und

nuklearer RNA. Die einfachste Form ist der Haarnadel-Typ. Hier bilden Nukleotide innerhalb

einer Schleife Basenpaarungen mit einer benachbarten, komplementären Region außerhalb

der Stamm-Schleifen Struktur aus. Ein Pseudoknoten besteht immer aus mindestens zwei

Stammregionen und zwei Schleifen (Deiman et al., 1997).

Die genannten Sekundärstruktur-Elemente sind sehr einfach aufgebaut, reichen aber für sich

alleine nicht aus, damit die RNA ihre katalytische Funktion erfüllen kann. Erst aus der

Kombination dieser Elemente entstehen die hochkomplexen und biologisch aktiven

Tertiärstrukturen. Beim Übergang von der Sekundär- zur Tertiärstruktur kommt es zu neuen

Einleitung 9

intramolekularen Verknüpfungen und Wechselwirkungen zwischen oftmals weit voneinander

entfernten doppelsträngigen und hochkomplexen nicht-helicalen Bereichen. Daran sind

Basenstapelungs- und Baseninterkalationseffekte, sowie sekundäre und tertiäre H-

Brückenbindungen beteiligt. Nicht-Watson-Crick-Basenpaarungen können Verwindungen in

der Nukleotidkette erzeugen und damit den Zugriff auf blockierte Positionen freigeben und

auch den Zugang zur großen und kleinen Furche doppelsträngiger RNA modifizieren. Mg2+-

Ionen erzeugen essentielle elektrostatische Wechselwirkungen mit dem Ribose-Phosphat

Rückgrat der RNA und bewirken dadurch eine strukturelle Stabilisierung der RNA.

2.2 RNA-Aptamere

Aptamere sind Nukleinsäuremoleküle, die mit hoher Affinität und Spezifität niedermolekulare

Liganden binden. Diese können Antibiotika, Peptide, Proteine, Metabolite oder organische

Moleküle sein (Burgstaller et al., 1995; Ellington et al., 1990; Geiger et al., 1996; Schurer et

al., 2001; Wallace et al., 1998). Ein Aptamer ist typischerweise eine 15-60 Nukleotide lange

Sequenz, welche eine Bindetasche ausformt, die es ermöglicht, den Liganden fest zu

umschließen.

2.3 Selektion von Aptameren mittels SELEX

Aptamere werden in einem SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential

enrichment) genannten Verfahren gezielt hergestellt, um einen gewünschten Liganden zu

binden (Ellington & Szostak, 1990; Tuerk et al., 1990). Ausgehend von einer Sammlung

randomisierter Doppelstrang-DNA von 1014 – 1015 unterschiedlichen Sequenzen wird durch

in vitro Transkription RNA von der gleichen Variabilität synthetisiert. Anschließend erfolgt

eine gezielte Selektion auf diese Kandidaten mittels Affinitätschromatografie. Die an den

Liganden gebundene RNA wird von der Affinitätschromatografie-Säule eluiert und mittels

reverser Transkription und anschließender PCR-Amplifikation angereichert. Dieser Zyklus

wird 5 – 15 mal wiederholt. Auf diese Weise erhält man hochaffine RNA-Moleküle, welche

beinahe jeden gewünschten Liganden binden. Mittlerweile wird dieses Verfahren

kommerziell und automatisiert angewendet. Die online Datenbank „Aptamer Database“ (Lee

et al., 2004) enthält ca 3500 veröffentlichte Aptamere. Das Ligandenspektrum reicht dabei

von niedermolekularen Effektoren wie ATP (Sassanfar et al., 1993), Tryptohan (Famulok et

al., 1992), Theophyllin (Jenison et al., 1994), Arginin (Geiger et al., 1996) und Farbstoffen

(Werstuck et al., 1998) bis hin zu Makromolekülen, wie Proteinen (Tuerk & Gold, 1990),

Viren (Pan et al., 1995) und Einzellern (Homann et al., 1999).

Einleitung 10

2.4 Spezifität und Affinität von RNA-Aptameren

Künstlich selektionierte RNA-Aptamere können ihren Liganden mit hoher Spezifität und

Affinität binden. Die hohe Spezifität zeigt sich u. a. darin, dass Aptamere zwischen

Effektormolekülen diskriminieren können, die sich nur minimal voneinander unterscheiden.

Das Arginin-bindende RNA-Aptamer z.B. ist hoch enantioselektiv (Geiger et al., 1996). Es

bindet mit einer Gleichgewichts-Dissoziationskonstante von 330 nM das L-Enantiomer 12000

mal besser als D-Arginin.

Das Theophyllin-bindende Aptamer mit einer Länge von 38 Nukleotiden trägt ein 15

Nukleotide großes Bindemotiv, welches von einem Stamm und einer Stamm-Schleifen

Struktur eingerahmt wird (Jenison et al., 1994). Der Ligand Theophyllin wird mit einem KD

von 0,32 µM gebunden. Dem Theophyllin strukturell sehr ähnliche Stoffe zeigen ein bis zu

10000 fach schlechteres Bindungsverhalten. Koffein z.B. unterscheidet sich nur in einer

funktionellen Gruppe (N7- Methyl in Koffein und N7- H in Theophyllin) vom Theophyllin,

wird aber um den Faktor 10000 schlechter gebunden. NMR Untersuchungen am Komplex

ergaben, dass der Ligand Theophyllin in einer Bindetasche sitzt und sowohl über

Wasserstoffbrückenbindungen als auch mittels elektrostatischer Wechselwirkung fixiert wird.

Die Bindung von Theophyllin an das Aptamer verursacht deutliche strukturelle Änderungen

an der RNA. Entweder werden zusätzliche, in der freien RNA nicht vorhandene

Basenpaarungen ausgebildet, oder das Aptamer besitzt in Abwesenheit des Liganden eine

gewisse Dynamik, so dass durch das Theophyllin die für die Komplexbildung günstige

Konformation erst selektioniert wird (Jenison et al., 1994).

Zusätzlich wurde gezeigt, dass Koffein nicht im Kern des Aptamers (in der Theophyllin

Bindetasche) gebunden wird, sondern aufgrund von Basenstapelungseffekten mit der

terminalen Helix wechselwirkt (Zimmermann et al., 2000). Dies demonstriert deutlich die

hohe Ligandspezifität eines RNA-Aptamers.

2.5 Anwendung von Aptameren

Die Fähigkeit einen Liganden hochaffin und –selektiv zu binden, eröffnet für diese

molekularen Werkzeuge viele Anwendungsmöglichkeiten in der Diagnostik, in der Medizin

und der Forschung.

2.5.1 Aptamere als Werkzeuge in der Diagnostik

Aptamere treten immer stärker in Konkurrenz zu den klassischen Antikörpern, da sie einige

herausragende Eigenschaften besitzen, welche sie zu einer echten Alternative machen.

Einleitung 11

Aufgrund ihrer Größe und Oberflächenbeschaffenheit können Aptamere viel mehr Bindungen

mit ihrer Zielsubstanz eingehen als beispielsweise ein kleineres (bio-) chemisches Molekül.

Viele Aptamere erreichen KD Werte, die denen der Antigen-bindenden Fragmente von

Antikörpern ähneln (Gold et al., 1995).

In einem ultrasensitiven Detektionssystem für das Proteinhomodimer PDGF-BB wurden zwei

DNA-Aptamere eingesetzt, welche einen 5´- bzw. einen 3´-Überhang aus je 40 Nukleotiden

tragen (Fredriksson et al., 2002). Wenn diese Aptamere an ihr Zielprotein binden, nähern sich

die freien Nukleotidüberhänge einander an und können nach Anlagerung eines

Verbindungsoligonukleotids miteinander ligiert werden. Dieser Verbund kann anschließend

quantifiziert werden, wodurch der Nachweis von zeptomolaren Proteinmengen möglich ist.

Zum Methodenspektrum der in vivo Diagnostik zählen auch bildgebende Verfahren, bei

denen Radionuklid beladene Antikörper z.B. gegen Krebszellen eingesetzt werden. Während

die Antikörper mehrere Tage benötigen, um ein brauchbares Verhältnis von Signal zu

Rauschen zu erzeugen, wird dies von Tumor spezifischen Aptameren innerhalb mehrerer

Stunden erreicht (Hicke et al., 2000).

2.5.2 Aptamere als Bestandteil von hochempfindlichen Biosensoren für Toxine

Aptamere sind auch für den Einsatz in hochempfindlichen Biosensoren geeignet, da sie in der

Lage sind, eine große Bandbreite von Zielmolekülen, wie Proteine, Metabolite, Aminosäuren

und Nukleotide spezifisch zu erkennen. Im Gegensatz zu auf Antikörper basierenden

Biosensoren können Aptamere auch schwer zugängliche Moleküle wie Gifte oder nicht

immunogene Stoffe binden und somit nachweisen. Ein weiterer Vorteil von Aptameren ist die

Tatsache, dass ein bereits selektioniertes Aptamer beliebig oft und in gleich bleibender

Qualität neu synthetisiert werden kann. Dies ist bei der Herstellung von Antikörpern nicht

immer möglich. Mittlerweile existieren auf Aptameren basierende Biosensoren für Stoffe wie

das Choleratoxin und das Entereotoxin B aus Staphylokokken (Bruno et al., 2002).

2.5.3 Aptamere in der medizinisch-therapeutischen Anwendung

Ein Ansatz zur Bekämpfung viraler Infektionen ist die Inhibierung der viralen Vermehrung.

Da ein Virus zur Selbstreplikation auf den proteinbiochemischen Apparat des Wirtes

angewiesen ist, kann diese durch die gezielte Hemmung von essentiellen Protein-RNA

Interaktionen unterdrückt werden. Viele Viren, darunter auch das HI-Virus, rekrutieren über

die TAR (Trans-Acting Responsive element) und RRE (Rev Responsive Element) RNA-

Sequenzen die für die virale Vermehrung essentiellen Proteine Tat und Rev. Zur

Unterdrückung der viralen Replikation wurde erfolgreich Aptamer-RNA eingesetzt, die mit

Einleitung 12

der viralen TAR-RNA um den Liganden Tat konkurriert und dieser somit nicht rekrutiert

werden kann. Auf diese Weise wird die Transkription von HIV-RNA verhindert und die

Vermehrung des Virus reduziert (Kohn et al., 1999).

In einem gentherapeutischen Ansatz zur Bekämpfung von Krebs und Infektionskrankheiten

wie HIV wird mit auf Ribozymen basierenden Aptameren gearbeitet. In klinischen Studien

der Phasen I und II werden trans-aktive Aptamerribozyme eingesetzt, welche pathogene

mRNA erkennen und durch Restriktion zerstören. In klinischen Studien wurden diese RNA-

Medikamente den Patienten direkt als synthetisches Ribozym verabreicht. Alternativ wurden

retrovirale Vektoren verwendet, um entsprechende Expressionskassetten für anti-HIV

Aptamerribozyme ex vivo in Lymphozyten oder an der Blutbildung beteiligten Zellen zu

integrieren. Diese transduzierten Zellen wurden den Patienten anschließend reinjiziert. Diese

Methode wird von den Patienten gut toleriert und die veränderten Zellen sind etwa ein Jahr

lang im Körper nachweisbar (Amado et al., 1999; Bauer et al., 1997; Wong-Staal et al.,

1998).

Unter Umständen kann es sinnvoll sein, eine defekte mRNA zu reparieren. Die ersten Ansätze

dazu fokussierten auf trans spleissende Gruppe I Ribozyme. Das Ribozym lagert sich mit der

Aptamerdomäne an die mutierte/defekte mRNA an und positioniert eine korrekte

Exonsequenz an der Mutation. Durch die autokatalytisch ablaufende in trans Spleissreaktion

wird das defekte mRNA Fragment ersetzt. Damit konnten in Bakterien und Säugetierzellen

erfolgreich defekte lacZ Transkripte repariert werden (Jones et al., 1996; Sullenger et al.,

1994).

2.5.4 Chemische Modifikation von Aptamer-RNA zum Schutz vor Degradation

Da die Halbwertszeit von RNA im Blut nur wenige Sekunden beträgt, wurde mit Hilfe von

chemischen Modifikationen die Resistenz von RNA gegenüber Nukleasen erhöht. 5´-

Phosphothioatnukleotide bilden die erste Generation chemisch modifizierter Nukleotide. Sie

erhöhen die Halbwertszeit von RNA gegen Nukleasen im Serum auf über 48 h und sind nicht

giftig. Eine Weiterentwicklung stellt die 2´-Ortho-Alkyl-Phosphothioat RNA dar, die sehr

erfolgreich als Grundstruktur von Antisense RNA eingesetzt wird. Weitere Modifikationen,

die das RNA-Rückgrat betreffen, sind die Peptid-Nukleinsäure (Peptide Nucleic Acid: PNA)

von Peter Nielsen, die 2´-Ortho-Methoxyeythyl RNA, die Morpholino Nukleinsäure (Gene

Tools Inc.) und die geschlossenen Nukleinsäuren (Locked Nucleic Acid: LNA). Im Falle von

PNA sind die Nukleobasen über ein δ-Aminosäurenrückgrat verknüpft, bei den Morpholino

Nukleinsäuren besteht das RNA Rückgrat aus Phosphoramiden. Bei den LNA Nukleinsäuren

wird die Ribose über eine 2'-O-4'-C Methylbrücke in der C3-Endo Form arretiert, wodurch

Einleitung 13

sich neben der besseren Stabilität eine erhöhte Bereitschaft zur Hybridisierung mit

komplementärer RNA ergibt. Alle Modifikationen vermitteln Resistenz gegen endogene

Enzyme wie RNAse H und eignen sich daher zur Herstellung von Werkzeugverbindungen aus

Nukleinsäuren. Weitere bekannte Substituenten für die 2´-OH Gruppe in der Ribose sind z.B.

die 2´-Amino und 2´-Fluoro Gruppen, sowie das 2´-C-Allyl (Beigelman et al., 1995;

Darfeuille et al., 2002; King, 2002; Pieken et al., 1991). Befindet sich am 3´-Terminus der

RNA ein 3´-3´verbundenes Nukleotid, so erhöht dies ebenfalls die Halbwertsdauer von RNA

im Blut (Beigelman et al., 1995).

2.6 Genexpression in Eukaryoten

Die in der DNA-Sequenz gespeicherten Informationen zur Synthese von Proteinen werden

von einem lebenden Organismus zu unterschiedlichen Zeiten in verschiedenen Mengen

benötigt. Bei Eukaryoten verläuft die Genexpression in zwei Stufen ab, die nicht nur zeitlich

sondern auch räumlich getrennt sind. Die Transkription der RNA findet im Zellkern statt,

wohingegen die Translationsmaschinerie für die Proteinbiosynthese im Zytoplasma lokalisiert

ist. Transkription und Translation ist jedoch gemeinsam, dass sie an unterschiedlichen

Punkten im Ablauf regulierbar sind.

2.6.1 Transkription und Prozessierung der prä-mRNA

Die Kontrolle über die Expression eines bestimmten Genabschnitts beginnt bereits auf DNA-

Ebene. Nur wenn der entsprechende chromosomale DNA-Abschnitt für die Transkriptions-

maschinerie zugänglich, das heisst entpackt ist, kann über kontrollierte Initiation der

Transkription die RNA-Synthese beginnen. Der unmittelbare Bereich um die Startstelle der

Transkription wird als Promotor bezeichnet und ist durch die TATA-Box determiniert, die

sich etwa 30 Nukleotide stromaufwärts befindet. Das RNA-Polymerase II (RNAP II)

Holoenzym besteht aus mindestens 12 Untereinheiten plus den generellen Transkriptions-

faktoren. Für eine erfolgreiche Transkription ist es essentiell, dass das Holoenzym an den

Promotor herangeführt und stabil gebunden wird. Dieser Prozess wird durch die

Wechselwirkung mit dem TATA-Box bindenden Protein und dem Transkriptionsfaktor (TF)

TFIIB ermöglicht. Eukaryotische Gene können der Kontrolle von mehreren distalen und

proximalen regulatorischen Elementen wie den „enhancern“ und „silencern“ unterliegen

welche letztendlich die Menge an neu synthetisierter RNA regulieren. An diese Elemente

binden die sogenannten trans-Faktoren, welche die Prozessifität der RNAP II und damit auch

die Transkription Zelltyp- und Zellzyklus spezifisch regulieren. Intra- und extrazelluläre

Signale werden über Signalkaskaden weitergeleitet und steuern auf diese Weise die Aktivität

Einleitung 14

der TF. Die Beendigung der Transkription wird durch Terminationsregionen vermittelt. Diese

befinden sich häufig bis zu 1000 Nukleotide unterhalb der Erkennungsregion für die

Polyadenylierung von neusynthetisierter RNA.

Noch während der Transkription beginnt die Prozessierung der RNA (Proudfoot et al., 2002).

An das 5´-Ende wird eine 7-Methyl-Guanosin Kappe angeheftet, die zusätzlich durch

Methylierung modifiziert werden kann. Die unterschiedlichen 7-Methyl-Guanosin Kappen

spielen beim Spleissen, beim Export aus dem Zellkern und bei der Translation eine wichtige

Rolle und schützen die RNA vor Abbau (Sachs et al., 1997). Durch den Spleissvorgang

werden die nichtkodierenden Introns entfernt. An diesem nukleären Prozess sind Proteine und

kleine RNA-Moleküle beteiligt, die die hochkonservierten Sequenzen (5´-Spleissstelle,

Verzweigungspunkt und 3´-Spleissstelle) an den Exon-Intron Grenzen erkennen, spalten und

die Exongrenzen miteinander neu verbinden. Das 3´-Ende der RNA wird bei Eukaryoten

ebenfalls prozessiert. Vor der Polyadenylierung des 3´-Endes wird durch eine Nuklease ein

geeignetes 3´-Ende erzeugt. Durch das Enzym Poly(A)-Polymerase wird dann unter ATP-

Verbrauch eine ca. 100 – 200 Nukleotide lange Polyadenylsäure angeheftet, wodurch die

Stabilität der RNA erhöht wird. Nachdem die fertige mRNA aus dem Zellkern ausgeschleust

wurde, steht sie zur Translation am Ribosom zur Verfügung.

2.6.2 Aufbau der eukaryotischen mRNA

Nach Prozessierung der prä-mRNA und deren Ausschleusung aus dem Zellkern steht die reife

mRNA (Abbildung 2.2) zur Translation am Ribosom bereit. Die reife mRNA wird von einer

5´-m7G-Kappe und dem Poly(A)-Schwanz begrenzt. Die nichttranslatierten Bereiche

stromauf- und –abwärts des offenen Leserahmens (ORF) werden als 5´- und 3´-

untranslatierte Region (UTR) bezeichnet. Diese Regionen spielen eine wichtige Rolle bei der

5´- m7G AUG STOP Poly(A)

5´- UTR offener Leserahmen 3´-UTR

Abbildung 2.2

7-Methyl-Guanosin-Kappe (m7G-cap) am 5´-Ende und Poly(A)-Sequenz am 3´-Ende begrenzen die eukaryotische mRNA. In der 5´ und 3´untranslatierten Region (UTR) befinden sich nichtkodierende Sequenzen. Der offene Leserahmen (ORF) enthält die Protein kodierende Information und beginnt mit dem Startkodon AUG und endet an einem STOP Kodon.

Einleitung 15

Translation und deren Regulation, da sie Bindestellen für Regulatorproteine, wie das HuR-

Protein zur Regulation der Translation der Typ I Insulin ähnlichen Wachstumsfaktor Rezeptor

(IGF-IR) mRNA enthalten können (Meng et al., 2005).

In den UTRs können auch destabilisierende Elemente wie die AUUUA Sequenz, die die

Lebensdauer der mRNA beeinflussen, lokalisiert sein (Aharon et al., 1993). Die

Selenocystein Insertionssequenz (SECIS) z.B. ist bei Eukaryoten im 3´-UTR lokalisiert. Sie

ermöglicht die Translation der UGA Kodons im Leseraster eines Selenoproteins als

Selenocystein.

2.6.3 Initiation der Translation von eukaryotischer mRNA

Initiation, Elongation und Termination sind die drei Hauptschritte der Translation. Für

gewöhnlich ist die Gesamtsyntheserate eines Proteins von der Initiation der Translation

abhängig (Marcus, 1970). Meistens erfolgt die Initiation an der 5´-m7G-Kappe. Die 40S-

Untereinheit des Ribosoms verbindet sich mit den eukaryotischen Initiationsfaktoren (eIF) 3

und 4C und bildet den 43S-Komplex. Weitere eIF bereiten die mRNA auf die Bindung des

43S-Komplexes an die 5´-m7G-Kappe vor. Dieser sucht anschließend die mRNA in 5´-3´

Richtung nach dem ersten AUG-Kodon ab (scanning). Das initiale AUG wird vom 43S-

Ribosom mit Hilfe des ternären Komplexes (eIF2, GTP, Methionin und Methionin-tRNA)

durch Basenpaarung erkannt, worauf sich der ribosomale 48S-Komplex ausbildet. Die

Faktoren eIF5 und eIF5B bewirken die Hydrolyse von GTP, worauf der eIF2-GDP Komplex

und alle anderen gebundenen Faktoren das 48S-Ribosom verlassen. Die 60S-Untereinheit

kann sich nun mit dem 48S-Komplex zum vollständigen 80S-Ribosom verbinden und die

Synthese der Peptidkette beginnt.

2.6.4 Alternative Möglichkeiten zur Initiation der Translation

Bei Eukaryoten beginnt die Translation für gewöhnlich am ersten AUG Start-Kodon. Wenn

sich jedoch das erste AUG-Kodon in einem suboptimalen Kontext befindet, kann das

Ribosom auch an einem alternativen Start-Kodon mit der Translation beginnen. Dieser

Vorgang wird als lückenhafte Abtastung (leaky scanning) bezeichnet (Kozak, 1999).

Ein weiterer alternativer Mechanismus ist die Reinitiation der Translation. Wenn dem

initialen Start-Kodon nach wenigen Nukleotiden ein Stop-Kodon folgt, kann das

posttranslationale Ribosom die mRNA weiter in 3´-Richtung abtasten, bis es an einem

nachfolgenden Start-Kodon reinitiiern kann. Zuvor muss das abtastende Ribosom jedoch

wieder von eIF2 mit Met-tRNA beladen werden. Die Reinitiationsrate steigt mit der

Einleitung 16

Entfernung zum 5´-ORF (uORF: upstream ORF) und nimmt mit zunehmender Größe des

uORFS ab (Kozak, 1987; Kozak, 2001).

Nach Termination der Translation kann das Ribosom große Teile der mRNA überspringen

und an einem nachfolgenden AUG-Kodon neu initiieren. Dieses Überpringen (engl. shunting)

von Sequenzbereichen auf der mRNA wurde für die Translation verschiedener viraler RNA

wie z.B. von Cauliflower Mosaic Virus RNA beschrieben (Futterer et al., 1993).

Interne Ribosomen Eintrittsstellen (IRES) ermöglichen dem Ribosom, cap-unabhängig mit

der Translation zu beginnen. Die IRES Sequenzen sind 300 bis 800 Nukleotide lang und

wurden im 5´-UTR von viraler RNA gefunden. Es existieren unterschiedliche Typen von

IRES-Elementen, die sich in ihrem Bedarf an Initiationsfaktoren unterscheiden. Das Hepatitis

A Virus IRES benötigt zur internen Initiation intaktes eIF4G und eIF4E, wohingegen das in

Cricket Paralysis Virus RNA vorkommende IRES zur Initiation der Translation keine

weiteren Faktoren oder Met-tRNA benötigt (Borman et al., 2001; Wilson et al., 2000).

2.7 Regulation der Translation

Von etwa 10% aller eukaryotischen Gene wird die Expression translationell reguliert

(Mathews et al., 2000). Die Regulation der Translation erlaubt es dem Organismus, sehr

schnell auf äußere Einflüsse zu reagieren und die Proteinexpression anzupassen. Dies

geschieht bei Eukaryoten fast ausschließlich durch Regulation des Initiationsereignisses. Die

benötigten Initiationsfaktoren können durch gezielte Phosphorylierung inaktiviert werden,

wodurch die Proteinbiosynthese zum Erliegen kommt. Dieser Weg der Regulation benötigt

jedoch das Mitwirken von ein oder mehreren Proteinfaktoren und ist daher für konditionelle

Regulationssysteme weniger geeignet.

2.7.1 Regulation der Translation durch Riboswitche

Riboswitche sind komplex gefaltete RNA-Domänen, die sich im nicht kodierenden Bereich

von zahlreichen mRNAs befinden. Sie dienen als Rezeptor für Metabolite und kontrollieren

die Genexpression. Die meisten Riboswitche bestehen aus einer Aptamer-Domäne, die für die

Liganden-Bindung verantwortlich ist und aus einer Expressionsplattform, anhand derer die

Expression des Strukturgens kontrolliert wird (Ellington & Szostak, 1990; Lee et al., 2004).

Die Bindung des jeweiligen Liganden verursacht eine strukturelle Veränderung am

Riboswitch, welche letztendlich die Expression des Strukturgens beeinflusst. Die am

häufigsten durch Riboswitche kontrollierten Gene kodieren für Proteine, welche an der

Biosynthese oder dem Transport des jeweiligen Metaboliten beteiligt sind, der von der

Aptamer-Domäne gebunden wird (Mandal et al., 2004a). Meistens arbeitet der Riboswitch als

Einleitung 17

eine Art Rückkopplungsinhibitor, da die Bindung des Metaboliten an den Riboswitch die

Expression des Genproduktes reprimiert, welches zur Herstellung des Metaboliten benötigt

wird. In den meisten Fällen wird die Repression entweder durch Termination der

Transkription oder durch Unterbindung der Translations-Initiation erreicht (Gusarov et al.,

1999; Nudler et al., 2003; Winkler et al., 2002a; Winkler et al., 2002b). Abbildung 2.3 zeigt

die beiden beschriebenen Möglichkeiten.

Abbildung 2.3

Mechanismen der Genkontrolle durch Riboswitche. Kontrolle der Transkription durch Bindung eines Metaboliten worauf es zur Umfaltung der Aptamer-Domäne und damit zur Ausbildung einer Terminator-Struktur kommt. Im Gegensatz dazu erfolgt die Regulation der Translation durch eine Metabolit-induzierte strukturelle Änderung, aufgrund deren die Ribosomenbindestelle (RBS) maskiert wird (Tucker et al., 2005).

In Prokaryoten wurden zahlreiche Riboswitche gefunden. Das ribD Gen in Bacillus subtilis

steht unter Kontrolle des RFN Elements, welches einen FMN-abhängigen Riboswitch darstellt

(Gelfand et al., 1999; Vitreschak et al., 2002). In Abwesenheit von FMN bildet sich der

Antiterminator aus und die Transkription von ribD findet statt. Kommt es aber zur

Komplexbildung aus Riboswitch und FMN, so wird eine Terminatorstruktur ausgebildet,

worauf die Transkription von ribD abbricht (Winkler et al., 2003). In Escherichia coli ist der

TPP-Riboswitch des thiM Gens dafür verantworlich, dass es in Anwesenheit des Liganden zu

einer alternativen Basenpaarung kommt, wodurch die Shine-Dalgarno Sequenz blockiert wird

(Winkler et al., 2002a).

Eine sehr seltene Form von Riboswitchen sind die sogenannten „An“-Schalter. Der erste

beschriebene Riboswitch dieser Art ist ein Adenin-bindender Riboswitch und strukturell dem

Guanin-bindenden Riboswitch sehr ähnlich (Johansen et al., 2003; Mandal et al., 2003;

Mandal et al., 2004b). In Abwesenheit des Liganden Adenin wird die Genexpression durch

Ausbildung einer Terminator-Struktur unterbunden. Erst wenn Adenin an das Aptamer

Einleitung 18

gebunden hat und die Konformationsänderung des Riboswitches die Ausbildung des

Antiterminatores ermöglicht, kommt es zur Transkription einer vollständigen mRNA (Mandal

und Breaker, 2004).

Ein weiterer Riboswitch, der als „An“ -Schalter fungiert, ist der Glycin-abhängige Riboswitch

(Mandal et al., 2004c). Das Bemerkenswerte an diesem Riboswitch ist zum einen sein Aufbau

aus zwei in Tandem geschalteten Aptmer-Domänen, die jeweils ein Molekül Ligand binden.

Zum anderen erfolgt die Glycin-Bindung durch die zwei Aptamere kooperativ. Die Bindung

von Glycin an die eine Aptamer-Domäne erhöht die Affinität der zweiten Bindestelle um den

Faktor 1000. Glycin-Riboswitche reagieren somit hochsensitiv und sehr schnell auf kleinste

Konzentrationsänderungen des Liganden.

Bei der Familie der Glucosamin-6-Phosphat (GlcN6p) Riboswitche erfolgt die Kontrolle von

glmS durch induzierte autokatalytische Hydrolyse des Transkripts in Anwesenheit des

Liganden GlcN6p. Es wird vermutet, dass die Verkürzung des Transkripts aufgrund der

Autohydrolyse zu einer beschleunigten Degradation der mRNA durch RNasen führt (Tucker

& Breaker, 2005).

2.7.2 Regulation der Translation durch konditionelle Systeme

Um den Einfluss eines Genprodukts auf einen lebenden Organsismus zu untersuchen, war

man anfangs auf die Konstruktion einer Deletionsmutante (knock out Mutante) angewiesen.

Dies ist ein langwieriger und nicht immer erfolgreicher Prozess, insbesondere wenn die

Gendeletion einen lethalen Phänotyp verursacht. Andererseits kann die konstitutive

Expression eines zytotoxischen Proteins den Organismus ebenfalls schädigen. Zusätzlich ist

bei diploiden Organismen die Identifizierung eines rezessiven Phänotyps oft nur in der F2

Generation möglich. Daher wurden Methoden entwickelt, mit deren Hilfe es möglich ist, die

Expression eines Zielgens kontrolliert zu steuern.

Regulation durch Antisense RNA

Antisense RNA (asRNA) ist eine Möglichkeit zur Regulation der Proteinbiosynthese. Sie ist

einzelsträngig und bindet an die komplementäre Sequenz auf der Ziel mRNA. Der

entstandene doppelsträngige Bereich verhindert ein Ablesen durch das Ribosom und bewirkt

den Abbau der mRNA durch den RNA Interferenz (RNAi) Mechanismus. Bei der „Flavr

Savr“ Tomate wurde ein künstliches Gen eingebracht, welches bei Transkription asRNA

liefert, wodurch die Expression von am Reifungsprozess beteiligter Gene reduziert wird.

Einleitung 19

Regulation durch RNA Interferenz

RNAi ist ebenfalls ein Mechanismus, der zur Unterdrückung der Translation führt. RNAi

wurde erstmals in Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998) entdeckt und findet seither weit

verbreitet Anwendung bei der gezielten Inhibierung der Genexpression (Plasterk, 2002). Die

21 bis 23 Nukleotid langen RNAi Moleküle binden an die komplementären Bereiche der

mRNA. Der Proteinkomplex RISC (RNAi induced silencing complex) erkennt diese

doppelsträngigen Regionen und baut die RNA ab. Somit steht keine oder nur noch sehr wenig

mRNA zur Translation zur Verfügung (Elbashir et al., 2001; Fire et al., 1998; Tuschl, 2001).

Regulation durch Ribozyme/Aptazyme

Ribozyme oder RNA Enzyme haben katalytische Funktion. Sie sind in der Lage, entweder

sich selbst oder eine andere RNA zu spalten. Die Kombination eines Ribozyms mit einem

Aptamer ergibt ein sogenanntes Aptazym, welches durch die Bindung eines Liganden in den

aktiven oder inaktiven Zustand versetzt wird (Robertson et al., 1999; Silverman, 2003). Ein

Flavin Mononukleotid (FMN) sensitives Ribozym wurde aus der Verbindung der FMN-

Aptamerdomäne und dem Hammerhead-Ribozym durch ein Kommunikationsmodul erzeugt

(Soukup et al., 1999). Je nachdem welches Kommunikationsmodul gewählt wurde, kommt es

bei Bindung des Liganden zur Aktivierung oder Deaktivierung der Ribozymdomäne. Befindet

sich ein solches Aptazym auf der mRNA, so kann diese jederzeit durch Zugabe oder

Reduzierung des Liganden zerstört und damit die Translation beendet werden. Diese System

findet jedoch momentan nur in vitro Anwendung.

Einleitung 20

Regulation durch Aptamere / künstliche Riboswitche

In Saccharomyces cerevisiae wurde ein System zur post-transkriptionellen Genregulation

entwickelt, das auf dem Tetracyclin (Tc) -bindenden RNA-Aptamer cb32 (Abbildung 2.4)

basiert (Berens et al., 2001; Hanson et al., 2003; Suess et al., 2003).

UAGACC

CGC

GCG

U

AA

A A

AU

C

C

UU

UC

UU

A

CC

CCA

A

A

GGG

GGCC

CGG

A AA

A

AA

C C

A CCC

G

G

UU

A

A

691

10

40

50

60

20

30

UG C

A G GG UB1-2 L3

Abbildung 2.4

Sekundärstruktur des Tc-bindenden RNA Aptamers. Die Nummerierung beginnt bei 0 um die ursprüngliche Zählweise der Nukleotide beizubehalten, da ein zusätzliches GC Basenpaar zur in vitro Transkription eingefügt wurde.

Das Aptamer wurde in den 5´-UTR des Reportergens GFP (Grün fluoreszierendes Protein)

oder Luciferase inseriert und die Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden

Tetracyclin gemessen. Abbildung 2.5 zeigt ein Modell des Regulationssystems (Berens et al.,

2001; Hanson et al., 2003; Suess et al., 2003). Ausführliche Untersuchungen ergaben

positions- und strukturabhängige Änderungen der Fluoreszenz und somit der regulatorischen

Eigenschaften des Tc-Aptamers. Erfolgt die Insertion cap-proximal, kommt es zu einer

Inhibierung der Bindung des 43S-Präinitiationskomplexes an die cap-Struktur. Erfolgt die

Aptamer Insertion cap-distal nahe dem Startkodon, so wird der 43S-Präinitiationskomplex

am „scanning“ gehindert und das 80S Ribosom kann sich nicht ausbilden, was ebenfalls zur

Inhibierung der Translation führt. Im Falle der cap-proximalen Insertion wird eine 3-fache

und im Falle der cap-distalen Insertion eine 9-fache Repression des Reportergens erreicht. In

HeLa-Zellen konnte dieses System nicht zur Anwendung gebracht werden. Dies liegt

vermutlich daran, dass es bei der Translationsinitiation bei höheren und niedrigeren

Eukaryoten Unterschiede gibt. Bei in vitro Translationsversuchen mit Zellextrakt aus

Weizenkeimen wurde eine 3-fache Repression erreicht, womit bewiesen war, dass es

prinzipiell auch in höheren Eukaryoten funktioniert.

Einleitung 21

C)

B)

A)

Abbildung 2.5

System zur konditionalen Genexpression in Hefe basierend auf dem Tc-bindenden RNA Aptamer. Schematische Ansicht der mRNA des GFP-Gens. Der 5’-UTR ist durch eine schwarze Linie dargestellt, die „Cap site“ als schwarzer Kreis, die Fünfecke stellen den Liganden Tc dar, und das graue Rechteck den codierenden Bereich des GFP-Gens. (A) zeigt die Translation in Abwesenheit des Liganden. (B) zeigt, wie die Bindung des Liganden an ein cap-proximales Aptamer die Bindung der 43S-Ribosomen-Untereinheit verhindert. (C) zeigt, wie die Bindung des Liganden an ein cap-distales Aptamer das Scanning des Präinitiationskomplexes unterbricht.

2.8 Tetracyclin

Tetracyclin (Abbildung 2.6 (A)) ist der namensgebende Vertreter einer Antibiotika Familie,

welche seit den 1940er Jahren gegen ein breites Spektrum von Gram-negativen und Gram-

positiven Bakterien eingesetzt wird (Chopra et al., 2001; Chopra, 2002). Es ist ein flaches,

polycyclisches Molekül und ist aus vier C6-Ringen aufgebaut. Die antibiotische Funktion

beruht auf der Hemmung der Proteinbiosynthese.

Tc bindet an die ribosomale RNA der kleinen Untereinheit des Ribosoms.

Kristallisationsstudien zeigen mehrere Bindestellen für Tc an der 30S Untereinheit. Die

primäre Bindestelle (Abbildung 2.6 (B)) liegt zwischen Helix H31 und H34 der 16S rRNA,

nahe an der Aminoacyl-tRNA–Bindestelle (A-Site) des Ribosoms (Brodersen et al., 2000;

Pioletti et al., 2001). In Gegenwart von Tc erfolgt keine Stabilisierung der Bindung von

Einleitung 22

Aminoacyl-tRNA in der A-Site der 30S Untereinheit, womit die Proteinbiosynthese gehemmt

wird. Bisher sind sechs Tc-Bindestellen (Tet-1 bis Tet-6) bekannt, von denen sich fünf auf der

16S rRNA befinden. Alle Bindestellen sind strukturell unterschiedlich. Es ist bis heute nicht

bekannt, welche und wie viele Bindestellen für die Vermittlung der antibiotischen Funktion

von Tc benötigt werden und welche auf unspezifischer Bindung beruhen (Pioletti et al.,

2001). Untersuchungen von ribosomalen Schutzproteinen, welche Tc-Resistenz vermitteln,

legen jedoch nahe, dass zumindest die primäre Bindestelle Tet-1 eine wesentliche Rolle spielt

(Connell et al., 2003). Dies steht in Einklang mit Bindestudien, nach denen die Equilibrium-

Bindekonstante KD für Tet-1 im Bereich 1-20 µM liegt. Für die niedrigaffinen Bindestellen

wurden KD Werte im hohen µM bis hin zum niedrigen mM Bereich beschrieben (Nelson et

al., 2001).

OH O OH O

OH

OH

H3C OH

O

NH2

C

NH3C CH3A B

Abbildung 2.6

(A) Struktur von Tetracyclin; (B) Mögliche Wechselwirkungen zwischen Tc und der Tet-1 Bindestelle an der 16S RNA (Brodersen et al., 2000). Die Positionen der mit Tc wechselwirkenden 16S RNA Nukleotide sind angegeben. (C) Wechselwirkung von [tc-Mg]+ mit TetR(D); Die mit Tc wechselwirkenden Aminosäuren sind im Einbuchstabenkode und ihrer Aminosäureposition angegeben. Die Kontakte zu den einzelnen TetR(D) Monomeren sind in blau und grün dargestellt. Mg2+ ist als gelbe und die koordinierten Wassermoleküle als rote Kugeln dargestellt. Hydrophobe Wechselwirkungen sind als gestrichelte Balken, hydrophile Wechselwirkungen als gestrichelte Linien dargestellt (Henssler et al., 2004).

Die Tc-Bindetasche Tet-1 in der 16S RNA besteht aus einer irregulären kleinen Furche in

Helix 34 die von den Nukleotiden 1196-1200:1053-1056 gebildet wird, und den Nukleotiden

Einleitung 23

964-967 aus der Stammschleife von H31. Der Großteil der Kontakte besteht aus

Wasserstoffbrücken zwischen dem Ribose-Phosphat Rückgrat der RNA in H34 und der

hydrophilen Seite von Tc. Eine zusätzliche Wasserstoffbrücke besteht zwischen dem O2P von

Nukleotid G966 in H31. Die Bindetasche wird zur einen Seite durch die Basen an Position

1054 und 1196 begrenzt, welche aus der doppelhelikalen Strucktur von H34 ausgebeult sind

und elektrostische Wechselwirkungen mit Tc eingehen. Weitere wichtige Kontakte existieren

zwischen dem Mg2+ an der hydrophilen Seite von Tc und dem Saueratoff in der

Phosphatgruppe der Nukleotide G1197 und G1198.

An der Kristallstruktur von Tc im Komplex mit Tetracyclinrepressor der Klasse D (TetR(D))

ist ebenfalls zu sehen, dass Tc aus einer hydrophoben und einer hydrophilen Region

aufgebaut ist (Abbildung 2.6 (C)). Die hydrophoben Wechselwirkungen mit TetR(D) finden

hauptsächlich an den funktionellen Gruppen der Ringe C und D von Tc statt. Am gedrehten

Ring A kommt es überwiegend zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu TetR(D).

Zusätzliche hydrophile Kontakte werden direkt über das am Tc koordinierte Mg2+ und

indirekt über drei an diesem Mg2+ fixierte Wassermoleküle erzeugt. Das Mg2+ ist an der

selben Stelle lokalisiert wie im Komplex mit der Tet-1 Bindestelle der 16S RNA.

2.9 Zielstellung der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Bindungsverhalten der Aptamer-RNA an Tc zu

charakterisieren. Dazu sollte die Aptamer-RNA durch in vitro Transkription synthetisiert und

aufgereinigt werden und die Komplexbildung thermodynamisch und biochemisch untersucht

werden. Desweiteren sollte versucht werden, wichtige Kontakte zwischen Tc und Aptamer-

RNA zu identifizieren, um die Tc-Bindetasche näher beschreiben zu können. Dazu wurde der

Einfluss von Punktmutationen im Aptamer untersucht. Die Substratspezifität des Tc-

Aptamers wurde durch die Analyse des Bindungsverhaltens an Tc-Derivate getestet.

Der zweite Teilaspekt der Arbeit beinhaltete die gezielte Beeinflussung des Spleißprozesses.

Es sollte versucht werden, durch Maskierung von 5´-Spleißstelle oder Verzweigungspunkt

durch das Tc-Aptamer eine Tc-abhängige Regulation zu erreichen. Dazu wurde ein Protokoll

für das in vitro Spleißen mit Hilfe eines Hefe-Zellextrakts etabliert und Spleißexperimente

durchgeführt.

Material und Methoden 24

3 Material und Methoden

Materialien: Chemikalien, Hilfsmittel, Geräte, Apparaturen, kommerziell erhältliche

Systeme und Programme sind im Anhang aufgeführt.

3.1 Bakterien- und Hefestämme, Plasmide und Oligonukleotide

3.1.1 Bakterien- und Hefestämme

Tabelle 3.1 Bakterien- und Hefestämme

Stamm relevanter Genotyp Referenz

Escherichia coli

DH5α recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17rK- mK+

relA1 supE44 Φ80∆lacZ∆M15 ∆(lacZYA-

argF)U169

(Sambrook et al., 1989)

BL21(DE3) F- lon ompT rBmB hsdS gal (cIts857 ind1 Sam7

nin5 lacUV5-T7 gene1)

(Sambrook et al., 1989)

Saccharomyces cerevisiae

RS453 MATa ADE2-1 TRP1-1 CAN1-100 LEU2-3

Leu2-112 HIS3-1 URA 3-52

(Sauer et al., 1993)

BJ2168 MATa LEU 2 TRP1 URA3-52 PRB1-1122

PEP4-3 PRCL-407 GAL2

(Ohashi et al., 1994)


3.1.2 Plasmide

Tabelle 3.2 Plasmide

Plasmid Marker Referenz

pAE1219 AmpR, Überexpressionsvektor für T7-RNA Polymerase in

E. coli BL21(DE3)

Görlach, Jena

pSP6 Actin AmpR, enthält SP6-Promotor zur in vitro Transkription des

Hefe Actin Mini-Intron Konstrukts für in vitro Spleißen

Fabrizzio, Göttingen

pSP64 ApR, 2999 bp, ori pMB1, SP6 Promotor zur in vitro

Transkription; relevante singuläre Schnittstellen HindIII,

EcoRI

Promega, 1992

NCBI Genbank

X65327

pSP64 T7 Aktin basiert auf pSP64, trägt das Hefe Aktin Mini-Intron

Konstrukt aus pSP6 Actin für in vitro Spleißen

diese Arbeit

pSP64 Tc-Aptamer basiert auf pSP64; enthält T7-Promotor zur in vitro

Transkription von Tc-Aptamer RNA als Hammerhead-

Ribozym Fusions-RNA

diese Arbeit

pSP64 Tc-Aptamer X basiert auf pSP64 Tc-Aptamer mit Mut. X im Tc-Aptamer;

(X= A8G, A9G, A13U, A50U, A55G)

diese Arbeit

pSP64 Tc-Minimer basiert auf pSP64; enthält T7-Promotor zur in vitro

Transkription von Tc-Minimer RNA als Hammerhead-

Ribozym Fusions-RNA

diese Arbeit

pSP64 Tc-Minimer

A55U

basiert auf pSP64 Tc-Minimer mit Mutation A55U im Tc-

Minimer

diese Arbeit

pWHE601 AmpR, 2µ-ori, gfp+, URA3, pADH, AflII, NheI (Suess et al., 2003)

pWHE601 AN32 X basiert auf pWHE601 AN32 mit der im Aptamer

integrierten 5´-SS bzw. bp; (X= S1a, S1b, S2, S3, S4, S5,

S6)

diese Arbeit

pWHE601 AN32 ApR, 2µ-ori, gfp+, URA3, pADH, AflII, NheI

enthält cb32 vor gfp

(Suess et al., 2003)


3.1.3 Oligonukleotide

Die Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech, Ebersberg, bezogen.

Tabelle 3.3 Oligonukleotide

Primer 5´--3´Sequenz

AP1_pSP64 TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA CAA G

AptC1_F AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GCT A

AptC1_R AGC TTA GCT GGT ATG TTT TAG GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA G

AptC2_F AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CTG GAG AGG TGA AGA ATA CGA

CCA CCT AGG CTC A

AptC2_R AGC TTG AGC CTA GGT GGT CGT ATT CTT CAC CTC TCC AGC CTA TAG TGA

GTC GTA TTA G

b1 CCT CTC CAG ATT AAA GCG CGG GTG GCG ATC TGG TAT GTT TTA GGC CCT

ATA GTG AGT CGT ATT AG

b2 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GAT CGC

CAC CCG CGC TTT AA

C_Xho-Linker_rev TAC GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTA AAA CAT ACT CGA GTG

AAA GCT CGA GAG AGG TGA AGA ATA CGA CCA CC

c1 CCT CTC CAG ACT TTC ATC TGG TAT GTT TTA GGC CCT ATA GTG AGT CGT

ATT AG

c2 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GAT GAA AG

c3 CTA GAG CCT AGG TGG TCG TAT TCT TCA

c3_1 CTA GAG CCT AGG TGG TCG AAT TCT TCA

c4 TCT GGA GAG GTG AAG AAT ACG ACC ACC TAG GCT

c4_1 TCT GGA GAG GTG AAG AAT TCG ACC ACC TAG GCT

d1 CCT CTC CAG AGC ATA GAC TTT CAT CCT TAG CTC TGG TAT GTT TTA GGC

CCT ATA GTG AGT CGT ATT AG

d2 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GAG CTA

AGG ATG AAA GTC TAT GC

GFP-Rev CAA GAA TTG GGA CAA CTC C

hh1 AGC TTC TAG GCT TTC GTC CTC ACG GAC TCA TCA GTA GAG TCA CCT

hh2 CTA GAG GTG ACT CTA CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAG CCT AGA


InsHT7SE_forw AGC TTT AAT ACG ACT CAC TAT AGT CGA CGC TGC CG

InsHT7SE_rev AAT TCG GCA GCG TCG ACT ATA GTG AGT CGT ATT AA

K7F1: TCG AGA GATTTC TCT TTT ACC TTT TTT TAC TAT TTT TCA CTC TCC CAT

AAC CTC CTA TAT TGA CTG ATC

K7F2: TGT AAT AAC CAC GAT ATT ATT GGA ATA AAT AGG GGC TTG AAA TTT

GGA AAA AAA AAA AAA ACT GAA ATA T

K7F3: TTT CGT GAT AAG TGA TAG TGA TAT TCT TCT TTT ATT TGC T AC TGT TAC

TAA GTC TGG CCT ACT AAC ATA C

K7F4: CAG ATC GCC ACC CGC GCT TTA ATC TGG AGA GGT GAA GAA TAC GAC

CAC CTA GGC CAT TGA TAA CGG TTC TG

K7F5: GTA TGT GTA AAG CCG GTT TTG CCG GTG ACG ACG CTC CTC G TG CTG TCT

TCC CAT CTA TCG TCG GTA GAC C

K7F6: AAG ACA CCA AGG TAT CAT GGT CGG TAT GGG TCA AAA AGA CTC CTA

CGT TGG TGA TGA AGG GG

K7R1: TGA AAA ATA GTA AAA AAA GGT AAA AGA GAA ATC TC

K7R2: TCA AGC CCC TAT TTA TTC CAA TAA TAT CGT GGT TAT TAC AGA TCA GTC

AAT ATA GGA GGT TAT GGG AGA G

K7R3: AGC AAA TAA AAG AAG AAT ATC ACT ATC ACT TAT CAC GAA AAT ATT

TCA GTT TTT TTT TTT TTT CCA AAT T

K7R4: TAT TCT TCA CCT CTC CAG ATT AAA GCG CGG GTG GCG ATC TGG TAT GTT

AGT AGG CCA GAC TTA GTA ACA GT

K7R5: CGA GGA GCG TCG TCA CCG GCA AAA CCG GCT TTA CAC ATA CCA GAA

CCG TTA TCA ATG GCC TAG GTG GTC G

K7R6: CCC ATA CCG ACC ATG ATA CCT TGG TGT CTT GGT CTA CCG ACG ATA GAT

GGG AAG ACA GCA

K7R7: AAT TCC CCT TCA TCA CCA ACG TAG GAG TCT TTT TGA

MP_A8_R TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTA AGA CAT ACC AGA TCG CCA CC

MP_G55_F GCC TAG GTG GTC GCA TTC TTC ACC TCT CCA GAT TAA AGC GCG

MP_G9_R TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTA AAG CAT ACC AGA TCG CCA CC

MP_U_13_R TCA CTA TAG GGC CTA AAA CAT TCC AGA TCG CCA CCC GCG

MP_U50_F AGA GCC TAG GTG GTC GTA TTC ATC ACC TCT CCA GAT TAA AGC


MP_U51_F AGA GCC TAG GTG GTC GTA TTA TTC ACC TCT CCA GAT TAA AGC

P1F: GAT CCC CCT TTT AGA TTT TTC ACG CTT ACT GCT TTT TTC TTC CCA AGA

TCG AAA ATT TAC TGA ATT AAC

P1R: GAA AAA AGC AGT AAG CGT GAA AAA TCT AAA AGG GG

P2F AAT GGA TTC AGG TAT GTA AAA CAT ACC AGA TCG CCA CCC GCG CTT

TAA TCT GGA GAG GTG AAG AAT ACG A

P2R: CGG GTG GCG ATC TGG TAT GTT TTA CAT ACC TGA ATC CAT T GT TAA TTC

AGT AAA TTT TCG ATC TTG GGA A

P3F: CCA CCT ACA TGC TTC TCT TTT ACC TTT TTT TAC TAT TTT TCA CTC TCC

CAT AAC CTC CTA TAT TGA CTG A

P3R: AAA AAT AGTA AAA AAA GGT AAA AGA GAA GCA TGT AGG TGG TCG TAT

TCT TCA CCT CTC CAG ATT AAA GCG

P4F: TCT GTA ATA ACC ACG ATA TTA TTG GAA TAA ATA GGG GCT TGA AAT TTG

GAA AAA AAA AAA AAA CTG AAA T

P4R: AAG CCC CTA TTT ATT CCA ATA ATA TCG TGG TTA TTA CAG ATC AGT CAA

TAT AGG AGG TTA TGG GAG AGT G

P5F: ATT TTC GTG ATA AGT GAT AGT GAT ATT CTT CTT TTA TTT G CT ACT GTT

ACT AAG TCT CAT GTA CTA ACA T

P5R: CAA ATA AAA GAA GAA TAT CAC TATC ACT TAT CAC GAA AAT ATT TCA

GTT TTT TTT TTT TTT CCA AAT TTC

P6F: GAT CCC CCT TTT AGA TTT TTC ACG CTT ACG GCC TAA AAC ATA CCA GAT

CGC CAC CCG CGC TTT AAT CTG

P6R: CGA TGT TAG TAC ATG AGA CTT AGT AAC AGT AG

P7F: GAG AGG TGA AGG TAT GTC GAC CAC CTA GGC CCA TCC CAT TTA ACT

GTA AGA AGA ATT GCA CGG TCC CAA T

P7R: GTT TTA GGC CGT AAG CGT GAA AAA TCT AAA AGG GG

P8F: TGC TCG AGA GAT TTC TCT TTT ACC TTT TTT TAC TAT TTT TCA CTC TCC

CAT AAC CTC CTA TAT TGA CTG A

P8R: AAT GGG ATG GGC CTA GGT GGT CGA CAT ACC TTC ACC TCT C CA GAT

TAA AGC GCG GGT GGC GAT CTG GTA T

P9R: AAA AAT AGT AAA AAA AGG TAA AAG AGA AAT CTC TCG AGC AAT TGG

GAC CGT GCA ATT CTT CTT ACA GTT A

pADH GCA CAA TAT TTC AAG CTA TAC C


sp GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG G

Splice1_for AGA TCT CTT AAG GCC TAA AAS GTA TGT GAT CGC CAC CCG CGC TTT AAT

CAC GAG AGG TGA AGA ATA C

Splice2_for GCT AGA TCT CTT AAG GTATG TAA AAC ATA CCA G

Splice2_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGC ATGT AGG TGG TCG TAT TC

Splice3_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGG CCT AGG TGG TCG ACATA CCT TCA CCT

CTC C

Splice4_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGG CCT ATG TGG TCG TAT TCT TCA CATAC

CTC CAG ATT AAA GCG

Splice6_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGG CCT ATA CCG TCG TAT TGT TAG TAT CTC

CAG ATT AAA GCG

Splice7_for AGA TCT CTT AAG GCC TAC T AAC ATA CCA GAT CGC

T7_forw_AN32K AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CAA CTC CAA GCT AGA TCT CTT AAG

Xho_sp_F TCG AGC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC

Xho_sp_R TCG AGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGC

3.2 Puffer, Lösungen und Medien

Puffer, Lösungen und Medien wurden mit Millipore-Wasser oder deionisiertem Wasser

angesetzt und 25 min im Dampfdrucktopf bei 120°C und 2 bar autoklaviert. Thermolabile

Substanzen wurden gelöst und sterilfiltriert. Als Lösungsmittel diente Reinstwasser (MilliQ),

andere Lösungsmittel sind angegeben.

3.2.1 Bakterien- und Hefenährmedien

Flüssigmedien

LB-Medium (1 l) 10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

10 g NaCl


MM-Medium (1 l) 2 g Yeast Nitrogen Base

(Hefe-Minimalmedium 5,5 g (NH4)2SO4

ohne Uracil) 20 g Glukose

20 ml AS-Mix

20 ml Adenin (600 µg/ml)

pH 5,6 mit 2 M NaOH eingestellt

YEPD-Medium (1 l) 10 g Hefeextrakt

(Hefe Vollmedium) 20 g Pepton

20 g Glukose

Plattenmedien

Zur Herstellung von Plattenmedien wurden den Grundmedien 15 g/l Agar zur Verfestigung

zugesetzt.

Antibiotika

Ampicillin wurde als 1000-fach konzentrierte Stammlösung in 70% Ethanol gelöst. Die

Lösung wurde bei -20°C aufbewahrt. Nach Abkühlung der Medien auf ca. 50°C wurde das

Antibiotikum zugegeben. Die Endkonzentration für E. coli betrug bei Ampicillin 100 µg/µl.

Sonstiges

IPTG wurde bei der Präparation der T7-RNA-Polymerase in einer Endkonzentration von 0,5

mM eingesetzt.

3.2.2 Puffer und Lösungen

0,8%-Agarosegel

für DNA-Gelelektrophorese

0,8% (w/v) Agarose

1x TAE

10x TAE-Puffer


0,4 M Tris

0,2 M Na-Acetat

12,5 mM EDTA

pH 8,3 (eingestellt mit Essigsäure)


DNA-Farbmarker


0,25% Ficoll 400

1% (w/v) SDS

0,25% Bromphenolblau

100 mM EDTA (pH 8,0)

10x Proteinlaufpuffer

für Protein-Gelelektrophorese

1,92 M Glyzin

0,5 M Tris

1% SDS

pH 8,9 (durch exaktes Einwiegen)

5x SDS-Probenpuffer


15% β-Mercaptoethanol

15% SDS

1.5% Bromphenolblau

50% Glyzerin

Färbelösung


0,5% Coomassie Brillant Blue R250

10% Essigsäure

45% Methanol

44,5% H2O

Entfärbelösung


10% Essigsäure

Waschlösung


45% Methanol

10% Essigsäure

45% H2O

Trenngel


7% - 15% Acrylamid (39:1)

375 mM Tris-HCl pH 8,8

800 µl 2% SDS

mit sterilem Millipore-Wasser auf 9,8 ml aufgefüllt

200 µl 10% APS

2,5 µl TEMED


Sammelgel


4% Acrylamid-Bisacrylamid (39:1)


0,1% SDS

mit sterilem Millipore-Wasser auf 9,95 ml aufgefüllt

50 µl APS

10 µl TEMED

10x PBS 1370 mM NaCl

27 mM KCl

100 mM Na2HPO4

20 mM KH2PO4

pH 7,4 (eingestellt mit HCl )

10x TBE-Puffer

für RNA-Gelelektrophorese

0,89 M Tris

0,89 M Borsäure

10 mM EDTA

pH 8,3 (durch exaktes Einwiegen)

10% PAA-Gel

mit 8 M Harnstoff


20 ml Acrylamid-Bisacrylamid (39:1)

16 ml 10 x TBE

38,4 g Harnstoff; cEnd= 8 M

mit H2O auf 80 ml

800 µl 10% APS

80 µl TEMED

10% PAA-Gel (nativ)


10 ml Acrylamid- Bisacrylamid (39:1)

4 ml 10x nativer Gelpuffer

26 ml H2O

400 µl 10% APS

40 µl TEMED


Formamid-Probenpuffer

für RNA-Gelektrophorese

99% Formamid

0,1% Bromphenolblau

0,1% Xylen Cyanol FF

5x Transkriptionspuffer 500 mM Tris

pH 8,1 (eingestellt mit Glutaminsäure)

200 mM Spermidin (1 ml)

(Transkription)

32 µl Spermidin

568 µl H2O

400 µl 5x Transkriptionspuffer

500 mM Spermidin (1 ml)

(Spleißen)

80 µl Spermidin

520 µl H2O

400 µl 5x Transkriptionspuffer

DTT 1 M DTT in 10 mM Natriumacetat pH 5,2 lösen

sterilfiltriert

Proteinase K Mix

6 µl 5 mg/ml Proteinase K

3 µl 0,5 M EDTA

3 µl 10 % SDS

18 µl H2O

Stoppuffer 2 (1 ml)

(Spleißen)

167 µl 3M Na-Acetat pH 5,2

0,6 µl 0,5 M EDTA pH 8,0

5 µl 20% SDS

15 µl E. coli tRNA (1µg/µl)

813 µl H2O

Elutionspuffer für RNA (1 ml)

167 µl 3 M Na-Acetat pH 5,2

2 µl 0,5 M EDTA pH 8

25 µl Phenol/Chloroform (1:1)

806 µl H2O


Zell-Wasch-Puffer

(T7-RNA-Polymerase)

20 mM TrisHCl pH 8,1

20 mM NaCl

2 mM EDTA

Lysispuffer (100 ml)

(T7-RNA-Polymerase)


20 mM NaCl

2 mM EDTA

nach dem Autoklavieren wurden zugegeben:

1 mM DTT (100 µl der 1 Stammlsg.

10 µg/ml Bacitracine (100 µl der 10 mg/ml Stammlsg.

0,1 mM Benzamidine (100 µl der 0,1 M Stammlsg.

20 µg/ml PMSF (100 µl der 20 mg/ml Stammlsg in 70%

EtOH)

0,8% Deoxycholate

(T7-RNA-Polymerase)

0,8% Deoxycholate in H2O

bei RT lagern

10% Ethylenimin Polymer

(T7-RNA-Polymerase)

10% Ethylenimin Polymer in H2O

pH 8 mit HCl eingestellt

bei RT lagern

10x Puffer C-0 (2 l)

(T7-RNA-Polymerase)

200 mM Na-Phosphat pH 7,7 (aus 1 M Stammlsg)

10 mM EDTA

50% Glycerin

nach dem autoklavieren zugegeben:

10 mM DTT

bei 4°C lagern und kurz vor Gebrauch herstellen

Puffer-C-2000 (2 l)

(T7-RNA-Polymerase)

2 M NaCl

auf 2 l mit 1x Puffer C-0


Puffer-C-10 (1 l)

(T7-RNA-Polymerase)

5 ml Puffer C-2000


Puffer-C-25 (500 ml)

(T7-RNA-Polymerase)

6,25 ml Puffer C-2000


Puffer-C-50 (1 l)

(T7-RNA-Polymerase)

25 ml Puffer C-2000


Puffer-C-100 (1 l)

(T7-RNA-Polymerase)

50 ml Puffer C-2000


Puffer-C-200 (1 l)

(T7-RNA-Polymerase)

100 ml Puffer C-2000


Puffer-C-250 (500 ml)

(T7-RNA-Polymerase)

62,5 ml Puffer C-2000


Puffer-C-100/50 % Glycerin (1 l)

(T7-RNA-Polymerase)

50 ml Puffer C-2000

500 ml Glycerin


Puffer-D (2 l)

(T7-RNA-Polymerase)

40 ml 1M Hepes-KOH pH 7,9

800 µl 0,5 M EDTA pH 8,0

50 ml 2 M KCl

460 ml Glycerin

auf 2 l mit H2O

bei 4°C lagern und kurz vor Gebrauch zugegeben:

1 ml 1 M DTT

10 ml 0,1 M PMSF

4 ml 1 M Benzamidin


5x Puffer-T 200 mM Tris-HCl pH 7,5

1 M NaCl

100 mM MgCl2

5x Puffer-K 200 mM K-Phosphat pH 7,5 (aus 1 M Stammlsg)

1 M NaCl

100 mM MgCl2

(Achtung erst Wasser vorlegen!)

10x Nativer Gellaufpuffer 500 mM Tris-Acetat pH 7,5

100 mM Mg-Acetat

AGK Puffer (200 ml) 2 ml 1 M Hepes-KOH pH 7,9 (cEnd= 10 mM)

0,3 ml 1 M MgCl2 (cEnd= 1,5 mM)

20 ml 2 M KCl (cEnd= 200 mM)

20 ml Glycerin (cEnd= 10%)

50 ml 2 M KCl (cEnd= 50 mM)

Puffer D (2 l)

(Dialysepuffer für Hefe Zell-

extrakt)

40 ml 1 M Hepes-KOH pH 7,9 (cEnd= 20 mM)

0,8 ml 0,5 M EDTA pH 8 (cEnd= 0,2 mM)

460 ml Glycerin (cEnd= 20 %)

bei 4°C lagern und kurz vor Dialyse zugegeben:

1 ml 1 M DTT

10 ml 0,1 M PMSF (in 70% Ethanol)

4 ml 1 M Benzamidin

K-PO4-PEG (800 µl) 500 µl 0,5 M K-PO4 pH 7,0

300 µl 50% PEG 8000 in H2O

Alle Puffer zur Verwendung mit Chromatografiegeräten wurden vor dem Autoklavieren mit

einem 0.45 µm Steritop Filter filtriert.


3.2.3 Enzymlösungen

Alle kommerziellen Enzyme stammen aus dem lehrstuhleigenen Vorrat und wurden mit den

vom Hersteller gelieferten Puffern verwendet.

3.3 Methoden

3.3.1 Allgemeine Methoden

Zusammenfassung der allgemeinen Methoden (Tabelle 3.4.), die in der Literatur beschrieben

sind und in dieser Arbeit angewendet wurden:

Tabelle 3.4 Allgemeine Methoden

Methode Referenz

Absorptionsmessung (Sambrook et al., 1989)

Ethidiumbromidfärbung von DNA/RNA (Sambrook et al., 1989)

Fällung von Nukleinsäuren (Sambrook et al., 1989)

Gelelektrophorese von DNA (Sambrook et al., 1989)

Gelelektrophorese von Proteinen (denaturierend) (Laemmli, 1970)

Ligation von DNA-Fragmenten (Sambrook et al., 1989)

Proteinmengenbestimmung (Bradford, 1976)

Plasmidpräparation aus E. coli (Sambrook et al., 1989)

Transformation von E. coli (Sambrook et al., 1989)

Herstellung kompetenter E. coli Zellen (Sambrook et al., 1989)

Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1992)

3.3.2 Anzucht von Bakterien

Soweit nicht anders angegeben, wurde E. coli in LB-Medium bei 37°C und 250 U/min in

Reagenzgläsern oder Schikanekolben angezogen. Beimpft wurde von frischen

Vereinzelungsplatten bzw. aus Übernachtkulturen. Das Wachstum wurde durch Messung der

optischen Dichte bei 600 nm verfolgt.


3.3.3 Transformation von E. coli

Kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut, dann 200 µl zu 10-100 ng DNA gegeben, der

Ansatz gemischt und für 30 min auf Eis gestellt. Danach wurde das Reaktionsgefäß 1,5 min

auf 42°C erwärmt und nach Zugabe von 800 µl LB-Medium 1 h bei 37°C im Wasserbad

inkubiert. Von den Transformationsansätzen wurden jeweils 50 bzw. 100 µl und der

abzentrifugierte Rest auf Selektionsplatten ausplattiert.

3.3.4 Anzucht von S. cerevisiae

Soweit nicht anders angegeben, wurde S. cerevisiae in YEPD-Medium oder MM-Medium bei

30°C und 250 U/min in Reagenzgläsern oder Schikanekolben angezogen. Beimpft wurde von

frischen Vereinzelungsplatten bzw. aus Übernachtkulturen. Das Wachstum wurde durch

Messung der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt.

3.3.5 Anzucht und Transformation von kompetenten S. cerevisiae

Präparation kompetenter Zellen

Für die Präparation kompetenter Hefen wurde der kommerziell erhältliche Kit Frozen-EZ

Yeast Transformation IITM verwendet. Die Lösungen EZ 1 und EZ 2 wurden diesem Kit

entnommen.

Zur Herstellung kompetenter S. cerevisiae wurde zunächst der gewünschte Hefestamm aus

einer Stockkultur auf YEPD-Platten ausgestrichen und bei 28°C inkubiert. 20 ml YPD-

Flüssigmedium wurden mit je einer Kolonie beimpft und weiterhin bei 28°C auf einem

Rundschüttler (250-300 rpm) üN inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde YPD-

Flüssigmedium mit der üNK auf eine oD600 von 0,2 eingestellt und bei 28°C unter Schütteln

bis zu einer oD600 von 0,8-1,0 wachsen gelassen. Die folgenden Schritte wurden bei

Raumtemperatur durchgeführt. Zunächst wurde die Hefesuspension bei 500 g für 4 min

abzentrifugiert, das Sediment mit 10 ml EZ 1-Lösung gewaschen und unter den bereits

angegebenen Bedingungen nochmals abzentrifugiert. Das Sediment wurde anschließend mit 1

ml EZ 2-Lösung resuspendiert, aliquotiert (100 µl, 50 µl) und bei -70°C gelagert.

Transformation von S. cerevisiae

Die kompetenten Hefezellen wurden bei RT aufgetaut. Für die Transformation wurden ca.

200 ng der zu transformierenden DNA in 3 µl Millipore-Wasser mit 10 µl kompetenter Zellen

versetzt und nach Zugabe von 100 µl EZ 3-Lösung (Kit Frozen-EZ Yeast Transformation

IITM) gevortext. Die Ansätze wurden 45 min bei 28°C inkubiert, wobei alle 15 min gevortext


wurde, weil sich die Hefen aufgrund ihrer Größe nach einer gewissen Zeit am Boden

absetzen. Nach Abschluss der Transformation wurde der gesamte Ansatz auf MM-Platten

ausplattiert und bei 28°C für 2-3 Tage inkubiert.

3.3.6 Nachweis und Präparation von DNA

Aufreinigung von Plasmid-DNA über modifizierte Alkali/SDS Lyse

Die Plasmidisolierung erfolgte aus 4 ml bis 2 l Übernachtkultur durch alkalische Lyse und

anschließende chromatographische Aufreinigung (Nucleospin; Macherey-Nagel, Düren).

DNA-Gelelektrophorese

Zur Größenbestimmung und zur präparativen Auftrennung von DNA-Restriktionsfragmenten

wurde eine Gelelektrophorese mit 0,8% Agarosegelen durchgeführt. Die Gele hatten eine

Dimension von 8,5 cm Länge, 10 cm Breite und waren 3-5 mm dick. Die Agarosegele wurden

nach dem Gießen (60°C) durch Abkühlen auf RT verfestigt, die Proben mit DNA-Farbmarker

versetzt und auf das Gel aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei 100-120 V, bis der DNA-

Farbmarker das untere Drittel des Gels erreicht hatte. Danach wurden die Gele 10 min in

Ethidiumbromid gefärbt, kurz in H2O entfärbt und anschließend unter UV-Licht (254 nm)

fotografiert. Bei 365 nm konnten DNA-Banden aus präparativen Gelen ausgeschnitten und in

ein Eppendorfgefäß überführt werden. Die Elution der DNA erfolgte mit dem Nucleospin

Extract 2 in 1 nach Anleitung des Herstellers.

Größenstandards für die DNA-Gelelektrophorese

PEQ Gold Leiter-Mix (PEQ-Gold), Fragmentgrößen in kb:

10/8/6/5/4/3,5/3/2,5/2/1,5/1,2/1,031/0,9/0,8/0,7/0,6/0,5/0,4/0,3/0,2/0,1

Sequenzierung von DNA

Der Sequenzierung lag das Prinzip der Kettenabbruchmethode von Sanger (Sanger et al.,

1992) zugrunde, wobei die Terminatoren fluoreszenzmarkiert sind. Die Sequenzierung

erfolgte mit Hilfe des Big Dye Terminator Mix (PE-Biosystem). Die Durchführung der

Sequenzierreaktion erfolgte gemäß den Vorschriften des Herstellers, wobei die

Hybridisierungstemperatur dem jeweiligen Oligonukleotid angepasst wurde. Die Analyse der

Sequenzierreaktion erfolgte mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyser (PE-Biosystem).


Cycle-Sequencing-Ansatz 400-500 ng Plasmid DNA

5 pmol Primer

3 µl Ready Reaction Mix

mit Millipore-Wasser auf 10 µl auffüllen

Bedingungen 25 Zyklen

96°C 10 sec

45-60°C (jeweils angegeben) 5 sec

60°C 4 min

Fällung des Ansatzes

in Eppendorfgefäß

10 µl Ansatz + 90 µl H2O + 10 µl 3 M NaAc mischen

250 µl 100% Ethanol (RT) zugeben und mischen

15 min bei 13000 U/min (RT) zentrifugieren

Überstand sorgfältig abziehen

Pellet mit 250 µl 70% frischem Ethanol (RT) waschen

5 min bei 13000 U/min (RT) zentrifugieren

Überstand sorgfältig abziehen

Pellet 5 min in SpeedVac trocknen

Probenvorbereitung Pellet in 10 µl Formamid aufnehmen

Ansatz in Geräte-Reaktionsgefäß überführen und mit

Septum verschließen

Restriktion von DNA

Die Restriktionen mit Endonukleasen wurden in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer

durchgeführt. Die Enzymmenge und Inkubationsdauer richteten sich nach der eingesetzten

DNA-Menge und dem Reaktionsvolumen.

Ligation von DNA

Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde mit T4-DNA-Ligase unter Verwendung des vom

Hersteller mitgelieferten Puffers durchgeführt. Es wurden 100 ng Vektor-DNA und ein

1-5 facher molarer Überschuss an Fragment eingesetzt. Die Ligationsreaktion erfolgte über

Nacht bei Raumtemperatur.


Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion wurde stets mit zirkulärer Plasmid-DNA als Matrizen-DNA

durchgeführt.

Reaktionsansatz (100 µl) :

3 µl Primer 1 (30 pmol)

3 µl Primer 2 (30 pmol)

3 µl Ziel-DNA (ca. 100 ng)

20 µl 10× Phusion-Polymerase Puffer

1 µl Phusion-Polymerase

2 µl dNTPs

79 µl H2O

Der Ansatz wurde gemischt und die Reaktion im Thermocycler mit folgendem Programm

durchgeführt:

Anzahl der Zyklen Reaktion Temperatur Dauer der Reaktion

1 Vorlauf 98°C 30 sec

30 Denaturierung

Annealing

Primer Extention

94°C

jeweils angegeben

72°C

15 sec

30 - 60 sec

20 – 30 sec

1 Endlauf 72°C 7 min

Nach Abschluss des Programms wurde der Reaktionsansatz auf 4°C abgekühlt.

Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel überprüft und mittels Nucleospin Extract 2

in 1 (Macherey-Nagel, Düren) aufgereinigt.

3.3.7 Nachweis und Präparation von RNA

RNase-freies Arbeiten

RNasen sind überaus stabile Proteine. Sie können innerhalb kürzester Zeit RNA abbauen.

Daher muss die Kontamination mit RNasen unbedingt vermieden werden. Alle Lösungen

wurden mit RNase-freiem Millipore-Wasser angesetzt und autoklaviert. Alle Glasgeräte

wurden über Nacht bei 200°C sterilisiert. Plastikgeräte wurden über Nacht mit 0,1% (v/v)

Diethylpyrocarbonat-Lösung (DEPC) bei 37°C behandelt, autoklaviert, mit RNase-freiem

Wasser gewaschen und bei 80°C getrocknet.


RNA Gele

Denaturierende RNA Gele mit 8 M Harnstoff in TBE-Puffer wurden im Format 16x18 cm in

einer Dicke von 1 mm oder 2 mm gegossen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei

30 W ohne Kühlung der Platten. Um ein Zerspringen der Platte und den Zerfall des Harnstoffs

zu vermeiden, sollte die Temperatur nicht über 55°C steigen. Als Laufpuffer wurde 2x TBE

verwendet. Proben wurden in Formamid-Auftragepuffer aufgenommen und 3 min bei 95°C

denaturiert.

Native RNA Gele enthielten keinen Harnstoff. Die Gelelektrophorese erfolgte bei

Raumtemperatur und einer konstanten Spannung von 100 V. Als Laufpuffer wurde 50 mM

Tris-Acetat, pH 7,5 mit 10 mM Mg-Acetat verwendet. Die Proben wurden mit 10% Glyzerin

versetzt und aufgetragen.

RNA-Synthese und Aufreinigung

Die für die in vitro-Transkription benötigte T7-RNA-Polymerase wurde von Dr. Oliver

Weichenrieder (NKI-Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt oder selbst

aufgereinigt. Die benötigte SP6-RNA-Polymerase wurde mit einer Konzentration von 50 U/µl

von Roche bezogen

Nukleotid-Triphosphate für in vitro Transkription

Die benötigten Nukleotid-Triphosphate (NTPs) wurden in Pulverform von Sigma bezogen.

Jedes NTP wurde als 100 mM Stammlösung in Milliporewasser hergestellt und mit 5 M

NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Die Lösung der Nukleotide erfolgte in der Originalflasche.

Jedes neutralisierte NTP wurde portioniert und bei –20°C gelagert. Die exakte Konzentration

wurde per oD 260 nm ermittelt. Der Quotient aus der gemessenen oD260 und dem jeweiligen

ε260 Wert gibt die Nukleotidkonzentration in mol/l. Tabelle 3.5 enthält die Lösungsvolumina

und die Extinktionskoeffizienten (ε260) zur Konzentrationsmessung (Weichenrieder,

persönliche Mitteilung). Der Quotient aus der gemessenen oD260 und dem jeweiligen ε260

Wert gibt die Nukleotidkonzentration in mol/l.


Tabelle 3.5 Lösungsvolumina zur Herstellung von 100 mM NTP Lösungen aus Feststoff.

NTP Lösungsvolumena

für 100 mM

H2O 5 M NaOH

(max. zugegeben)

ε260

(l M-1 cm-1)

ATP 9,07 ml / 0,5 g 8 ml 0,325 ml 15,4 x 103

UTP 9,09 ml / 0,5 g 8 ml 0,175 ml 9,9 x 103

CTP 10,35 ml / 0,5 g 9,5 ml 0,305 ml 7,4 x 103

GTP 4,78 ml / 0,25 g 4 ml 0,075 ml 11,7 x 103

a Die angegebenen Volumina basieren auf Erfahrungswerten bei der Neutralisierung von vollständig gefüllten Fläschchen und sind somit als Anhaltspunkt zu verstehen, da es durchaus Schwankungen in der Füllmenge gibt.

DNA-Matrize

Die bei der enzymatischen RNA-Synthese durch in vitro-Transkription verwendete T7-RNA-

Polymerase benötigt eine DNA-Matrize, in der mindestens die Promotorregion doppelsträngig

ist, während der für die RNA kodierende Bereich einzel- oder doppelsträngig sein darf. Im

Fall der SP6-Polymerase ist eine komplett doppelsträngige DNA-Matrize notwendig. Die

Sequenz der verwendeten Promotoren sind in Abbildung 3.1 gezeigt. Als Signal für den

Transkriptionsabbruch dient das Ende der Matrize. In dieser Arbeit wurden linearisiertes

pSP64 und pSP6 als DNA-Matrize verwendet

-17 -10 -1 +1 +2

5´- T A A T A C G A C T C A C T A T A G G -3´

3´- A T T A T G C T G A G T G A T A T C C -5´

-17 -10 -1 +1 +2

5´-A T T T A G G T G A C A C T A T A G G -3´

3´-T A A A T C C A C T G T G A T A T C C -5´

Abbildung 3.1

oben: Konsensussequenz des T7-RNA-Polymerase-Promotors. Die Positionen +1 und +2 wurden beibehalten, um eine effiziente in-vitro Transkription zu ermöglichen. unten: Konsensussequenz des SP6-RNA-Polymerase-Promotors. Die Positionen +1 und +2 wurden beibehalten, um eine effiziente in-vitro Transkription zu ermöglichen.


In vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase

Für analytische und semipräparative Zwecke wurden Transkriptionsreaktionen in einem

Maßstab von 100 µl durchgeführt, wobei die folgenden Parameter variiert wurden:

Magnesiumkonzentration (für jede Polymerasepräparation anpassen, da Mg2+ bereits in der

Enzymlösung vorhanden ist), Templatekonzentration, T7-RNA-Polymerasekonzentration und

Reaktionsdauer (je nach Enzymaktivität erhöhen) (Tabelle 3.6.).

Tabelle 3.6 Reaktionsbedingungen bei der in vitro Transkription mit T7-RNA-Polymerase

Tris-Glutamat, pH 8,1 200 mM

DTT 20 mM

Spermidin 2 mM

Mg(Ac)2 20 - 35 mM

rNTP, gesamt 16 mM

Plasmid 10 - 20 µg / 100 µl Ansatz

T7-RNA Polymerase 7 - 10 µg / 100 µl Ansatz

Reaktion bei 37°C

Der Reaktionsverlauf wurde durch analytische PAGE verfolgt. Dabei wurden je 5 µl Probe

mit 20 µl Formamid-Auftragepuffer versetzt und für 3 min bei 95°C denaturiert. Für die

PAGE wurden 8-12%ige denaturierende Acrylamid-Gele verwendet. Die Auftrennung

erfolgte bei konstanter Leistung von 30 W. Anschließend wurde das analytische Gel analog

zu DNA-Gelen in Ethidiumbromid gefärbt und unter UV Licht photografiert.

Die präparative Transkriptionsreaktion wurde in einem Maßstab von 2-10 ml bei den

Bedingungen durchgeführt, die in den analytischen Ansätzen die größtmögliche Ausbeute

geliefert haben. Die Reaktion erfolgte bei 37°C für 7 h oder über Nacht. Der

Transkriptionsansatz wurde anschließend mit dem 5 fachen Volumen einer 25 mM MgCl2

Lösung verdünnt. Um die autokatalytische Hydrolyse des Hammerhead-Ribozyms zu erhöhen

wurde der Ansatz zwei Hitze-Kälte Zyklen von jeweils 10 min bei 60°C, 10 min auf Eis und

anschließend 30 min bei 20°C ausgesetzt. Zur Beendigung der Reaktion wurde 0,5 M EDTA

pH 8 bis zum vollständigen Aufklaren der Lösung zugegeben.


RNA-Aufreinigung durch chromatographische Verfahren

Die weitere Aufreinigung der RNA erfolgte durch säulenchromatographische Verfahren.

Zunächst wurden aus dem Reaktionsgemisch die T7-RNA-Polymerase und nicht eingebaute

Nukleotide entfernt. Zu diesem Zweck wurde eine DEAE-Sepharose FF-

Anionenaustauschersäule verwendet. Die Säule (∅ 0,8 cm, 10 cm lang) wurde mit 1 ml

DEAE-Sepharose befüllt und mit 10 ml H2O gewaschen. Die Säule wurde mit 10 ml einer 0,3

M NaAc Lösung pH 5,5 äquilibriert, mit 5 ml 3 M NaAc, pH 5,5 gewaschen und

abschließend wieder mit 10 ml einer 0,3 M NaAc pH 5,5 Lösung re-äquilibriert. Im

Anschluss daran konnte die Säule mit dem abgestoppten Transkriptionsansatz beladen

werden. Sämtliche Durchflüsse der Säule wurden gesammelt. Die beladene Säule wurde mit

10 ml einer 0,3 M NaAc Lösung pH 5,5 gewaschen. Die Elution erfolgte mit 5 ml einer 2 M

NaAc Lösung pH 5,5. Mittels denaturierender Gelelektrophorese wurden alle Fraktionen auf

ihren RNA-gehalt hin analysiert. Die RNA wurde dann durch Zugabe des 2,5–4 fachen

Volumens an kaltem EtOH üN bei –20°C präzipitiert. Das RNA-Pellet wurde abzentrifugiert

(10000 g, 4°C, 2 h) und dann in Wasser gelöst.

RNA-Aufreinigung durch präparative PAGE

Die weitere Aufreinigung erfolgte über präparative denaturierende PAGE. Zu diesem Zweck

wurden ein oder zwei (bei 10 ml Transkriptionen) PAA-Gele mit 8 M Harnstoff in einer

Dicke von 2 mm verwendet. Die Gelplatten wurden so angeordnet, dass sich die jeweilige

fluoreszierende Seite innen befand (unter 254 nm UV-Licht-Bestrahlung gelblich

fluoreszierend; beide Seiten der Platte auf dunklem Untergrund im Photolabor vergleichen

und die fluoreszierende Seite markieren!). Die in Wasser gelöste RNA wurde mit einem

Volumen 8 M Harnstoff mit Bromphenolblau und Xylencyanol versetzt. Die

elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 30 W bis die Bromphenolblau-Bande im unteren

Drittel angekommen ist. Nach der Entfernung einer der beiden Glasplatten wurde die RNA-

enthaltende Bande per „UV-shadowing“ sichtbar gemacht. Dazu wurde das geöffnete Gel auf

der Glasplatte über einem dunklen Untergrund mit einer 254 nm UV-Handlampe bestrahlt.

Nukleinsäurehaltige Banden erscheinen als dunkler Schatten, da hier das UV-Licht absorbiert

wird. Der restliche Bereich fluoresziert. Die gewünschte Bande wurde mit einem sterilen

Skalpell ausgeschnitten und in ein bis drei sterile 50 ml Plastikgefäße überführt.


Elution der RNA aus dem PAA-Gel

Um die RNA aus dem Gel eluieren zu können, wurden die Gelstücke mit einem RNase freien

Glasstab zerkleinert und mit 50–150 ml 0,3 M Na-Ac pH 5,5 überschichtet. Die Elution

erfolgte über Nacht bei RT unter Schütteln. Anschließend wurde das Eluat mit Hilfe eines

Steritopfilters (Porengröße 0,45 µm) von den Feststoffen befreit. Das Filtrat wurde

abschließend wie oben beschrieben per DEAE-Säulenchromatografie aufgereinigt.

In vitro-Transkription und Aufreinigung von radioaktiv markierter RNA

SP6-Polymerase und T7-Polymerase wurden zur in vitro Synthese von radioaktiv markierter

RNA verwendet. α-32P UTP (3000 Ci/mmol) wurde ab dem Kalibrierungsdatum für maximal

7 Tage verwendet. Tabelle 3.7 gibt die Reaktionsbedingungen wieder. Die Transkription

wurde im 20 µl Maßstab bei 37°C für 2 h durchgeführt (Tabelle 3.7) und wie oben

beschrieben über denaturierende PAGE aufgereinigt.

Tabelle 3.7 Reaktionsbedingungen bei der radioaktiven in vitro Transkription

Die Elution der RNA erfolgte für 6 h bis über Nacht bei 4°C in 400 µl Elutionspuffer für

RNA. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abgezogen und mit 2,5 Volumen Ethanol

für 5 min in flüssigen Stickstoff gefällt und 10 min bei 13k rpm (RT) abzentrifugiert. Das

Pellet wurde mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen und wie oben abzentrifugiert. Das

getrocknete Pellet wurde in 20 – 50 µl H2O resuspendiert und die Aktivität im

10x Polymerasepuffer (Roche) 2 µl

Plasmid Template 2–5 µg

10x rNTP-Mix

(5 mM A, C, G, 1 mM U)

2 µl

α-32P UTP (3000 Ci/mmol) 4 µl

RNA guard 1 µl

SP6-RNA Polymerase (50 U/µl)

oder

T7-RNA Polymerase (1:50)

2 µl

oder

0,5–1 µl

H2O auf 20 µl

Reaktion bei 37°C


Szintillationszähler bestimmt. Dazu wurden 2 µl RNA mit 3 ml Szintillationsflüssigkeit

gemischt und vermessen. Die aufgereinigte RNA wurde portioniert und bei –20°C gelagert.

3.3.8 Fluoreszenz Messungen

Bestimmen der Bindekonstanten über Tetracyclin Titrationsspektroskopie

Alle Messungen wurden bei 25°C an einem Fluorolog FL3-22 durchgeführt. Die Anregung

erfolgte für alle Tc-Derivate bei 370 nm. Die einzige Ausnahme stellte Anhydrotetracyclin

mit einer Anregungswellenlänge von 455 nm dar. Die Emissionsspektren wurden von 450 nm

bis 600 nm in Schritten von 1 nm aufgezeichnet. Die Integrationszeit pro Datenpunkt betrug

0,3 sec, die Spaltbreite betrug 2 mm. Für die Messungen wurden Acryl-Küvetten mit einer

Seitenlänge von 1 cm verwendet. Die verwendeten Rührfische wurden über Nacht in 2 M

NaOH gewaschen, gründlich mit H2O gespült und autoklaviert. Vor Gebrauch wurde der

Rührfisch mit Puffer-K gespült und mit Druckluft getrocknet. Die Tc oder Tc-Derivat Lösung

wurde in einem Volumen von 2 ml in Puffer P vorgelegt. Pro Messreihe wurden maximal 100

µl RNA in Puffer-K zutitriert, da somit die Volumenerhöhung (maximal 5%)

vernachlässigbar ist. Nach jeder Titration wurde der Ansatz gerührt und vor der Messung für

10 min äquilibriert. Der Bereich des Signalmaximums der emittierten Fluoreszenz wurde

gemittelt, normalisiert und gegen die Konzentration der freien RNA aufgetragen. Dazu wurde

die fraktionale Sättigung FS berechnet:

FS = (S – Smin) / (Smax – Smin) = ∆S / ∆Smax

∆S ist der Unterschied zwischen dem Fluoreszenzsignal (S) und der Hintergrundfluoreszenz

(Smin) bei jedem einzelnen Titrationsschritt. ∆Smax ist der Unterschied zwischen dem

Fluoreszenzmaximum bei vollständiger Sättigung (Smax) und Smin. Da das detektierte

Fluoreszenzsignal vom Tc stammt, welches als Akzeptormolekül dient, entspricht FS dem

Grad der Sättigung. Die Konzentration der freien RNA wurde somit als

cfreie-RNA = ctotal-RNA – (FS * c(tc))

berechnet.

Die Berechnung der isothermalen Bindekurve, der Dissoziationskonstante (KD) und der

maximalen Anzahl an Bindestellen (B) erfolgt iterativ anhand der Gleichung

FS = (Bmax * cfreie-RNA / (KD + cfreie-RNA))

mit Hilfe der Software Origin 5.0.


GFP Messungen

Alle Messungen wurden bei 25°C an einem Fluorolog FL3-22 durchgeführt. Die Anregung

erfolgte bei 484 nm. Die Emissionsspektren wurden von 490 nm bis 530 nm in Schritten von

1 nm aufgezeichnet. Die Integrationszeit pro Datenpunkt betrug 0,3 sec, die Spaltbreite betrug

2 mm. Für die Messungen wurden Acryl-Küvetten mit einer Seitenlänge von 1 cm verwendet.

Für GFP Messungen wurde der Stamm S. cerevisiae RS 453 verwendet. Der mit dem Plasmid

pWHE601 oder pWHE601-AN32 transformierte Hefe-Stamm wurde für 48 h in 10 ml MM-

Medium ± 100 µM Tc-Derivat inkubiert. Die Zellen wurden 10 min bei 8500 rpm

abzentrifugiert, das Zellpellet zweimal mit PBS gewaschen und in 2 ml PBS resuspendiert.

Pro Derivat wurden 3 parallele Ansätze vermessen und an zwei Messtagen wiederholt. Die

Zelldichte wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm bestimmt und wurde zur

Normalisierung der Absorbtionswerte verrechnet.

3.3.9 Isothermale Titrationskalorimetrie

Isothermal Titration Calorimetry (ITC) Experimente wurden an einem Microcal VP-ITC

Gerät am NKI in Amsterdam durchgeführt. Mittels ITC Messungen kann das

thermodynamische Verhalten einer Bindungsreaktion untersucht werden. Enthalpie (∆H) und

Entropie (-T∆S) sowie die Bindungsstärke und Stöchiometrie einer Reaktion können direkt

bestimmt werden. Die Messzelle (1,44 ml) wurde mit RNA Lösung in Puffer-T gefüllt und

auf 25°C äquilibriert. Die Injektionskanüle enthielt in Puffer-T gelöstes Tc oder ein Tc-

Derivat. Jedes Experiment wurde mit einer 2 µl Injektion gestartet, gefolgt von 10 µl oder 15

µl Injektionen in einem Abstand von 3 min. Jede Injektion erzeugte eine Wärmepulskurve

(µcal/sek vs min). Die bei jedem Titrationsschritt freiwerdende Wärme wurde durch

Integration der Fläche einer jeden Wärmepulskurve ermittelt und bezüglich der

Verdünnungswärme (Injektionen von Tc in Puffer-T) korrigiert. Die integrierten Wärmepulse

wurden gegen das entsprechende molare Verhältnis von Tc und RNA aufgetragen. Die

Prozessierung der Rohdaten und Erstellung der Titrationskurve erfolgte mit Hilfe der vom

Hersteller gelieferten Software Microcal Origin 5.0, da diese ein spezielles Modul zur

Auswertung von ITC-Daten enthält.


3.3.10 Analytische Gelfiltration am SMART System

Analytische Gelfiltrationen wurden am Pharmacia SMART System anhand einer Superdex

GF75 Säule durchgeführt. Die Säule wurde zuvor mit 20 ml Puffer T äquilibriert. Die

Flussrate betrug 80 µl/min. Das Probenvolumen war 15 µl. Als Laufpuffer wurde Puffer-T

verwendet. Die optische Dichte wurde bei 290 nm und 374 nm verfolgt.

3.4 Aufreinigung der T7-RNA-Polymerase

Überexpression

Zur Überexpression wurde der Stamm E. coli BL21 / pAE1219 verwendet, welcher von Dr.

Matthias Görlach (IMB Jena, Abteilung für Biophysik) zur Verfügung gestellt wurde.

2x 1 l LBAmp 100 Medium wurden mit jeweils 10 ml üNK angeimpft und bei 37°C unter

schütteln inkubiert. Bei einer oD600 von 0,5 wurde die Expression der T7-Polymerase mit 0,5

M IPTG (Endkonzentration) induziert und für 3 h weiter inkubiert. Die Zellen wurden durch

Zentrifugation im JA10 Rotor geerntet (5000 rpm, 10 min, 4°C) und mit 50 ml Zell-

Waschpuffer gewaschen. An dieser Stelle kann das Pellet (ca. 8 g Feuchtgewicht) bei –70°C

gelagert werden.

Zellaufschluss

Folgenden Schritte wurden im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. 8 g Zellen (aus 2 l Kultur)

wurden in 24 ml Lysis Puffer (frisch zubereitet) in einem Becherglas resuspendiert. Nach

Zugabe von 6 ml Lysozymlösung (1,5 mg/ml in Lysispuffer) wurde für 20 min auf Eis

inkubiert. Anschließend wurden 2,5 ml einer 0,8% Deoxycholat-Lösung zugegeben und für

20 min auf Eis unter Rühren weiterinkubiert. Der Zellaufschluss erfolgte durch Beschallung

mit der großen Ultraschallsonde für 10 x 5 sec bei 30% Leistung. Die viskose Suspension

wurde mit kalten Lysispuffer auf 50 ml aufgefüllt. Nach Zugabe von 5 ml einer 10%

Ethylenimin Polymer Lösung (pH 8,0) nimmt die Viskosität stark ab. Die Lösung wurde für

weitere 20 min auf Eis gerührt und anschließend für 15 min bei 20000 rpm im Ti60 Rotor bei

4°C abzentrifugiert. Zum Überstand wurde unter Rühren das 0,82-fache Volumen einer

gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung tröpfchenweise zugegeben. Es wurde weitere 30 min

unter rühren inkubiert und anschließend bei 8500 rpm und 4°C in der Minifuge

abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 15 ml Puffer C-100 resuspendiert. Anschließend wurde

üN gegen 2x 1 l Puffer C-100 dialysiert (Ausschlussgröße 12 kDa). Das Dialysat wurde für 10


min bei 8500 rpm und 4°C in der Minifuge abzentrifugiert und durch Zugabe von einem

Volumen Puffer C-0 auf die Pufferbedingung C-50 eingestellt.

SP-Sepharose-FF Kationenaustauscher Chromatografie

Eine Pharmacia XK 26/20 Säule (∅ 26 mm, Höhe 20 cm) wurde mit 50 ml SP-Sepharose-FF

befüllt. Die Säule wurde an einer Äkta prime im Kühlraum bei 4°C betrieben. Die verwendete

Programmierung ist in Tabelle 8.6 aufgelistet. Die Äquilibrierung der Säule erfolgte mit 200

ml Puffer C-50 bei einer Flussrate von 5 ml/min. Das auf Pufferbedingung C-50 eingestellte

Dialysat wurde bei einer Flussrate von 5 ml/min auf die Säule geladen. Anschließend wurde

mit 200 ml Puffer C-50 bei 5 ml/min gewaschen. Die Elution erfolgte mit Puffer C-200. Das

Eluat wurde in 1,2 ml Fraktionen in 1,5 ml Schraubeppis gesammelt. Dazu wurde der

passende Einsatz für den Fraktionen-Sammler montiert. Der Schreiber wurde bei 2 mm/min

und einer Empfindlichkeit von 0,5 V betrieben. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden

auf einem denaturierenden 7% PAA Gel analysiert. Die T7-RNA-Polymerase enthaltenden

Fraktionen wurden vereinigt und 1:2 mit Puffer C-0 verdünnt. Anschließend wurde üN gegen

3 l Puffer C-20 bei 4°C dialysiert (Ausschlussgröße 12 kDa). Das Volumen des Dialysats

wurde bestimmt.

DEAE-Sepharose FF Anionenaustauscher Chromatografie

Eine Pharmacia XK 26/20 Säule (∅ 26 mm, Höhe 20 cm) wurde mit 30 ml DEAE-Sepharose-

FF befüllt. Das entsprichr einer Säulenmaterialhöhe von 6 cm. Die Säule wurde an einer Äkta

prime im Kühlraum bei 4°C betrieben. Die verwendete Programmierung ist in Tabelle 8.7

aufgelistet. Die Äquilibrierung der Säule erfolgte mit 200 ml Puffer C-25 bei einer Flussrate

von 5 ml/min. Die Beladung der Säule erfolgte mit 5 ml/min. Im Anschluß daran wurde mit

200 ml Puffer C-25 gewaschen (Flussrate 5 ml/min). Zur Elution wurde ein linearer Gradient

aus je 200 ml Puffer C-25 und Puffer C-250 bei 5 ml/min verwendet. Es wurden Fraktion zu

je 7 ml gesammelt. Der Schreiber wurde bei 2 mm/min und einer Empfindlichkeit von 0,1 V

betrieben. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden auf einem denaturierenden 7% PAA

Gel analysiert. Alle T7-RNA-Polymerase enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit

Hilfe von Centriprep 10 Filtereinheiten auf ca. 20% des Ausgangsvolumens eingeengt.

Anschließend wurde üN bei 4°C gegen 1 l Puffer C-10 und nochmals üN gegen 1 l Puffer C-0

dialysiert (Ausschlussgröße 12 kDa). Das Präzipitat enthält die T7-RNA-Polymerase. Dieses

wird durch Zentrifugation (10 min/8000 rpm/4°C) gewonnen und in 10-15 ml Puffer C-100

resuspendiert. Anschließend wurde üN bei 4°C gegen 1 l Puffer C-100 + 50 % Glycerin


dialysiert. Die T7-RNA-Polymerase kann bei –20°C gelagert werden. Der oxidative Abbau

der Polymerase wird durch monatliche Zugabe von 1 mM DTT verhindert.

Denaturierende Proteingelelektrophorese

Denaturierende Proteingele wurden nach der Methode von (Laemmli, 1970) hergestellt. Die

Gele, bestehend aus Trenn- und Sammelgel, wurden mit einer Dicke von 1 mm gegossen. Die

Proben wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt und vor der Auftragung 5 min auf 95°C

erhitzt. Die Gelläufe erfolgten bei 100 V. Danach wurden die Gele 20 min in Waschlösung

fixiert, 15 min mit Färbelösung behandelt und ÜN in 10% Essigsäure entfärbt. Als

Größenstandard wurde der peqGOLD Protein-Marker II verwendet (Fragmentgrößen in kDa:

10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200).

3.5 Präparation eines Hefe Zellextrakts

Zellanzucht

1 l YEPD-Medium wurden mit 10 ml einer S. cerevisiae BJ2168 üNK angeimpft und unter

schütteln bei 30°C üN bis zu einer oD600 von 3–5 inkubiert. Die Zellen wurden durch

Zentrifugation (JA 10 Rotor, 7000 rpm, 15 min, 4°C) geerntet. Das Pellet wurde je einmal in

50 ml kaltem Milliporewasser und 50 ml kaltem AGK-Puffer (+25 µl 1 M DTT; +100 µl 1 M

Benzamidin) gewaschen und wie oben in der Minifuge abzentrifugiert. Anschließend wurde

das Pellet in 10 ml kaltem AGK-Puffer (+ 5 µl 1 M DTT; + 25 µl 0,2 M PMSF; + 20 µl 1 M

Benzamidin) resuspendiert und das Volumen bestimmt. Anhand der Volumen Erhöhung

wurden die Konzentrationen von KCl, DTT und PMSF berechnet. Die Zellsuspension wurde

anschließend mit 2 M KCl-Stammlösung auf 200 mM KCl, mit 1 M DTT-Stammlösung auf

0,5 mM DTT und mit 0,2 M PMSF-Stammlösung auf 0,5 mM PMSF eingestellt. Die Zellen

wurden im Kühlraum in flüssigen N2 getropft, so dass möglichst kleine Zellkügelchen

entstanden, welche bei –70 °C gelagert wurden. Dazu wurden 50 ml Plastikgefäße mit

flüssigen N2 gefüllt. Vor dem Verschließen der Gefäße wurden mit einer sterilen Nadel kleine

Löcher in den Deckel gestochen, um den verdampfenden N2 entweichen zu lassen.

Zellaufschluss mit Mörser und Pistill

Um die Zellen möglichst schonend aufzuschließen, wurden diese mechanisch zerkleinert.

Dazu wurde ein auf –20 °C vorgekühlter Mörser im Kühlraum auf Eis mit flüssigen N2 weiter

heruntergekühlt. Die Zellkügelchen wurden darin unter ständiger Zufuhr von flüssigen N2 zu


einem sehr feinen Puder zermahlen. Anschließend wurde das Zellpuder unter ständigen

Rühren bei 4°C aufgetaut. Das Homogenat wurde abzentrifugiert (JA 20 Rotor, 17k rpm, 4°C,

30 min). Der Überstand wurde ultrazentrifugiert (Ti60 Rotor, 37k rpm, 4 °C, 1 h). Das

Ultrazentrifugen-Röhrchen wurde erschütterungsfrei dem Rotor entnommen und geöffnet.

Der klare Überstand zwischen Pellet und Fettschicht wurde zügig mit gläsernen Pasteur-

Pipetten abgezogen. Hierbei wurde vermieden, dass Teile des Pellets oder der Fettschicht

verschleppt wurden. Anschließend wurde 2x für je 90 min gegen 1 l Puffer-D (mit DTT,

PMSF und Benzamidin) bei 4 °C dialysiert (MWCO 6000 – 8000). Der Zellextrakt wurde zu

100 µl aliquotiert und in flüssigen N2 schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei –70 °C.

3.6 in vitro Spleißexperimente

In vitro Spleißexperimente wurden an der Aktin prä mRNA durchgeführt. Die Präparation

von radioaktiv markierter Aktin RNA erfolgt wie in Kapitel 3.3.7 beschrieben. Als DNA-

Matrize für die in vitro Transkription diente EcoRI linearisiertes Plasmid pSP6-Aktin. Die

aufgereinigte RNA wurde im Szintillationszähler auf ihre Aktivität vermessen und auf eine

Konzentration von 40000 Zerfällen pro Minute und µl (cpm/µl) eingestellt.

Für die Spleißreaktion wurde ein Hefezellextrakt aus dem Stamm S. cerevisiae BJ2168

verwendet. Die Präparation ist in Kapitel 3.5 beschrieben.

Für die in vitro Spleißreaktion wurden die in Tabelle 3.8 aufgeführten Lösungen (5x Spleiß

Cocktail, Mix 1 und Mix Aktin) frisch hergestellt und bei RT aufbewahrt.

Tabelle 3.8

5x Spleiß Cocktail Mix 1 Mix Aktin

80 µl K-PO4-PEG

10 µl 0,1 M ATP

5 µl 0,25 M MgCl2 20,4 µl H2O 6,0 µl Aktin (40000 cpm/µl)

2 µl 0,5 M Spermidin 9,6 µl 5x Spleiß Cocktail 4,8 µl 5x Spleiß Cocktail

1,5 µl H2O 24 µl Hefe Zellextrakt 1,2 µl H2O

100 µl 54 µl 12,0 µl


Für die Spleißreaktion wurden pro Ansatz 4,5 µl Mix 1 und 0,5 µl Mix Aktin gemischt und

bei 23°C inkubiert. Die Inkubationszeit betrug maximal 45 min. Zum Beenden der

Spleißreaktion wurde jeweils 1 µl Proteinase K Mix zugegeben und 15 min bei 37°C

inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Stoppuffer 2 zugegeben und gemischt.

Die weitere Aufreinigung erfolgte durch Phenolextraktion. Dazu wurden jeweils 200 µl

Phenol (für RNA) zugegeben, gevortext und 15 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Die

wässrige Phase (ca. 180 µl) wurde vorsichtig abgezogen und in ein frisches Eppendorfgefäß

überführt. Für die anschließende Ethanolfällung wurde das 2,5x Volumen an kaltem Ethanol

zugegeben, gemischt und für 3 min in flüssigen Stickstoff inkubiert. Anschließend wurde die

RNA für 30 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgezogen

und das getrocknete Pellet in 10 µl RNA Auftragepuffer durch kurzes Vortexen resuspendiert.

Die Proben wurden auf ein denaturierendes 6% PAA-Gel aufgetragen. Die Gelelektrophorese

erfolgte bei 25 W bis die Xylen-Cyanol Bande den unteren Gelrand erreicht hat. Eine

Phosphoimager-Platte wurde üN belichtet und anschließend ausgelesen.

Ergebnisse 54

4 Ergebnisse

4.1 in vitro Synthese von Aptamer-RNA

Für in vitro Experimente wurden das 69 Nukleotide (Nt) lange Aptamer cb32 und das 57

Nukleotide lange Minimer cb32_short um ein zusätzliches GC Basenpaar im Stamm P1

verlängert (Berens et al., 2001; Hanson et al., 2005). Dies war erforderlich, um eine

Transkription als Hammerhead-Ribozym Fusions-RNA zu ermöglichen (Abbildung 4.1 (A)).

Die veränderten Aptamere wurden als Tc-Aptamer und Tc-Minimer bezeichnet und sind in

Abbildung 4.1 (B) dargestellt. Im Tc-Minimer wurde der Stamm P2 verkürzt. Dieser wird nun

von der stabilen Tetranukleotidschleife GAAA abgeschlossen. Um die ursprüngliche

Nummerierung beizubehalten, trägt das 5´-terminale Nt die Nummer Null.

A B

A C C A C C U A G G C U U A G A G

G A U C C G A A U C U C

GUG

A

C

AAGCAGG

G A GUCC

CU

GAU

GUG

A

AACUX

3´-

5´- X

RibozymSpaltstelle

1 2 3 4 5 6 7

3´- terminale Sequenzder Aptamer RNA

UAGACC

CGC

GCG

U

AA

A A

AU

C

C

UU

UC

UU

A

CC

CCA

A

A

GGG

GGCC

CGG

A AA

A

AA

C C

A CCC

G

G

U

UA

A

691

10

40

50

60

20

30

UG C

GA

AA

U G

A G GG UB1-2 L3

Abbildung 4.1

(A) Sekundärstruktur des Hammerhead-Ribozyms als Fusions-RNA mit dem Tc-Aptamer. Die eingerahmten Nt entsprechen dem 3´-Terminus der Aptamer-RNA. Die Spaltstelle für das Ribozym ist angegeben. (B) Sekundärstrukturen vom Tc-Aptamer und Tc-Minimer. Für das Tc-Minimer ist nur der Unterschied zum Tc-Aptamer angegeben. Das erste Nt (G) trägt die Nummer Null, um die ursprüngliche Nummerierung beizubehalten (Hanson et al., 2005).

Ergebnisse 55

4.1.1 Das Hammerhead-Ribozym

Bei der in vitro Transkription mit T7-RNA Polymerase dient das 3´- Ende eines linearisierten

Templates (bei pSP64 HindIII) als Stopsignal für die Transkription („run off“ Transkription).

Da die T7-RNA Polymerase an das 3´-Ende der synthetisierten RNA unspezifisch zusätzliche

Nt anhängt, wurde die Aptamer-RNA als Fusionsprodukt mit einer Hammerhead-Ribozym-

RNA-Sequenz transkribiert, dessen intramolekulares Substrat das 3´-Ende der Aptamer-RNA

ist. Die 3´-terminale Sequenz des Aptamers (CUC) stellt die Hammerhead-Ribozym-

Spaltstelle dar. Die Fusions-RNA wird 3´- zum letzten Cytosin hydrolysiert. Dadurch wird ein

RNA-Produkt mit einem homogenen 3´-Ende erhalten. Abbildung 4.1 (A) zeigt die

Sekundärstruktur des Hammerhead-Ribozyms. Die eingerahmten Nt 1–7 (3´-Ende der

Aptamer-RNA) müssen mit dem 3´-Ende der Ribozym-Sequenz Basenpaarungen eingehen,

damit sich ein korrekt gefaltetes und somit aktives Ribozym ausbilden kann.

4.1.2 Der Klonierungsvektor pSP64

Als DNA-Matrize für die in vitro Transkription diente der Vektor pSP64 X, welcher die

Aptamer-Sequenzen (X = Tc-Aptamer, Tc-Minimer) unter Kontrolle des T7-Promotors

enthält. Als Ausgangsvektor für die Klonierung der Transkriptionsvektoren diente das

Plasmid pSP64 von Promega. Der Vektor ist 2999 Nukleotide lang, trägt eine Ampicillin

Resistenzkassette und den E. coli ori pMB1. In Abbildung 4.2 ist die Multiple

Klonierungsstelle (MCS) von pSP64 mit den relevanten singulären Schnittstellen für die

Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII dargestellt. Abbildung 4.3 zeigt diesen

Sequenzausschnitt nach der Klonierung von pSP64 Tc-Aptamer.

Amp R, ori pMB1

Hind III EcoRI

MCS

Abbildung 4.2

Multiple Klonierungsstelle (MCS) in pSP64; die relevanten Schnittstellen EcoRI und HindII sind eingezeichnet

Ergebnisse 56

sp

1 5´-GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA

3´-CCTTAACACT CGCCTATTGT TAAAGTGTGT CCTTTGTCGA TACTGGTACT

EcoRI T7-Promotor

51 TTACGAATTC TAATACGACT CACTATAGGG CCTAAAACAT ACCAGATCGC

AATGCTTAAG ATTATGCTGA GTGATATCCC GGATTTTGTA TGGTCTAGCG

↓

101 CACCCGCGCT TTAATCTGGA GAGGTGAAGA ATACGACCAC CTAGGCTCTA

GTGGGCGCGA AATTAGACCT CTCCACTTCT TATGCTGGTG GATCCGAGAT

HindIII

151 GAGGTGACTC TACTGATGAG TCCGTGAGGA CGAAAGCCTA GAAGCTTGTA

CTCCACTGAG ATGACTACTC AGGCACTCCT GCTTTCGGAT CTTCGAACAT

201 TTCTATAGTG TCACCTAAAT CGTATGTGTA TGATACATAA GGTTATGTAT

AAGATATCAC AGTGGATTTA GCATACACAT ACTATGTATT CCAATACATA

AP1_pSP64

Abbildung 4.3

Für Klonierungen und in vitro Transkription relevanter Sequenzausschnitt von pSP64 Tc-Aptamer. Primersequenzen (sp, AP1_pSP64) und Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII sind unterstrichen. Die T7-Promotor Sequenz ist kursiv dargestellt. Die Tc-Aptamer Sequenz ist in Rot, die Hammerhead-Ribozym Sequenz ist in Grün dargestellt. Der Pfeil markiert die Spaltstelle des Hammerhead-Ribozyms.

4.1.3 Konstruktion der Transkriptionsvektoren

Das Plasmid pSP64 wurde mit den Enzymen HindIII und EcoRI geschnitten und mittels

präparativer Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt. Das jeweilige Insert wurde aus

kommerziell erhältlichen Oligonukleotiden (MWG-Biotech, Ebersberg) erstellt. Dazu wurden

je 10 µl der teilweise komplementären Oligonukleotide (je 10 pM) gemischt und für 10 min

bei 90°C denaturiert. Um eine optimale Hybridisierung der Oligonukleotide zu gewährleisten,

wurde der Ansatz langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurde der

Oligonukleotidmix enzymatisch phosphoryliert und direkt mit dem HindIII und EcoRI

geschnittenen Vektor pSP64 ligiert. Die jeweils verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle

4.1 aufgelistet.

Ergebnisse 57

Tabelle 4.1 Hybridisierte Oligonukleotide

Plasmid pSP64 Oligonukleotide

Tc-Aptamer hh1, hh2, b1, b2, c3, c4

Tc-Minimer hh1, hh2, c1, c2, c3, c4

Tc-Minimer A55U hh1, hh2, c1, c2, c3_1, c4_1

Alle Punktmutationen von pSP64 Tc-Aptamer wurden über zweistufige PCR-Mutagenese

erstellt. Die Klonierung erfolgte über die singulären Schnittstellen EcoRI und HindIII. Als

äußere Primer dienten sp und AP1_pSP64. Die verwendeten Mutageneseprimer sind in

Tabelle 4.2 aufgeführt.

Tabelle 4.2 Verwendete Mutageneseprimer und äußere Primer

Konstrukt

pSP64 Tc-Aptamer Vorwärts Primer Rückwärts Primer

A8G AP1_pSP64 MP_A8B_R

A9G AP1_pSP64 MP_G9_R

A13U AP1_pSP64 MP_U13_R

A50U sp MP_U50_F

G51U sp MP_U51_F

U54G sp MP_G54_F

A55G sp MP_G55_F

4.2 Synthese und Aufreinigung der RNA

Präparative in vitro Transkriptionsreaktionen im Maßstab 2 – 10 ml wurden wie in Kapitel

3.3.7 beschrieben durchgeführt und mittels denaturierender PAGE analysiert. Abbildung 4.4

zeigt exemplarische eine Probe aus einer 2 ml Transkription von Tc-Aptamer RNA. Die

Transkription der RNA erfolgt als Fusions-RNA mit einem Hammerhead-Ribozym

(Abbildung 4.4). Die autokatalytische Hydrolyse erfolgt während der in vitro Transkription.

Ca. 70% der RNA liegen in Form der beiden Spaltprodukte Tc-Aptamer RNA (71 Nt) und

Hammerhead-RNA (47 Nt) vor.

Ergebnisse 58

1 2 3

DNA

FU

Apt

HH

Abbildung 4.4

In vitro Transkription von Tc-Aptamer RNA. 9% PAA/8 M Harnstoff Gel. In Spur 1 wurden 5 µl Transkriptionsansatz aufgetragen. Spur 2 enthält 2 µg Tc-Aptamer RNA als Größenstandard. In Spur 3 wurden 5 µl einer Nullkontrolle (Transkription ohne DNA Template) aufgetragen. Die Banden in Spur 1 entsprechen dem DNA Template (DNA), der Aptamer-Hammerhead- Ribozym-Fusions-RNA (FU), der Tc-Aptamer RNA (Apt) und dem abgespaltenen Hammerhead-RNA Anteil (HH).

Nach Beendigung der Reaktion erfolgte die weitere Aufreinigung über präparative PAGE wie

in Kapitel 3.3.7 beschrieben. Die Konzentration der RNA-Lösung wurde UV-photometrisch

anhand der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt. Pro 1 ml Transkription ergaben sich nach

der Aufreinigung 250 – 400 µg Aptamer RNA.

4.3 Konformation und Stöchiometrie des RNA-Tc Komplexes

4.3.1 Analyse des molaren Verhältnisses im Tc-RNA Komplex über analytische

Gelfiltration

Um strukturelle Änderungen oder Multimerisation an der RNA erfassen zu können, wurden

analytische Gelfiltrationsexperimente durchgeführt. 15 µl einer 40 µM Tc-Minimer RNA-

Lösung in Puffer-T wurden in An- und Abwesenheit von 120 µM Tc einer Gelfiltrations-

Chromatografie unterzogen. Der genaue Ablauf ist in Kapitel 3.3.10 beschrieben. Abbildung

4.5 zeigt das resultierende Chromatogramm der untersuchten Tc-Minimer RNA. Die

schwarze Linie entspricht der optischen Dichte bei 290 nm. Bei dieser Wellenlänge wurde das

Laufverhalten der RNA verfolgt. Die gepunktete rote Linie entspricht der optischen Dichte

bei 374 nm, bei der das Tc detektiert wurde. Die Analyse der freien RNA ergibt ein einziges

scharfes Signal bei 1,2 ml. Das Fehlen von zusätzlichen Signalen spricht für eine homogene

RNA-Population. Die Analyse des RNA-Tc Komplexes resultiert in zwei Signalen für die

oD290. Das stärkere Signal stammt von der RNA, wohingegen das zweite Signal vom Tc

Ergebnisse 59

stammt, welches ebenfalls UV-Licht bei 290 nm absorbiert. Die Detektion bei 374 nm ergab

ebenfalls zwei Signale. Das erste oD374 Signal stimmt mit dem oD290 Signal der freien

RNA überein. Dies zeigt, dass Tc an die RNA gebunden ist. Das zweite Signal von oD374 bei

2,3 ml stammt von überschüssigem Tc, welches aufgrund seines im Vergleich zum Tc-RNA

Komplex geringeren hydrodynamischen Radius stärker verzögert wird. Die strikte

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

optis

che

Dic

hte

Volumen / ml0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

optis

che

Dic

hte

Volumen / ml

A B

Abbildung 4.5

Chromatogramm der freien Tc-Minimer RNA (A) und des Tc-RNA Komplexes (B) in Puffer T. Die schwarze Linie zeigt die oD290 (RNA Absorption), die gepunktete rote Linie die oD374 (Tc Absorption). RNA wird nach 1,2 ml eluiert, freies Tc nach 2,3 ml.

Kolokalisation von gebundenem Tc und Aptamer RNA zeigt, dass es sich um einen kinetisch

und thermodynamisch stabilen Komplex handelt. Aufgrund der Komplexbildung kommt es

somit zu keiner über Größenausschluss-Chromatografie detektierbaren, Tc-bedingten

strukturellen Änderung oder Multimerisation der RNA.

Stöchiometrie des Tc-RNA Komplexes

Die Stöchiometrie wurde anhand der Chromatogramme (Abbildung 4.5) aus den exakten

RNA (R) und Tc Konzentrationen berechnet. Dazu musste berücksichtigt werden, dass Tc

ebenfalls UV-Licht bei 290 nm absorbiert. Die Extinktionskoeffizienten ε290(Tc) und

ε290(R) wurden anhand der oD290(Tc) und oD290(R) von Tc und RNA in Puffer-T ermittelt.

Die exakte Tc Konzentration wurde durch UV Absorptionsspektroskopie bestimmt

(Takahashi et al., 1986). Die RNA Konzentration wurde mit 1 oD260 = 0,035 mg/ml und

einem Molekulargewicht von 320 g/mol pro Nt berechnet.

Ergebnisse 60

Dies ergibt

ε290(tc) = oD290(tc) / ( c(tc) x d ) = 9658 M-1 x cm-1 für Tc und

ε290(R) = oD290(R) / ( c(R) x d ) = 95630 M-1 x cm-1 für die RNA.

Als nächstes wurden die Verhältnisse Q(Tc) und Q(R) der oD374 und oD290 für Tc und die

RNA berechnet.

Q(Tc) = oD374(Tc) / oD290(Tc) = 1.872 und

Q(R) = oD374(R) / oD290(R) = 0.000531.

Die Werte oD374(ges) = 0.06257 und oD290(ges) = 0.377063 wurden anhand der

Gelfiltration bei 1,2 ml ermittelt und geben die jeweilige optische Dichte für den Tc-RNA

Komplex (ges) wieder.

Für freie RNA gilt:

oD374(ges) – Q(R) x oD290(ges) = oD374(R) – Q(R) x oD290(R) = 0

Für freies Tc gilt:

oD374(ges) – Q(tc) x oD290(ges) = oD374(tc) – Q(tc) x oD290(tc) = 0

Um die Konzentration von Tc in einer Tc-RNA Mischung zu berechnen, muss berücksichtigt

werden, dass in der folgenden Gleichung immer gilt, dass (Tc) = (ges), da die RNA keinen

Beitrag leistet:

oD374(ges) – Q(R) x oD290(ges) = oD374(tc) – Q(R) x oD290(tc)

= oD290(tc) x ( Q(tc) – Q(R) )

= c(tc) x d x ε290(tc) x ( Q(tc) – Q(R) )

Die Konzentration von Tc in der Mischung berechnet sich daher zu:

c(Tc) = ( oD374(ges) – Q(R) x oD290(ges) ) / (ε290(Tc) x d x ( Q(Tc) – Q(R) ) )

Ergebnisse 61

Um die Konzentration von RNA in einer Tc-RNA Mischung zu berechnen, muss

berücksichtigt werden, dass in der folgenden Gleichung immer gilt, dass (R) = (ges), da das

Tc keinen Beitrag leistet:

oD374(ges) – Q(Tc) x oD290(ges) = oD374(R) – Q(Tc) x oD290(R)

= oD290(R) x ( Q(R) – Q(Tc) )

= c(R) x d x ε290(R) x ( Q(R) – Q(Tc) )

Die Konzentration von RNA in der Mischung berechnet sich daher zu:

c(R) = ( oD374(ges) – Q(Tc) x oD290(ges) ) / (ε290(R) x d x ( Q(R) – Q(Tc) ) )

Somit konnten die Konzentrationen der Bindungspartner im Komplex zu c(Tc) = 34,5 µM

und c(RNA) = 35,9 µM berechnet werden. Dies ergibt ein molares Verhältnis von Tc / RNA

= 0,96 und zeigt an, dass es sich um einen äquimolaren Tc-RNA Komplex handelt

4.3.2 Visualisierung des Tc-Aptamer Komplexes

Aufgrund der im Gelfiltrationsexperiment beobachteten Stabilität des Tc-Aptamer Komplexes

wurde als nächstes versucht, den Komplex mit Hilfe nativer Polyacrylamid Gelelektrophorese

(PAGE) zu visualisieren. Dieses Verfahren weist für gewöhnlich eine höhere Sensitivität

bezüglich struktureller Änderungen auf. Dazu wurde 20 µM RNA ohne und mit 50 µM Tc in

Puffer-T inkubiert und wie in Kapitel 3.3.7 beschrieben mittels nativer PAGE

elektrophoretisch analysiert. Das Gel für Wildtyp RNA und die A55U Mutante ist in

Abbildung 4.6 (A) gezeigt.

Die Spuren 1 – 2 zeigen das Gel nach Ethidiumbromid-Färbung. Die Spuren 3 – 4 zeigen die

Tc-Fluoreszenz des Gels unter 365 nm UV-Licht. Die Spuren 5 – 6 zeigen eine Überlagerung

der Tc-Fluoreszenz und des Ethidiumbromid gefärbten Gels. Tc war in den Spuren 2 und 4

enthalten. Anhand der Ethidiumbromid-Färbung ist deutlich zu erkennen, dass die Tc-

Minimer RNA eine einzige Konformation annimmt. Das Tc-Fluoreszenz-Signal stimmt exakt

mit der Laufweite der RNA überein. Dies bedeutet, dass die RNA Tc binden kann. Ebenso ist

zu beobachten, dass es durch Tc zu keiner detektierbaren Veränderung der

elektrophoretischen Mobilität der RNA kommt. Dies wäre ein Hinweis auf strukturelle

Veränderungen gewesen, die sich auf den hydrodynamischen Radius der RNA auswirken.

Ergebnisse 62

Solche Veränderungen sind z.B. Multimerisations-Ereignisse, aufgrund derer zusätzliche

RNA-Signale mit geringerer elektrophoretischer Mobilität zu erwarten gewesen wären.

0 10 20 30 40 50

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

c Konzentration (µM)

rela

tive

Fluo

resz

enz

A B

Tc - + - + - + - + - + - +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tc-Minimer A55U

Abbildung 4.6

(A) Native PAGE zur Analyse der Komplexbildung von Aptamer RNA Minimer RNA, in Spur 7 – 12 die A55U Mutante untersucht. Spuren 1 - 2 ungefärbte Gel, Spuren 3 – 4 und 9 – 10 zeigen die Tc-Fluoreszenz bei BestraSpuren 5 – 6 und 11 – 12 sind die entsprechenden Überlagerungen zKomplexbildung von Tc-Minimer RNA und steigenden Tc-KonzentrationenGelfotos gibt die Tc-Fluoreszenz wieder, der untere Teil zeigt das Ethidiumb Die Spuren 7 - 12 zeigen die A55U Mutante. Von dieser Mut

einer Verschlechterung des Regulationsfaktors in vivo führt

experimentelle Vorgehen war identisch mit dem für die Wild

zeigen das Gel nach Ethidiumbromid-Färbung. Die Spuren 9 –

des Gels unter 365 nm UV-Licht. Die Spuren 11 – 12 zeige

Fluoreszenz und des Ethidiumbromid gefärbten Gels. Tc war in

Im Gegensatz zur Wildtyp-RNA zeigt die A55U Mutante eine

geringerer elektrophoretischer Mobilität. Aufgrund des A55U

Bereich L3 zur palindromen Sequenz 51GAAUUC. Dies er

(Formation eines „kissing loop“ Komplexes), die als z

verzögertem Laufverhalten sichtbar wird. Diese RNA-Spezies

binden, da an dieser Stelle kein für Tc typisches Fluoresz

monomere Form ist in der Lage, Tc zu binden. Dies bestätigt

Komplex aus jeweils einem Molekül monomerer RNA und eine

den vorliegenden Bedingungen liegen ca. 50% der A55U RNA

Dimer vor. Aufgrund der Dimerisierung scheint es im betr

strukturellen Umorientierungen zu kommen, die eine Tc-Bind

Hinweis, dass diese Region an der Tc-Bindung beteiligt ist.

T

und Tc. In Spur 1 – 6 wurde Tc-d 7 – 8 zeigen das Ethidiumbromid

hlung mit 365 nm UV-Licht. In den u sehen. (B) Quantifizierung der . Der obere Teil des eingebundenen romid gefärbte Gel.

ation ist bekannt, dass sie zu

(Hanson et al., 2005). Das

typ-RNA. Die Spuren 7 – 8

10 zeigen die Tc-Fluoreszenz

n eine Überlagerung der Tc-

den Spuren 2 und 4 enthalten.

zusätzliche RNA-Bande mit

Nt-Austausches kommt es im

möglicht eine Dimerbildung

usätzliche RNA-Bande mit

ist nicht in der Lage, Tc zu

enzsignal auftritt. Allein die

die Annahme, dass der aktive

m Molekül Tc besteht. Unter

als Monomer und ca. 50% als

offenen Bereich von L3 zu

ung verhindern. Dies ist ein

Ergebnisse 63

Anschließend wurde die Stöchiometrie der Tc-RNA Komplexbildung anhand eines

Titrationsexperiments untersucht. Dazu wurde 20 µM Tc-Minimer RNA mit 0, 10, 15, 20, 30

und 50 µM Tc in insgesamt 10 µl Puffer-T inkubiert und einer nativen PAGE unterzogen. Die

Tc-Fluoreszenz eines jeden Komplexes wurde densidometrisch quantifiziert und gegen die

Tc-Konzentration aufgetragen. Die resultierende Bindekurve ist in Abbildung 4.6 (B)

dargestellt. Das Ethidiumbromid gefärbte Gel und die zugehörige Tc-Fluoreszenz sind

ebenfalls abgebildet. Die Bindekurve erreicht die Sättigung bei 15 µM Tc. Dies weißt

ebenfalls auf einen äquimolaren Komplex aus Aptamer-RNA und Tc hin.

4.4 Thermodynamische Charakterisierung des RNA-Tc Komplexes

Die Ergebnisse von analytischer Gelfiltration und nativen PAGE Experimenten bestätigten

nicht nur die angenommene 1:1 Stöchiometrie und die Existenz von konformationell

homogenen Populationen von freier und an Tc gebundener RNA, sondern deuten auch auf

eine ausgesprochen hohe thermodynamische Stabilität des Komplexes hin. Daher wurde diese

Komplexbildung mittels zweier unterschiedlicher Verfahren näher charakterisiert.

4.4.1 Titrationsfluoreszenzspektroskopie

Aufgrund seiner chemischen Struktur fluoresziert Tc bei Anregung mit 370 nm UV-Licht im

Bereich von 480 – 520 nm. Beim Übergang aus einer wässrigen (in Lösung) in eine

hydrophobe (im Komplex mit RNA) Umgebung kommt es zu einer starken Zunahme der Tc-

Fluoreszenz, welche quantifiziert werden kann (Takahashi et al., 1986). Dieses intrinsische

Verhalten von Tc wurde bei der Titrationsfluoreszenzspektroskopie ausgenutzt.

Fluoreszenzmessungen am Tc-Aptamer

Zur Quantifizierung der Bindung von Tc an das Aptamer wurden Dissoziationskonstanten

(KD) bestimmt. Dazu wurde in vitro transkribierte Aptamer RNA zu einer Tc-Lösung in

Puffer-K titriert und der entstandene Fluoreszenzanstieg detektiert (Abbildung 4.7 (A)). Das

experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.8 beschrieben. Aus dem Fluoreszenzanstieg wurde

die isothermale Bindekurve berechnet. Abbildung 4.7 (B) zeigt die berechnete Bindekurve.

Für das Tc-Aptamer wurden durch nichtlineare Regression ein KD von 0,73 nM und eine

Stöchiometrie N von 1,05 ermittelt. Alle Experimente wurden mindestens zweimal

wiederholt. Die gewonnenen Daten sind in Tabelle 4.3 enthalten.

Ergebnisse 64

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

2000

4000

6000

8000

10000

Puffer 0 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 6 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 5 10 15 20

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

F S

freie RNA / nM

A B

Abbildung 4.7

(A) Spektrenschar der Titration von Tc-Aptamer RNA zu 0,5 nM Tc. (B) Die ausgefüllten Symbole zeigen die Messwerte, die durchgezogene Linie die berechnete Bindekurve.

Mg2+-Abhängigkeit der Komplexbildung von Aptamer-RNA und Tc

Die Tertiärstruktur und Stabilität einer RNA sind von essentieller Bedeutung für ihre

biologische Funktion (Ohmichi et al., 2002). Für die Struktur und somit auch für die Funktion

katalytischer RNAs sind divalente Kationen wie Mg2+ von größter Bedeutung (Bujalowski et

al., 1986; Koizumi et al., 1991; Sugimoto et al., 1996). Für Tc ist ebenfalls bekannt, dass es

in der Lage ist, Mg2+ Ionen zu binden. Daher wurde die Mg2+-Abhängigkeit der Tc-Bindung

an die Aptamer-RNA fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Zu 0,5 nM Tc in 20 mM K-PO4

(pH 7,5), 100 mM NaCl und 1 mM EDTA wurde Tc-Aptamer RNA titriert (bis 15 nM

Endkonzentration). Hierbei war kein Anstieg in der Tc-Fluoreszenz messbar, wie er für die

Komplexbildung typisch ist (siehe Abbildung 4.8). Erst bei Zugabe von Mg2+ Ionen konnte

wieder der typische Fluoreszenzanstieg beobachtet werden.

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

2000

4000

6000

8000

10000 1mM EDTA 0 nM RNA 5 nM RNA 15 nM RNA + 1 mM MgCl2 + 2 mM MgCl2 + 10 mM MgCl2 + 15 mM MgCl2

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm

Abbildung 4.8

Mg2+-Titration von 0,5 nM Tc mit 15 nM Tc-Aptamer RNA in 20 mM K-PO4 (pH 7,5), 100 mM NaCl und 1 mM EDTA. Anschließend Zugabe von MgCl2 bis zu einer Endkonzentration von 15 mM.

Ergebnisse 65

Tabelle 4.3 Getestete Aptamer-Mutanten

Tetracyclin Doxycyclin Col 2 Oxytetracyclin

RNA c(Tc) (nM) N KD

(nM) Regulation in vivo a

c(dox) (nM) N KD

(nM) c(Col2)

(nM) N KD (nM)

c(Oxy)(nM) N KD

(nM)

Tc-Aptamer 0,5 1,05 ±0,01

0,73 ±0,05 5,8 10 1,21

±0,02 115 ±4 1,0 1,22

±0,04 9,8 ±0,9 1,0 1,00

±0,01 1,37 ±0,08

A8G

0,5 1,06 ±0,02

0,93 ±0,08 3,1

A9G 40 1,09 ±0,01

149 ±8 1,0 30 1 17700

±4300 10 1,14 ±0,01

2600 ±40 40 1,17

±0,01 450 ±10

A13U 30 1,26 ±0,01

210 ±3 0,9 30 1,50

±0,01 2390 ±40 30 1,39

±0,01 1700 ±30 30 1,26

±0,01 520 ±10

A50U 40 1,26 ±0,02

184 ±6 0,9, 0,9 b 50 1 10500

±2500 10 1,21 ±0,01

2600 ±70 40 1,15

±0,01 605 ±15

G51U 0,5 1,17 ±0,01

2,9 ±0,1 3,0

U54G 0,5 1,01 ±0,02

2,50 ±0,20 3,3

A55G 1,0 1,03 ±0,01

1,50 ±0,06 2,9 c

N Stöchiometrie; Kursiv geschriebene Werte: die Sättigung konnte nicht erreicht werden, daher wurden die Werte aus der Anfangssteigung berechnet a Die angegebenen in vivo Regulationsfaktoren geben das Verhältnis der GFP-Fluoreszenz mit und ohne 100 µM Tc im Medium wieder (Hanson et al., 2005). b A50U und A55G erzeugen ein zusätzliches Startkodon und sind somit nicht direkt messbar, in vivo Regulationsfaktoren für A50G bzw. A50C c Regulationsfaktor wurde als Doppelmutante mit A53C um die Bildung eines zusätzliches Startkodons zu verhindern. A53C zeigt in vivo Regulation wie WT.

Ergebnisse 66

Fluoreszenzmessungen mit verschiedenen Tc-Derivaten

Um die Interaktion von Tc und RNA näher zu charakterisieren, wurde das Bindungsverhalten

verschiedener Tc-Derivate an das Tc-Aptamer fluoreszenzspektroskopisch analysiert. Dies

diente nicht nur zur Analyse der Substratspezifität der Aptamer-RNA in vitro, sondern auch

zur Ermittlung funktioneller Gruppen, welche für die Komplexbildung essentiell sind. Die

untersuchten Tc-Derivate sind in Tabelle 4.4 aufgelistet und unterscheiden sich durch ein oder

mehrere Substitutionen an ihren funktionellen Gruppen von Tc. Diese sind in Abbildung 4.9

dargestellt. Die eingesetzten Konzentrationen wurden dem Bindeverhalten des jeweiligen Tc-

Derivats angepasst. Alle Messungen wurden mindestens zweimal wiederholt. Die

aufgezeichneten Spektren und alle berechneten isothermalen Bindekurven sind im Anhang in

Abbildung 8.4 dargestellt.

OH R11 R12 O

OH

OH

R6α R6βR7

R2

Η HR5α R4α

7

10

6

11

5

12

4

1

Abbildung 4.9

Struktur von Tc; die in dieser Arbeit untersuchten funktionellen Gruppen sind nummeriert. Die entsprechenden Substitutionen sind in Tabelle 4.4 aufgelistet.

Die resultierenden Dissoziationskonstanten und Stöchiometrie-Werte sind in Tabelle 4.4

dargestellt.

Der Austausch der Position R7 durch eine Cl-Gruppe (7-Chlor-Tc: KD 0,57 nM) führt zu

keiner signifikanten Änderung in der Affinität zur Aptamer-RNA. Ebensowenig die

Substitution von R5α mit einer OH-Gruppe (Oxy-Tc: KD 1,37 nM). Der Austausch der

Dimethyl-Amino-Gruppe an Position R4α durch eine OH-Gruppe (Col 6: KD 2,5 nM) oder

durch einen Wasserstoff (Col 1: KD 2,6 nM) verursacht nur einen minimalen Abfall der

Dissoziationskonstante. Der Wechsel von der Keto-Enol-Gruppe an Position R11-R12 zu einer

Pyrazol-Gruppe im Kontext von Col 1 ergibt das Derivat Col 5 (KD 0,62 nM) und führt

ebenfalls zu keiner signifikanten Äffinitätsänderung. Für Col 5 ist anzumerken, dass bei der

Fluoreszenz-Titration mit Aptamer-RNA eine viel höhere Konzentration des Derivates (20

nM) eingesetzt werden musste als bei der Titration von Tc, 7-Chlor-Tc oder Oxy-Tc (0,5 nM

bzw. 1 nM), welche ähnliche Dissoziationskonstanten ergeben wie letztlich Col 5, da das

emittierte Fluoreszenz-Signal ansonsten zu schwach ist. Die Amid-Gruppe an Position R2 ist

Ergebnisse 67

von größerer Bedeutung für die Komplex-Bildung, da die Substitution mit einer CN-Gruppe

(Col 2: KD 9,8 nM) eine Reduktion in der Bindung um den Faktor 14 bewirkt. Doxycyclin

(KD 115 nM) trägt zwei Substitutionen. Zum einen an Position R5α eine OH-Gruppe (wie

Oxy-Tc) und zusätzlich an Position R6β einen Wasserstoff. Somit ist im Vergleich von

Doxycyclin mit Oxy-Tc der Einfluss von R6β messbar. Diese Substitution an R6β erzeugt eine

drastische Reduktion in der Affinität zu Tc-Aptamer RNA um den Faktor 80. Eine Analyse

von Col 8 (KD 570 nM), welches zusätzlich zu den Austauschen in Doxycyclin noch an

Position R4α einen Wasserstoff trägt (wie in Col 1), ergibt für die Position R6β ebenfalls eine

ca. 80 fache Reduzierung der Affinität. Bei Sancyclin (KD 16,5 nM), die Reste R6α und R6β

tragen jeweils einen Wasserstoff, ist dieser Effekt nur in stark abgeschwächter Form zu

beobachten. Hier wird das Fehlen der R6β OH-Gruppe vermutlich durch eine strukturelle

Umorientierung teilweise kompensiert. Im Falle von Anhydro-Tetracyclin (KD 3,5 nM) ist R6β

deletiert und es kommt nur zu einer um den Faktor 5 reduzierten Affinität. In diesem Falle ist

der Kohlenstoff, welcher R6β trägt sp2 hybridisiert, wodurch die R6α Methyl-Gruppe in die

Ringebene wandert und eine größere Fläche für Basen-Stapelungseffekte erzeugt. Dies könnte

den Affinitätsverlust teilweise kompensieren.

Somit sind von den untersuchten funktionellen Gruppen im Tc die Positionen R6β (Faktor 80)

und R2 (Faktor 14) für die Bindung an die Tc-Aptamer RNA von großer Bedeutung.

Fluoreszenzmessungen an Mutanten von Tc-Aptamer RNA

Um zu untersuchen, welche Nt an der Tc-Bindung und in vivo Regulation beteiligt sind,

wurden interessante Positionen in der Aptamer-RNA mutagenisiert und ebenfalls

fluoreszenzspektroskopisch analysiert. Mehrere Positionen im Aptamer weisen einen starken

Tc-abhängigen Schutz bei enzymatischen und chemischen Interferenzstudien auf (A09N7&N1,

U12N3, A13N7>N1, A49N7>N1, A50N7>N1, G51N1&N2, U54N3, A55X, G57N1&N2; (Hanson et al.,

2005)). Aus diesen wurden je drei Positionen ausgewählt, die in Bezug auf Tc-abhängige

Regulation der Translation in vivo Mutationen gegenüber intolerant (A09, A13, A50) bzw.

tolerant (G51, U54, A55) sind. Die beiden letzten Positionen wurden auch wegen ihrer Nähe

zu einem Bereich im RNA-Rückgrat gewählt, welcher in Gegenwart von Tc gegen Hydroxyl-

Radikal-Spaltung hypersensitiv wird (Hanson et al., 2005). Als zusätzliche Kontrolle wurde

A08 mitgeführt, da diese Position nur einen minimalen Tc-abhängigen Schutz bei

Interferenzstudien zeigt und nach saturierender Mutagenese noch in vivo Regulationsfaktoren

von 2,1 (A08U), 2,8 (A08C) und 3,1 (A08G) aufweist (Hanson et al., 2005). Diese Auswahl

Ergebnisse 68

Tabelle 4.4 Getestete Tc-Derivate

Tc-Derivat R R R R R R2 R4α 5α 6α 6β R7 11 12 Konz.(nM)

KD (nM) rel. Fluoreszenza (%) Regulation

in vivo b

Tc CONH2 N(CH3)2 H CH3 OH H O OH 0,73 ±0,05

19,6±0,1 5,1

Oxy-Tc

OH 1 1,37 ±0,08 22,4±0,9 4,5

Col 6 OH 1 2,5 ±0,3 50±2 2,0

Col 1 H 1 2,6 ±0,2 71±20c 1,4c

Anhydro-Tc - 50 3,5 ±0,7 nd nd

Col 2 CN 1 9,8 ±0,9 77±5 1,3

7-Chlor-Tc Cl 1 0,57 ±0,05 26,2±0,6 3,8

Sancycline H H 10 16,5 ±0,7 77±8 1,3

Doxycycline OH H 10 115 ±4 86±3 1,1

Col 8 H OH H 10 570 ±20 nd nd

Col 5 H NNH 20 0,62 ±0,30 50,9±0,9 2,0

0,5

Funktionellen Gruppen aller verwendeten Tetracyclin-Derivate. Es sind jeweils die Unterschiede zu Tc angegeben. Die bei Fluoreszenzmessungen eingesetzten Konzentrationen sind angegeben. a Relative Fluoreszenz der in vivo Regulation. Die durch durch pWHE601-AN32 exprimierte GFP-Fluoreszenz wurde auf 100% gesetzt. b Die Effizienz der Regulation in vivo ist angegeben als das Verhältnis der relativen GFP-Fluoreszenz in Ab- und Anwesenheit von 100 µM Tc im Medium. c In vivo Regulation wurde mit 20 µM Col 1 bestimmt, da höhere Konzentrationen zu Wachstumsinhibierung führen. nd nicht detektierbar, aufgrund von Wachstumsinhibierung, Verursacht durch das entsprechende Tc-Derivat.

Ergebnisse 69

ergab drei Paare benachbarter Nukleotide, welche sich in ihren Eigenschaften bezüglich der

Interferenzstudien und Regulation unterscheiden (A08 und A09), sich nur in der Regulation

unterscheiden (A50 und G51) oder in beiden Belangen ähnlich sind (U54 und A55). Für diese

Mutanten wurde die Dissoziationskonstante über Fluoreszenztitrationsspektroskopie, wie in

Kapitel 3.3.8 beschrieben bestimmt. Alle Experimente wurden mindestens zweimal

wiederholt.

Zunächst wurden diejenigen Positionen untersucht, welche bei Mutation zum Verlust der in

vivo Regulation führen und somit einen großen Beitrag zur Tc-Bindung leisten. In Abbildung

8.1 sind exemplarisch die Spektrenscharen und die berechneten Bindekurven für die Aptamer-

Mutanten A9G, A13U und A50U von jeweils einer Messreihe dargestellt. Die ermittelten

Dissoziationskonstanten sind in Tabelle 4.3 enthalten.

Die eingeführten Mutationen resultieren in einer drastisch reduzierten Affinität zu Tc. Daher

wurden für die Fluoreszenzmessungen höhere Tc Konzentrationen vorgelegt (A9U 40 nM, bei

A13U 30 nM und bei A50U 40 nM), um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Die

berechneten Dissoziationskonstanten betragen für A9G 173 nM, für A13U 210 nM und für

A50U 184 nM. Die Komplexstöchiometrie N wurde bei allen untersuchten RNAs auf 1,1 bis

1,2 berechnet. Die eingeführten Mutationen haben somit keinen Einfluss auf den

Komplexaufbau.

Die Mutationen G51U, U54G und A55G werden in vivo noch weitgehend toleriert und

ergeben Regulationsfaktoren von ca. 3 (Hanson et al., 2005). Diese Nukleotid-Positionen in

der Aptamer-RNA sind somit von untergeordneter Bedeutung für die Tc-Bindung, liegen aber

dennoch im Bereich der postulierten Tc-Bindetasche. In Abbildung 8.2 sind exemplarisch die

Spektrenscharen und die berechneten Bindekurven für die Aptamer-Mutanten G51U, U54G

und A55G von jeweils einer Messreihe dargestellt. Die resultierenden

Dissoziationskonstanten sind in Tabelle 4.3 enthalten. Die eingeführten Mutationen

resultieren in einer geringfügig reduzierten Affinität zu Tc. Die berechneten

Dissoziationskonstanten für G51U, U54G und A55G betragen 2,9 nM, 2,5 nM und 1,5 nM.

Dies entspricht einer 2- bis 4-fach schlechteren Bindung im Vergleich zur Wildtyp-RNA. Die

Komplexstöchiometrie N ergibt einen Wert von ca. 1,1. Die eingeführten Mutationen haben

somit ebenfalls keinen Einfluss auf die Zusammensetzung des Tc-RNA Komplexes.

Die Mutation A8G wird in vivo ebenfalls noch gut toleriert, wenngleich sich der

Regulationsfaktor auf 3,1 reduziert (Hanson et al., 2005). In Abbildung 8.3 sind die

aufgezeichnete Spektrenschar und die berechnete Langmuir Isotherme aus einer Messreihe

dargestellt. Die Mutation führt zu einer minimal schlechteren in vitro Bindung an Tc mit

Ergebnisse 70

einem KD Wert von 0,93 und einer Stöchiometrie N von 1,06. Die Messdaten sind in Tabelle

4.3. enthalten.

Von allen untersuchten Positionen im Tc-Aptamer zeigen die Nukleotide A09, A13 und A50

bei Mutation nach A09G (Faktor 200), A13U (Faktor 290) und A50U (Faktor 250) den

größten Einfluß auf die Affinität des Aptamers zu Tc.

„Double Mutant Cycle“ Analyse nach Fersht zur Bestimmung möglicher

Interaktionspartner

Aus den vorherigen Fluoreszenz-Titrations-Experimenten geht hervor, dass die Nukleotide

A9, A13 und A50 in der Aptamer-RNA und die funktionellen Gruppen R6β und R2 von Tc

maßgeblich an der Tc-Aptamer-RNA Komplexbildung beteiligt sind. Um mögliche

intermolekulare Kontakte zwischen diesen Positionen zu ermitteln, wurden Über-Kreuz-

Messungen von den Tc-Aptamer Mutanten A9G, A13U und A50U mit den Tc-Derivaten

Oxytetracyclin, Col 2 und Doxycyclin durchgeführt.

Die Titration von Oxytetracyclin mit den Aptamer-Mutanten A9G, A13U und A50U ergibt

die stärkste Bindung mit einem KD von 450 nM, 520 nM bzw. 605 nM (Tabelle 4.3). Die

Affinität zwischen der jeweiligen Mutanten-RNA und Oxytetracyclin im Vergleich zu Tc ist

in etwa um das 3-fache reduziert und entspricht der beobachteten 50%igen Reduktion der

Bindungsstärke von Wildtyp-RNA mit Oxytetracyclin im Vergleich zu Tc.

Col 2, welches zum Tc-Aptamer eine 14-fach geringere Affinität aufweist als Tc, führt bei

Titration mit den Mutanten A9G und A50U zu einer Dissoziationskonstanten von jeweils

2600 nM, bei der Mutante A13U zu einem KD von 1700 nM (Tabelle 4.3). Im Falle von Col 2

ergibt sich mit den untersuchten Aptamer-Mutanten somit eine durchschnittliche Erhöhung

des KD-Wertes um den Faktor 13.

Doxycyclin, welches Mutationen an R5α (wie Oxytetracyclin) und an R6β trägt, ergab bei

Titration mit den Mutanten A9G bzw. A50U nur einen minimalen Fluoreszenzanstieg, so dass

es nicht möglich war den Sättigungsbereich zu erreichen. Die Dissoziationskonstanten für

Doxycyclin mit der Mutante A9G (KD=17700 nM) bzw. A50U (KD=10500 nM) wurden daher

aus den gemessenen Fluoreszenzanstiegen extrapoliert.

Um direkte Kontakte zwischen den Nukleotiden A09, A13 und A50 zu den Tc-Positionen R2,

R5α und R6β zu erkennen, wurden die freien Bindungsenergien (∆G und ∆∆G) der

Einzelmutationen und Kombinationsmutationen (im Anhang in Tabelle 8.8 zusammengefasst)

nach der „double mutant cycle“ Methode miteinander verglichen (Carter et al., 1984; Fersht

et al., 1992; Frisch et al., 1995; Horovitz, 1987). In Abbildung 4.10 (A) ist exemplarisch der

Ergebnisse 71

Rechenweg für die Kombination WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A13U-RNA mit

Doxycyclin aufgeführt.

A B C

∆∆G = 4.41 kcal/mol

TR

∆∆G = 2.6 kcal/molTwtOTc

wtDox

A13UDox

A13UOTc

∆∆G

= 3

.5 k

cal/m

olR

∆∆GT ∆∆GR

∆∆GTR

2

1

3

4

5

6

∆∆GT

R∆∆G+

∆∆GT

R∆∆G+

-

TcOTc

TcOTc

TcOTc

DoxOTc

DoxOTc

DoxOTc

TcCol2

TcCol2

TcCol2

wt-A09G wt-A13U wt-A50U

-2

-1

R5α R6β R6β R6βR2 R2 R2R5α R5α

Abbildung 4.10

(A) Rechenschema zur „double mutant cycle“ Methode zur Bestimmung von Interaktionspartnern im Komplex am Beispiel von WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A13U-RNA mit Doxycyclin. (B) Balkendiagramm der ∆∆G Werte. (C) Balkendiagramm der berechneten ∆∆Gint Werte der untersuchten Kombinationen aus RNA und Tc-Derivat.

∆∆GT und ∆∆GR stellen jeweils den Unterschied der freien Bindungsenergien dar, der sich bei

Betrachtung von einem Austausch im Tc oder in der RNA ergibt. Diese werden im Diagramm

durch die dunkelblaue bzw. dunkelrote Farbe dargestellt. ∆∆GTR gibt den Unterschied in der

Bindungsenergie wieder, der sich durch den gleichzeitigen Austausch der zuvor einzeln

betrachteten Positionen im Tc (-Derivat) und der RNA ergibt. Dieser Reaktionsweg ist in

schwarz dargestellt. In Abbildung 4.10 (B) sind die Messwerte (dunkelblau, dunkelrot und

schwarz) grafisch dargestellt. Wenn die zwei untersuchten Positionen (in Tc (∆∆GT), die

andere in der RNA (∆∆GR)) im Komplex in direkten Kontakt zueinander stehen, so ergibt

sich ein deutlicher Unterschied zwischen dem direkt gemessenen Wert ∆∆GTR (in schwarz)

und der (theoretischen) Summe von ∆∆GT und ∆∆GR. Dieser Unterschied in der freien

Bindungsenergie (∆∆Gint) ist in grün dargestellt. In Abbildung 4.10 (C) sind diese für alle

untersuchten Kombinationen zusammengefasst. Den größten Effekt zeigt der Vergleich von

WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A13U-RNA mit Doxycyclin (∆∆Gint=-1,72 kcal/mol),

gefolgt von WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A50U-RNA mit Doxycyclin (∆∆Gint=-

0,93 kcal/mol). Dies zeigt, dass Nukleotid A13 (und eventuell auch A50) in direkten Kontakt

zur R6β OH-Gruppe von Tc steht. Alle anderen Kombinationen ergeben keinen signifikanten

Wert für ∆∆Gint und somit keinen gemeinsamen Kontakt.

Ergebnisse 72

4.4.2 Isothermale Titrationskalorimetrie

Zur näheren thermodynamischen Charakterisierung des Komplexes und zur Bestätigung der

Daten aus den Fluoreszenzspektroskopieexperimenten wurde isothermale Titrations-

Kalorimetrie (ITC) durchgeführt. Mit Hilfe von ITC-Experimenten können Wärmeströme in

einer Größenordnung von weniger als 1 µcal/sek detektiert und quantitativ erfasst werden.

Dies ermöglicht es, die freigewordene oder aufgenommene Wärmeenergie bei der Umsetzung

der Reaktionspartner exakt zu bestimmen. Aus den gewonnenen Daten können nicht nur die

Dissoziationskonstante, die Stöchiometrie und die Änderung der Enthalpie ∆H sehr genau

bestimmt werden, vielmehr erlaubt der isothermale Aufbau auch die Berechnung der

Entropieänderung -T∆S und der freien Gibbs´schen Reaktionsenergie ∆G (Frisch et al., 1997;

Ladbury et al., 1996). Der enthalpische Beitrag entspricht dem Auf- und Abbau von

molekularen Wechselwirkungen, während der entropische Anteil Auskunft über die Zu- oder

Abnahme der Ordnung im System gibt, welches die beteiligten Makromoleküle und das

Lösungsmittel einschließt. Der Nachteil von ITC ist die etwas geringere Sensitivität (KD bis in

den nanomolaren Bereich) und der enorm hohe Verbrauch an RNA, welcher sich auf mehrere

hundert Mikrogramm pro Titrationsexperiment beläuft.

ITC-Messungen am Tc-Aptamer

Zunächst wurde die thermodynamische Interaktion von Tc-Aptamer RNA mit Tc und

Doxycyclin untersucht. Das experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.9 beschrieben. Die

exakten Konzentrationen an RNA in der Messzelle und Tc bzw. Doxycyclin in der

Injektionsspritze sind in Tabelle 4.5 aufgelistet. Da bei diesem Experiment die

Empfindlichkeitsgrenze des Messgeräts erreicht wurde, konnte nur eine sehr steile

Titrationskurve mit wenigen Datenpunkten im Bereich der Transition aufgezeichnet werden

(Abbildung 4.11 (A)). Für WT RNA titriert mit Tc ergibt sich somit eine

Dissoziationskonstante von 0,6 nM (∆G = -12,51 kcal/mol). Die Bindungsenthalpie ∆H,

welche unter den gegebenen Bedingungen viel verlässlicher bestimmt werden kann (Ladbury

& Chowdhry, 1996), beträgt –20,4 kcal/mol. Der resultierende entropische Beitrag -T∆S

beträgt +8,2 kcal/mol.

Ergebnisse 73

Abbildung 4.11

Zeit / Min

Wär

mee

nerg

ieµc

al /

sek

Wär

mee

nerg

ieµc

al /

sek

Inje

ktio

nsw

ärm

ekc

al /

mol

Inje

ktio

nsw

ärm

ekc

al /

mol

[Tc] / [RNA] [Doxy] / [RNA]

-0,20

-0,15

-0,10

-0,05

0,000 10 20 30 40 50 60 70 80

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

-20

-10

0

-0,2

-0,1

0,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

-20

-10

0

Zeit / Min A B

Das obere Feld zeigt die aufgezeichnete Wärmepulskurve sequentieller Injektionen von (A) Tc und (B) Doxycyclin zu Tc-Aptamer RNA in Puffer-T. Das untere Feld zeigt die integrierte Injektionswärme nach Korrektur für entsprechende Injektionen von Ligand in Puffer-T. Punkte kennzeichnen die gemessene Injektionswärme, die durchgezogene Linie ist die berechnete Bindekurve.

Um den Effekt der R6β OH-Gruppe von Tc genauer charakterisieren zu können, wurde die

Komplexbildung mit Doxycyclin ebenfalls mittels ITC untersucht. Die ermittelte

Dissoziationskonstante für den Komplex aus Tc-Aptamer RNA und Doxycyclin beträgt 65

nM. Die Transitionskurve ist aufgrund der niedrigeren Affinität deutlich flacher als im Falle

von Tc (Abbildung 4.11 (B)). Die gemessene Bindungsenthalpie ist mit -17,1 kcal/mol

deutlich niedriger als bei Tc. Dies bedeuted, dass zwischen Doxycyclin und dem Tc-Aptamer

weniger neue inter- und intramolekulare Bindungen aufgebaut werden. Der entropische Term

-T∆S ist mit 7,3 kcal/mol nur minimal geringer als bei Tc. Daraus folgt, dass sowohl bei Tc

als auch bei Doxycyclin die bei der Komplexbildung auftretenden Umorientierungen an den

beteiligten Molekülen (RNA, Tc-Derivat, Puffer) nahezu identisch sind. Alle Daten sind in

Tabelle 4.5 enthalten.

ITC-Messungen an Tc-Aptamer Mutanten

Das Bindeverhalten von Tc-Aptamer Mutanten A9G, A13U, A50U und A55G mit Tc wurde

ebenfalls mittels ITC thermodynamisch charakterisiert (Tabelle 4.5). Die hierbei gemessenen

Dissoziationskonstanten von 260 nM, 190 nM, 210 nM und 7,6 nM korrelieren sehr gut mit

den fluorimetrisch ermittelten Werten.

Die A55G Mutation bewirkt nur eine geringfügige Verschlechterung der Bindung und sowohl

der enthalpische (∆H= -19,4) als auch der entropische (-T∆S= 8,3) Beitrag erfahren bei Tc-

Bindung nur eine minimale Änderung im Vergleich zur WT-RNA. Dies verdeutlicht, dass die

Ergebnisse 74

Identität der Base an Position 55 nur von geringer Bedeutung ist und der Kontakt zum Tc

vermutlich über das RNA-Rückgrat zustande kommt.

Bei den anderen Mutanten kommt es neben einem drastischen Rückgang in der

Bindungsstärke (höherer KD) zu sehr unterschiedlichen enthalpischen und entropischen

Beiträgen zu diesem Effekt im Vergleich zur WT-RNA.

Im Falle von A13U wird der Verlust an Tc-Affinität hauptsächlich durch die reduzierte

Bindungsenthalpie ∆H von –8,9 kcal/mol verursacht, wohingegen der entropische Beitrag

(-T∆S= 8,6) nur geringfügig steigt. Diese Mutation eliminiert vermutlich eine wichtige Tc-

RNA Bindung, hat aber gleichzeitig wenig Einfluss auf die RNA-Faltung.

Bei der A09G Mutante liegt die Ursache für die reduzierte Affinität im stark erhöhten

entropischen Term -T∆S von 13,9 kcal/mol, welcher im Vergleich zu WT-RNA sehr viel

ungünstiger ist. Dies legt die Vermutung nahe, dass das Adenin an Position 9 für die (Vor-)

Strukturierung der RNA von großer Bedeutung ist und somit bei der Mutante mehr Energie

für die strukturelle Ordnung des Komplexes aufgewendet werden muss. Die

Bindungsenthalpie von -22,9 kcal/mol ähnelt dem Bindungsverhalten von WT-RNA.

Die Mutation A50U bewirkt einen enormen Verlust an Bindungsenthalpie (∆H= -8,9

kcal/mol), welcher durch den vollständigen Rückgang des ungünstigen entropischen Terms

(-T∆S= -0,2) kompensiert wird. Höchstwarscheinlich verhindert die A50U Mutation, dass

sich große Bereiche von L3 bei Tc-Bindung richtig falten.

Ergebnisse 75

Tabelle 4.5 Resultate der ITC-Experimente

Experimentelle Parameter der ITC-Messungen. Angegeben sind die jeweils verwendeten RNA und Tc Konzentrationen, sowie Anzahl und Volumen der jeweiligen Injektionen von Tc in die RNA-Lösung. Der enthalpische (∆H) und entropische (-T∆S) Term, die freie Bindungsenergie (∆G) sowie Stöchiometrie N und Assoziationskonstante KA wurden anhand der Messdaten mit der Software Microcal Origin Version 5.0 berechnet. KD wurde als 1/KA berechnet.

RNA [RNA]

in Messzelle

(µM )

[Tc]

in Spritze

(µM )

Injektionen ∆G

(kcal/mol)

∆H

(kcal/mol)

-T∆S

(kcal/mol)

N

(tc / RNA )

KA

(M-1)

KD

(nM)

Tc-Aptamer 1.71 22.89 24 * 10 µl -12,52±0,24 -20,4±0,29 7,8 1.15±0.01 (1.68±0.87)x109 0.60±0.20

A9G 5.53 49.23 19 * 15 µl -8,98±0,07

-22,9±0,35 13,9 1.18±0.01 (3.83±0.43)x106 260±30

A13U 4.63 48.40 19 * 15 µl -9,17±0,07 -17,8±0,21 8,6 1.21±0.01 (5.32±0.51)x106 190±20

A50U 3.82 58.00 19 * 15 µl -9,11±0,20 -8,9±0,27 -0,2 1.38±0.03 (5.84±1.07)x106 210±60

A55G 3.28 49.23 19 * 15 µl -11,1±0,10 -19,4±0,16 8,3 1.32±0.01 (1.32±0.26)x108 7.60±1.90

Tc-Aptamer 2.59 Doxy 36.0 24 * 10 µl -9,80±0,07 -17,1±0,22 7,3 1.25±0.01 (1.53±0.19)x107 65±10

Ergebnisse 76

4.5 Regulation der gfp-Expression in vivo durch verschiedene Tc-Derivate

Zur Untersuchung der Substratspezifität des Tc-bindenden Aptamers in vivo wurde ein

System zur konditionalen Genexpression in S. cerevisiae verwendet (Suess et al., 2003). S.

cerevisiae RS453 wurde wie in Kapitel 3.3.8 beschrieben angezogen und die GFP-

Fluoreszenz in Anwesenheit von verschiedenen Tc-Derivaten bestimmt. Die relative GFP-

Fluoreszenz, welche durch den Vektor pWHE601-AN32 in Abwesenheit von Liganden

erzeugt wurde, wird als 100% Wert angesehen. Die Regulationsfaktoren sind in Abbildung

4.12 als das Verhältnis der relativen GFP-Fluoreszenz ohne und mit Tc-Derivat angegeben.

Die relativen Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 4.4 enthalten. Alle Tc-Derivate wurden

in Konzentrationen von 100 µM eingesetzt; Col 1 konnte nur bei einer Konzentration von 20

µM verwendet, da es bei höheren Konzentrationen das Wachstum von S. cerevisiae inhibiert.

Um den Vergleich mit den anderen Derivaten zu ermöglichen, wurde für die Referenz ohne

Tc die gleiche Zellmenge eingesetzt wie im Falle von Col 1. Anhydro-Tc und Col 8 führen

selbst bei einer Konzentration von 20 µM im Medium zu einer starken

Wachstumsinhibierung. Diese beiden Derivate konnten somit nicht in vivo getestet werden.

0

1

2

3

4

5

6

Reg

ulat

ions

fakt

or

Tc-Derivat

Tc Oxy-Tc Col 6 Col 1 Col 2 7-Chlor-Tc Sancyclin Doxycyclin Col 5

Abbildung 4.12

In vivo Regulationsfaktoren der getesteten Tc-Derivate. Die relative GFP-Fluoreszenz exprimiert durch pWHE601-AN32 ohne Tc wird als 100% Wert betrachtet.

Die in vivo Regulationsfaktoren der Tc-Derivate korrelieren sehr gut mit der in vitro Affinität

zum Tc-Aptamer. Die Derivate Oxy-Tc, 7-Chlor-Tc, Col 6 und Col 5 ergeben neben

Dissoziationskonstanten bis maximal 2,5 nM die besten Regulationsfaktoren.

Ergebnisse 77

4.6 Das zweigeteilte Tc-Aptamer

Da die Tc-Bindetasche aus zwei unabhängigen Bereichen aufgebaut ist, stellte sich die Frage,

ob bereits einer dieser Teile für die Tc-Bindung ausreichend ist. Um dies zu testen, wurden

zuerst Sekundärstrukturberechnungen durchgeführt. Zum einen wurden die

Sekundärstrukturen der in Abbildung 4.13 (A und B) dargestellten 5´- und 3´-Hälften der Tc-

Minimer RNA-Sequenz berechnet. Dies ergab, dass sich nur die 3´-Hälfte wie die

Originalsequenz im Tc-Minimer zu L3 faltet. Die Hybridisierung in silico ergab, dass die

beiden Aptamer Teile zusammen ein RNA-Hybrid (Abbildung 4.13 (D)) ergeben, welches der

Sekundärstruktur von Tc-Minimer entspricht. Um dies experimentell zu bestätigen, wurde die

Tc-Minimer RNA in zwei Hälften transkribiert und die Tc-Bindung sowohl an die einzelnen

Hälften als auch an das Hybrid analysiert.

Klonierung und Transkription der Aptamer-Hälften

Das Plasmid pSP64 Tc-Aptamer wurde mit HindIII und EcoRI restringiert und mit den

hybridisierten Oligonukleotiden AptC1_F und AptC1_R (ergibt Teil 1) bzw. mit AptC2_F

und AptC2_R (ergibt Teil 2) ligiert. Nach Transformation von kompetenten E. coli DH5α

wurden positive Transformanden sequenziert. Die in vitro Transkription erfolgte in diesem

Falle nicht als Fusions-RNA mit einer Hammerhead-Ribozym-Sequenz. Die Präparation der

RNA erfolgte wie in Kapitel 3.3.7 beschrieben, ausgehend von HindIII linearisiertem Plasmid

pSP64 Tc-Minimer Teil 1 und pSP64 Tc-Minimer Teil 2. Die RNA-Sequenzen der Aptamer-

Teile lauten:

RNA Tc-Minimer Teil 1: G GGC CUA AAA CAUA CCA GCU A

RNA Tc-Minimer Teil 2: GG CUG GAG AGG UGA AGA AUA CGA CCA CCU AGG

CUC A

Abbildung 4.13 (A) zeigt ein analytisches denaturierendes RNA-Gel mit der gereinigten RNA

von Tc-Minimer Teil 1 (Spur 2) und Teil 2 (Spur 3). Als Größenstandard ist Tc-Minimer

RNA aufgetragen.

Ergebnisse 78

1 2 3 A B C D

Abbildung 4.13

(A) 15% PAA/8M Harnstoffgel der Aptamer RNA Teil 1 (Spur 2) und Teil 2 (Spur 3). Als Größenvergleich ist Tc-Minimer RNA (Spur 1) aufgetragen. Die Berechnung der theoretischen Sekundärstrukturen von RNA Tc-Minimer Teil 1 (B), Tc-Minimer Teil 2 (C) und dem Hybrid (D) erfolgte mit Hilfe der Software RNA-structure.

Tc-Bindung an das geteilte Aptamer

Anhand nativer PAA-Gelelektrophorese wurde die Tc-Bindung an die beiden Aptamer-

Hälften und deren Hybrid analysiert. Das experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.7

beschrieben. Die RNAs Tc-Minimer Teil 1 (entspricht B1-2) und Teil 2 (entspricht L3)

wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt, so dass pro Ansatz 0,2 nmol RNA enthalten

waren (Tabelle 4.6), für 5 min bei 65°C denaturiert und wieder auf RT abgekühlt.

Anschließend wurde Tc zugegeben und weitere 5 min bei RT inkubiert. Als Kontrolle wurden

in Spur 8 0,2 nmol Tc-Minimer RNA mitgeführt. Nach Beendigung der Gelelektrophorese

wurde an RNA gebundenes Tc unter 366 nm UV-Licht sichtbar gemacht. Anschließend

wurde die RNA mit Ethidiumbromid gefärbt und ebenfalls visualisiert.

Tabelle 4.6 Beladungsplan natives Gel

Spur 1 Spur 2 Spur 3 Spur 4 Spur 5 Spur 6 Spur 7 Spur 8

Tc (1 µM] + + + + + + + +

Teil 1 / nmol 0,2 - 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 -

Teil 2 / nmol - 0,2 0,15 0,125 0,1 0,075 0,05 -

Tc-Minimer / nmol - - - - - - - 0,2

Ergebnisse 79

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 A B

Abbildung 4.14

Natives 15% PAA-Gel. (A) Tc-Fluoreszenz unter 366 nm UV-Licht. (B) Das gleiche Gel nach Ethidiumbromid-Färbung. Der Beladungsplan ist in Tabelle 4.6 enthalten.

In Spur 1 und 2 sind jeweils nur Teil 1 bzw. Teil 2 enthalten. Die charakteristische grünliche

Fluoreszenz von gebundenm Tc ist in beiden Fällen nicht vorhanden. Bei einem

Mischungsverhältnis von 1 Teil Tc-Minimer Teil 1 und 0,6 Teilen Tc-Minimer Teil 2 ist die

Tc-Fluoreszenz maximal. Im Vergleich zur Tc-Fluoreszenz von 0,2 nmol Tc-Minimer in Spur

8 ist die Fluoreszenz des Komplexes aus Heterodimer und Tc deutlich schwächer. Nach

Ethidiumbromid-Färbung der RNA ist zu sehen, dass sich sich die beiden Monomere und das

Heterodimer aufgrund ihrer unterschiedlichen hydrodynamischen Radii in ihren

elektrophoretischen Mobilitäten unterscheiden (Teil 2 > Teil 1 > Tc-Minimer). Dies zeigt,

dass jede Hälfte der Tc-Bindetasche für sich alleine nicht in der Lage ist, Tc zu binden. Erst

wenn sich aus beiden Teilen ein Heterodimer gebildet hat, ist die Tc-Bindetasche wieder

ausgebildet (Spuren 2 – 7).

Bei der Titration von 10 nM Tc in Puffer-K mit RNA Teil 1 oder Teil 2 war der für Tc-

Bindung typische Fluoreszenzanstieg nicht zu verzeichnen. Dies bestätigt das Resultat der

nativen PAGE, wonach eine Aptamerhälfte für die Tc-Bindung nicht ausreicht.

Das Bindungsverhalten des Hybrids wurde ebenfalls fluorimetrisch in einem

Titrationsexperiment quantifiziert. Die beiden Hälften wurden im optimalen

Mischungsverhältnis von 1 Teil Tc-Minimer Teil 1 und 0,6 Teilen Tc-Minimer Teil 2

gemischt und zu 10 nM Tc in Puffer-K titriert. Das weitere experimentelle Vorgehen ist in

Kapitel 3.3.8 beschrieben.

Ergebnisse 80

A B

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

0

50000

100000

150000

200000

250000 0 nM RNA 3 nM RNA 6 nM RNA 9 nM RNA 12 nM RNA 15 nM RNA 18 nM RNA 21 nM RNA 24 nM RNA 27 nM RNA 30 nM RNA 39 nM RNA 48 nM RNA 57 nM RNA 66 nM RNA 75 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

Abbildung 4.15

(A) Spektrenschar der Fluoreszenztitration von 10 nM Tc in Puffer-K mit der Hybrid-RNA aus Tc-Minimer Teil 1 und Teil 2 RNA. (B) Hyperbolische Bindekurve der Titrationsreihe

In Abbildung 4.15 sind die aufgezeichnete Spektrenschar (A) und die berechnete isothermale

Bindekurve (B) dargestellt. Die Auswertung ergab einen KD von 17 nM und eine

Stöchiometrie N von 1,3. Unter der Annahme, dass das Hybrid den gleichen KD wie das Tc-

Aptamer aufweist, kann man folgern, dass etwa 25% der zutitrierten RNA ein aktives Hybrid-

Aptamer gebildet haben.

4.7 Das CAA- Aptamer

Nachdem gezeigt wurde, dass sich ein funktionelles Aptamer aus den zwei RNA-Hälften

formen kann, wurde untersucht, ob sich die beiden Hälften ebenfalls finden, wenn diese in cis

durch eine 30 Nt lange Sequenz aus sich wiederholenden CAA-Nukleotid-Tripletts getrennt

sind.

Klonierung und Transkription des CAA-Aptamers

Über zweistufige PCR-Mutagenese wurden in pSP64 Tc-Minimer zwei XhoI Schnittstellen

mit 6 Nt Abstand eingefügt. dazu wurden der Mutageneseprimer C_Xho-Linker_rev und die

beiden äußeren Primer sp und AP1_pSP64 verwendet. Das resultierende Plasmid pSP64 XhoI

wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten und mit der XhoI - (CAA)10 - XhoI

Sequenz (bestehend aus den hybridisierten Oligonukleotiden Xho_sp_F und Xho_sp_R)

ligiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pSP64 CAA und erlaubt die in vitro

Transkription der CAA-Aptamer RNA (Abbildung 4.16) als Fusions-RNA mit einer

Ergebnisse 81

Hammerhead-Ribozym-Sequenz. Transkription und Aufreinigung erfolgten wie für Tc-

Aptamer RNA beschrieben.

Die Sequenz des CAA-Aptames lautet:

5´-GGG CCU AAA ACA UAC UCG AG CAA CAA CAA CAA CAA CAA CAA CAA

CAA CAA C UCG AG AGA GGU GAA GAA UAC GAC CAC CUA GGC UC

Die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym XhoI ist in rot, die 10x CAA Sequenz ist

in blau dargestellt.

Abbildung 4.16

Die Berechnung der theoretische Sekundärstruktur des CAA-Aptamers erfolgte mit Hilfe der Software RNA-structure.

Tc-Bindung an das CAA-Aptamer

Die Quantifizierung der Bindung erfolgte durch Fluoreszenz-Titrations-Spektroskopie. Für

die Komplexbildung wurde eine Dissoziationskonstante von 4 nM und eine Stöchiometrie N

von 1,1 ermittelt.

Ergebnisse 82

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000 0 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA 25 nM RNA 30 nM RNA 35 nM RNA 40 nM RNA 45 nM RNA 50 nM RNA 55 nM RNA 60 nM RNA 65 nM RNA 70 nM RNA 75 nM RNA 80 nM RNA 85 nM RNA 90 nM RNA 95 nM RNA 100 nM RNA 115 nM RNA

Wellenlänge / nm-10 0 10 20 30 40 50 60 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

A B

nz /

cps

resz

e

Fluo

Abbildung 4.17

(A) Spektrenschar der Titration von RNA CAA-Aptamer zu 50 nM Tc. (B) Die ausgefüllten Symbole zeigen die Messwerte, die durchgezogene Linie die berechnete Bindkurve.

Dies zeigt, dass sich die zusammengesetzte Tc-Bindetasche unabhängig vom Kopfbereich des

Tc-Aptamers ausbilden kann.

4.8 Kontrollierte Regulation des Spleißens durch das Tc-Aptamer

Alternatives Spleißen ist bei höheren Eukaryoten ein Weg, um die Kodiervariabilität eines

Gens zu erhöhen. In Hefe enthalten ca. 4% aller Gene ein Intron. Die in silico Suche nach

Konsensussequenzen der Metabolit-Bindedomäne des TPP (Thiaminpyrophosphat) -

Riboswitches in Eukaryoten ergab, dass sich diese u.a. in Introns im 5’-UTR von Genen der

Thiaminbiosynthese von vier Pilzarten befindet (Sudarsan et al., 2003). Daraufhin wurde

postuliert, dass das Spleissen durch Riboswitche reguliert werden kann. Einen

experimentellen Nachweis gab es jedoch nicht. Mit Hilfe des Tc-Aptamers sollte versucht

werden, das Spleissen eines Mini-Intron Konstruktes in vitro zu beeinflussen, indem

wahlweise die 5´- Spleißsttelle (5´-SS; AC/G GUAUGU ) oder der Verzweigungspunkt

(branchpoint; bp; UACUAAC) maskiert wird.

4.8.1 Integration von 5´-SS und bp in das Tc-Aptamer und Test auf Tc-Bindung

Um eine möglichst effiziente Tc-abhängige Maskierung von 5´-SS oder bp zu erreichen,

wurden diese Motive direkt in das Tc-Aptamer integriert. Die Motive wurden so eingeführt,

dass sich möglichst wenig Nukleotidaustausche ergeben, so dass die Originalsequenz des Tc-

Aptamers und dessen Ligandenbindefähigkeit weitestgehend erhalten bleibt. Das Plasmid

pWHE601-AN32 enthält das Tc-Aptamer im 5´-UTR von gfp (Kapitel 4.5). In dieses wurden

mittels PCR-Mutagenese die Spleißmotive inseriert, um zu überprüfen, welchen Einfluss die

Ergebnisse 83

Mutationen auf die regulatorische Aktivität des Aptamers haben. Die Klonierungen erfolgten

über die singulären Schnittstellen AflII und NheI. In Tabelle 4.7 sind die verwendeten

Oligonukleotid Primer sowie das jeweils in das Tc-Aptamer integrierte Sequenz-Motiv

angegeben. Die Kontrolle der Konstrukte erfolgte durch Sequenzierung mit den Primern

pADH und GFP_rev.

Tabelle 4.7 Klonierung der modifizierten Tc-Aptamere

Konstrukt Ausgangsplasmid Vorwärts Primer Rückwärts Primer integriertes Motiv

S1 a und b pWHE601-AN32 Splice1_for

GFPrev 5´-SS

a: AC GUAUGU

b: AG GUAUGU

S2 pWHE601-AN32 Splice2_for Splice2_rev 5´-SS

AG GUAUGU

S3 pWHE601-AN32 pADH Splice3_rev 5´-SS

AG GUAUGU S4 pWHE601-AN32 pADH Splice4_rev 5´-SS

AG GUAUGU

S5 pWHE601-AN32 pADH Splice6_rev Verzweigungspunkt

UACUAAC

S6 pWHE601-AN32 Splice7_for GFPrev Verzweigungspunkt

UACUAAC

In Tabelle 4.8 sind die Sequenzen der modifizierten Tc-Aptamere angegeben. Das eingeführte

Motiv (5´-SS; bp) ist in rot, kompensatorische Mutationen zur Aufrechterhaltung der

Aptamerstruktur sind in blau dargestellt.

Ergebnisse 84

Tabelle 4.8 Sequenzen der modifizierten Tc-Aptamere

Konst. Tc-Aptamer-Sequenz

WT GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC S1a GGCCUAAAACGUAUGUGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCACGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC

S1b GGCCUAAAAGGUAUGUGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCACGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC

S2 AGGUAUGUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUACUGCS3 GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGGUAUGUCGACCACCUAGGCC

S4 GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGGUAUGUGAAGAAUACGACCACAUAAGGCCS5 GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAUACUAACAAUACGACGGUAUAGGCC

S6 GGCCUACUAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC

Die Konstrukte S1 bis S7 wurden auf ihre regulatorische Aktivität in vivo untersucht. Das

experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.8 beschrieben. Alle Konstrukte führen zum Verlust

der in vivo Regulation. In den Konstrukten S1a bis S4 wurde mit dem integrierten

Sequenzmotiv ein alternatives Startkodon eingeführt. Darunter verursacht nur das zusätzliche

AUG im Konstrukt S4 eine Verschiebung des Leserasters von gfp, wodurch kein funktionales

Protein mehr translatiert wird. Bei den übrigen Konstrukten könnte das eingeführte Motiv die

für in vivo Regulation benötigte Struktur bzw. Strukturänderung am Aptamer negativ

beeinflusst sein. Da jedoch hier für die Insertion in ein Intron nur die Tc-Bindefähigkeit von

Bedeutung ist, wurden die veränderten Tc-Aptamere anschließend darauf getestet, ob sie noch

in der Lage sind Tc zu binden. Die benötigte DNA Matrize zur in vitro Transkription wurde

durch PCR hergestellt. Dazu wurden die Primer T7_forw_AN32K (trägt den T7-Promotor am

5´-Ende) und GFP_rev verwendet. Als PCR-Matrize dienten die Plasmide pWHE601-AN32

S1 bis S6. Die in vitro Transkriptionsreaktionen wurden im 100 µl Maßstab wie in Kapitel

3.3.7 beschrieben durchgeführt. Die Matrizen-DNA (PCR-Produkt) wurde durch Behandlung

mit DNAse entfernt. Die RNA wurde nach Ethanolfällung in Puffer-K resuspendiert und auf

eine Konzentration von 100 µM eingestellt. Der Test auf Tc-Bindung erfolgte fluorimetrisch.

Das genaue Vorgehen ist in Kapitel 3.3.8 beschrieben. 200 nM Tc wurde in 2 ml Puffer-K

vorgelegt und die Fluoreszenzintensität bestimmt. Anschließend wurde 750 nM RNA

zutitriert und die Fluoreszenz erneut bestimmt. Als Positivontrolle (+K) wurde Tc-Aptamer

RNA mitgeführt und die gemessene Fluoreszenz als 100% Wert festgesetzt. Die

Basalfluoreszenz von 200 nM Tc wurde ebenfalls gemessen. In Abbildung 4.18 sind die

realtiven Fluoreszenzintensitäten dargestellt.

Ergebnisse 85

1

0,5

0

rela

tive

Flu

ore

sze

nz

Abbildung 4.18

Test der Spleißkonstrukte auf Tc-Bindung. Die relativen Fluoreszenzintensitäten bei 520 nM sind angegeben. Die relative Fluoreszenz von Tc ohne Aptamer RNA (Tc) ist ebenfalls dargestellt. Die Fluoreszenz der Positivkontrolle (+K) wurde als 100% Wert verwendet.

Nur die Konstrukte S2, S3 und S6 zeigen den für die Tc-Bindung charakteristischen

Fluoreszenzanstieg. Dieser erreicht in allen drei Fällen ca. 50% des Maximalwerts der durch

die Positivkontrolle vorgegeben wurde. Bei den übrigen Konstrukten ist davon auszugehen,

dass durch das eingeführte Sequenzmotiv (5´-SS; bp) die Tc-Bindefähigkeit des Aptamers

zerstört wurde.

4.8.2 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von Aktin

Die Aptamer-Konstrukte S2, S3 und S6 wurden nun so in das Intron von Aktin aus S.

cerevisiae integriert, dass sich die Lage des maskierten Motivs bezüglich des WT Aktins nicht

verändert. Das Plasmid pSP6-Aktin trägt das von zwei Mini-Exons flankierte Intron von

Aktin. Da das Plasmid pSP6-Aktin über keine geeigneten singulären Schnittstellen verfügt,

wurde die Exon-Intron-Exon Sequenz über die Schnittstellen SalI und EcoRI ausgeschnitten.

Für die Umklonierung musste in das Plasmid pSP64 Tc-Aptamer die Schnittstelle SalI im

Anschluss an den T7-Promotor eingefügt werden. Um dies zu erreichen, wurde das Plasmid

mit den Enzymen HindIII und EcoRI verdaut und mit einem Insert, bestehend aus den zwei

synthetischen Oligonukleotiden InsHT7SE_forw und InsHT7SE_rev, ligiert. Das entstandene

Plasmid pSP64 HT7SE wurde mit SalI und EcoRI verdaut und mit der aus pSP6-Aktin

entnommenen Exon-Intron-Exon Sequenz ligiert. Das entstandene Plasmid pSP64-T7-Aktin

wurde durch Sequenzierung mit den Primern sp und AP1_pSP64 überprüft. Der relevante

Ergebnisse 86

Sequenzausschnitt ist im Anhang in Abbildung 8.5 (A) dargestellt. Nun konnten die

Konstrukte S2, S3 und S6 in pSP64-T7-Aktin eingefügt werden. Die Inserts wurden wie in

Kapitel 4.1.3 beschrieben, aus synthetischen Oligonukleotiden hergestellt. Diese sind in

Tabelle 4.9 für das jeweilige Konstrukt aufgelistet. Die Klonierung von S2 und S3 erfolgte

über die Schnittstellen BamHI und ClaI. Für die Klonierung von S6 wurden die Schnittstellen

AvaI und EcoRI verwendet.

Tabelle 4.9 Konstruktion der Spleißstellen-Aptamer Hybride

Konstrukt verwendete Oligonukleotide

pSP64-T7-Aktin-S2 P1F, P2F, P3F, P4F, P5F, P1R, P2R,P3R, P4R, P5R, P6R

pSP64-T7-Aktin-S3 P4F, P5F, P6F, P7F, P8F, P4R, P5R, P6R, P7R, P8R, P9R

pSP64-T7-Aktin-S6 K7F1, K7F2, K7F3, K7F4, K7F5, K7F6, K7R1, K7R2, K7R3, K7R4,

K7R5, K7R6, K7R7

Die relevanten Sequenzausschnitte von pSP64-T7-Aktin-S2, S3 und S6 sind im Anhang in

Abbildung 8.5 (B-D) dargestellt.

4.8.3 In vitro Spleißen der Aktin RNA

Erste in vitro Spleißexperimente wurden an WT Aktin prä-mRNA durchgeführt, um den

präparierten Hefe-Zellextrakt auf seine Aktivität zu testen. Als Template für die radioaktive in

vitro Transkription diente EcoRI linearisiertes Plasmid pSP6 Aktin. Die Präparation der

verwendeten RNA ist in Kapitel 3.3.7 beschrieben. Das experimentelle Vorgehen bei in vitro

Spleißexperimenten ist in Kapitel 3 beschrieben.

Das Resultat eines in vitro Spleißexperiments von Aktin prä-mRNA nach 0, 20 und 45

minütiger Inkubation ist in Abbildung 4.19 (A) dargestellt. Die gespleißte RNA (Exons 1 und

2; 257 Nt) zeigt aufgrund ihrer reduzierten Größe eine höhere elektrophoretische Mobilität.

Das Spleißzwischenprodukt (Intron mit Exon 2; 478 Nt) zeigt die niedrigste

elektrophoretische Mobilität. Das herausgespleißte Intron (309 Nt) bewegt sich ebenfalls

langsamer als die ungespleißte RNA. Die reduzierte elektrophoretische Mobilität kommt

durch die Ringstruktur des gespleißten Introns (Lariat) zustande.

Ergebnisse 87

1 2 3

2

1 2

1 2

478 Nt

309 Nt

566 Nt

257 Nt

88 Nt 169 Nt

1 2 3A B

Abbildung 4.19

Autoradiogramme von 6% PAA / 8 M Harnstoffgelen von in vitro Spleißexperimenten von Aktin prä mRNA. Die Exons 1 und 2 sind als Kasten, das Intron als Linie dargestellt. Die Größe der jeweiligen RNA Spezies ist angegeben. (A) Spur 1, 2 und 3 zeigen das Resultat nach 0 min, 20 min und 45 min Inkubation. (B) In vitro Spleißexperiment in Gegenwart von 8 µM Tc (Spur 1), 16 µM Tc (Spur 2) und 40 µM Tc (Spur 3).

Um zu testen, ob Tc den in vitro Spleißvorgang behindert, wurden vor der Spleißreaktion 8,

16 und 40 µM Tc zum Mix Aktin zugegeben. Nach 5 min Inkubation von 0,5 µl Mix Aktin +

Tc bei RT wurde die Reaktion durch Zugabe von 4,5 µl Mix 1 gestartet. Die Dauer der

Spleißreaktion betrug 20 min. Das experimentelle Vorgehen wurde ansonsten nicht verändert.

Das Resultat ist in Abbildung 4.19 (B) dargestellt. Das Autoradiogramm zeigt, dass Tc in den

eingesetzten Konzentrationen keinen sichtbaren Einfluss auf die Spleißreaktion hat.

Ergebnisse 88

4.8.4 In vitro Spleißen der Aptamer enthaltenden Aktin Konstrukte

Um zu testen, ob die Aktin prä-mRNA nach der Maskierung von der 5´-SS (Konstrukte S2

und S3) bzw. des Verzweigungspunktes (Konstrukt S6) durch das Tc-Aptamer noch gespleißt

werden kann, wurden auch an diesen Konstrukten in vitro Spleißexperimente durchgeführt.

Das experimentelle Vorgehen entsprach dem für WT Aktin prä mRNA und ist in Kapitel 3

beschrieben. Die Inkubationszeiten betrugen 0, 20, 40 und 60 min. Die Autoradiogramme

sind in Abbildung 4.20 dargestellt.

A B C

0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60

Abbildung 4.20

Autoradiogramme von 6% PAA / 8 M Harnstoffgelen von in vitro Spleißexperimenten an den Konstrukten (A) S2, (B) S3 und (C) S6. Die jeweilige Reaktionsdauer von 0, 20, 40 oder 60 min ist angegeben.

Alle drei Konstrukte werden in vitro nicht mehr gespleißt. Dies ist daran zu erkennen, dass

die typischen Spleißzwischenprodukte mit geringerer elektrophoretischen Mobilität (Intron

mit Exon 2; Intron) nicht vorhanden sind.

Diskussion 89

5 Diskussion

5.1 Der Tc-Aptamer-RNA Komplex

Im Rahmen dieser Arbeit ist das Tc-bindende RNA Aptamer und dessen Komplexbildung mit

Tc biochemisch und thermodynamisch charakterisiert worden. Dazu wurde das

Bindungsverhalten von Tc und verschiedenen Tc-Derivaten an WT und RNA-Mutanten über

analytische Gelfiltration, native PAA-Gelelektrophorese, Fluoreszenztitrations-Spektroskopie

und isothermale Titrationskalorimetrie untersucht.

Der Komplex aus Tc und Aptamer konnte erstmals visualisiert und die bisher nur

angenommene 1:1 Stöchiometrie bestätigt werden. Das Tc-Aptamer ist in der Lage den

Liganden Tc hochaffin mit einem KD von 0,73 nM zu binden, was den bisher angenommenen

KD im µM-Bereich deutlich übertrifft (Berens et al., 2001). Für die Komplexbildung wichtige

Nukleotide bzw. funktionelle Gruppen am Tc konnten mit den angewendeten Methoden

identifiziert werden. Die aus in vitro Experimenten gewonnenen Erkenntnisse über die

Ligandenbindefähigkeit korrellieren mit der regulatorischen Aktivität des Tc-Aptamers. Trotz

einer noch fehlenden dreidimensionalen Struktur des Aptamers, konnte das bestehende

Arbeitsmodell der zweigeteilten Tc-Bindetasche bestätigt und verfeinert werden.

5.1.1 Komplexaufbau

Anhand der analytischen Gelfiltrationsexperimente konnte die Komplexstöchiometrie auf ein

Tc/RNA Verhältnis von 0,96 berechnet werden. Somit ist von einem äquimolaren Komplex

aus Tc und Aptamer-RNA auszugehen, der bisher nur angenommen, experimentell aber noch

nicht belegt wurde (Hanson et al., 2005). Durch native PAGE-Experimente konnte dies

bestätigt werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Aptamer-RNA in einer

homogenen Form vorliegt und sich keine alternativen Konformationen ausbilden. Diese

Informationen sind sehr wichtig für die Interpretation der Daten von chemischen und

enzymatischen Interferenzstudien. Würden mehrere Moleküle Tc gleichzeitig an die Aptamer-

RNA binden, so könnte das resultierende Interferenzmuster einen falschen Aufbau der Tc-

Bindetasche suggerieren. Den gleichen Effekt würde die parallele Existenz verschiedener

Aptamer-Strukturen erzeugen.

5.1.2 Affinität des Tc-Aptamers zum Liganden Tc

Für die Bindung von Tc an das Tc-Aptamer wurde die Dissoziationskonstante auf 0,73 nM

bestimmt. Weitere RNA-Aptamere, die in vivo regulatorisch aktiv sind, wie das

Diskussion 90

Malachitgrün-bindende Aptamer (KD= 40 nM; (Grate et al., 1999)), das Theophyllin-Aptamer

(KD= 200 nM; (Jenison et al., 1994)) oder das Biotin-Aptamer (KD= 6 µM; (Wilson et al.,

1998)) erreichen keine derart hohe Affinitäten. Unter den niedermolekularen Liganden-

bindenden Aptameren weist das hier untersuchte Tc-Aptamer die stärkste Bindung auf. Zwar

wurden Aptamere mit noch besseren Bindefähigkeiten selektioniert, jedoch handelt es sich bei

diesen um Protein-bindende Aptamere. Proteine sind deutlich größer als Tc und bieten damit

auf ihrer Oberfläche deutlich mehr funktionelle Gruppen für multiple Bindungen an. Somit

könnte das Aptamer im Idealfall mit seiner ganzen Oberfläche an den Liganden binden,

wodurch sich die Affinität natürlich deutlich steigert. Das KGF- (Keratinocyten

Wachstumsfaktor) bindende Aptamer z.B. übertrifft das Tc-Aptamer mit einer

Dissoziationskonstante von 3 pM um das 250-fache (Pagratis et al., 1997).

Bei der in vivo Anwendung des Tc-Aptamers als Riboregulator müssen trotz der

außerordentlich hohen in vitro Affinität zu Tc 100-1000 fach höhere Konzentrationen an

Ligand eingesetzt werden, als die Dissoziationskonstante vermuten lässt. Diese Diskrepanz

wurde auch bei anderen in vivo Systemen zur Translationsregulation beobachtet und ist

gegenwärtig das wohl größte Hindernis in der Entwicklung von hochsensitiven

Riboregulatoren in höheren Eukaryoten (Desai et al., 2004). Mögliche Ursachen dafür sind

alternative Sekundärstrukturen in der Zelle, um den Liganden konkurrierende Proteine und

RNAs und natürlich auch die Dynamik der Bindungsreaktion selbst.

5.1.3 Aufbau der Tc-Bindetasche

Bereits zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass zwei unabhängige Bereiche im Tc-Aptamer

(B1-2 und L3) an der Tc-Bindung beteiligt sind. Diese Bereiche weisen Tc-abhängige

Änderungen in der Zugänglichkeit bei enzymatischen und chemischen Interferenzstudien auf,

woraus sich erste Hinweise auf Kontakte zwischen Tc und dem Aptamer ergaben, ohne

jedoch die Bedeutung der einzelnen Nukleotide genauer definieren zu können (Hanson et al.,

2005). In Abbildung 5.1 ist die Sekundärstruktur des Tc-Aptamers dargestellt. Die Positionen,

welche in vitro bei Mutation den stärksten Effekt auf die Tc-Bindung aufweisen, sind rot

markiert. Orange markierte Positionen bewirken bei Mutation nur eine geringfügige

Verschlechterung, während die grün markierte Position A8 nach Mutation zu G fast dem WT

entspricht.

Der Bereich L3 im Tc-Aptamer beginnt mit einer Nukleotidfolge aus 6 Purinen (G48-A53).

Die Nukleobasen dieser Purinkette können durch Basenstapelungseffekte miteinander

wechselwirken und somit die strukturelle Voraussetzung für die Tc-Bindung an das Aptamer

schaffen. Für das Nukleotid G51 wurde gezeigt, dass es eine UV-induzierte kovalente

Diskussion 91

Verknüpfung mit Tc eingeht (Berens et al., 2001), aber dessen Mutation nach U nur eine

minimale Reduzierung der Tc-Affinität verursacht. Demzufolge ist die Identität der

Nukleobase an Position 51 für die Tc-Bindung nur von sekundärer Bedeutung.

Das für Tc-Bindung essentielle Nukleotid A50 befindet sich in direkter Nachbarschaft. Somit

ist es durchaus möglich, dass der aromatische Teil von Tc im Purinstapel G48-A53 durch

elektrostatische Wechselwirkungen (Basenstapelungseffekte) von A50 gebunden wird und die

UV-induzierte Verknüpfung von Tc an G51 nur aufgrund von sterischen Effekten an dieser

Position zustande kommt. Dies wird durch die Beobachtung, dass Tc nur mit Guanin eine

UV-induzierte Verknüpfung eingeht (Barta, persönliche Mitteilung) und der Tatsache, dass

G51 das nächstliegende Guanin ist, bestätigt. Dem Adenin an Position 50 kommt zudem eine

große strukturelle Bedeutung für das Aptamer bei. Dies wird aus der Analyse der

Komplexbildung mit der A50U Mutante bei ITC-Experimenten deutlich. Die A50U Mutation

verursacht den kompletten Wegfall des entropischen Terms aufgrund fehlender inter- und

intramolekularer Wechselwirkungen zwischen den Bindungspartnern. Für die WT-RNA

bedeutet das, dass A50 für die Strukturierung von L3 im Aptamer essentiell ist.

Direkt im Anschluss an den Purinstapel befinden sich die Nukleotide U54 und A55, welche

bei Mutation nach G nur einen geringfügigen Tc-Affinitätsverlust zeigen. Der Bereich um die

Position 55 ist für die Tc-Bindung von großer Bedeutung, da diese Position eine Tc-

abhängige Hypersensitivität gegenüber der Spaltung durch OH-Radikale (Fenton-Reaktion)

aufweist und somit mit Mg2+ in Kontakt steht. Mg2+ ist für die Komplexbildung essentiell und

wird durch das Tc positioniert. Dieses bildet über R11 und R12 mit Mg2+ einen

Chelatkomplex und kann durch Kontakte zum RNA-Rückgrat den Komplex stabilisieren.

Die A55U Mutante kann Tc noch binden, erzeugt jedoch das Palindrom 51GAAUUC.

Dadurch kommt es zur Homodimerisierung von zwei RNA Molekülen. Anders als die

monomere Form ist das Homodimer nicht mehr in der Lage, Tc zu binden. Dies liegt

vermutlich daran, dass aufgrund der Doppelstrangbildung L3 nicht mehr korrekt gefaltet ist.

Chemische und enzymatische Interferenzstudien zeigen zusätzlich, dass die A55U Mutation

auch eine Änderung des Spaltmusters im Bereich B1-2 bewirkt. Während die Nukleotide A9,

U12 und A13 im WT-Aptamer einen starken Tc-abhängigen Rückgang in der Signalintensität

zeigen, kommt es in der A55U Mutante bei A9 zu einer Intensitätserhöhung und bei U12 und

A13 nur noch zu einer geringfügigen Reduktion der Signalstärke (Hanson et al., 2005). Dies

zeigt ebenfalls, dass die Bereiche B1-2 und L3 miteinander in Kontakt stehen.

Die Position A09 scheint für die Vorstrukturierung des Aptamers von großer Bedeutung zu

sein. Die Mutante A09G zeigt eine drastisch reduzierte Affinität zu Tc. Dieser Effekt ist

Diskussion 92

jedoch ausschliesslich entropisch bedingt und zeigt, dass die RNA ungeordneter bzw. weniger

vorstrukturiert ist. Daher muss für die Komplexbildung mehr Faltungsenergie aufgewendet

werden. Für das rationale Design eines artifiziellen Riboregulators ist diese Mutation ein

Schritt in die Richtung, das freie Aptamer für das Ribosom durchlässiger zu machen. Jedoch

ist der hier erzielte Effekt so stark, dass es dabei zum kompletten Verlust der in vivo Aktivität

kommt.

Für das Adenin an Position 13 konnte gezeigt werden, dass es in direkten Kontakt zur R6β

OH-Gruppe im Tc steht. Dies gelang mit der „double mutant cycle“ Methode bei der das

Bindungsverhalten von mehreren Aptamer-Mutanten mit unterschiedlichen Tc-Derivaten

verglichen wurde. Aus chemischen Interferenzstudien ist zusätzlich bekannt, dass der

Stickstoff N7 des Adenins in Gegenwart von Tc vor der Modifizierung durch DMS geschützt

wird. Daher ist es vermutlich dieser Stickstoff N7 im Adenin an Position 13, der mit der R6β

OH-Gruppe von Tc in Kontakt steht. In der A13U Mutante ist dieser direkte Tc-Adenin

Kontakt unterbrochen, was von einer reduzierten Bindungsenthalpie begleitet wird, ohne

jedoch einen großen Einfluss auf die RNA Struktur auszuüben.

Für die Tc-Bindung müssen sich B1-2 und L3 räumlich nahe sein und sich in der richtigen

strukturellen Orientierung befinden. Einer der beiden Bereiche allein reicht für die

Komplexierung von Tc nicht aus. Somit ergibt sich ein Bild, in dem der aromatische Teil von

Tc durch elektrostatische Wechselwirkungen, ausgelöst durch Basenstapelungseffekte

zwischen den Nukleotiden G48-A53 von A50 fixiert wird. Über das an der Ketoenol-Gruppe

komplexierte Mg2+ entsteht wahrscheinlich ein weiterer Kontakt zum Zucker-Phosphat

Rückgrat an Position A55 in L3. Das Nukleotid A13 steht in direkten Kontakt mit der R6β

OH-Gruppe und kann das in L3 fixierte Tc wie eine Klammer in Position halten. Weitere

Kontakte des Tc bilden die R2 Amidgruppe und eventuell der nicht getestete Kohlenstoff C1.

Der Kopfbereich des Tc-Aptamers ist an der Komplexbildung nicht beteiligt. Im

komplexierten Zustand ähnelt die RNA somit einem Pseudoknoten, der durch das Tc

vermittelt wird.

Diskussion 93

UAGACC

CGC

GCG

U

AA

A A

AU

C

C

UU

UC

UU

A

CC

CCA

A

A

GGG

GGCC

CGG

A AA

A

A

AA

C C

A CCC

G

*G

U

UA

A

691

10

40

50

60

20

30

UG C

wichtig für die RNA-Struktur

direkter Kontakt von N7

zur R6β OH-Gruppe im Tc

Kontakt zu Tc durch elektrostatische Wechselwirkung mit dem aromatischen Teil von Tc

wichtig für die RNA-Struktur

G GG UB1-2 L3

Mg2+ vermittelter Kontakt

von Tc zum RNA-Rückgrat

Abbildung 5.1

Sekundärstruktur des Tc-Aptames. Eingekreiste Nukleotide zeigen einen sehr geringen (grün), mittleren (gelb) und sehr starken (rot) Effekt auf die Tc-Bindung in vitro. Der G48-A53 Pyrimidintrakt ist in hellblau, die OH-Radikal hypersensitive Position A55 ist in violett dargestellt. Der * markiert die UV-induzierte Verknüpfung mit Tc. Bekannte Funktionen einzelner Nukleotide sind eingetragen.

In den Bereichen B1-2 und L3 des Tc-Aptamers gibt es Sequenzähnlichkeiten zu den Tc-

Bindestellen in der 16S rRNA von E. coli. Die Nukleotidfolgen AAG (49-51; 50-48; 53-51)

und UAC (12-10; 12-14; 54-56) im Tc-Aptamer finden sich in der Sequenz der ribosomalen

Tc-Bindestellen Tet-1 (AAG: 1196-1198; UAC: 1056-1054) und Tet-2 (AA: 894-895; UAC:

891-893) wieder (Brodersen et al., 2000; Hanson et al., 2005; Pioletti et al., 2001). Sowohl

die ribosomalen Tc-Bindetaschen als auch diejenige im Aptamer sind modular aufgebaut und

fixieren das Tc wie in einer Klammer über muliple Kontakte.

Dieses Strukturmodel der Tc-Bindetasche liefert eine mögliche Erklärung für die

regulatorische Aktivität des Tc-Aptamers in vivo. Das Ribosom ist in der Lage, Stamm-

Schleifen Strukturen in der mRNA aufzulösen. Es ist jedoch nicht in der Lage, einen

Pseudoknoten zu überwinden. Dieser stellt eine zu stabile Barriere dar. Ebenso verhält es sich

mit dem Tc-Aptamer. Das Ribosom kann die Stammschleifen in der Apo-Struktur wie einen

Reißverschluss öffnen. Wenn sich jedoch aus dem Aptamer durch Tc-Bindung eine

pseudoknotenähnliche Struktur ausgebildet hat, stellt dieser ein kaum zu überwindendes

Hindernis für das Ribosom dar.

Diskussion 94

5.2 Spleißregulation in S. cerevisiae durch das Tc-Aptamer

In diesem Projekt sollte versucht werden, das Tc-Aptamer zur Spleißregulation in S.

cerevisiae einzusetzen. Bisher wurde es zur Translationsregulation in Hefe in den 5´-UTR

eines Reporters inseriert. Daher sollte getestet werden, ob mit Hilfe des Tc-Aptamers die für

das Spleißen wichtigen Sequenzen 5´-SS und Verzweigungspunkt Tc-abhängig maskiert

werden können. Anders als im 5´-UTR interferiert das Aptamer dabei nicht mit dem

Ribosom, sondern mit dem Spleißosom bzw. dessen Formierung. In allen getesteten

Konstrukten wurden 5´-SS bzw. Verzweigungspunkt in der Aktin prä-mRNA direkt in die

Aptamersequenz integriert, wobei darauf geachtet wurde, dass die Tc-Bindefähigkeit erhalten

bleibt.

In vitro Spleißexperimente haben jedoch gezeigt, dass diese Art der Maskierung bereits ohne

Tc zu einer kompletten Inhibierung der Spleißreaktion führt.

Literaturverzeichnis 95

6 Literaturverzeichnis

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Abkürzungsverzeichnis 101

7 Abkürzungsverzeichnis

% (v/v) % (volume/volume) (Volumenprozent)

% (w/v) % (weight/volume) (Massenprozent)

1D, 2D, 3D ein-, zwei-, dreidimensional

A Adenin

Abb. Abbildung

Amp Ampicillin

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Amminosäure

bp Basenpaare; Verzweigungspunkt („branch point“)

C Cytosin

c(X) Konzentration der Substanz X

Da Dalton

DEAE Diethylaminoethyl-Sepharose, Anionenaustauschermatrix

DEPC Diethylpyrocarbonat

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleotidtriphosphat

ds Doppelstrang („double strand“)

DTT Dithiothreitol

E. Escherichia

EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure

eIF eukaryotischer Initiationsfaktor

EtOH Ethanol

g Erdbeschleunigung oder Gramm

G Guanin oder Gibb´s freie Energie

H Enthalpie

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ITC Isothermale Titrations-Kalorimetrie

KA Assoziationskonstante

kb Kilobasenpaare

KD Dissoziationskonstante

kDa Kilodalton


MCS Multiple Klonierungsstelle („multiple cloning site“)

MWCO Molekulargewichts-Ausschlussgrenze für die Passage durch

Membranen („molecular weight cut of“)

N Nukleotid, A, G, C oder U oder Stöchiometrie

NaAc Natrium Acetat

Nt Nukleotide

NTP Nukleotidtriphosphat

ODx optische Dichte, gemessen bei Wellenlänge λ=x nm

orf offener Leserahmen („open reading frame“)

PAA Polyacrylamid

PAGE PAA Gelelektrophorese

PCR Polymerasekettenreaktion

pH „pondus hydrogenii“

PMSF Phenylmethylsulphonylfluorid

RBD RNA-bindende Domäne

RBS Ribosomenbindestelle

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rRNA ribosomale RNA

RT Raumtemperatur

S. Saccharomyces

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

ss Einzelstrang („single strand“)

T Thymin

Tab. Tabelle

Tc Tetracyclin

TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin

Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

tRNA „transfer“-RNA

U Uracil oder „unit“

üNK über-Nacht-Kultur

UTR nicht translatierter Bereich „untranslated region“

WT Wildtyp


Einheiten: Vorsätze:

A Ampere k kilo 103

bp Basenpaar m milli 10-3

°C Grad Celsius µ mikro 10-6

g Gramm n nano 10-9

h Stunde

l Liter Nukleotide:

m Meter A Adenin

M molar (mol/l) C Cytosin

min Minute(n) G Guanin

sec Sekunde(n) T Thymin

Upm Umdrehungen pro Minute U Uracil

V Volt

W Watt

Anhang 104

8 Anhang

8.1 Materialien und Geräte

Häufig verwendete Chemikalien sind in Tabelle 8.1 aufgeführt. Weitere Chemikalien wurden

in per analysis Qualität von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma (München)

bezogen, und Oligonukleotide ausschließlich von MWG Biotech AG (Ebersberg). In den

folgenden Tabellen sind verwendete Hilfsmittel (Tabelle 8.2), Geräte (Tabelle 8.3),

verwendete Programme (Tabelle 8.4) kommerziell erhältliche Systeme (Tabelle 8.5)

aufgelistet. Die an der Äkta prime verwendeten Programme sind in Tabelle 8.6 und Tabelle

8.7 aufgelistet.

Tabelle 8.1 Chemikalien

Chemikalie Bezugsquelle 7-Cl-Tetracyclin

α-[32P] UTP (3000 mCi/mmol)

β-Mercaptoethanol

Anhydroteracyclin

APS (Ammonium-Peroxodisulfat)

Acrylamid: Bisacrylamid (40:1), 40 %

Adenin

AS-Mix (ohne L-Glutamin)

Adenosin-5´-triphosphat (ATP)

Agar

Agarose

Ammoniumsulfat

Ampicillin

Benzamidin

Borsäure

Bromphenolblau

Calciumchlorid

Col 1-8

DEAE-Sepharose FF

Deoxycholat

Desoxyribonukleintriphosphate

DMS (Dimethylsulfat)

Doxycyclin

Acros Organics, Belgien

Amersham Biosciences, Freiburg

Merck, Darmstadt


Merck, Darmstadt

Roth, Karlsruhe

Sigma, Steinheim

Gibco, Paisley (Schottland)

Roche Diagnostics, Mannheim

Merck, Darmstadt

peqLab, Erlangen

Roth, Karlsruhe

Roth, Karlsruhe

Sigma, Steinheim

Merck, Darmstadt

Serva, Heidelberg

Merck, Darmstadt

Collagenex Pharmaceuticals, USA


Fluka AG, Schweiz

Boehringer, Mannheim

Fluka AG, Schweiz

Hovione, Schweiz

Anhang 105

dNTPs

DTT (Dithiothreitol)

EDTA

Essigsäure

Ethanol

Ethidiumbromid

Formamid

Glucose

Glyzerin

Hefeextrakt

Isoamylalkohol

Isopropanol

Magnesiumchlorid

Magnesiumsulfat

Natruimacetat

Natriumcacodylat

Natriumchlorid

Natriumhydroxid

Neomycin Sulfat

Oxyteracyclin

PMSF

Polyehylenimin Polymer

Phenol (TE-gesättigt)

rNTPs

SDS (Sodiumdodecylsulfat)

SP-Sepharose FF

Stickstoffquelle für Hefe

Temed

Tetracyclin

Trypton

Xylencyanol

Yeast nitrogen base

Roche Diagnotics, Mannheim

Sigma, München

Roth, Karlsruhe

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Roth, Karlsruhe

Fluka AG, Schweiz

Roth, Karlsruhe

Merck, Darmstadt

Oxoid, Heidelberg

Merck, Darmstadt

Roth, Karlsruhe

Roth, Karlsruhe

Merck, Darmstadt

Roth, Karlsruhe

Sigma, München

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Sigma, USA


Sigma, USA

Fluka AG, Schweiz

Roth, Karlsruhe

Amersham Biosciences, Freiburg und Sigma, München

Roth, Karlsruhe


Becton-Dickinson, Dublin (Irland)

Merck, Darmstaft

Sigma, USA

Oxoid, Heidelberg

Roth, Karlsruhe

Difco

Tabelle 8.2 Hilfsmittel

Hilfsmittel Bezugsquelle

Einmalspritzen

Eppendorfgefäße (1,5 / 2,0 ml)

Glaspipetten

Kunststoffpetrischalen

Becton-Dickinson, Dublin (Irland)

Greiner, Nürtingen

Brand, Wertheim

Greiner, Nürtingen

Anhang 106

Imager Platte BAS-IIIS

Mikroliterpipetten (einfach)

Mikroliterpipetten (8-Kanal)

PCR-Reaktionsgefäße (0,2 ml)

Pipettenspitzen, Kunststoff

Polyethylenröhrchen (12 / 50 ml)

Küvetten (10x10x48 mm)

Küvetten (Halb-Mikro)

Reagenzgläser (10 ml)

XK-Säule

Zentrifugenbecher

Fuji Photo Film, Japan

Gilson, Düsseldorf

Eppendorf, Hamburg

peqLab, Erlangen

Greiner, Nürtingen

Greiner, Nürtingen

Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Greiner, Nürtingen

Sarstedt, Nürnbrecht


Beckmann, München

Tabelle 8.3 Geräte

Gerät Bezugsquelle

ABI Prism 310 Genetic Analyser

Äkta prime

Autoklav

BiofugeA, fresco und primoR

Brutschrank

Elektrophoreseapparaturen für Agarose- und

PAA-Gele

Feinwaage Sartorius

Fluorolog-3

Thermomixer comfort

Horizontalschüttler 3006

Kühlzentrifuge Avanti J-25

Kulturschüttler G 25

Long/Short Wave Light UVLS-26

Magnet-Heizrührer

Microcal VP-ITC

pH-Meter Calimatic

Phosphoimager Fuji BAS-1500

Scintillator LS 5000 TD

Spannungsquelle TN 300–120

Speed-Vac-Konzentrator

Spektralphotometer Ultraspec 3000

Thermocycler Gene Amp PCR-system 2400

Umlaufkühler FC 360

UV-Schirm 254 nm und 366 nm

Perkin Elmer, Weiterstadt

Amersham Biosciences, Piscateway (USA)

Deutsch und Neumann, Berlin

Heraeus Christ, Osterode

Heraeus Christ, Osterode

B. Macht, Universität Erlangen-Nürnberg

Sartorius, Göttingen

Instruments S.A., Inc., New Jersey

Eppendorf, Hamburg

GFL, Burgwedel

Beckmann, München

New Brunswick, Neuisenburg

Upland, CA USA

JAK Werk, Staufen

MicroCal Inc, Northampton

Knick, Berlin

Raytest Isotopenmessgeräte, Straubenhardt

Beckman, München

Heinzinger, Rosenheim

Bachofer, Reutlingen

Pharmacia Biotech, Freiburg

Pharmacia Biotech, Freiburg

JULABO Labortechnik GmbH, Seelbach

JKA-Labortechnik, Staufen

Anhang 107

Vortexer VF2

Waage Sartorius Universal

Wasserbad

Wasservollentsalzungsanlage

Vetter, Wiesloch

Sartorius, Göttingen

Braun, Melsungen

Millipore, Frankreich

Tabelle 8.4 Programme

Programm Bezugsquelle

Mfold

RNAstructure 3.7

TINA 2.08c

Origin 5.0

http://mfold.burnet.edu.au/

http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/

raytest Isotopenmessgeräte GmbH

Microcal Inc.

Tabelle 8.5 Kommerziell erhältliche Systeme (Kits)

Reagenziensatz Bezugsquelle Anwendung

Frozen-EZ Yeast Transformation II

Nucleobond AX

Nucleospin Plasmid

NucleoSpin Extract 2 in 1

GFX

Ready To Go PCR-Beads

Terminationsmix

Zymo Research, Orange (USA)

Macherey-Nagel, Düren



Amersham Biosciences,

Piscateway (USA)

Amersham Pharmacia, Freiburg

PE-Biosystems, USA

Plasmidtransformation in Hefe

Plasmidpräparation

DNA-Elution aus Agarose

Aufreinigung von PCR-Produkten

DNA-Elution aus Agarose,

Aufreinigung von PCR-Produkten

PCR, Kolonie-PCR



Anhang 108

Tabelle 8.6 Programmierung der Äkta prime für SP-Sepharose Säule

breakpoint bei

ml 0.00 50 250 251 369

conc %B 0 0 0 100 100

flow rate

ml/min.

5

4

4

3 3

fraction size ml 0.0 0 0 1.2 1.2

buffer valve

pos 2 1 1 1 1

inject valve pos load Load load load load

peak collect no no no no no

autozero no no no no no

event mark no no no no no

time volume

ml 0.00 50 250 251 369

Puffer/Vorgang Probenbeladung Waschen Elution

Anhang 109

Tabelle 8.7 Programmierung der Äkta prime für DEAE-Sepharose Säule

breakpoint bei

ml 0 30 100 200 600 630 650 655 755

conc %B 0 0 0 0 100 60 60 0 0

flow rate

ml/min. 5 5 5 5 5 5 5 5 5

fraction size ml 0.0 10 10 6.0 6.0 10.0 0.0 0.0 0.0

buffer valve pos 1 2 1 1 1 1 1 1 1

inject valve pos load load load load load load load load load

peak collect no no no no no no no no no

autozero no yes no no no no no no no

event mark no no no no no no no no no

time volume

ml 0 30 100 200 600 630 650 655 755

Puffer/Vorgang Baseline Proben-

beladung Waschen Gradient/Elution Hochsalzpuffer/Stoßelution Waschen

Anhang 110

8.2 Fluoreszenzmessungen an Mutanten von Tc-Aptamer RNA

A

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

020000400006000080000

1000001200001400001600001800002000002200002400002600

0 nM RNA 20 nM RNA 40 nM RNA 80 nM RNA 120 nM RNA 160 nM RNA 200 nM RNA 280 nM RNA 360 nM RNA 440 nM RNA 520 nM RNA 600 nM RNA 800 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

Puffer 0 nM RNA 15 nM RNA 30 nM RNA 45 nM RNA 60 nM RNA 90 nM RNA 120 nM RNA 180 nM RNA 240 nM RNA 300 nM RNA 360 nM RNA 480 nM RNA 600 nM RNA 720 nM RNA 840 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 200 400 600 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

20000400006000080000

100000120000140000160000180000200000220000240000260000280000

Puffer 0 nM RNA 40 nM RNA 80 nM RNA 120 nM RNA 200 nM RNA 320 nM RNA 480 nM RNA 720 nM RNA 1080 nM RNA 1480 nM RNA 1960 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 500 1000 1500 2000

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fsfreie RNA / nM

B

00C

Abbildung 8.1

Titration von Tc mit RNA Tc-Aptamer A9G (A), A13U (B) und A50U (C). Die Spektrenschar ist jeweils links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist jeweils rechts dargestellt. Für die Titration wurden bei A9G 40 nM, bei A13U 30 nM und bei A50U 40 nM Tc in Puffer-K vorgelegt

Anhang 111

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

100015002000250030003500400045005000550060006500700075008000850090009500

Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 9 nM RNA 14 nM RNA 19 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620500

10001500200025003000350040004500500055006000650070007500

Puffer 0 nM tc 1 nM tc 2 nM tc 4 nM tc 8 nM tc 16 nM tc 32 nM tc 48 nM tc 60 nM tc

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

2000

4000

6000

8000

10000

12000 Puffer 0 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 4 nM RNA 8 nM RNA 15 nM RNA 30 nM RNA 60 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nm

C

B

A

Abbildung 8.2

Titration von Tc mit RNA Tc-Aptamer G51U (A), U54G (B) und A55G (C). Die Spektrenschar ist jeweils links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist jeweils rechts dargestellt. Für die Titration wurden bei G51U und U54G 0,5 nM und bei A55G 1 nM Tc in Puffer-K vorgelegt.

Anhang 112

cps

uore

szen

z /

Fl

440 460 480 500 520 540 560 580 600 62010001500200025003000350040004500500055006000650070007500 Puffer

0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 8 nM RNA 13 nM RNA

Wellenlänge / nm-2 0 2 4 6 8 10 12 14

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

Abbildung 8.3

Titration von Tc mit Tc-Aptamer A8G RNA. Die Spektrenschar ist links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist rechts dargestellt. Für die Titration wurden 0,5 nM Tc in Puffer-K vorgelegt.

Anhang 113

8.3 Fluoreszenz-Messungen mit verschiedenen Tc-Derivaten

600

800

400

200

2

1

1 1

5000

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

0

0

0

0

10000

12000

14000

16000

18000

Puffer 0 nM RNA 0.5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 50 nM RNA 100 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 20 40 60 80 100

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

2000

4000

6000

8000

10000

2000

4000

16000

8000

0 Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 7 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

100015002000250030003500400045005000550060006500700075008000850090009500

1 Puffer 0 nM RNA 0.5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 25 nM RNA 50 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA /nM

475 500 525 550 575 600

0

10000

15000

20000

Puffer 0 nM RNA 30 nM RNA 60 nM RNA 90 nM RNA 120 nM RNA 150 nM RNA 300 nM RNA 450 nM RNA 600 nM RNA 900 nM RNA 1200 nM RNAko

rrig

ierte

Flu

ores

zenz

/ cp

s

Wellenlänge / nm0 200 400 600 800 1000 1200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

D

A

0000C

000B

Anhang 114

zenz

/ cp

s

uore

s

Fl

cps

resz

enz

/

Flu

enz

/ cps

esz

Fluo

r

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA 50 nM RNA

Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Puffer 0 nM RNA 0.5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA

o


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

1 K-PO4 Puffer 0 nM RNA 1 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA 50 nM RNA 60 nM RNA 70 nM RNA 80 nM RNA 90 nM RNA


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

22000

24000 Puffer 0 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA 60 nM RNA 80 nM RNA 120 nM RNA 160 nM RNA 200 nM RNA 250 nM RNA 300 nM RNA 400 nM RNA 500 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 100 200 300 400 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

H

F

E

8000G

Anhang 115

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000 Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 7 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

100020003000400050006000700080009000

100001100012000130001400015000160001700018000

0 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 50 nM RNA 100 nM RNA 200 nM RNA 300 nM RNA

Fluo

resz

enz

/ cps

Wellenlänge / nm0 50 100 150 200 250 300

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fs

freie RNA / nM

K

J

Abbildung 8.4

Titration von Tc-Derivat mit Tc-Aptamer RNA. Die Spektrenschar ist links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist rechts dargestellt. Es wurden (A) Oxytetracyclin, (B) Col 6, (C) Col 1, (D) Anhydrotetracyclin, (E) Col2, (F) 7-Cl-Tetracyclin, (G) Sancyclin, (H) Doxycyclin, (I) Col 8 und (J) Col 5 analysiert. Im Falle von (A), (B), (C), (E) und (F) wurde 1 nM Tc-Derivat vorgelegt, bei (G), (H) und (I) wurden 10 nM vorgelegt, bei (J) 20 nM und bei (D) 50 nM.

Anhang 116

8.4 „Double mutant cycle“ Analyse nach Fersht

Tabelle 8.8 ∆G und ∆∆G Werte für die „double mutant cycle“ Analyse

Tc Oxy-Tc Col 2 Doxy

∆G

(kcal/mol)

∆∆G

(kcal/mol)

∆G

(kcal/mol)

∆∆G

(kcal/mol)

∆G

(kcal/mol)

∆∆G

(kcal/mol)

∆G

(kcal/mol)

∆∆G

(kcal/mol)

WT -12.46 ± 0.04 -12.09 ± 0.04 -0.37 ± 0.08 -10.92 ± 0.06 -1.54 ± 0.09 -9.47 ± 0.02 -2.99 ± 0.06

A09G -9.31 ± 0.03 -3.15 ± 0.07 -8.66 ± 0.01 -3.43 ± 0.05 -7.62 ± 0.01 -3.30 ± 0.06 -6.48 ± 0.16 -2.98 ± 0.18

A13U -9.11 ± 0.01 -3.35 ± 0.05 -8.57 ± 0.01 -3.52 ± 0.05 -7.87 ± 0.01 -3.05 ± 0.07 -7.67 ± 0.01 -4.79 ± 0.03

A50U -9.19 ± 0.02 -3.28 ± 0.06 -8.48 ± 0.01 -3.61 ± 0.05 -7.62 ± 0.02 -3.31 ± 0.07 -6.79 ± 0.16 -5.67 ± 0.18

∆G Werte wurden aus den entsprechenden KD Werte mit der Formel ∆G=-RT ln(KD-1) berechnet.

∆∆G Werte wurden als ∆G(WT / Tc) - ∆G(RNA / Tc-Derivat) berechnet.

Anhang 117

Tabelle 8.9 Berechnung von ∆∆Gint

∆∆GT (kcal/mol) ∆∆GR (kcal/mol) ∆∆GTR (kcal/mol) ∆∆Gint (kcal/mol)a

WT – A09G Tc / Oxy-Tc 0.37 ± 0.08 3.15 ± 0.07 3.81 ± 0.06 0.28 ± 0.21

Tc / Col 2 1.54 ± 0.10 3.15 ± 0.07 4.85 ± 0.04 0.16 ± 0.22

Oxy-Tc / Doxy 2.62 ± 0.06 3.43 ± 0.05 5.61 ± 0.20 - 0.45 ± 0.31

Oxy-Tc / Col 2 1.17 ± 0.09 3.43 ± 0.05 4.47 ± 0.04 - 0.13 ± 0.19

Tc /Doxy 3.00 ± 0.06 3.15 ± 0.07 5.98 ± 0.22 - 0.17 ± 0.36

Col 2 /Doxy 1.46 ± 0.08 3.31 ± 0.07 4.44 ± 0.22 - 0.32 ± 0.37

WT– A13U Tc / Oxy-Tc 0.37 ± 0.08 3.35 ± 0.05 3.89 ± 0.05 0.16 ± 0.18

Tc / Col 2 1.54 ± 0.09 3.35 ± 0.05 4.59 ± 0.05 - 0.30 ± 0.20

Oxy-Tc / Doxy 2.62 ± 0.06 3.52 ± 0.05 4.42 ± 0.05 - 1.72 ± 0.15

Oxy-Tc / Col 2 1.17 ± 0.09 3.52 ± 0.05 4.22 ± 0.05 - 0.46 ± 0.19

Tc /Doxy 3.00 ± 0.06 3.35 ± 0.05 4.80 ± 0.07 - 1.56 ± 0.18

Col 2 /Doxy 1.46 ± 0.08 3.05 ± 0.07 3.26 ± 0.07 - 1.26 ± 0.21

WT – A50U Tc / Oxy-Tc 0.37 ± 0.08 3.28 ± 0.06 3.98 ± 0.06 0.33 ± 0.20

Tc / Col 2 1.54 ± 0.10 3.28 ± 0.06 4.85 ± 0.05 0.03 ± 0.21

Oxy-Tc / Doxy 2.62 ± 0.06 3.61 ± 0.05 5.30 ± 0.20 - 0.93 ± 0.30

Oxy-Tc / Col 2 1.17 ± 0.09 3.61 ± 0.05 4.47 ± 0.05 - 0.30 ± 0.20

Tc /Doxy 3.00 ± 0.06 3.28 ± 0.06 5.67 ± 0.22 - 0.60 ± 0.34

Col 2 /Doxy 1.46 ± 0.08 3.31 ± 0.07 4.13 ± 0.22 - 0.63 ± 0.37

∆∆Gint wurde als ∆∆GTR – (∆∆GT + ∆∆GR) berechnet

Anhang 118

8.5 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von

Aktin

A T7-Promotor SalI BamHI 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACTGCT TTTTTCTTCC CAAGATCGAA AATTTACTGA 5´-SS 101 ATTAACAATG GATTCTGGTA TGTTCTAGCG CTTGCACCAT CCCATTTAAC AvaI 151 TGTAAGAAGA ATTGCACGGT CCCAATTGCT CGAGAGATTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp ClaI 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTCATGTAC TAACATCGAT TGCTTCATTC 3´-SS 401 TTTTTGTTGC TATATTATAT GTTTAGAGGT TGCTGCTTTG GTTATTGATA 451 ACGGTTCTGG TATGTGTAAA GCCGGTTTTG CCGGTGACGA CGCTCCTCGT 501 GCTGTCTTCC CATCTATCGT CGGTAGACCA AGACACCAAG GTATCATGGT EcoRI 551 CGGTATGGGT CAAAAAGACT CCTACGTTGG TGATGAAGGG GAATTCGTAA

B T7-Promotor BamHI 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACTGCT TTTTTCTTCC CAAGATCGAA AATTTACTGA 5´-SS 101 ATTAACAATG GATTCAGGTA TGTAAAACAT ACCAGATCGC CACCCGCGCT 151 TTAATCTGGA GAGGTGAAGA ATACGACCAC CTACATGCTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp ClaI 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTCATGTAC TAACATCGAT TGCTTCATTC 3´-SS 401 TTTTTGTTGC TATATTATAT GTTTAGAGGT TGCTGCTTTG GTTATTGATA 451 ACGGTTCTGG TATGTGTAAA GCCGGTTTTG CCGGTGACGA CGCTCCTCGT 501 GCTGTCTTCC CATCTATCGT CGGTAGACCA AGACACCAAG GTATCATGGT EcoRI 551 CGGTATGGGT CAAAAAGACT CCTACGTTGG TGATGAAGGG GAATTCGTAA

Anhang 119

C T7-Promotor BamHI 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACGGCC TAAAACATAC CAGATCGCCA CCCGCGCTTT 5´-SS 101 AATCTGGAGA GGTGAAGGTA TGTCGACCAC CTAGGCCCAT CCCATTTAAC 151 TGTAAGAAGA ATTGCACGGT CCCAATTGCT CGAGAGATTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp ClaI 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTCATGTAC TAACATCGAT TGCTTCATTC 3´-SS 401 TTTTTGTTGC TATATTATAT GTTTAGAGGT TGCTGCTTTG GTTATTGATA 451 ACGGTTCTGG TATGTGTAAA GCCGGTTTTG CCGGTGACGA CGCTCCTCGT 501 GCTGTCTTCC CATCTATCGT CGGTAGACCA AGACACCAAG GTATCATGGT EcoRI 551 CGGTATGGGT CAAAAAGACT CCTACGTTGG TGATGAAGGG GAATTCGTAA D T7-Promotor 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACTGCT TTTTTCTTCC CAAGATCGAA AATTTACTGA 5´-SS 101 ATTAACAATG GATTCTGGTA TGTTCTAGCG CTTGCACCAT CCCATTTAAC AvaI 151 TGTAAGAAGA ATTGCACGGT CCCAATTGCT CGAGAGATTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTGGCCTAC TAACATACCA GATCGCCACC 3´-SS 401 CGCGCTTTAA TCTGGAGAGG TGAAGAAACG ACCACCTAGG CCATTGATAA 451 CGGTTCTGGT ATGTGTAAAG CCGGTTTTGC CGGTGACGAC GCTCCTCGTG 501 CTGTCTTCCC ATCTATCGTC GGTAGACCAA GACACCAAGG TATCATGGTC EcoRI 551 GGTATGGGTC AAAAAGACTC CTACGTTGGT GATGAAGGGG AATTCGTAAT

Abbildung 8.5

Relevante Sequenzausschnitte von (A) pSP64 T7 Aktin, (B) pSP64 T7 Aktin S2, (C) pSP64 T7 Aktin S3 und (D) pSP64 T7 Aktin S6. Die T7-Promotorsequenz ist kursiv, 5´-SS, bp und 3´-SS sind in blau und die Aptamersequenz ist in rot dargestellt. Schnittstellen für verwendete Restriktionsenzyme sind unterstrichen.

Publikationen 120

9 Publikationen

Michael Müller, Julia Weigand, Oliver Weichenrieder and Beatrix Suess. (2006).

Thermodynamic characterization of an engineered tetracycline-binding riboswitch. J Biol

Chem (eingereicht)

Schilling, O., Langbein, I., Müller, M., Schmalisch, M. H. & Stulke, J. (2004). A protein-

dependent riboswitch controlling ptsGHI operon expression in Bacillus subtilis: RNA

structure rather than sequence provides interaction specifity. Nucleic Acids res 32, 2853-2864.

Lebenslauf 121

10 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Michael Müller

Geburtsdatum 08.05.1975

Geburtsort Passau

Familienstand verheiratet

Schulausbildung

1981 – 1986 Grund- und Hauptschule Thyrnau

1986 – 1995 Gymnasium Untergriesbach

Grundwehrdienst

1995 – 1996 Grundausbildung in der Marinewaffenschule in Eckernförde

Mannschaftsdienstgrad auf dem Minenjagdboot Homburg 1.MSG

Hochschulausbildung

1996 – 2001 Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander Universität

Erlangen-Nürnberg

Diplomarbeit am Lehrstuhl für Mikrobiologie, Friedrich-Alexander

Universität Erlangen-Nürnberg bei PD Dr. Jörg Stülke zum Thema:

„NMR-Untersuchungen an einer gefalteten RNA“; davon 6 Monate am

Institut für molekulare Biotechnologie, Abteilung für Biophysik in Jena

Abschluss: Diplom-Biologe Univ.

2002 – 2005 Promotion am Lehrstuhl für Mikrobiologie, Friedrich-Alexander

Universität Erlangen-Nürnberg bei Prof. Dr. Wolfgang Hillen in der

AG Dr. Beatrix Süß;

Thema: „Molekulare Analyse eines synthetischen Tetracyclin-

abhängigen RNA-Regulators“

Erlangen, den 07.12.2005

Documents

Molekulare Analyse eines synthetischen Tetracyclin ... · Vertiefende Analysen durch isothermale Titrations-Kalorimetrie (ITC) zeigen ein ungewöhnliches Bindungsverhalten mit einem