Molekulare PräsentationstechnikenPhage Display

Gentechnik und Genomics WiSe 2007/2008

Kristian M. Müller

Institut für Biologie III

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

Pharma-Biotech Umsatz in den USA

Nature Biotechnology2007 25 1097

Wie macht man Antikörper?

• Immunisierung -> Hybridoma -> Humanisierung

• Natürliche humane Bibliotheken -> Selektion -> IgG Klonierung

• Künstliche Bibliotheken -> Selektion -> IgG Klonierung

Der neue Weg zu Antikörpern

immunology today 2000 21 371

Neue Bindemoleküle

Current Opinion in Structural Biology 2007, 17:481

Fab Fn3

AnkyrinZ-Domäne „Affibody“

Lipocalin „Anticalin“

Kamel VH

Künstliche Diversität

Möglichkeiten der verzufallten Synthese

nnktotal 32

vantotal 12

vnntotal 48

vdntoal 36

rnntotal 32

vwntotal 24

dyntotal 24

A = Ala 2 6.25 - 4 - 4 - 4

C = Cys 1 3.13 - - - - - -

D = Asp 1 3.13 2 2 2 2 2 -

E = Glu 1 3.13 2 2 2 2 2 -

F = Phe 1 3.13 - - - - - 2

G = Gly 2 6.25 - 4 4 4 - -

H = His 1 3.13 2 2 2 - 2 -

I = Ile 1 3.13 - 3 3 3 3 3

K = Lys 1 3.13 2 2 2 2 2 -

L = Leu 3 9.38 - 4 4 - 4 2

M = Met 1 3.13 - 1 1 1 1 1

N = Asn 1 3.13 2 2 2 2 2 -

P = Pro 2 6.25 - 4 - - - -

Q = Gln 1 3.13 2 2 2 - 2 -

R = Arg 3 9.38 - 6 6 2 - -

S = Ser 3 9.38 - 2 2 2 - 4

T = Thr 2 6.25 - 4 - 4 - 4

V = Val 2 6.25 - 4 4 4 4 4

W = Trp 1 3.13 - - - - - -

Y= Tyr 1 3.13 - - - - - -

TAG stop 1 3.13 - - - - - -

TCAG

UUU F 21.7 UCU S 9.1 UAU Y 16.2 UGU C 5.1

UUC F 16.7 UCC S 8.9 UAC Y 12.4 UGC C 6.4

UUA L 13.4 UCA S 7.6 UAA * 2 UGA * 0.9

UUG L 13.2 UCG S 8.7 UAG * 0.3 UGG W 14.4

CUU L 11.1 CCU P 7 CAU H 12.6 CGU R 21.1

CUC L 10.7 CCC P 5.3 CAC H 9.8 CGC R 21.5

CUA L 3.9 CCA P 8.4 CAA Q 14.7 CGA R 3.6

CUG L 51.9 CCG P 22.8 CAG Q 29 CGG R 5.5

AUU I 29.8 ACU T 9.4 AAU N 18 AGU S 8.8

AUC I 25.1 ACC T 23.1 AAC N 21.8 AGC S 15.7

AUA I 4.9 ACA T 7.5 AAA K 34.4 AGA R 2.5

AUG M 27.4 ACG T 14 AAG K 11.2 AGG R 1.5

GUU V 19 GCU A 16.1 GAU D 32.1 GGU G 25.3

GUC V 14.9 GCC A 25.2 GAC D 19.5 GGC G 29.2

GUA V 11.2 GCA A 20.4 GAA E 39.9 GGA G 8.3

GUG V 25.8 GCG A 32.8 GAG E 18.4 GGG G 11.0

T

C

A

G

T C A G

R= A/G Y= C/T M= A/C K= G/T S= C/G W= A/T

H= A/C/T B= C/G/T V= A/C/G D= A/G/T

N= A/C/G/T

Trinukleotide

Nucleic Acids Res 1994 22 5600

Künstliche Diversität in einer Antikörperbibliothek

Phage Display

Phagen koppeln in einer leicht zu handhabbaren und stabilen Form Genotyp und Phänotyp

Bevorzugt werden filamentöse Phagen (fd, M13):• die Phagengröße kann sich der Genomgröße

anpassen• die Phagen lysieren die Zellen nicht• der Terminus eines Hüllproteins (genIIIprotein) ist

leicht zugänglich.

Der Lebenszyklus eines filamentösen Phagen

Phage im Elektronenmikroskop

Figure 4

P3 (5 Kopien)

P6P7 (5 Kopien)

P9 (5 Kopien)P8

(ca. 2300 Kopien)

Gene of interest Gene3

Phagen Genom

Peptide of interest

N1

C

C

C N2

N2

N2

N1

N1

Der schematische Aufbau eines Phagen

ca. 1 µm lang (je nach DNA)ca. 7 nm Durchmesser

Das Genom des M13 Phagen

Gene und Proteine des Phagen

Gen3Protein und Phageninfektion

Die Vermehrung eines filamentösen Phagen

ca. 100 bis 200 RF DNA in 15 min

Molecular Cloning Manual

Phage-Display Übersicht

Phagenselektion

Immunoröhrchen

belegen

Phagen

binden

Phagen

waschen

Phagen

eluieren

Phagenproduktion

Plaques / infizierte Zellen

auf Agar-PlatteZellen in

Flüssigkultur PEG/NaCl-Fällung

Titerbestimmung

Zellen

infizieren

Elution

Mirror-Image Phage Display

L-Base

L-Base

• Directed coating of D-peptide via Streptavidin-Biotin.

• Selection of L-peptide library displayed on phage.

Washing stepBinding

Erfinder des Phage DisplayGeorge P. Smith

• Born in Norwalk, Connecticut, 1941. A.B. degree in biology from Haverfored College, 1963

• Year as a high-school teacher and laboratory technician

• Ph.D. in bacteriology and immunology from Harvard University, 1970.

• Postdoctoral fellowship with Oliver Smithies at the University of Wisconsin

• Assistant Professor at the Division of Biological Sciences at the University of Missouri in Columbia, 1975

• Associate and Full Professor

“Filamentous fusion phage: novel expression vectorsthat display cloned antigens on the virion surface.”

Science. 1985 Jun 14;228(4705):1315-7

Phage, Phagemid und Helfer-Phage

• Phagmid ist ein Plasmid mit f1 ori

• Helfer-Phagen sind verpackungsdefiziente Phagen (z.B. M13K07 mit Mutation im genII)

• Infektion mit einem Helfer-Phagen führt zur Herstellung von Einzelstrang-DNA und Verpackung des Phagmids.

Phagenpräsentations-Formen

geneVIII

geneIII

library

Phage Display

mosaicPhage Display

PhagemidDisplay

Helfer Phage

Phagmid Smith & Petrenko Chem. Rev. 1997, 97, 391.

Disulfidbrücken ermöglichen leichte Elution

Bild: Morphosys

weitere Selektionstechniken

5‘Poly(AAA)‘3

5‘Poly(AAA)‘3

5‘Poly(AAA)‘3

5‘Poly(AAA)‘3

In vitrotranscription

In vitro translation

Ligand selection on target

Protein tethered to ribosome via cold shock or chloramphenicol

Immobilized target

Dissociation of ribosomeand release of mRNA

5‘Poly(AAA)‘3

mRNA

Isolation of mRNA

RT-PCR

dsDNA

Mutagenesis by error-prone PCR

Ribosome Display

Protein-Fragment Complementation Assay (PCA)

AmpR

proteinA mDHFR frag1

A-DHFR[1]

CamR

proteinB mDHFR frag2coding

for

codingfor plasmid: B-DHFR[2]plasmid:

proteinA

proteinB

mDHFRfragment1

mDHFRfragment2

cotransformationinto E. coli

Interacting partners Non-interactingpartners

colonies no colonies

Minimal medium, trimethoprim

sequencinggrowth competition

Single-step selection

Pelletier et al. Nature Biotechnol. 1999, Arndt et al. JMB 2000, Arndt et al. Structure 2002

target:c-Jun

peptidelibrary

mDHFRfragment1

mDHFRfragment2

+

A) Targeting c-Jun

Selection for interaction

c-Jun / FosW

target:c-Fospeptide

library

mDHFRfragment1

mDHFRfragment2

+

B) Targeting c-Fos

Selection for interaction

JunW / c-Fos

Finding Interaction Partners for cJun and cFos