Molekulargenetische Charakterisierung der Bruchpunktregion

Molekulargenetische Charakterisierung der Bruchpunktregion 19q13.4

bei gutartigen follikulären Schilddrüsentumoren und Charakterisierung des Kandidaten-Gens ZNF331

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

Dem Promotionsausschuß Dr. rer. nat. im Fachbereich Biologie / Chemie der Universität Bremen

vorgelegt von

Maren Meiboom

1. Gutachter: Prof. Dr. Jörn Bullerdiek 2. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Bonk Bremen, 23.06.2004

Erklärung

Erklärung

Hiermit versichere ich, Maren Meiboom, geb. am 13.11.1968, daß für das Verfassen

der vorliegenden Dissertation „Molekulargenetische Charakterisierung der

Bruchpunktregion 19q13.4 bei gutartigen follikulären Schilddrüsentumoren und

Charakterisierung des Kandidaten-Gens ZNF331” folgende drei Aussagen zutreffen:

1. Ich habe die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt.

2. Ich habe keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel

benutzt.

3. Ich habe die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen

als solche kenntlich gemacht.

Bremen, 23.06.2004

Maren Meiboom

“In fact, one could argue that cloning these junctions is a very effective method for identifying new transcription factors” O.I. Olopade, O.M Sobulo, J.D. Rowley in “Recurring chromosome rearrangements

in human cancer”

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen.............................................................................................................................I

1 Einleitung ..........................................................................................................................1

2 Material und Methoden.....................................................................................................6

2.1 Gewebeproben .............................................................................................................6

2.2 Kultivierung von Tumorproben......................................................................................6

2.3 Herstellung von Zellinien ..............................................................................................6

2.4 DNA-Sonden.................................................................................................................6 2.4.1 Sonden für die Darstellung der Bruchpunktregion in 19q13.4 .............................................. 6

2.4.1.1 Cosmid-Klone .................................................................................................................... 6 2.4.1.2 PAC-Klone ......................................................................................................................... 7 2.4.1.3 BAC-Klone ......................................................................................................................... 7

2.4.2 Sonden für die Darstellung des subtelomeren Bereichs von 19q ......................................... 7 2.4.3 Sonden für die Darstellung der Bruchpunktregion in 2p21 ................................................... 7 2.4.4 Sonde für das Mapping des caninen ZNF331....................................................................... 7

2.4.4.1 Herstellung der Screening-Sonde...................................................................................... 7 2.4.4.2 Screening........................................................................................................................... 8

2.5 DNA-Gel-Elektrophorese ..............................................................................................8

2.6 Nukleinsäure-Isolierung ................................................................................................8 2.6.1 DNA-Isolierung ...................................................................................................................... 8 2.6.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen........................................................... 9 2.6.3 RNA-Isolierung ...................................................................................................................... 9

2.7 DNA-DNA-Hybridisierungen .........................................................................................9 2.7.1 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)............................................................................. 9 2.7.2 Southern Blots ..................................................................................................................... 10

2.7.2.1 Herstellung von Southern-Blots ....................................................................................... 10 2.7.2.2 Hybridisierung auf Southern Blots ................................................................................... 10

2.8 DNA-RNA-Hybridisierung ...........................................................................................11 2.8.1 Herstellung von Northern-Blots ........................................................................................... 11 2.8.2 Hybridisierung auf Northern Blots ....................................................................................... 11

2.9 PCR ............................................................................................................................11

2.10 cDNA-Erst-Strang-Synthese.......................................................................................12

2.11 RT-PCR ......................................................................................................................12

Inhaltsverzeichnis

2.12 RACE – Rapid Amplification of cDNA Ends ...............................................................12 2.12.1 3’RACE................................................................................................................................ 12 2.12.2 5’RACE................................................................................................................................ 13

2.13 Klonierung von DNA-Fragmenten...............................................................................13 2.13.1 Ligation ................................................................................................................................ 13 2.13.2 Transformation .................................................................................................................... 14

2.14 PCR-Screening an der caninen Phagemid-cDNA-Library ..........................................14

2.15 Sequenzanalysen/In Silico Analysen..........................................................................15

3 Ergebnisse ......................................................................................................................16

3.1 Molekulargenetische Charakterisierung der Bruchpunktregion 19q13 bei gutartigen follikulären Schilddrüsentumoren (Rippe et al., 1999; Belge et al., 2001)...........................................................................................................................16

3.2 Identifizierung und Charakterisierung des Target-Gens ZNF331 (Rippe et al., 1999; Meiboom et al., 2003b) .....................................................................................17

3.3 Evaluierung möglicher versteckter Aberrationen im langen Arm des Chromosom 19 bei follikulären Schilddrüsenadenomen mit scheinbar normalem Karyotyp (Meiboom et al., 2003a)..............................................................19

3.4 Molekulargenetische Charakterisierung eines Kandidatengens in der Bruchpunktregion 2p21 bei benignen, follikulären Schilddrüsentumoren (Rippe et al., 2003) .....................................................................................................20

3.5 Herstellung eines FISH-Sonden-Mixes zur molekular-zytologischen Charakterisierung von Schilddrüsentumoren (Posterpräsentation Meiboom et al., 2003).....................................................................................................................21

3.6 Klonierung, Charakterisierung und Mapping des caninen KRAB Zinkfinger Protein Gens ZNF331 (Meiboom et al., 2004)............................................................22

4 Diskussion.......................................................................................................................24

5 Zusammenfassung .........................................................................................................35

6 Summary .........................................................................................................................37

7 Literatur ...........................................................................................................................39

Danksagung......................................................................................................................51

Publikationsübersicht........................................................................................................52

Anhang .............................................................................................................................53

Abkürzungen I

Abkürzungen aa amino acid (Aminosäure)

Anti-dig-AP Anti-digoxigenin-Alkalische-Phosphatase (Konjugat)

ATC Anaplastic Thyroid Carcinoma (Anaplastisches Schilddrüsenkarzinom)

BAC bacterial artificial chromosome

bp Basenpaar

CFA Canis Familiaris (Chromosom)

DAPI 4’,6’ –Diamidino-2-Phenylindol

cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate

cDNA copy Desoxyribonukleinsäure

dATP Desoxyadenosin-Triphosphat

dCTP Desoxycytosin-Triphosphat

dig Digoxigenin

DNA Desoxyribonukleinsäure

dTTP Desoxythymidin-Triphosphat

dUTP Desoxyuridin-Triphosphat

DTT Di-Thiotreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EST expressed sequence tags

EtBr Ethidiumbromid

FKS fötales Kälberserum

FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung

FTC Follicular Thyroid Carcinoma (Follikuläres Schilddrüsenkarzinom)

gsp G protein subunit alpha

HP1 Heterochromatin Protein 1

HRAS Homolog des viralen (v-Ha-ras) Harvey Rat Sarcoma Onkogens

HUGO Human Genome Organization

HSA Homo Sapiens (Chromosom)

IGF1 Insulin-like growth factor 1

KRAB Krüppel associated Box (Domäne)

KRAS Homolog des viralen (v-Ki-ras) Kirsten Rat Sarcoma Onkogens

kbp Kilobasenpaar

LLNL Lawrence Livermore National Laboratory

LOH loss of heterozygosity (Heterozygositätsverlust)

Mb Megabase

MgCl2 Magnesiumchlorid

MOPS 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure

Abkürzungen II

mRNA messenger Ribonukleinsäure

NaAc Natrium-Acetat

Na-Citrat Natrium-Citrat

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

NCBI National Center for Biotechnology Information

NRAS Homolog des viralen (v-ras) Neuroblastoma Rat Sarcoma Onkogens

NTRK1 Neurotrophic Tyrosine Kinase Receptor Type 1 Gene

ORF Open Reading Frame

PAC P1-derived artificial chromosome

PAX8 Paired Box Gen 8

PBS Phosphate buffered saline

pfu plaque forming unit

PPARG Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma

PTC Papillary Thyroid Carcinoma (papilläres Schilddrüsenkarzinom)

RACE Rapid Amplification of cDNA Ends

Rb Retinoblastoma Gene

RET ret Proto-Onkogen

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

SDS Natrium-Dodecylphosphat

SSC Standard Saline Citrate

STS sequence tagged site

TFG TRK-fused Gene

TK Tyrosin Kinase

TPM3 Non-muscular Tropomyosin Gene 3

TPR Translocated Promoter Region Gene

TSH Thyroid Stimulating Hormone (Thyreotropin)

TSHR Thyroid Stimulating Hormone Receptor (Gen/Protein)

WHO World Health Organization

ZKH Zentralkrankenhaus

ZNF Zinkfinger (Gen/Protein)

Einleitung 1

1 Einleitung

Knotenbildungen in der Schilddrüse sind häufig und von beträchtlicher klinischer

Relevanz. Die Prävalenz von Herdbefunden in der Schilddrüse bewegt sich nach

aktuellen Studien zwischen 5 und 67% (Ezzat et al., 1994; Tan et al., 1997; Reiners

et al., 2003), wobei die große Spannbreite in der Häufigkeit durch zunehmend

verbesserte sonographische Techniken zu erklären ist.

Die Schilddrüse besteht aus zwei Haupttypen epithelialer Zellen: den follikulären

Zellen und den parafollikulären C-Zellen (Hedinger et al., 1988). Die Mehrzahl der

Knoten entstehen aus der follikulären Zelle und zeigen dabei ein großes

phänotypisches Spektrum und unterschiedliche klinische Eigenschaften.

Grundsätzlich können die Schilddrüsenknoten in nicht-neoplastische Veränderungen,

d.h. hyperplastische Knoten, zystische Knoten und Kolloidknoten und nicht-

neoplastische Knoten mit entzündlichem Potential, und in neoplastische Knoten

unterschieden werden.

Nicht-neoplastische Knoten sind nicht der Ausdruck einer einzelnen Erkrankung,

sondern die klinische Manifestation einer ganzen Reihe von Erkrankungen. Das

Ursachenspektrum für die Entstehung solcher Knoten reicht dabei von

Hormonsynthesestörungen über exogene Faktoren (u.a. Jodmangel und Goitrogene)

bis hin zu immunologisch ausgelösten Knoten (Bidey et al., 1999; Knudsen et al.,

2002; Muro-Cacho et al., 2003; Sheu et al., 2003).

Neoplastische Knoten sind meistens follikulären Ursprungs. Den größten Anteil an

den follikulären Tumoren haben die benignen Adenome. Abgesehen von den

„toxischen“, hyperfunktionierenden Varianten sind die meisten Schilddrüsenadenome

wegen ihres relativ langsamen, lokalen Wachstums klinisch von geringerer Relevanz.

Sie können jedoch bei entsprechender Größenzunahme massive Atem- und

Schluckbeschwerden bei den Patienten auslösen und unterliegen stets, unabhängig

von ihrer Größe, der weiteren Beobachtung wegen einer möglichen malignen

Transformation (Schmid, 1997). Follikuläre Adenome wurden in etwa 3%

autopsierter, ansonsten normaler Schilddrüsen gefunden (Hamburger, 1995). Ein

klassisches Adenom ist ein einzelner, eingekapselter Tumor und unterscheidet sich

von normalem Schilddrüsengewebe durch eine höhere Zellularität und geringes

Kolloid; tatsächlich findet sich jedoch ein sehr variabler histologischer Aufbau

(mikrofollikulär, normofollikulär, makrofollikulär, trabekular, solide u.a.). Manche

Einleitung 2

Adenome zeigen eine stark erhöhte Zellularität ohne jedoch den für Karzinome

typischen Kapseleinbruch zu zeigen und werden daher als atypische Adenome

bezeichnet (Oertel & Oertel, 1998a).

Schilddrüsenkarzinome sind relativ selten und machen nur etwa 1% aller malignen

Tumore aus (Gimm, 2001). Mit Ausnahme des medullären Karzinoms (MTC), das

aus den parafollikulären C-Zellen entsteht, des Schilddrüsen-Lymphoms und des

sehr seltenen intrathyreoidalen Sarkoms entstehen maligne Schilddrüsentumoren

aus den follikulären Zellen des Epithels und repräsentieren hauptsächlich papilläre

Karzinome (PTC), follikuläre Karzinome (FTC) und anaplastische Karzinome (ATC).

Die Prognose des anaplastischen Karzinoms ist dabei deutlich schlechter als die der

gut-differenzierten Karzinome (PTC, FTC). Die papillären Karzinome lassen sich

recht gut durch ihre papilläre Architektur, die Einlagerung von Psammomkörnern und

charakteristische Formationen des Zellkerns identifizieren. Histologisch lassen sich

follikuläre Karzinome oft nur durch einen Kapseleinbruch und/oder vaskuläre

Invasion von den follikulären Adenomen unterscheiden. Zytologisch ist die

Unterscheidung kaum möglich. Die anaplastischen Karzinome wachsen extrem

schnell und aggressiv, häufig lassen sich nekrotische Bereiche finden (Oertel &

Oertel, 1998b). Die drei aus der follikulären Schilddrüsenzelle entstehenden

Karzinome umfassen etwa 90% aller malignen Läsionen der Schilddrüsen. Mit bis zu

80% der Fälle ist das papilläre Karzinom (PTC) das häufigste, gefolgt vom

follikulären Karzinom (FTC) mit etwa 10-20% und vom undifferenzierten

(anaplastischen) Karzinom (ATC) mit bis zu 10% der Fälle. Mit etwa 5-10% der

malignen Schilddrüsenveränderungen ist das medulläre, aus den C-Zellen der

Schilddrüsen entstehende Karzinom das häufigste, nicht-follikuläre Karzinom

(Busnardo & De Vido, 2000).

Die exogenen, zytogenetischen und molekularen Mechanismen, die ein vermehrtes

Schilddrüsenwachstum bewirken und eine klonale Expansion einzelner Zellen oder

eine autonome Replikation einzelner Zellgruppen stimulieren und so zur Bildung

klonaler bzw. polyklonaler Schilddrüsenknoten führen, sind erst in ihren Grundzügen

bekannt. Äußere Einflüsse wie Jodmangel wirken auf die Pathogenese von

Strumaknoten (endemische Strumen) ein, indem sie wachstumssteigernde Prozesse

verstärken (Derwahl and Studer, 1998). Ebenso ist der Einfluß radioaktiver Strahlung

Einleitung 3

insbesondere auf die Entstehung papillärer Karzinome bekannt (Busnardo & De

Vido, 2000). Bisher scheint die Pathogenese von Schilddrüsentumoren allerdings

durch eine einzelne Mutation nicht erklärt werden zu können (Derwahl & Studer,

2001), da in ihr nicht nur die Überexpression von Proto-Onkogenen,

Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren, sondern auch Wachstums-fördernde

Mutationen und regulatorische Atypien involviert sind und zudem exogene Faktoren

wie z.B. der Jodmangel den Wachstumsprozeß beeinflussen. Es wird angenommen,

daß die Aktivierung (Hamacher et al. 1995; Gärtner et al. 1998; Bidey et al., 1999;

Kimura et al., 1999) von Proto-Onkogenen oder Wachstumsfaktor-Rezeptoren wie

gsp, MET, NTRK1, RAS, RET, TSHR und IGF1 bzw. Wachstums-fördernde

Mutationen und regulatorische Atypien (Aeschimann et al., 1993; Derwahl et al.,

1999; Derwahl & Studer, 2000; Holzapfel et al., 2002; Vasko et al., 2003) frühe

Ereignisse in der Tumorentstehung sind. Eine aberrante Expression der o.g. Gene ist

mit der Entstehung von Tumoren assoziiert, deren Spektrum vom follikulären

Adenom (RAS, IGF1) über das toxische Adenom (gsp und TSHR) bis zu

differenzierten follikulären Karzinomen (RAS) und papillären Karzinomen (RET, MET,

NTRK1) reicht (Segev et al., 2003). Veränderungen in Tumorsuppressor-Genen wie

p53 oder Rb werden häufig in gering-differenzierten Karzinomen beobachtet und

scheinen ein spätes Ereignis in der Tumorgenese zu sein (Fagin et al., 1993; Zou et

al., 1998).

Ein im Vergleich zu anderen epithelialen Tumoren einzigartiges Charakteristikum der

Schilddrüsentumoren ist die Häufigkeit spezifischer chromosomaler Aberrationen, die

oft Rearrangierungen von Genen (RET/PTC, NTRK1, PAX8/PPARG) zur Folge

haben (Viglietto et al., 1995; Portella et al., 1999; Greco et al., 1997; Soares et al.,

1998; Kroll et al., 2000; Dwight et al., 2003; Nikiforova et al., 2003). Das Vorkommen

der gleichen Translokationen bzw. Gen-Rearrangierungen in benignen wie malignen

Tumoren, wie z.B. PAX8/PPARG (Marques et al., 2002; Cheung et al., 2003)

unterstützt die Hypothese der sog. Adenom-Karzinom-Sequenz, nach der die

verschiedenen Schilddrüsenläsionen unterschiedliche Stufen der histologischen

Entwicklung von der normalen follikulären Zelle zum Adenom, vom Adenom zum

differenzierten Karzinom und vom differenzierten Karzinom zum anaplastischen

Karzinom darstellen (Williams, 1995; Salabè, 2001). Studien zum

Heterozygositätsverlust (LOH) lassen vermuten, daß die Pathogenese papillärer und

Einleitung 4

follikulärer Karzinome unterschiedlich ist (Learoyd et al., 2000) und daß papilläre

Karzinome de novo aus der follikulären Zelle entstehen, während die Entwicklung

des follikulären Karzinoms der Adenom-Karzinom-Sequenz folgt (Segev et al., 2003).

Umfangreiche zytogenetische Studien zeigten gleiche chromosomale

Veränderungen bei nodulären Strumen und follikulären Adenomen, insbesondere

Polysomien der Chromosomen 7 und 12 und strukturelle Veränderungen der

chromosomalen Region 19q13 (Bartnitzke et al., 1989; Bondeson et al., 1989;

Teyssier & Ferre, 1989; Dal Cin et al., 1992; Roque et al., 1993; Belge et al., 1998).

Obwohl der Wachstumsprozeß bei Strumen eher als hyperplastisch denn als

neoplastisch angesehen wird, konnten Kopp et al. (1994) in einer Knotenstruma

neben polyklonalen Knoten auch monoklonale Knoten nachweisen, die damit echten

benignen Tumoren entsprechen (Derwahl, 1998). Das Vorhandensein der gleichen

chromosomalen Veränderungen bei den monoklonalen Knoten wie bei echten

Adenomen deutet auf die Entwicklung von Adenomen aus diesen Knoten und damit

auf eine Strumaknoten-Adenom-Sequenz hin.

Follikuläre Adenome weisen in 30-45% der Fälle klonale Aberrationen auf (Bondeson

et al., 1989; Belge et al., 1994; Belge et al. 1998), bei den nodulären Strumen ist die

Häufigkeit klonaler Aberrationen mit etwa 8% sehr viel niedriger (Belge et al., 1998).

Die häufigsten strukturellen Aberrationen in den follikulären Adenomen sind mit

einem Anteil von etwa 20% der Fälle mit klonalen Aberrationen (Belge et al., 1998)

Veränderungen des Chromosom 19 in der Bande 19q13 und mit etwa 10%

Translokationen des Chromosoms 2 mit Beteiligung der Bande 2p21 (Teyssier et al.,

1990; Belge et al., 1998; Bol et al., 1999; Bol et al., 2001). Die Vermutung liegt nahe,

daß diese Translokationen Rearrangierungen von Genen in der Bruchpunktregion

bewirken, die mit der Entstehung oder Entwicklung der Tumoren assoziiert sind. Da

die typischen Veränderungen der Chromosomen 2 und 19 bisher nur in nodulären

Strumen und Adenomen der Schilddrüse, aber nicht in Karzinomen gefunden

wurden, besteht weiterhin Anlaß zu der Vermutung, daß die zugrundeliegende

Translokationen zur Entstehung von Adenomen führen, die kein Potential zur

malignen Transformation haben. Damit könnte die Existenz dieser chromosomalen

Veränderungen als diagnostischer und prognostischer Faktor zur Beurteilung

follikulärer Adenome dienen.

Einleitung 5

In der vorliegenden Arbeit wurde die molekulargenetische Charakterisierung der

Bruchpunktregionen 2p21 und 19q13 bei follikulären Adenomen der Schilddrüse mit

besonderem Fokus auf die Bruchpunktregion 19q13 vorgenommen. In dieser Region

wurden mehrere Gene in der Nähe des Bruchpunktbereichs identifiziert, von denen

eines, das KRAB Zinkfinger Protein Gen ZNF331, eine aberrante Expression in

Zellinien von Schilddrüsenadenomen, aber nicht in verschiedenen Zellinien von

Schilddrüsenkarzinomen zeigte. Dieses Gen wurde molekulargenetisch

charakterisiert. Wegen der zunehmenden Bedeutung des Hundes als Modelltier zur

Untersuchung der Mechanismen der Tumorentstehung (Ostrander et al., 2000;

Ostrander & Kruglyak, 2000) wurde ebenfalls das canine ZNF331 charakterisiert und

zytogenetisch lokalisiert. In der Bruchpunktregion 2p21 bei follikulären

Schilddrüsenadenomen wurde das Gen THADA identifiziert und charakterisiert. Die

zugrundeliegende Translokation führt zu der Entstehung verschiedener

Fusionstranskripte, die in einer Trunkation von THADA resultieren. Die funktionelle

Bedeutung der aberranten Expression von ZNF331 und der Trunkation von THADA

für das Proliferationsverhalten der follikulären Schilddrüsenzelle ist noch unbekannt

und bleibt das Objekt zukünftiger Untersuchungen, dennoch ist mit der Identifizierung

und Charakterisierung der Gene ein erster wichtiger Schritt in diese Richtung getan.

Material und Methoden 6

2 Material und Methoden

2.1 Gewebeproben

Zum Zwecke der RNA-Isolierung wurden mit der Unterstützung des Instituts für Pathologie

des ZKH St.-Jürgen-Str. in Bremen verschiedene Normalgewebe gesammelt. Diese wurden

etwa 30 min nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren

Verwendung bei –80°C verwahrt.

2.2 Kultivierung von Tumorproben

Gewebeproben von Tumoren wurden unmittelbar nach Entnahme und Begutachtung in

sterile Hanks-Lösung verbracht. Vor der Kultivierung der Zellen erfolgte zunächst ein

mechanischer, darauf folgend ein enzymatischer Aufschluß mit 0,35%iger Collagenase für 3-

4 h bei 37°C. Der Ansatz wurde mit Kulturmedium (Medium 199, Earl’s Salze, 20% FKS

(Gibco BRL, Karlsruhe), 200 IU/ml Penicillin, 200µg/ml Streptomycin (Biochrom, Berlin))

gewaschen und abhängig von der ursprünglichen Größe des Tumorstücks auf 2-3

Zellkulturflaschen verteilt. Die Kultivierung erfolgte in etwa 5ml Kulturmedium bei 37°C und

5% CO2.

2.3 Herstellung von Zellinien

Zur Herstellung von Zellinien wurden kultivierte Tumorzellen mit dem SV40 large T Antigen

mit Hilfe der Calcium-Phophat-Kopräzipitationsmethode (Kazmierczak et al., 1990; Belge et

al., 1992)) transformiert.

2.4 DNA-Sonden

2.4.1 Sonden für die Darstellung der Bruchpunktregion in 19q13.4

2.4.1.1 Cosmid-Klone

Die verwendeten Cosmid-Klone stammen aus den Chromosom-19-spezifischen Cosmid

Libraries (http://bbrp.llnl.gov:80/genome/html/cosmid.html) des Lawrence Livermore National

Laboratory (LLNL, Livermore, USA)) und wurden durch das LLNL zur Verfügung gestellt.

Klon 15841 (LLNLF-113H5) und Klon 20019 (LLNLF-157D7) stammen aus der Chromosom-

19-spezifischen Cosmid Library LLNLF,

Klon 29573 (LLNLR-256H9) und Klon 30316 (LLNLR-264F8) stammen aus der Chromosom-

19-spezifischen Cosmid Library LLNLR (Rippe et al., 1999; Belge et al. 2001).


2.4.1.2 PAC-Klone

Das Screenen der PAC-Klone 19/1 (13174) und 19/2 (13173) erfolgte mit Hilfe von Cosmid-

15841-spezifischen Primer-Sets in der Human PAC Library von Genome Systems (Rippe et

al., 1999).

2.4.1.3 BAC-Klone

Die Auswahl der BAC-Klone aus der humanen chromosomalen Region 19q13.4 erfolgte mit

Hilfe der im Internet veröffentlichten Restriktions-/Klonkarte für Chromosom 19

(http://bbrp.llnl.gov:80/genome/html/chrom_map.html) des LLNL. Die Klone wurden durch

das LLNL zur Verfügung gestellt.

Klon 41372 (CTB-31K1) stammt aus der Caltech Human BAC Library B,

Klon 280723 (CTC-339O9) stammt aus Caltech Human BAC Library C und

Klon 829651 (CTD-3022G6) stammt aus der Caltech Human BAC Library D2 (Belge et al.,

2001).

2.4.2 Sonden für die Darstellung des subtelomeren Bereichs von 19q

Der BAC-Klon aus dem subtelomerischen Bereich des langen Arms von Chromosom 19

stammt aus dem Subtelomer-Sonden-Set, das detailliert von Knight et al., 2000, beschrieben

wurde. Die Klone des Subtelomer-Sonden-Sets wurden von Eric F: P. M. Schoenmakers

(Nijmegen, Die Niederlande) zur Verfügung gestellt (Meiboom et al., 2003a).

2.4.3 Sonden für die Darstellung der Bruchpunktregion in 2p21

Die Auswahl der BAC-Klone aus den humanen chromosomalen Regionen 2p21 (1069E24,

339H12, 183F15, 204D19), 3p25 (167M22) und 7p15 (379L16) erfolgte über

Sequenzanalysen. Die Klone stammen aus der RPCI-11 Male Human BAC Library (RZPD,

Heidelberg) (Rippe et al., 2003).

2.4.4 Sonde für das Mapping des caninen ZNF331

Der Klon 138K24 wurde mittels Hybridisierung einer für canines ZNF331 spezifischen Sonde

auf einen BAC/PAC Filter der caninen RCPI 81 Library (BACPAC RESOURCES, Childrens

Hospital, Oakland, USA) gescreent (Meiboom et al., 2004).

2.4.4.1 Herstellung der Screening-Sonde

Für die Herstellung der Sonde wurde zunächst eine PCR mit den Primern CTG TAC TGG

GAC GTG ATG TTG GAG AA und AGA GTA AAG AGG TGG GAT GGT GAT GG an einer

cDNA Library aus caninem Testis-Gewebe (Zentrum für Humangenetik, Bremen)

durchgeführt. Das resultierende, 1687 bp lange PCR-Fragment repräsentiert einen Teil der


cDNA des caninen ZNF331, startend in der KRAB-Domäne und endend in der Zinc-Finger-

Domäne von ZNF331. Nach EcoRI-Verdau des PCR-Produkts und Auftrennung des

Restriktionsverdaus über Agarose-Gelelektrophorese wurde ein 300 bp großes, der Spacer-

Region des caninen ZNF331 entsprechendes Fragment aus dem Gel isoliert (QIAExII,

QIAGEN, Hilden). Zur Verifizierung wurde das Fragment kloniert (pGEM-T Easy, Promega,

Mannheim) und sequenziert.

2.4.4.2 Screening

Die canine Spacer-Sonde wurde mittels Primer Extension (Random Primed Labeling Kit,

Roche, Mannheim) mit 50µCi [α32P]dCTP gelabelt und den Angaben des Herstellers des

caninen RCPI 81 Library Filters (http://bacpac.chori.org/highdensity.htm) folgend auf den

RPCI 81 Filter hybridisiert. Der Filter wurde lt. Anweisungen des Herstellers ausgewertet.

Der positive Klon RP81-138K24 wurde zusätzlich über eine PCR mit den Primern GAA TGC

AAA GAC TGT GGC AAG ACC und GTT TAA CAA GGC TCG AAC CCC AG und

Sequenzierung des PCR-Produkts verifiziert.

2.5 DNA-Gel-Elektrophorese

Die Auftrennung der DNA erfolgte in horizontalen Elektrophorese-Kammern. Dabei variierte

die Gelkonzentration von 0,8% Agarose bei großen Fragmenten bis zu 2% bei kleinen

Fragmenten. As Elektrophorese-Puffer wurde 1 x TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM

EDTA, pH8,0) eingesetzt. Vor dem Auftragen wurden die Proben mit 1/6 Volumen

Gelbeladungspuffer (15% (w/v) Ficoll 400, 0,25% Xylen Cyanol FF, 0,25% Bromphenolblau)

versetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 80–100 V bis die gesuchten Fragmente genügend

aufgetrennt waren. Die Sichtbarmachung der DNA-Banden erfolgte durch Färbung mit EtBr

und nachfolgende UV-Bestrahlung; die Dokumentation erfolgte durch Photographie (MP4

Kamerasystem, Polaroid).

2.6 Nukleinsäure-Isolierung

2.6.1 DNA-Isolierung

Die Isolierung der Plasmid-, BAC- und PAC-DNA erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen

Lyse mit nachfolgender Aufreinigung über Anionen-Austauscher-Säulen. Hierfür wurden die

kommerziellen DNA-Isolierungs-Kit „QIAGEN Plasmid Midi Kit“ und "QIAprep Spin Miniprep

Kit" (QIAGEN, Hilden) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet (QIAGEN

Plasmid Purification Handbook, QIAprep Miniprep Handbook).


2.6.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Die zu isolierenden DNA-Fragmente wurden in einem präparativen Agarose-Gel aufgetrennt

und unter UV-Licht aus dem Gel herausgeschnitten. Die Isolierung der DNA erfolgte mit Hilfe

und nach den Protokollen des QIAExII Gel Isolation Kits (QIAGEN, Hilden).

2.6.3 RNA-Isolierung

Die Isolierung von totaler RNA aus Geweben oder kultivierten Zellinien erfolgte auf der Basis

des Einzelschritt Säure-Phenol-Isolierungsprinzips für RNA (Chomczynski & Sacchi, 1987)

mit Hilfe des kommerziellen TRIzol Reagens (Invitrogen, Karlsruhe) nach den Angaben des

Herstellers.

Die Isolierung von mRNA erfolgte über die Aufreinigung der mRNA aus totaler RNA über die

Bindung an dC10T30-markierte Polystyren-Latex-Kügelchen mit Hilfe des Oligotex® mRNA

Mini Kits (QIAGEN, Hilden). Für die Verwendung der mRNA in Northern Blot Analysen wurde

für die Isolierung das Batch-Protokoll des Herstellers (QIAGEN Oligotex® Handbook)

verwendet. Hatte die mRNA-Isolierung zum Ziel die mRNA in weiterführenden Verfahren

(cDNA-Synthese, RACE) zu verwenden, erfolgte die Isolierung unter zusätzlicher

Verwendung der im Kit enthaltenen Zentrifugationssäulen nach den Vorgaben des

Herstellers mit dem Spin-Column-Protokoll (QIAGEN Oligotex® Handbook).

2.7 DNA-DNA-Hybridisierungen

2.7.1 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung erfolgte nach GTG-Bänderung, Dokumentation und

Entfärben derselben Metaphasen nach dem Protokoll von Kieviets et al. (1990) mit

geringfügigen Modifikationen. Als DNA-Sonden dienten die unter dem Punkt 2.4

aufgeführten PAC-, BAC- und Cosmid-Klone. Diese wurden mit dig-11-dUTP oder biotin-14-

dATP mittels Nick Translation (Roche, Mannheim) markiert. Für die FISH an humanen

Chromosomen-Präparaten wurden die Sonden in einem Hybridisierungsmix bestehend aus

2–4 ng/µl markierter Sonden-DNA, 1 µg/µl Lachs-Testis-DNA, 200-300 ng/µl humaner

Plazenta-DNA, 1×SSC, 1×SSPE, 50% Formamid und 10% Dextran-Sulfat aufgenommen.

Eine entsprechende Zusammenstellung des Hybridisierungsmixes erfolgte für die FISH an

caninen Präparaten bis auf die Zugabe der humanen Plazenta-DNA, die bei diesen FISH-

Ansätzen mit 20 ng/µl Ultraschall-fragmentierter, caniner DNA ersetzt wurde. Die

hybridisierten Sonden wurden entsprechend ihrer Markierung mit Anti-dig-Fluorescein FAB

Fragmenten (Roche, Mannheim) oder Cy3-konjugiertem Streptavidin (Jackson Immuno

Research, Westgrove, PA, USA) nachgewiesen. Eine Gegenfärbung der Chromosomen

bzw. Interphase-Kerne erfolgte abhängig von der Markierung der Sonden mit DAPI- oder

Propidiumiodid-Antifade-Lösung. Die Auswertung erfolgte an einem Axiophot Fluoreszenz-


Mikroskop (Zeiss, Oberkochen) unter Zuhilfenahme von den jeweilig verwendeten

Fluorochromen entsprechenden Filtern und der Software des Power Gene Karyotyping

Systems (PSI, Halladale, UK). Je Sonde wurden mindestens 10-20 Metaphasen

ausgewertet.

2.7.2 Southern Blots

2.7.2.1 Herstellung von Southern-Blots

Mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI, BamHI bzw. HindIII verdaute DNA-Proben der

verschiedenen PAC-, BAC- und Cosmid-Klone wurden mittels Gel-Eektrophorese in einem

0,8%igem Agarose-Gel über Nacht bei etwa 25 V aufgetrennt. Bei PCR-Produkten erfolgte

eine Auftrennung bei etwa 70V für 2 h. Nach einer Denaturierung der DNA durch eine

zweimalige Inkubation des Gels für jeweils 15 min in 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl,

Neutralisierung durch dreimalige Inkubation für jeweils 10 min in 3 M NaCl/0,5 M Tris-HCl,

pH7,4 und Equilibrierung für etwa 10 min in 20×SSC (3 M NaCl/0,3 M Na-Citrat, pH7,0)

folgte die Übertragung der DNA auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond-N+,

Amersham, Freiburg) mittels Vakuum (Vakuum Blotter 785, BioRad, München). Die

transferierte DNA wurde über UV-Cross-Linking (0,4 J/cm) auf der Membran fixiert.

2.7.2.2 Hybridisierung auf Southern Blots

Hybridisierte dig-markierte Sonden wurden über Chemielumineszenz mit Hilfe von Anti-dig-

AP und CDP-Star nachgewiesen. Die Membran mit der fixierten DNA wurde zunächst für 30

min in 5 ml ExpressHyb-Lösung (Clontech, Palo Alto, USA) bei 60°C prähybridisiert. Die

Lösung wurde verworfen, mit 5-10 ml frischer ExpressHyb-Lösung und 20-50 ng/ml

denaturierter dig-markierter Sonde (Random-primed Labeling Kit, Roche, Mannheim) ersetzt

und für 60 min bei 60°C inkubiert. Im Anschluss an die Hybridisierung erfolgte die Entfernung

unspezifischer Bindungen durch Waschungen für 2 × 15 min in 2×SSC/0.1% SDS bei RT, 2

× 15 min in 0.1×SSC/0.1% SDS bei 60°C und 5 min in 0,1 M Maleinsäure/0,15 M NaCl,

pH7,5/0.3% Tween-20. Nach einer Equilibrierung der Membran in 0,1 M Maleinsäure/0,15 M

NaCl, pH7,5/1% Blocking-Reagens für 30 min folgte eine 30-minütige Inkubation im gleichen

Puffer mit 75 mU/ml Anti-dig-AP/Fab-Fragmente (Roche, Mannheim). Nicht-gebundene

Antikörper wurden durch zwei Waschungen für 15 min bei RT in 0,1 M Maleinsäure/0,15 M

NaCl, pH7,5/0.3% Tween-20 entfernt. Nach Equilibrierung der Membran in 0,1 M Tris-

HCl/0,1 M NaCl/50 mM MgCl2, pH9,5 wurde die Membran im gleichen Puffer mit 0,25 mM

CDP-Star (Promega, Mannheim) in Folie geschweißt. Der Nachweis der Chemielumineszenz

erfolgte auf Hyperfilm ECL (Amersham, Freiburg).


2.8 DNA-RNA-Hybridisierung

2.8.1 Herstellung von Northern-Blots

Jeweils 5µg mRNA aus verschiedenen Gewebe und/oder Zellinien wurden zunächst für 10

min bei 65°C in RNA-Ladepuffer (50% (v/v) Formamid, 2,2 M Formaldehyd, 1×MOPS-Puffer,

1% Ficoll 400, 0,02% Bromphenolblau) inkubiert und nach einer kurzen Inkubation auf Eis für

etwa 4 h bei 75 V in einem 1% Agarose/6% Formaldehyd-Gel aufgetrennt. 1×MOPS-Puffer

(20 mM MOPS, 5 mM NaAc, 1 mM EDTA, pH8,0) diente dabei sowohl als Puffer für die Gel-

Herstellung als auch als Elektrophorese-Laufpuffer. Nach der Auftrennung wurde das Gel

bzw. die RNA für 20 min in 50 mM NaOH denaturiert, durch eine Inkubation für 2 × 15 min in

1,8 M NaCl/0,5 M Tris-HCl, pH7.5, 0,5 µg/ml EtBr wieder neutralisiert und für die folgende

Dokumentation angefärbt. Nach der Equilibrierung des Gels durch Inkubation für 2 × 20 min

in 10×SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M Na-Citrat, pH7,0) erfolgte der Transfer der RNA mittels

Kapillarsog für etwa 18 h auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond-N+, Amersham,

Freiburg). Die transferierte RNA wurde über UV-Cross-Linking (0,4 J/cm) auf der Membran

fixiert.

2.8.2 Hybridisierung auf Northern Blots

Die cDNA-Sonden wurden mittels Primer Extension (Random Primed Labeling Kit, Roche,

Mannheim) mit 50µCi [32P]dCTP gelabelt, denaturiert und in einer Konzentration von 10-20

ng/ml zu den Northern Blot Membranen gegeben. Als Hybridisierungslösung wurde sowohl

für die Prähybridisierung (30 min bei 68°C) als auch für die Hybridisierung (60 min bei 68°C)

ExpressHyb-Lösung (Clontech, Palo Alto, USA) verwendet. Ungebundene Sonden wurden

durch viermalige Waschung für 10 min bei RT in 2xSSC/0.05% SDS und zweimalige

Waschung für 20 min bei 50°C in 0.1x SSC/0.1% SDS von der Membran entfernt. Die

Auswertung der Signale erfolgte mit einem STORM Phosphor Imager (Molecular Dynamics,

Sunnyvale, USA).

2.9 PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgte in Ansätzen von 20-50 µl und wurde in einem

Eppendorf Mastercycler (Eppendorf, Hamburg) mit Deckelheizung durchgeführt. Etwa 20-

100 ng Template DNA wurden mit 200-300µM dNTPs, 200-400 nM jedes Primers, 1×PCR-

Puffer (inkl. 1,5 mM MgCl2) und 2,5 U Taq-DNA-Polymerase durchgeführt. Die Hersteller der

jeweils verwendeten Taq-DNA-Polymerasen und Puffer sind den anhängenden

Publikationen zu entnehmen.


2.10 cDNA-Erst-Strang-Synthese

Die cDNA-Erst-Strang-Synthese erfolgte standardmäßig an 5 µg totaler RNA oder 1 µg

mRNA in einem Volumen von 20 µl mit Hilfe von 200 U M-MLV-Reverser Transkriptase

(Invitrogen, Karlsruhe), 500 nM dNTPs, 1 µM Primer AAGGATCCGTCGACATCT(17),

1×Reaktions-Puffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH8.3) und 10 mM DTT für

45 min bei 42°C. Eine Inaktivierung des Synthese-Ansatzes erfolgte durch eine 5-minütige

Inkubation bei 65°C.

Die cDNA-Synthese für nachfolgende 3’RACE-Experimente erfolgte wie oben beschrieben

mit geringen Modifikationen. Die Erst-Strang-Synthese erfolgte mit 200 U Superscript™

Reverser Transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe) für 50 min bei 37°C.

Die cDNA-Erst-Strang-Synthese für nachfolgende 5’RACE-Experimente erfolgte zunächst

wie oben für die 3’RACE beschrieben. Als Primer wurden statt des Oligo-(dT)-Primers Gen-

spezifische Primer (Meiboom et al., 2003b) eingesetzt. Auf die Erst-Strang-Synthese folgte

ein 30-minütiger Verdau mit 3 U RNase H (Invitrogen, Karlsruhe) bei 37°C und eine

Aufreinigung der Proben über Spin-Säulen (PCR Purification Kit, QIAGEN, Hilden). Das 5’

Ende der aufgereinigten cDNAs wurde mit Hilfe von 15 U Terminaler Deoxynucleotidyl

Transferase (TdT, Promega, Mannheim) in 1×Tailing-Puffer (100mM Cacodylat Puffer

(pH6.8), 1mM CoCl2, 0.1mM DTT) für 10 min bei 37°C mit 200 µM dCTP getailt und damit

eine Bindungsstelle für den 5’ Anchor-Primer GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG

GII GGG IIG hergestellt.

2.11 RT-PCR

Für die Durchführung von RT-PCRs erfolgte zunächst eine Erst-Strang-Synthese an 5 µg

totaler RNA oder 1 µg mRNA, wie unter Punkt 2.10 beschrieben. 2 µl der cDNA wurden dann

in einer Standard-PCR, wie unter Punkt 2.9 beschrieben, amplifiziert.

2.12 RACE – Rapid Amplification of cDNA Ends

2.12.1 3’RACE

Die 3’RACE-PCR erfolgte grundsätzlich wie unter Punkt 2.9 beschrieben. 1-2 µl cDNA

wurden mit jeweils 400 nM Oligo (dT)-Primer und 400 nM Gen-spezifischem Primer über 35

Zyklen amplifiziert. Die Annealing-Temperaturen lagen abhängig von den verwendeten

Primern zwischen 55 und 60°C. Die Zeiten für die Extension variierten zwischen 2-5 min.

Alternativ wurde die 3’RACE mit Hilfe und nach den Vorgaben des Advantage cDNA PCR

Kits (Clontech, Palo Alto, USA) durchgeführt (Rippe et al., 2003).


2.12.2 5’RACE

Die 5’RACE-PCR erfolgte grundsätzlich wie unter Punkt 2.9 beschrieben. 5 µl dC-getailter

cDNA wurden mit jeweils 400 nM 5’ Anchor-Primer GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG

GGI IGG GII GGG IIG und 400 nM Gen-spezifischem Primer (Meiboom et al., 2003b) über

30-35 Zyklen amplifiziert. Die Annealing-Temperaturen lagen abhängig von den verwendeten

Primern zwischen 55 und 60°C. Die Zeiten für die Extension variierten zwischen 2-5 min.

Alternativ wurde die 5’RACE-PCR an einer kommerziellen, in Adaptoren ligierte cDNA

Library aus Testis-Gewebe (Marathon-Ready™ cDNA Kit, Clontech, Palo Alto, USA)

durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte nach den Angaben des Herstellers an 5 µl der

Marathon-Ready™ cDNA Library mit 0,2 µM des im Kit enthaltenen Adaptor-Primer, 0,2 µM

Gen-spezifischem Primer, 200 µM dNTPs, 1×cDNA-PCR-Puffer (40 mM Tricine-KOH

(pH9.2), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)2, 3,75 µg/ml BSA) und 1µl 50×Advantage cDNA

Polymerase Mix (Clontech, Palo Alto, USA) in einer Touchdown-PCR mit 5 Zyklen mit 20 sec

bei 94°C und 5 min bei 72°C, 5 Zyklen mit 20 sec bei 94°C und 5 min bei 70°C und 25

Zyklen mit 20 sec bei 94°C und 5 min bei 68°C.

Bei der 5’RACE des caninen ZNF331 wurde eine cDNA Library aus caninem Testis-Gewebe

als Template eingesetzt. Hier wurden 400 nM des Vektor-Primers M13rev AGC GGA TAA

CAA TTT CAC ACA GG als Upstream-Primer und 400 nM des Gen-spezifischen Primers

TAT TTT CTC TAC AAG TGG GCG TTT T für die Amplifikation in einer Standard-PCR

genutzt.

2.13 Klonierung von DNA-Fragmenten

2.13.1 Ligation

Die Ligationen wurde in einem Gesamtvolumen von 10-20 µl durchgeführt. Das Verhältnis

von Vektor- zu Fragment-DNA richtete sich nach den abgeschätzten Mengen und betrug ca.

1:1-1:5.

Die Ligation von PCR-Produkten erfolgte standardmäßig mit Hilfe des Vektor-Systems

pGEM®-T Easy (Promega, Mannheim) nach den Vorgaben des Herstellers.

Die Ligation von geschnittenen DNA-Fragmenten erfolgte mit Hilfe von T4-DNA-Ligase

(Promega, Mannheim) in den Vektor pGEM11zf+ (Promega, Mannheim), der zuvor mit dem

des zu klonierenden DNA-Fragmentes entsprechenden Restriktionsenzym geschnitten und

aufgereinigt wurde.

Die Ligation von RACE-PCR-Produkten erfolgte standardmäßig in pGEM®-T Easy-Vektor

(Promega, Mannheim). Alternativ wurde das pAMP1-Vektor-System (Gibco BRL,

Eggenstein) nach den Vorgaben des Herstellers verwendet.


2.13.2 Transformation

Die Thermo-Transformation von Ligationsprodukten erfolgte nach dem Protokoll von Inoue et

al. (1990) in kompetente DH5α E.coli-Zellen (Stratagene, La Jolla, USA).

2.14 PCR-Screening an der caninen Phagemid-cDNA-Library

Für die Isolierung eines caninen cDNA-Klons von ZNF331 wurde ein PCR-Screening an

einer Phagemid-cDNA-Library aus caninem Testis-Gewebe (hergestellt von H. Murua

Escobar, Zentrum für Humangenetik, Bremen) durchgeführt. Für das Screening wurde eine

Standard-PCR mit 3 µl Phagemid-Lösung und je 400 nM der humanen, ZNF331-spezifischen

Primern GTA AAT CCC TTG GCC GTA ACT G und AGG CCT TCC CAC ATT CTT GAC bei

einer Annealing-Temperatur von 56°C durchgeführt. Der Nachweis eines positiven PCR-

Resultats erfolgte über Southern-Blot-Hybridisierungen wie unter 2.7.2 beschrieben.

Ausgehend von einem Superpool (komplette Library) wurden positive Pools weiter verdünnt

und gescreent bis von einer statistischen Wahrscheinlichkeit von 1-2 Klonen/Pool

ausgegangen werden konnte. Die Kultivierung und Verdünnung der Phagemid-Klone wurde

nach den Instruktionen des ZAP-cDNA® Gigapack® III Gold Cloning Kits (Stratagene, La

Jolla, USA) vorgenommen. Zur Verdünnung der Pools wurde nach vorangehender

Titerbestimmung (pfu/µl) eine definierte Anzahl pfus mit 500 µl XL1-Blue MRF’ Zellen für 15

min bei 37°Cinkubiert und in 20 ml vorgewärmtes LB-Medium (2% Maltose/10 mM MgSO4)

überführt. 64 100 µl-Aliquots der Verdünnung wurden daraufhin in einer Mikrotiterplatte in

einem 8×8 Raster für 6 h bei 37°C unter horizontaler Rotation inkubiert. Die Anzahl der

pfus/100 µl-Kultur entsprach dabei 0,5% der Ausgangsmenge. 25 µl der 100 µl-Kulturen

wurden jeweils horizontal und vertikal gepoolt, resultierend in 16-Pools mit je 200 µl

Volumen, die über PCR nach der Existenz von ZNF331 überprüft wurden (s.o.) und bei

positivem Ergebnis die Identifizierung der Ausgangs-100 µl-Kultur in der Mikrotiterplatte

ermöglichten. Diese wurde dann weiter verdünnt und gescreent bis die Exzision eines

einzelnen Phagemids mit Hilfe von ExAssist® Helfer Phagen (Stratagene, La Jolla, USA)

nach den Angaben des Herstellers erfolgte.


2.15 Sequenzanalysen/In Silico Analysen

Die Sequenzierungen wurden von kommerziellen Anbietern (MWG Biotech, München; GAG,

Bremen; Institut für Rechtsmedizin, ZKH St.-Jürgen-Str., Bremen) durchgeführt.

Die Sequenzanalysen erfolgten mit Hilfe des Lasergene Software Pakets (DNAstar,

Madison, USA). Homologie-Untersuchungen erfolgen mit Hilfe des online BLAST

Programms des National Center for Biotechnology Information, NCBI (Altschul et al., 1997)

und mit dem BLAT Programm des UCSC Genome Browser der University of California-

Santa Cruz (Kent et al., 2002).

Für in silico Analysen von DNA- und Aminosäure-Sequenzen wurden diverse, vom NCBI

online (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) zur Verfügung gestellte Programme und Datenbanken

genutzt (Locus Link, SAGE, MapViewer, AceViewer, ePCR, GenBank, UniGene, usw.).

Ergebnisse 16

3 Ergebnisse

3.1 Molekulargenetische Charakterisierung der Bruchpunktregion 19q13 bei gutartigen follikulären Schilddrüsentumoren (Rippe et al., 1999; Belge et al., 2001)

Strukturelle Aberrationen im langen Arm des Chromosom 19 in der Region 19q13

gehören zu den häufigsten klonalen Veränderungen bei gutartigen follikulären

Schilddrüsentumoren. Da die Translokationspartner von Chromosom 19 variieren, ist

anzunehmen, daß ein von der Translokation betroffenes und damit als Kandidaten-

Gen für die Tumorentstehung anzusehendes Gen auf Chromosom 19 lokalisiert ist .

Die Charakterisierung der Bruchpunktregion in der Region 19q13 erfolgte zunächst

über FISH, dafür wurde ein Set von sechs Cosmid-, PAC- und BAC-Sonden, die

einen 470-kbp-Kontig der Bruchpunktregion bilden, eingesetzt. Bei zwei Zellinien aus

Schilddrüsenadenomen mit einer t(5;19)(q13;q13) bzw. einer t(1;19)(p35-p36.1;q13)

wurde der Bruchpunktbereich auf eine Größe von etwa 140 kbp, überspannt von

einem einzelnen PAC-Klon (PAC19/1), reduziert (Rippe et al., 1999). In einer

weiteren FISH-Studie an primärem Tumormaterial von vier Schilddrüsenadenomen

mit t(2;19)(p12;q13) bzw. t(5;19)(q13;q13) bzw. t(14;19)(q22;q13) wurde der

Bruchpunktbereich bei allen Primärtumoren durch den BAC-Klon 280723 überspannt

Belge et al.,2001).

Sequenzanalysen der Cosmid-, PAC- und BAC-Klone des 470-kbp-Kontigs der

Bruchpunktregion und Vergleich der Daten mit der Restriktions-/Klonkarte für

Chromosom 19 des LLNL (http://bbrp.llnl.gov:80/genome/html/chrom_map.html)

ermöglichten eine Feinkartierung des Bruchpunktbereichs. Zehn neu etablierte STS-

Marker wurden in die Karte eingearbeitet. Die Feinkartierung des

Bruchpunktbereichs ermöglichte die Lokalisation der Bruchpunkte der Zellinien und

Primärtumoren auf einen Bereich von etwa 150 kbp. Die Bruchpunktregion in den

Primärtumoren liegt dabei etwa 50 kbp distal zur Bruchpunktregion in den Zellinien

(Belge et al., 2001).

Durch BLAST-Analysen der Klone wurde eine Anzahl von ESTs bzw. Genen in der

kartierten 470-kbp-Region entdeckt. In der Reihenfolge auf das Telomer zuwandernd

liegen proximal vom Bruchpunkt das KRAB-Zinkfinger-Gen ZNF331 sowie ein Gen,

das eine Homologie zu Genen der Familie der hCATs (human Cationic Amino Acid

Ergebnisse 17

Transporter) aufweist. In einem Abstand von etwa 190 kbp zum hCAT-homologen

Gen findet sich distal vom Bruchpunkt PYPAF7 (Pyrin-containing APAF-like Protein

7). Darauf folgen in kurzem Abstand MYADM (Myeloid-associated Differentiation

Marker) und PKCG (Protein Kinase C gamma). Innerhalb des durch FISH-Analysen

identifizierten 150-kbp-Bruchpunktbereichs konnte kein EST bzw. Gen identifiziert

werden.

Von diesen Genen bzw. ESTs wurde in der vorliegenden Arbeit das KRAB-

Zinkfinger-Gen ZNF331 umfassend charakterisiert.

3.2 Identifizierung und Charakterisierung des Target-Gens ZNF331 (Rippe et al., 1999; Meiboom et al., 2003b)

In silico Analysen von Sequenzen des PAC-Klons 13174 und des Cosmid-Klons

15841 ermöglichten die Erstellung der cDNA-Sequenz des KRAB Zinkfinger Protein

Gens RITA (Rearranged in Thyroid Adenoma), das später, der HUGO

Gennomenklatur folgend, ZNF331 genannt wurde.

ZNF331 ist etwa 25 kbp proximal des identifizierten 150-kbp-Bruchpunktbereichs bei

follikulären Schilddrüsentumoren lokalisiert. Es ist in Richtung des Telomers

orientiert, d.h. die Bruchereignisse bei Schilddrüsentumoren treten 3’ des Gens auf.

Mit Hilfe von RACE-PCRs konnten acht verschiedene Splice-Varianten des Gens

identifiziert werden, zwei weitere wurden mit Hilfe von BLAST-Analysen gefunden.

Die Länge der Transkripte variiert abhängig von der jeweiligen Splice-Variante

zwischen etwa 2,1 und 2,5 kbp. Die etablierte cDNA besteht aus 15 Exons und

überspannt auf genomischer Ebene etwa 56 kbp. Die Transkripte unterscheiden sich

dabei hauptsächlich durch Trunkationen im 5’ Ende des Gens, seltener durch

Trunkationen im 3’ Ende.

Der ORF ist bei allen identifizierten Splice-Varianten gleich. Das gebildete Protein

besteht aus 463 Aminosäuren und enthält eine 42 aa KRAB-A Domäne und eine 332

aa Zinkfinger-Region. Die beiden funktionellen Einheiten werden durch eine 89 aa

Spacer-Region getrennt. Die Zinkfinger-Region bildet 12 C2H2-Zinkfinger-Stukturen,

die Linker-Sequenz zwischen den einzelnen Fingern entspricht der konservierten

Sequenz TGEKPYX (H/C link), wobei X eine beliebige Aminosäure ist.

Ergebnisse 18

Die Expression von ZNF331 wurde mittels Northern Blot Hybridisierungen an mRNA

aus verschiedenen Normalgeweben inkl. Schilddrüsengewebe untersucht.

Vergleichend wurden Northern Blot Hybridisierungen an mRNA aus Zellinien von

Schilddrüsenadenomen mit den spezifischen 19q13-Aberrationen und aus Zellinien

von Schilddrüsenkarzinomen vorgenommen. Zusätzlich wurde die mRNA aus

normalen, kultivierten Fibroblasten zu vergleichenden Untersuchungen hinsichtlich

möglicher Zellkultur-Artefakte herangezogen.

In den Normalgeweben sowie in den Zellinien aus Schilddrüsenkarzinomen konnte

die Expression von zwei Transkripten mit etwa 4,0 und 4,8 kbp nachgewiesen

werden. Zusätzlich fand sich in Testis-Gewebe und in der Zellinie des

Anaplastischen Karzinoms (ARO) die zusätzliche Expression eines etwa 2,1 kbp

Transkriptes. Insgesamt war die Expression der Transkripte in den Karzinom-

Zellinien signifikant schwächer als in den Normalgeweben.

In den Zellinien aus Schilddrüsenadenomen mit den spezifischen 19q13-

Aberrationen wurden drei Transkripte mit 3,4, 5,5 und 6,2 kbp gefunden. Eine

vergleichende Untersuchung an kultivierten Fibroblasten zeigte zusätzlich zur

Expression der „normalen“ 4,0 und 4,8 kbp Transkripte eine schwache Expression

der 5,5 und 6,2 kbp Transkripte und deutete daher auf einen möglichen Einfluß der

Zellkultivierung auf das Expressionsprofil von ZNF331.

Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß das normale Expressionsprofil von

ZNF331 drei Transkripte (2,1, 4,0 und 4,8 kbp) umfaßt. Dieses findet sich in

Normalgeweben, kultivierten Fibroblasten und kultivierten Tumorzellen ohne 19q13

Aberration in unterschiedlicher Stärke und unterschiedlichem Vorkommen der

einzelnen Transkripte, wobei insbesondere bei den Karzinom-Zellinien die

Expression aller Transkripte sehr schwach ist. Die Expression von zwei großen

Transkripten von ZNF331 (5,5 und 6,2 kbp) wird wahrscheinlich durch Komponenten

des Zellkultivierungssytems beeinflußt und kann daher nicht mit den

Bruchereignissen in Chromosom 19q13 korreliert werden.

Die Expression des 3,4 kbp Transkriptes wird ausschließlich in den Zellinien aus

Schilddrüsenadenomen nachgewiesen und steht daher in deutlichem

Zusammenhang mit den Bruchereignissen in Chromosom 19q13, d.h. die veränderte

Expression von ZNF331 wird durch den chromosomalen Bruch verursacht.

Ergebnisse 19

Zytogenetisch gehören die Translokationen unter Einbeziehung der chromosomalen

Bande 19q13 zu den häufigsten strukturellen Aberrationen bei benignen follikulären

Schilddrüsentumoren. Da sowohl das Chromosom 19 als auch das vom Chromosom

19 translozierte Chromosomensegment sehr klein sind, könnten Translokationen

entstehen, die mit Standard-Methoden zytogenetisch nicht zu erfassen sind. Daher

wurde eine Gruppe von Adenomen mit scheinbar normalem Karyotyp über FISH auf

die Integrität des terminalen Bereichs des langen Arms des Chromosoms 19

überprüft.

3.3 Untersuchungen auf Aberrationen im langen Arm des Chromosom 19 bei follikulären Schilddrüsenadenomen mit scheinbar normalem Karyotyp (Meiboom et al., 2003a)

Bei etwa 45% der follikulären Schilddrüsenadenome sind klonale Veränderungen zu

finden, von denen etwa 20% strukturelle Aberrationen in der chromosomalen Bande

19q13.4 aufweisen. Die Aberrationen sind Translokationen mit jeweils wechselnden

Translokationspartnern des Chromosom 19, dabei sind die am häufigsten

gefundenen Veränderungen die t(5;19)(q13;q13), t(2;19)(p12;q13) und t(1;19)(p35

oder 36;q13). Bei diesen Translokationen sind große Chromosomen-Segmente der

Translokationspartner involviert, die wegen ihrer Größe und ihres charakteristischen

Bandenmusters recht einfach mit konventionellen Banding-Methoden identifiziert

werden können. Wegen der geringen Größe des von Chromosom 19 translozierten

Segments stellt sich jedoch die Frage, ob ein Austausch mit ebenfalls kleinen

Segmenten der Translokationspartner, möglicherweise ohne charakteristische

chromosomale GTG-Banden, der Entdeckung durch zytogenetische Banding-

Methoden entgeht.

Um das Vorkommen und die Häufigkeit versteckter Aberrationen zu ermitteln wurden

FISH-Studien mit einer Sonde durchgeführt, die für den subtelomerischen Bereich

des Chromosoms 19q spezifisch ist. Die Sonde stammt aus einem Set von

Subtelomer-Klonen (Knight et al., 2000), die in einem Abstand von etwa 100–800

kbp von den jeweiligen Chromosomenenden lokalisiert sind, und ist damit gut

geeignet Translokationen sowie Deletionen des terminalen Bereichs des

Chromosoms 19q nachzuweisen. In die Studie wurden 38 Schilddrüsenadenome

Ergebnisse 20

eingesetzt, die nach GTG-Banding einen scheinbar normalen Karyotyp aufwiesen

und die mit Rücksicht auf mögliche Fibroblasten-Kontaminationen aus sorgfältig

kultivierten, frühen Passagen der Tumorzellkulturen stammten.

Bei allen untersuchten Fällen hybridisierte die Subtelomer-Sonde am Ende des

langen Arms der Chromosomen 19. Damit wurde die Integrität des Telomerbereichs

des Chromosoms 19q bestätigt und es ist unwahrscheinlich, daß eine höhere als die

durch zytogenetische Banding-Methoden bestimmte Aberrationsrate bei

Schilddrüsenadenomen existiert. Da mit der verwendeten Sonde kleine

intrachromosomale Veränderungen möglicherweise nicht entdeckt wurden, besteht

allerdings noch eine geringe Wahrscheinlichkeit für versteckte Aberrationen bei

einem Anteil der Fälle.

3.4 Molekulargenetische Charakterisierung eines Kandidatengens in der Bruchpunktregion 2p21 bei benignen, follikulären Schilddrüsentumoren (Rippe et al., 2003)

Strukturelle Veränderungen in der chromosomalen Bande 2p21 machen mit etwa

10% der Fälle mit klonalen Veränderungen die zweitgrößte zytogenetische

Subgruppe bei benignen, follikulären Schilddrüsentumoren aus (Teyssier et al., 1990;

Belge et al., 1998; Bol et al., 1999; Bol et al., 2001). Ein Set von vier überlappenden

BAC-Klonen, die die bekannte 450-kbp-Bruchpunktregion abdecken (Bol et al.,

2001), wurde in FISH-Studien an zwei Zellinien aus Schilddrüsenadenomen

eingesetzt. Die Zellinien wiesen die spezifischen Veränderungen in der Bande 2p21

auf und waren durch eine t(2;20;3)(p21;q11.2;p25) bzw. eine t(2;7)(p21;p15)

charakterisiert. Bei beiden Zellinien wurde der Bruchpunkt entweder durch den BAC-

Klon 1069E24 überspannt oder von den BAC-Klonen 339H12 und 204D19, die den

BAC-Klon 1069E24 flankieren, eingegrenzt.

Durch Datenbank-Recherchen mit Sequenzmaterial der BAC-Klone wurden etliche

nicht-charakterisierte ESTs in der Bruchpunktregion gefunden. In silico Analysen der

EST-Klone und RT-PCRs ermöglichten die Erstellung der cDNA-Sequenz eines

bisher nicht beschriebenen Gens, welches der HUGO Gen Nomenklatur folgend

THADA (Thyroid Adenoma Associated) genannt wurde. Es ist in Richtung des

Ergebnisse 21

Telomers des kurzen Arms von Chromosom 2 orientiert und überspannt auf

genomischer Ebene etwa 365 kbp. THADA besteht aus 38 Exons bei einer

Transkriptlänge von etwa 6090 bp. Bei einer Splice-Variante des Gens werden die

Exons 27 und 28 nicht transkribiert, resultierend in einer cDNA mit 36 Exons und

einer Länge von etwa 5868 bp.

Mittels Northern Blot Hybridisierungen konnte die Expression eines etwa 6,2 kbp

Transkriptes von THADA in diversen Normalgeweben nachgewiesen werden. Die

Stärke der Expression variierte in den verschiedenen Geweben, war jedoch generell

auf einem niedrigen Niveau. Eine stärkere Expression von THADA konnte in Testis-

und Pankreasgewebe nachgewiesen werden, die Expression von THADA in

Schilddrüsengewebe war deutlich schwächer.

THADA überspannt auf genomischer Ebene einen großen Teil der Bruchpunktregion.

Die Auswirkungen der chromosomalen Brüche auf die Genstruktur von THADA

wurden mittels 3’RACE-Analysen an den o.g. Zellinien untersucht. Die gefundenen

Transkripte zeigten einen Abbruch der bekannten cDNA-Sequenz von THADA nach

dem Exon 28. Das an das Exon 28 fusionierte Sequenzmaterial stammte von den

Translokationspartner 3p bzw. 7p. Da in silico Analysen des fusionierten Materials

von Chromosom 3 bzw. Chromosom 7 keinerlei Hinweise auf mögliche

Genstrukturen in diesen Bereichen gaben, scheint der kritische Effekt der 2p21-

Aberration bei Schilddrüsentumoren eher in einer Trunkation von THADA,

resultierend aus Brüchen im Intron 28, als in der Bildung eines neuen (Fusions)gens

zu bestehen.

3.5 Herstellung eines FISH-Sonden-Mixes zur molekular-zytologischen Charakterisierung von Schilddrüsentumoren (Posterpräsentation Meiboom et al., 2003)

Ein wichtiges präoperatives, diagnostisches Instrument zur Beurteilung des

Tumorrisikos von Schilddrüsenknoten ist die zytologische Untersuchung nach

Feinnadelbiopsie. Diese zytologische Untersuchung hinterläßt jedoch eine

„diagnostische Lücke“ aufgrund der zytologisch nicht möglichen Unterscheidung

zwischen benignen und malignen Tumoren follikulären Ursprungs.

Ergebnisse 22

Die zytogenetische Analyse von über 500 Schilddrüsenläsionen hatte gezeigt, daß

die häufigsten wiederkehrenden chromosomalen Veränderungen bei benignen

Schilddrüsentumoren strukturelle Aberrationen im Chromosom 2 in der Bande p21

und im Chromosom 19 in der Bande 19q13.4 sowie numerische Veränderungen des

Chromosoms 7 sind. Von den chromosomalen Brüchen der Chromosomen 2 und 19

sind zwei Gene direkt betroffen: das Gen THADA in 2p21 und das Gen ZNF331 in

19q13.4. Obwohl die Auswirkungen der veränderten Expression dieser Gene auf die

Tumorentstehung noch nicht vollständig geklärt sind, wird mit dem Nachweis der

genetischen Veränderungen auf der chromosomalen Ebene über die FISH die

Einschätzung des Zusammenhangs zwischen Genveränderung und

Tumorentwicklung ermöglicht.

Für die Darstellung der Bruchereignisse wurde flankierende Sonden gewählt, da

diese den Vorteil haben mit der Trennung des Signalpaars auch in Interphase-

Kernen einen Bruch eindeutig darzustellen. Die Verwendung von den Bruchpunkt

überspannenden Sonden würde bei zytologischen Präparaten mit einer vorhandenen

Translokation 3 Signale erzeugen, die ohne Kenntnis des molekularen Hintergrunds

der Präparate auch eine Trisomie des betreffenden Chromosoms darstellen könnten.

Ein Set von 5 BAC- und PAC-Sonden wurde zusammengestellt, mit dem strukturelle

Aberrationen in 19q13 und 2p21 sowie numerische Veränderungen des Chromosom

7 simultan nachgewiesen werden können.

3.6 Klonierung, Charakterisierung und Mapping des caninen KRAB Zinkfinger Protein Gens ZNF331 (Meiboom et al., 2004)

Tiermodelle sind ein wichtiges Instrument sowohl in der Untersuchung genetischer

Grundlagen von Tumoren als auch für die Entwicklung von Therapieansätzen.

Gegenüber den bekannten Mausmodellen bietet der Hund als Modelltier den

entscheidenden Vorteil, daß Tumoren bei Hunden spontan auftreten und oft in ihrer

Histologie und ihren Wachstumscharakteristika den menschlichen Tumoren sehr

ähnlich sein können. Eine wichtige Voraussetzung für die Anwendbarkeit des

Modells ist die molekulargenetische Charakterisierung des caninen Genoms,

insbesondere hinsichtlich möglicher Tumor-relevanter Gene.

Ergebnisse 23

Das KRAB Zinkfinger Gen ZNF331 ist beim Menschen in der chromosomalen Bande

19q13.42 lokalisiert, in unmittelbarer Nähe der Bruchpunktregion, die für eine

zytogenetische Subgruppe follikulärer Schilddrüsentumore charakteristisch ist. Die

Nähe zum Bruchpunkt und die veränderte Expression des Gens bei follikulären

Tumoren der Schilddrüse deuten auf eine Beteiligung des Gens in der Tumorgenese.

Die molekulargenetische Charakterisierung des caninen ZNF331 erfolgte an einem

cDNA-Klon aus einer cDNA-Library aus caninem Testis-Gewebe und durch 5’RACE-

Analysen von Klonen aus derselben Library. Die 2148 bp cDNA-Sequenz des

caninen ZNF331 zeigte eine hohe Identität (85.3%) mit der menschlichen cDNA-

Sequenz bei Vergleich eines Sequenzbereichs, der den ORF und etwa 40 bp des

5’UTRs upstream des ATG Start-Codon umfaßt. Die Identität war dabei in den

funktionellen Domänen, mit 87.3% Identität in der KRAB-A-Domäne und 87.2% in

der Zinkfinger-Domäne, höher als in der die Domänen trennenden Spacer-Region

(77,3%). Das 3’UTR und das verbleibende 5’UTR zeigten mit 35.6% bzw. 39.8%

Sequenzidentität keine Homologie.

In der Aminosäure-Sequenz zeigte sich eine sehr viel höhere Identität der beiden

Gene. Hier konnte eine 92.9%-Identität der KRAB-A-Domänen und eine 96%-

Identität der Zinkfinger-Domänen gezeigt werden. Die Spacer-Region zeigte nur

59.6% Identität. Die geringe Identität in der Aminosäure-Sequenz der Spacer-

Region, deckt sich mit der Erkenntnis, daß diese Regionen hoch variabel sind und

wird durch die Tatsache bestätigt, daß diese Regionen häufig genutzt werden, um

einzelne Mitgliedern der Zinkfinger-Gen-Famlilie zu unterscheiden. Eine unerwartete

Diskrepanz findet sich jedoch im Carboxy-terminalen Ende des caninen ZNF331. Im

Vergleich zum menschlichen ZNF331 ist im caninen Gen die Zinkfinger-Domäne um

26 Aminosäuren verlängert. Dies resultiert aus einer Deletion unmittelbar upstream

des TGA Stop-Codons, die zu einer Verschiebung des ORFs führt.

Die Lokalisation des caninen ZNF331 erfolgte mittels FISH mit einer caninen, für

ZNF331 spezifischen BAC-Sonde an kultivierten, normalen Lymphozyten eines

Mischlings. In allen untersuchten Metaphase-Chromosomen hybridisierte die BAC-

Sonde im terminalen Bereich des langen Arms des caninen Chromosom 1 (CFA1) in

der Bande 1q33.

Diskussion 24

4 Diskussion

Klonale chromosomale Veränderungen werden in den Zellen vieler benigner und

maligner Neoplasien gefunden und etliche Gene, die von den Veränderungen,

betroffen sind, wurden bisher identifiziert. Chromosomale Translokationen führen

zum Austausch genetischen Materials zwischen zwei oder mehr Chromosomen,

dabei können die Gene, die im Bruchpunktbereich lokalisiert sind, strukturell mit

entscheidenden Auswirkungen auf ihre Genprodukte, verändert werden. Bei

Bruchereignissen außerhalb der Gene bzw. ihrer kodierenden Regionen kann es zu

einer Störung der transkriptionellen Kontrolle durch den Wegfall oder den Austausch

regulatorischer Elemente kommen.

Die zwei größten zytogenetischen Subgruppen follikulärer Schilddrüsentumoren mit

strukturellen Aberrationen zeigen Translokationen unter Einbeziehung der

chromosomalen Bande 19q13 und finden sich in etwa 20% der Fälle mit klonalen

Aberrationen bzw. zeigen Translokationen unter Einbeziehung der chromosomalen

Bande 2p21 und findet sich in etwa 10% der Fälle (Belge et al., 1998; Bol et al.,

1999; Bol et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden diese Bruchpunktregionen,

insbesondere die Bruchpunktregion 19q13, molekulargenetisch charakterisiert.

Mit Hilfe umfassender FISH-Studien konnte der Bruchpunktbereich in 19q13

eingegrenzt und kloniert werden (Belge et al., 1995, Belge et al., 1997; Rippe et al.,

1999; Belge et al., 2001). Die Eingrenzung des Bruchpunkts erfolgte an zwei

Zellinien aus Schilddrüsenadenomen mit einer t(5;19)(q13;q13) bzw. einer

t(1;19)(p35-p36.1;q13) sowie an primärem Tumormaterial von vier

Schilddrüsenadenomen mit einer t(2;19)(p12;q13) bzw. t(5;19)(q13;q13) bzw.

t(14;19)(q22;q13). Dabei wurde der Bruchpunkt bei den zwei Zellinien von dem PAC-

Klon 13174 (Rippe et al., 1999) und bei den vier untersuchten Primärtumoren von

dem den PAC-Klon 13174 überlappenden BAC-Klon 280723 überspannt (Belge et

al., 2001). Die FISH-Analysen mit den o.g. PAC- und BAC-Klonen sowie mit weiteren

BAC- und Cosmid-Klonen ermöglichten die Eingrenzung des Bruchpunktes bei den

Zellinien und Primärtumoren auf etwa 150 kbp und ermöglichten die gezielte

molekulargenetische Untersuchung des Bruchpunktbereichs durch in silico Analysen

der in die FISH eingesetzten Klone. Ein vielversprechendes Kandidatengen

(ZNF331) wurde proximal des Bruchpunkts identifiziert. ZNF331 ist ein KRAB

Diskussion 25

Zinkfinger Protein und weist die typischen Merkmale dieser Protein/Genfamilie auf.

Am N-terminalen Ende findet sich eine KRAB-A Domäne, die durch eine Spacer-

Region von der am C-terminalen Ende lokalisierten Zinkfinger-Region getrennt ist

(Rippe et al., 1999, Meiboom et al., 2003b). Das Bruchereignis in Chromosom 19

findet 3’ des Gens statt, so daß es weder zur Bildung eines Fusionsgens noch zu

Trunkation von ZNF331 kommt. Dennoch scheinen regulatorische Elemente von

ZNF331 durch den Bruch verändert zu sein, denn es läßt sich die Expression eines

aberranten Transkriptes in Zellinien mit einer Veränderung in Chromosom 19

nachweisen, nicht aber in normalen Geweben verschiedenen Ursprungs oder

Zellinien verschiedener Schilddrüsenkarzinome (Meiboom et al., 2003b).

Die Rolle von ZNF331 als mögliches Kandidatengen für die Tumorgenese bei

Schilddrüsen gewinnt zusätzlich an Bedeutung durch die Zugehörigkeit zu einer

großen Familie von Transkriptionsfaktoren. Das Motiv der C2H2 (oder Krüppel-like)

Zinkfinger Gene ist typisch für eine große Familie von DNA-bindenden Proteinen. Es

wurde ursprünglich in dem TFIIIA Transkriptionsfaktor von Xenopus (Miller et al.,

1985) und anschließend in den Drosophila Krüppel und hunchback

Segmentierungsgenen (Rosenberg et al., 1986) gefunden. Das Merkmal der

Genfamilie ist das typische Polypeptid-Motiv der Zinkfinger, das durch die

Aminosäureabfolge CX2-4CX3FX5LX2HX2-4H, verbunden durch die Linker-Sequenz

TGEKPYX, charakterisiert ist. Dabei kann X eine beliebige Aminosäure sein (Miller et

al., 1986; Schuh et al., 1986). Etwa 600-700 Gene kodieren das C2H2-Motiv

(Bellefoid et al., 1991, Venter et al., 2001) und etwa ein Drittel dieser Gene kodieren

für eine konservierte KRAB (Krüppel associated box) Domäne, die ein starker

transkriptioneller Repressor ist (Margolin et al., 1994; Witzgall et al., 1994; Vissing et

al., 1995). Die KRAB Domäne besteht entweder aus der KRAB-A Box und der

KRAB-B Box, aus der KRAB-A Box und einer trunkierten KRAB-b Box oder aus der

KRAB-A Box alleine (Mark et al., 1999). Alle Varianten unterdrücken die

Transkription durch spezifische Interaktionen mit dem Ko-Repressor KAP-1 (TRIM28,

KRIP-1, TIF1β) (Friedman et al., 1996; Moosmann et al., 1996; Kim et al., 1996).

Jüngste Studien haben die Erstellung eines Modells erlaubt, nach dem KRAB-

enthaltende Proteine, an ihre spezifische DNA-Erkennungssequenz binden, einen

Anlagerungsprozess von KAP-1 auslösen, der das Einbinden von HP1-Isoformen

(Heterochromatin Protein 1), Histon-Deacetylasen und Setdb1, einem SET-Domäne-

Diskussion 26

Protein, beinhaltet, und die Genexpression durch Bildung eines Heterochromatin-

ähnlichen Komplexes an dem Target-Promotor unterdrücken (Schultz et al., 2002).

Dabei ist die KRAB-A Box für die Repressoraktivität essentiell, die KRAB-B Box

unterstützt die Interaktion mit KAP-1. Die trunkierte KRAB-b Box hat weder

Repressoraktivität noch unterstützt sie die Bindung von KAP-1(Vissing et al., 1995;

Abrink et al., 2001). Eine neue KRAB-C Domäne wurde kürzlich von Looman et al.

(2004) entdeckt, diese scheint ebenso wie die KRAB-B Domäne die Interaktion der

KRAB-A Domäne mit KAP-1 zu unterstützen (Abrink et al., 2001). Die Besonderheit

der aktiven transkriptionellen Repression, die durch die KRAB Zinkfinger Proteine

vermittelt wird, besteht in der Möglichkeit der Transkriptionsinhibierung ihrer Target-

Gene unabhängig von der gleichzeitigen Anwesenheit oder Abwesenheit von

transkriptionellen Aktivatoren dieser Gene (Johnson, 1995). Eine Funktion von KRAB

Zinkfinger Genen könnte daher in der Verhinderung der Gen-Expression trotz der

Anwesenheit von Gen-Aktivatoren während der Entwicklung oder Differenzierung

von Zellen bzw. Geweben liegen.

Obwohl zunehmend mehr Erkenntnisse über die allgemeinen Funktionsweisen von

KRAB Zinkfinger Proteine gewonnen werden, ist wenig über die spezielle Funktion

der KRAB Zinkfinger Proteine bekannt. Von Kid-1 ist bekannt, daß es an

Heteroduplex-DNA bindet und über die Induzierung nukleolärer Desintegration die

Synthese ribosomaler RNA durch die RNA Polymerase I reduziert (Elser et al., 1997;

Huang et al., 1999). ZNF74 interagiert mit der hyperphosphorylierten Form der RNA

Polymerase II und ko-lokalisiert mit ihr in Kernstrukturen, die reich an Splicing-

Faktoren sind. Daher ist es möglich, daß ZNF74 die Gen-Expression durch sowohl

transkriptionelle als auch posttranslationale Mechanismen steuert (Grodin et al.,

1996; Grodin et al., 1997; Cote et al., 2001). KS1 ist ein starker Repressor von RNA-

Polymerase-Aktivität nach den oben beschriebenen Mechanismen unter Involvierung

von KAP-1. Zudem wird KS1 eine Rolle in der Suppression neoplastischer

Transformation, die durch verschiedene Onkogene (HRAS, Gα12 und Gα13)

vermittelt wird, zugeschrieben (Gebelein et al., 1998; Gebelein et al., 2001). Einige

KRAB Zinkfinger Proteine scheinen in die Regulierung der Apoptose involviert zu

sein, so konnten Katoh et al. (1998) zeigen, daß myeloische Zellen, die mit der cDNA

des KRAB Zinkfinger Proteins ZK1 transformiert wurden, sensibler auf

Ionisierungsstrahlung reagierten als nicht-transformierte Zellen. Das KRAB Zinkfinger

Diskussion 27

Protein ZBRK1 interagiert mit BRCA1 (Peng et al., 2002), einem Protein, das als

Caretaker angesehen wird und dessen Abwesenheit zu genetischer Instabilität führt

und bei Mammatumoren häufig verändert ist, und es wurde kürzlich gezeigt, daß

auch eine veränderte Expression von ZBRK1 in Mammatumoren zu finden ist (Garcia

et al., 2004).

Die Frage, inwieweit das durch die Rearrangierung von Chromosom 19 veränderte

ZNF331 funktionell an der Tumorentstehung bei Schilddrüsen beteiligt ist, bleibt

ungeklärt. Die Beteiligung der Mitglieder der Familie der KRAB Zinkfinger Proteine an

grundlegenden Prozessen in der Zelle, wie Entwicklung, Differenzierung und

Apoptose, ist jedoch ein Zeichen für eine möglicherweise wichtige Rolle des Gens in

der Tumorgenese. Tiermodelle könnten in der zukünftigen Untersuchung der

Funktion von ZNF331 eine wichtige Funktion erfüllen. Daher wurde das canine

ZNF331 erstmals charakterisiert und auf dem caninen Chromosom (CFA) 1q33

lokalisiert. Das canine und das humane ZNF331 weisen eine hohe Sequenzidentität

sowohl auf der DNA- als auch auf der Aminosäure-Ebene auf. Auf der DNA-Ebene

war die Identität der Sequenzen, die für die funktionellen Domänen kodieren, höher -

mit 87.3% Identität in der KRAB-A-Domäne und 87.2% in der Zinkfinger-Domäne -

als in der die Domänen trennenden Spacer-Region (77,3%). Noch deutlicher war die

Ähnlichkeit auf der Aminosäure-Ebene, hier konnte eine 92.9%-Identität der KRAB-

A-Domänen und eine 96%-Identität der Zinkfinger-Domänen gezeigt werden. Die

Spacer-Region zeigte nur 59.6% Identität (Meiboom et al., 2004). Die große

Variabilität der Spacer-Regionen auch bei nah verwandten Mitgliedern der KRAB

Zinkfinger Gen Familie ist seit längerem bekannt (Bellefroid et al., 1993) und deckt

sich mit Erkenntnissen von Shannon et al. (2003) bei Vergleichen von homologen

humanen und murinen Zinkfinger-Genen. Die Lokalisation von ZNF331 auf CFA1q33

ermöglicht zum einen die Fokussierung auf diesen Bereich bei zytogenetischen

Untersuchungen beim Hund, bei denen Translokationen ein eher seltenes Ereignis

sind, zum anderen ist sie ein Beitrag zur Charakterisierung des Hundegenoms,

indem hier ein weiteres Gen aus der humanen chromosomalen Region 19q13.4 in

die terminale Region des langen Arms von CFA1 kartiert werden konnte.

Diskussion 28

In einer FISH-Studie (Meiboom et al., 2003a) wurde der Überlegung Rechnung

getragen, daß das Vorkommen klonaler Aberration bei Schilddrüsenadenomen

größer sein könnte als durch konventionelle zytogenetische Untersuchungen

ermittelt. Anlaß zu dieser Vermutung gab die Feststellung, daß chromosomale

Translokationen unter Einbeziehung von Chromosom 19q13 häufig mit großen

chromosomalen Segmenten der Translokationspartnern entstehen, die mit

konventioneller Banding-Technik gut zu identifizieren waren (Belge et al., 1998) und

die sich aufdrängende Ungewißheit, ob bei einem Austausch kleiner Segmente diese

Translokationen entdeckt werden könnten. Kryptische oder versteckte

Translokationen in Zellen mit scheinbar normalem Karyotyp wurden u.a. bereits in

Fällen von akut myeloischer Leukämie und in einem Fall von MCA/MR beschrieben

(de Die-Smulders et al., 1999; Alvarez et al., 2002). Mit Hilfe einer Sonde aus dem

subtelomerischen Bereich von Chromosom 19q (Knight et al., 2000) wurden FISH

Analysen an 38 Schilddrüsenadenomen mit scheinbar normalem Karyotyp

durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie zeigten keine telomerischen

Veränderungen, d.h. Signale der subtelomerischen Sonde waren bei allen

untersuchten Fällen am Ende der langen Arms der Chromosomen 19 lokalisiert

(Meiboom et al., 2003a). Einfache reziproke Translokationen unter Einbeziehung von

Chromosom 19q13, die wegen eines sehr kleinen chromosomalen Segmentes des

Translokationspartners unentdeckt bleiben, finden damit nicht statt. Kleine

intrachromosomale Deletionen oder eine intrachromosomale Inversion in der Region

19q13, entsprechend der Veränderung inv(10)(q11.2q21.2) bzw.

inv(10)(q11.21q11.23) wie sie beim papillären Schilddrüsenkarzinom bei der Bildung

von RET/PTC-1 und RET/PCT-3 auftritt, sind nicht auszuschließen. Die

Untersuchung auf solche Veränderungen würde jedoch aufgrund des unbekannten

zu überprüfenden Bereichs eine sehr aufwendige FISH Analyse erfordern und ist,

ohne Vorliegen von Beweisen für eine solche Inversion wie z.B. die Bildung von

Fusionsgenen mit Partnergenen, die auf dem gleichen Chromosomenarm lokalisiert

sind, nicht sinnvoll.

Die zweitgrößte zytogenetische Subgruppe mit strukturellen Aberrationen bei

benignen follikulären Schilddrüsentumoren ist mit einer Häufigkeit von etwa 10% der

Fälle mit klonalen Aberrationen die Gruppe mit Veränderungen in der

Diskussion 29

chromosomalen Bande 2p21 (Belge et al., 1998; Bol et al., 1999; Bol et al., 2001). In

der chromosomalen Bruchpunktregion 2p21 konnte über positionelle Klonierung das

Kandidatengen THADA (Thyroid Adenoma Associated) identifiziert werden. Im

Gegensatz zu ZNF331 ist THADA durch das Bruchereignis strukturell betroffen und

bildet Fusionen mit ektopischen Sequenzen der jeweiligen Translokationspartner

(Rippe et al., 2003). Die Brüche finden im Intron 28 von THADA statt und die

entstehende Fusion scheint eher in einer Trunkation von THADA als in der Bildung

von neuen Fusionsproteinen zu resultieren. THADA ist ein neues Gen, dessen cDNA

Sequenz über in silico Analysen und RT-PCR etabliert wurde (Rippe et al., 2003).

Ein Anhaltspunkt für eine mögliche Funktion des Gens ergab sich aus der

Beschreibung zu einem GenBank-Eintrag einer dem Gen THADA entsprechenden

mRNA-Sequenz. Danach wurde diese Sequenz über two-hybrid Experimente als

Ligand des Death Receptors DR5 identifiziert (Puduvalli VK und Ridgway L,

GenBank-Eintrag zu Accession Number AF323176). DR5 und DR4 sind Rezeptoren

des TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) Signalwegs. Neben dem FasL

Signalweg gehört der TRAIL Signalweg zu den am besten untersuchten Apoptose-

Signalwegen in Verbindung mit der Homeostase von Schilddrüsenzellen (Arscott et

al., 1998; Bretz et al., 1998). Im Gegensatz zu FasL wird TRAIL in vielen normalen

Zellen exprimiert, woraus zu folgern ist, daß dieser Signalweg einer starken

Regulierungsmechanismen unterliegt und Schutzmechanismen in normalen Zellen

vorhanden sein müssen. Obwohl normale Zellen TRAIL-resistent sind (Griffith &

Lynch, 1998), scheinen Tumorzellen in vitro selektiv durch TRAIL in die Apoptose

geführt zu werden (Bonavida et al., 1999). In vitro Studien haben gezeigt, das bei

normalen Schilddrüsenzellen die Apoptose über den TRAIL Signalweg über

proinflammatorische Zytokine induziert werden kann (Bretz et al., 2002), während die

Zellen von Strumen der Schilddrüse unter dem Einfluß von Zytokinen gegenüber

dem TRAIL Signalweg resistent bleiben und eine funktionelle Abnahme der durch die

Death Rezeptoren vermittelten, apoptotischen Aktivität bei Strumazellen erfolgt

(Mezosi et al., 2002). Die Ergebnisse dieser Studie legen die Vermutung nahe, daß

TRAIL Signalweg ein wichtiger Faktor in der Erhaltung der normalen Zellpopulation

ist, der bei irregulärer Resistenz der Zellen zur Entstehung von (knotigen) Strumen

beiträgt. Als potentieller Ligand des DR5 wäre THADA damit möglicherweise

entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homeostase von Schilddrüsenzellen und

eine Trunkation des Gens könnte zu der o.g. Resistenz von Strumazellen gegenüber

Diskussion 30

dem TRAIL/DR5-Apoptose-Signalweg führen. Auf dem heutigen Stand der Kenntnis

ist dies jedoch wegen der nur auf den GenBank-Eintrag gestützten Funktionalität von

THADA noch Hypothese.

Die exogenen, zytogenetischen und molekularen Mechanismen, die ein vermehrtes

Schilddrüsenwachstum bewirken und eine klonale Expansion einzelner Zellen oder

eine autonome Replikation einzelner Zellgruppen stimulieren und so zur Bildung

klonaler bzw. polyklonaler Schilddrüsenknoten führen, sind erst in ihren Grundzügen

bekannt (Derwahl et al., 2001, Salabè, 2001; Boltze et al., 2002; Segev et al., 2003).

Die Schilddrüse besteht aus zwei Haupttypen epithelialer Zellen: den follikulären

Zellen und den parafollikulären C-Zellen (Hedinger et al., 1988).

Die Mehrzahl der Tumoren und tumor-ähnlichen Läsionen entstehen aus der

follikulären Zelle und zeigen dabei ein großes phänotypisches Spektrum und

unterschiedliche klinische Eigenschaften. Es wird angenommen, daß die

Lebensdauer der normalen, differenzierten follikulären Schilddrüsenzelle etwa 5

Zellteilungen beinhaltet (Coclet et al., 1989; Dumont et al., 1992). Ihre proliferative

Reaktion auf TSH (thyroid-stimulating hormon) ist transient und auf etwa 3-5

Zellteilungen beschränkt (Wynford-Thomas, 1997). Daher kann man adulte follikuläre

Zellen als stabile Populationen mit einer sehr geringen Rate von sowohl Proliferation

als auch Apoptose bezeichnen, die allerdings eine proliferative Antwort auf einen

adäquaten Stimulus geben können (Wynford-Thomas, 1997).

Trotz einer recht einheitlichen Erscheinung in histologischen Schnitten bestehen die

Schilddrüsenfollikel aus sehr heterogenen Zellen, hinsichtlich ihrer proliferativen

Kompetenz und endokrinen Funktion. Neofollikel der Schilddrüse entstehen aus

Auswüchsen kleiner Zellkohorten des parentalen Follikels. Der proliferative Prozess

involviert dabei einzelne Zellen oder fokale Gruppen von Zellen, während die

benachbarten Zellen kein oder nur geringes Wachstum zeigen (Peter et al., 1985).

Die proliferierenden Zellgruppen unterliegen alternierenden Wachstumsschüben mit

unregelmäßigen Ruheintervallen (Derwahl et al., 1990). In vivo- und in vitro-Studien

haben gezeigt, daß jeder Thyreozyt ein eigenes konstitutives Wachstumspotential

besitzt (Peter et al., 1985; Derwahl et al., 1990; Studer & Derwahl, 1995), wobei die

zugrundeliegenden molekularen Mechanismen jedoch noch nicht bekannt sind

Diskussion 31

(Derwahl et al., 1998). Man nimmt an, daß Zellen mit hohem intrinsischen

Wachstumspotential kürzere natürliche Replikationsintervalle und damit ein höheres

Wachstumspotential haben. Da viele der individuellen Eigenschaften der Mutterzelle

auf ihren Nachkommen übertragen werden, wird eine Stimulation durch

extrazelluläre Wachstumsstimulatoren oder durch intrazelluläre Überexpression von

wachstumsassoziierten Proteinen den Wachstumsvorteil dieser Zellen akzentuieren

und in einen Prozess fokaler Expansion resultieren (Kopp et al., 1994; Derwahl et al.,

1999; Derwahl, 2000; Derwahl & Studer, 2001). Die kürzere Verdopplungszeit der

Zellen begünstigt dann zudem das Auftreten von quantitativ und qualitativ sehr

verschiedenen Mutationen.

Ein im Vergleich zu anderen epithelialen Tumoren einzigartiges Charakteristikum der

Schilddrüsentumoren ist die Häufigkeit spezifischer chromosomaler Aberrationen, die

oft Rearrangierungen von Genen (RET/PTC, NTRK1, PAX8/PPARG) zur Folge

haben (Viglietto et al., 1995; Portella et al., 1999; Greco et al., 1997; Soares et al.,

1998; Kroll et al., 2000; Dwight et al., 2003; Nikiforova et al., 2003). Bei papillären

Schilddrüsenkarzinomen (PTC) werden häufig Rearrangierungen des Onkogens

RET, welches für eine Rezeptor Tyrosin Kinase kodiert, gefunden. Diese

Rearrangierungen führen zu einer konstitutiven Aktivierung des Rezeptors

(RET/PTC) (Bongarzone et al., 1989; Santoro et., 1992; Pacini et al., 2000; Kjellman

et al., 2001, Pierotti et al., 2001). RET/PTC entstehen durch die Fusion der Tyrosin

Kinase (TK) Domäne von RET an die 5’ terminale Region eines anderen Gens wie

H4 in RET/PTC-1 (Pierotti et al, 1992) oder ELE1 in RET/PTC-3 (Jhiang et al., 1994;

Santoro et al., 1994). Dies kann sowohl durch chromosomale Inversion

inv(10)(q11.2q21.2) bzw. inv(10)(q11.21q11.23) bei RET/PTC-1 und RET/PTC-3

geschehen als auch durch eine Translokation t(10;17)(q11.2;q23) bei RET/PTC-2,

bei der die regulatorische Untereinheit R1alpha der Proteinkinase A an die TK

Domäne von RET fusioniert (Bongarzone et al., 1993; Sozzi et al., 1994). Weitere

RET Rearrangierungen (RET/PTC-5, RET/PTC-6, RET/PTC-7, RET/PTC-8,

RET/ELKS und RET/PCM-1) sind in letzter Zeit publiziert worden, die wie die o.g.

RET/PTCs durch intra- oder interchromosomale Rearrangierungen entstehen

(Klugbauer et al., 1998; Klugbauer & Rabes, 1999; Nakata et al., 1999; Corvi et al.,

2000; Klugbauer et al., 2000). RET Rearrangierungen, die nicht in Zusammenhang

mit radioaktiver Strahlung stehen, werden mit einer Häufigkeit von 3-33 % in

Diskussion 32

papillären Schilddrüsenkarzinomen gefunden (Santoro et. al., 1992; Bongarzone et

al., 1996) und scheinen frühe Ereignisse in der Tumorgenese zu sein (Viglietto et al.,

1995) und sind anscheinend nicht mit der Progression der Tumoren assoziiert (Tallini

et al., 1998).

Ähnlich wie bei den RET/PTC Rearrangierungen erfolgt bei papillären Karzinomen

eine Aktivierung des Transmembran TK Rezeptors NTRK1 (1q23) durch eine

chromosomale Rearrangierung, d.h. eine Inversion im langen Arm des Chromosoms

1, in etwa 10% der Fälle (Pierotti et al., 1996 Greco et al., 1997). Die die TK Domäne

kodierende Sequenz von NTRK1 wird dabei an das 5’ Ende verschiedener Gene

fusioniert. Die Fusionspartner sind TPM3 (1q31), resultierend im Fusionsprotein

TRK-T1 und TPR (1q25), resultierend im Fusionsprotein TRK-T2. Ein weiteres

Fusionsprotein, TRK-T3, entsteht durch eine Translokation t(1;3)(q23;q12), bei der

die die TK Domäne kodierende Sequenz von NTRK1 an TFG fusioniert (Greco et al.,

1992; Greco et al., 1995; Greco et al., 1997). Die NTRK1 Rearrangierungen

scheinen spezifisch für papilläre Tumoren zu sein. Sie wurden bisher nicht in

Adenomen oder follikulären Karzinomen gefunden, sondern nur in papillären

Karzinomen und in einem Fall eines anaplastischen Karzinoms (Said et al., 1994;

Delvincourt et al., 1996; Bongarzone et al., 1996).

Bei follikulären Schilddrüsenkarzinomen wurde von Kroll et al. (2000) die Bildung des

Fusionsgens PAX8/PPARG durch eine Translokation t(2;3)(q13;p25) beschrieben.

PAX8 ist ein Schilddrüsen-spezifischer Paired-Domain Transkriptionsfaktor, der

essentiell für die Entwicklung der follikulären Schilddrüsenzelle und die Regulierung

der Expression Schilddrüsen-spezifischer Gene ist (Moretti et al., 2000; Puglisi et al.,

2000). Folgerichtig konnten bei Fällen mit Schilddrüsen-Fehlentwicklung und daraus

resultierender angeborener Schilddrüsenunterfunktion Mutationen in PAX8 gefunden

werden (Macchia et al., 1998). PPARG gehört zur Familie der nukleären

Hormonrezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in der Lipogenese und Adipozyten-

Differenzierung (Chawla et al., 1994; Tontonz et al., 1994). Weiterhin konnte eine

durch PPARG vermittelte Wachstumsinhibierung bei Schilddrüsenkarzinomzellen

gezeigt werden (Ohta et al., 2001). Durch die t(2;3)(q13;p25) entsteht eine Fusion

des Exons 7, 8, 9 oder 10 von PAX8 mit dem Exon 1 von PPARG (Kroll et al., 2000,

Marques et al., 2002 Cheung et al., 2003). Durch die Fusion verliert PPARG seine

Diskussion 33

Fähigkeit zur Stimulation der Thiazolidindion-induzierten Transkription und scheint

außerdem die transkriptionelle Aktivität des „Wildtyp“ PPARG zu unterdrücken (Kroll

et al., 2000). Im Gegensatz zu den ersten Untersuchungen zur

Gewebe/Zelltypspezifität von Kroll et al. (2000) wird das Fusionsprodukt

PAX8/PPARG nicht ausschließlich in follikulären Schilddrüsenkarzinomen gebildet,

sondern läßt sich über RT-PCR auch in 8-55% der follikulären Adenomen finden

(Marques et al., 2002, Cheung et al., 2003, Nikiforova et al., 2003).

Die Translokation t(2;3)(q13;p25), die der Bildung des Fusionsgens PAX8/PPARG

zugrunde liegt, gehört zytogenetisch zu den selteneren Aberrationen bei gutartigen

follikulären Tumoren der Schilddrüse (Belge et al., 1998). Die am häufigsten

beobachteten Translokationen involvieren die chromosomalen Regionen 19q13 bzw.

2p21. Hier konnten mit THADA und ZNF331 zwei Kandidatengene über positionelle

Klonierung der Bruchpunktregionen identifiziert werden. Obwohl diese Gene durch

die spezifischen Bruchereignisse in ihrer Struktur bzw. in ihrem Expressionsmuster

verändert werden und daher wahrscheinlich an der Entwicklung gutartiger

Schilddrüsentumoren beteiligt sind, sind die funktionellen Mechanismen dieser

Beteiligung noch unbekannt und eine Klärung der Funktion dieser Gene in normalen

Zellen wie die Klärung der Funktion der veränderten Gene in Zellen von

Schilddrüsenadenomen sollte in zukünftigen Studien erfolgen.

Da die spezifischen strukturellen Aberrationen in 19q13 und 2p21 bisher

ausschließlich in gutartigen Adenomen der Schilddrüse beschrieben wurden, kann

ihr Nachweis auch ohne das Wissen um die molekulargenetischen Auswirkungen der

veränderten Genexpression als Marker für benigne Neoplasien der Schilddrüse

verwendet werden. In der präoperativen Diagnostik von Schilddrüsenknoten durch

zytologische Untersuchungen von Feinnadelbiopsien besteht eine „diagnostische

Lücke“ aufgrund der zytologisch nicht möglichen Unterscheidung zwischen benignen

und malignen Tumoren follikulären Ursprungs (Oertel & Oertel, 1998a). In der

vorliegenden Arbeit wurde daher ein FISH-Sonden-Mix aus bereits charakterisierten

Sonden (Bol et al., 2001; Rippe et al., 1999; Belge et al., 2001) etabliert, der es

erlaubt, die strukturellen Aberrationen 2p21 und 19q13, sowie die häufige

numerische Aberration des Chromosom 7 simultan zu detektieren und damit ein

diagnostisches Tool für benigne Schilddrüsenneoplasien darstellt. Der FISH-Sonden-

Mix wird außerdem in zukünftige Studien an Tumorgewebe sowohl aus

Diskussion 34

Feinnadelbiopsien als auch aus Tumorgewebeschnitten eingesetzt werden und über

die Korrelation der chromosomalen Veränderungen und der Tumorart und –

progression Aussagen über die Prognose der Tumoren ermöglichen.

Zusammenfassung 35

5 Zusammenfassung

Die Inzidenz knotiger Veränderungen in Schilddrüsengewebe ist außerordentlich

hoch. Einige dieser Knoten können Tumoren repräsentieren, dabei ist der molekulare

Hintergrund, der zur Entstehung der Knoten bzw. der Tumoren führt, erst in den

Grundzügen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der positionellen

Klonierung die Charakterisierung der Bruchpunktregionen der beiden häufigsten

zytogenetischen Subgruppen bei gutartigen, follikulären Schilddrüsentumoren

vorgenommen. Die Feinkartierung der Bruchpunktregionen und die darauf folgenden

Sequenzanalysen ermöglichten die Charakterisierung von Genen, die durch die

Subgruppen-spezifischen Aberrationen 19q13.4 bzw. 2p21 beeinflußt werden und

damit für die Tumorentstehung relevant sein können.

In der zytogenetische Subgruppe mit 19q13.4 Aberrationen wurde der Bruchpunkt

auf 150 kbp eingegrenzt. Etwa 25 kbp upstream der Bruchpunktregion wurde das

KRAB-Zinkfinger-Gen ZNF331 identifiziert und charakterisiert. ZNF331 besteht aus

15 Exons und überspannt auf genomischer Ebene etwa 56 kbp. Das gebildete

Protein besteht aus 463 Aminosäuren und enthält eine 42 aa KRAB-A Domäne und

eine 332 aa Zinkfinger-Region mit 12 Zinkfingern. Die Bruchereignisse finden 3’ des

Gens statt. Das normale Expressionsmuster von ZNF331 beinhaltet drei Transkripte

von etwa 2,1, 4,0 und 4,8 kbp. Ein 3,4 kbp Transkript von ZNF331 wird

ausschließlich in gutartigen Schilddrüsentumoren mit 19q13 Veränderung exprimiert.

Durch eine in silico Analyse der DNA der Bruchpunktregion wurden vier weitere

Gene entdeckt. Eine Veränderung der Struktur oder Expression der Gene durch die

Bruchereignisse konnte bisher nicht nachgewiesen werden.

In der zytogenetischen Subgruppe mit 2p21 Aberrationen wurde das die

Bruchpunktregion überspannende Gen THADA identifiziert und charakterisiert.

THADA ist in Richtung des Telomers des kurzen Arms von Chromosom 2 orientiert

und überspannt auf genomischer Ebene etwa 365 kbp. THADA besteht aus 38

Exons bei einer Transkriptlänge von etwa 6090 bp. In zwei Zellinien wurde die

Bruchpunktregion auf das Intron 28 von THADA eingegrenzt. Die Analyse der aus

der Aberration resultierenden Fusionstranskripte lassen den Schluß zu, daß eine

Trunkation von THADA als kritisches Resultat der chromosomalen Veränderung

entsteht.

Zusammenfassung 36

Versteckte Translokationen in der zytogenetischen Subgruppe mit Veränderungen in

19q13, die wegen des Austauschs kleiner, nicht-charakteristischer Chromosomen-

Segmente der Entdeckung durch konventionelle zytogenetische Methoden entgehen

und damit eine höhere Aberrationsrate bei follikulären Schilddrüsentumoren

verschleiern, konnten nicht bestätigt werden.

Ein FISH-Sonden-Set, das die simultane Detektion der strukturellen Aberrationen des

Chromosoms 19 und des Chromosoms 2, sowie der numerischen Aberrationen des

Chromosoms 7 ermöglicht und als unterstützendes, diagnostisches Tool in der

Bewertung von Feinnadelpunktaten eingesetzt werden kann, wurde entwickelt.

Die Charakterisierung des caninen Orthologs von ZNF331 zeigte eine hohe Identität

mit dem humanen ZNF331 sowohl in der Nukleinsäure-Sequenz als auch in der

Aminosäure-Sequenz. Das canine ZNF331 konnte in der chromosomalen Bande

1q33 des caninen Chromosoms 1 lokalisiert werden.

Summary 37

6 Summary

The significance in the high incidence of thyroid nodules is that some of these

nodules may harbour thyroid tumors. Still, the molecular mechanisms underlying the

tumor formation are not fully understood. In this study, the positional cloning

approach was used to characterize the chromosomal breakpoints specific for the two

main cytogenetic subgroups in benign follicular thyroid tumors. Fine mapping of the

breakpoint regions and subsequent sequence analyses allowed the identification and

characterization of two genes affected by the specific translocations in 19q13 and

2p21, respectively.

In the cytogenetic subgroup with 19q13 aberrations, the breakpoint region was

narrowed down to a region of about 150 kbp. Proximal to the breakpoint region, a

candidate gene was identified at a 25 kbp distance. The chromosomal breaks occur

3’ of this gene, which was characterized as a KRAB zinc finger protein gene and

named ZNF331. ZNF331 consists of 15 exons and encodes for a 463 aa protein with

a 42 aa KRAB-A domain and a 332 aa zinc finger region. The normal expression

pattern of ZNF331 shows 3 transcripts of 2.1, 4.0 und 4.8 kbp. Exclusively in cell

lines established from thyroid adenomas with 19q13 aberration, the expression of a

3.4 kbp transcript was detected.

In silico analyses of the breakpoint region revealed four additional genes, none of

which so far has been shown to be altered by the chromosomal breaks regarding its

structure or expression.

In the cytogenetic subgroup with 2p21 aberrations, a candidate gene, THADA,

covering the 450-kbp breakpoint region was identified and first characterized. THADA

is orientated towards the telomere of the short arm of chromosome 2 with a so far

known mRNA sequence of 6090 bp. It consists of 38 exons and spans about 365 kbp

at the genomic level. In two cell line with 2p21 aberrations the chromosomal

breakpoint was narrowed down to intron 28 of THADA. Analyses of fusion transcripts

resulting from the aberrations pointed to truncation of THADA rather than fusion to

particular coding sequences as the critical effect of the chromosomal breaks.

Hidden translocations involving chromosome 19 may mask a higher rate of clonal

aberrations in benign thyroid tumors. FISH analyses did not confirm the existence of

Summary 38

such translocations in a subset of 38 thyroid adenomas with apparently normal

karyotype indicating that hidden translocations do not occur in thyroid tumors or at

least at a very low rate.

A set of probes was designed to simultaneously detect structural aberrations in

chromosome 19q13.4 and 2p21, and numerical alterations of chromosome 7 by

FISH, e.g. in samples of fine needle aspirate biopsies from thyroid tumors. The probe

set is intended to provide a fast and easy to use diagnostic tool in evaluating

correlations between the chromosomal alterations and thyroid tumor progression.

The characterization of canine ZNF331 showed a high percentage of sequence

identity with its human counterpart at nucleic acid level as well as at the amino acid

level. By FISH, canine ZNF331 was mapped to the terminal region of canine

chromosome 1, i.e. CFA1q33.

Literatur 39

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Danksagung 51

Danksagung Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Jörn Bullerdiek für die

wissenschaftliche Betreuung und Diskussion dieser Arbeit.

Ich danke Prof. Dr. Ulrich Bonk für die Übernahme des zweiten Gutachtens.

Ich danke Dr. Gazanfer Belge, Volkhard Rippe und insbesondere Norbert Drieschner

für die gute Zusammenarbeit und die zahlreichen wissenschaftlichen Diskussionen.

Ich danke Hugo Murua Escobar ganz besonders für die Bereitstellung der caninen

cDNA-Library. Desweiteren danke ich ihm für die vielen wissenschaftlichen

Diskussionen, für die sehr gute Zusammenarbeit bei den Arbeiten zur

Charakterisierung des caninen ZNF331 und für die zahlreichen, engagierten Stunden

in der Isotopenzone (und im Kühlraum).

Für die gute und freundschaftliche Zusammenarbeit im Labor danke ich Dr. Cornelia

Blank, Norbert Drieschner, Dr. Aljoscha Flohr, Dr. Sven Hauke, Inga Lemke, Britta

Meyer, Hugo Murua Escobar, Andreas Richter, Claudia Schlüter, Birte Seebeck,

Susanne Winkler und allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Zentrums für

Humangenetik. Für ihre stets freundliche Hilfe danke ich Heike Munzinger, Klaus

Drechsler und Eva Thode. Den Diven, den Dodos und den Hunden danke ich dafür,

daß die Arbeit immer Spaß gemacht hat.

Dr. Piere Rogalla danke ich für die vielen wissenschaftlichen Diskussionen.

Ein ganz besonderes „Dankeschön“ geht an Andreas Richter und Norbert Drieschner

für die Pflege und Wartung der DOS- bzw. MAC-Rechner.

Ich danke Prof. Dr. Ulrich Bonk, Dr. Brita Halle und Dr. Siegfried Loeschke für die

gute Kooperation und die Bereitstellung von Gewebeproben.

Publikationsübersicht 52

Publikationsübersicht

Im folgenden sind die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Publikationen

chronologisch aufgeführt.

1) Rippe V, Belge G, Meiboom M, Kazmierczak B, Fusco A, Bullerdiek J. A KRAB

zinc finger protein gene is the potential target of 19q13 translocation in benign

thyroid tumors. Genes Chromosomes Cancer 26:229-36 (1999).

2) Belge G, Rippe V, Meiboom M, Drieschner N, Garcia E, Bullerdiek J. Delineation

of a 150-kb breakpoint cluster in benign thyroid tumors with 19q13.4 aberrations.

Cytogenet Cell Genet 93:48-51 (2001).

3) Rippe V, Drieschner N, Meiboom M, Murua Escobar H, Bonk U, Belge G,

Bullerdiek J. Identification of a gene rearranged by 2p21 aberrations in thyroid

adenomas. Oncogene 22:6111-6114 (2003).

4) Meiboom M, Belge G, Bol S, El-Aouni C, Schoenmakers EF, Bullerdiek J. Does

conventional cytogenetics detect the real frequency of 19q13 aberrations in

benign thyroid lesions? A survey of 38 cases. Cancer Genet Cytogenet 146:70-72

(2003a).

5) Meiboom M, Murua Escobar H, Pentimalli F, Fusco A, Belge G, Bullerdiek J. A

3.4-kbp transcript of ZNF331 is solely expressed in follicular thyroid adenomas.

Cytogenet Genome Res 101:113-117 (2003b).

6) Meiboom M, Murua Escobar H, Winkler S, Nolte I, Bullerdiek J. Molecular

characterization and mapping of the canine KRAB zinc finger gene ZNF331. Anim

Genet 35:262-263 (2004).

7) Meiboom M, Murua Escobar H, Belge G, Bullerdiek J. FISH-Sonden zur

molekularzytologischen Charakterisierung von Schilddrüsentumoren.

Posterpräsentation. Bremer Krebskongress 2003, Bremen, Deutschland.

Anhang 53

Anhang

Rippe V, Belge G, Meiboom M, Kazmierczak B, Fusco A, Bullerdiek J.

A KRAB zinc finger protein gene is the potential target of 19q13 translocation in benign thyroid tumors.

Genes Chromosomes Cancer 26:229-36 (1999)

Eigenanteil: Subklonierung des PAC-Klons, RNA-Isolierung und Herstellung des

Northern-Blots, cDNA-Synthesen und PCR, Detailcharakterisierung von ZNF331

(RITA).

Anhang 54

Belge G, Rippe V, Meiboom M, Drieschner N, Garcia E, Bullerdiek J.

Delineation of a 150-kb breakpoint cluster in benign thyroid tumors with 19q13.4 aberrations.

Cytogenet Cell Genet 93:48-51 (2001)

Eigenanteil: RNA-Isolierung und Herstellung des Northern-Blots, Herstellung der

Sonden für die Hybridisierung, Durchführung der Hybridisierung.

Gene Mapping, Cloning and Sequencing

Cytogenet Cell Genet 93:48–51 (2001)

Delineation of a 150-kb breakpoint cluster inbenign thyroid tumors with 19q13.4aberrationsG. Belge,a V. Rippe,a M. Meiboom,a N. Drieschner,a E. Garcia,b andJ. Bullerdieka

a Center for Human Genetics and Genetic Counseling, University of Bremen, Bremen (Germany);b Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, California (USA)

Supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant BE 1942/1-3. G.B. andV.R. contributed equally to this paper and should thus both be considered firstauthors.

Received 21 December 1999; revision accepted 6 February 2001.

Request reprints from Dr. J. Bullerdiek, Center for Human Genetics,University of Bremen, Leobenerstrasse ZHG, D–28359 Bremen (Germany);telephone: +49 421 218 4239; fax: +49 421 218 4239;email: [email protected]

ABC Fax + 41 61 306 12 34E-mail [email protected]

© 2001 S. Karger AG, Basel0301–0171/01/0932–0048$17.50/0

Accessible online at:www.karger.com/journals/ccg

Abstract. Structural rearrangements involving the long armof chromosome 19 characterize a cytogenetic subgroup ofbenign thyroid tumors and constitute one of the most frequentspecific chromosome abnormalities in epithelial tumors. Re-cently, we have been able to narrow down the breakpoint regionaffected in two cell lines to a region covered by a single PACclone. Close to that region a candidate gene has been identifiedwhich we tentatively referred to as RITA (Rearranged In Thy-roid Adenomas) now named ZNF331 according to HUGOnomenclature. However, the results had been obtained on twocell lines only making it necessary to extend the studies to a

larger number of tumors including primary material. Herein,we have used four further primary tumors showing transloca-tions involving 19q13 for fluorescence in situ hybridization(FISH) mapping studies using a variety of molecular probesfrom a 470-kbp cosmid/BAC contig. Ten new STSs were char-acterized and physically mapped within an EcoRI restrictionmap. The results enabled us to define an approximately 150-kbp breakpoint cluster region of the 19q13 aberrations inbenign thyroid tumors flanked by two newly established STSmarkers.

Copyright © 2001 S. Karger AG, Basel

Chromosome aberrations involving 19q13 first described10 years ago (Bartnitzke et al., 1989) are the most frequentstructural alterations in follicular thyroid adenomas and hyper-plasias (Belge et al., 1998). Recently, we have been able to nar-row down the breakpoints of several primary tumors and celllines derived from thyroid tumors and hyperplasias with 19q13translocations to a region of about 400 kbp between the twocosmid clones 30316 and 20019 (Belge et al., 1995; 1997). Fur-ther analyses allowed us to establish the cDNA sequence andthe genomic structure of a candidate gene which we tentatively

referred to as RITA (Rearranged In Thyroid Adenomas) nownamed ZNF331 according to HUGO nomenclature. Neverthe-less, the identification of that candidate gene so far is based onthe results obtained from only two cell lines not allowing for aclear delineation of the breakpoint region. Thus, further studieson primary tumors would be helpful to characterize in depththese very frequent chromosome aberrations in human tumors.We have therefore extended our studies to the molecular cyto-genetic analysis of the 19q13 breakpoints observed in four pri-mary benign thyroid tumors.

Material and methods

For cell culturing and chromosome analyses, a method previouslydescribed for pleomorphic adenomas of the parotid gland (Bullerdiek et al.,1987) was used. Karyotypes were described according to ISCN (1995).

The cell lines were obtained by transfection with a construct containingthe SV40 “early region” as reported previously (Kazmierczak et al., 1990;Belge et al., 1992). Four primary tumors were used for FISH studies andcompared to the results obtained on the two previously reported SV40-trans-formed cell lines with 19q13 aberrations (Rippe et al., 1999). Karyotypedescriptions of the tumors are summarized in Table 1.

Cytogenet Cell Genet 93:48–51 (2001) 49

To map the breakpoints we used PAC clone 13174 (Genome Systems,USA), a PAC clone previously described in detail (Rippe et al., 1999), cosmidclones 15841 and 29573, and the BAC clones 41372, 280723, and 829651identified according to the Livermore National Laboratory nomenclature(LLNL) (Ashworth et al., 1995). The cosmid clones were derived from thehuman chromosome 19 flow-sorted library prepared at LLNL (de Jong et al.,1989; Trask et al., 1992; Ashworth et al., 1995). The BAC clones werederived from the human library CIT-HSPC and isolated at LLNL. Cosmid/BAC fragments were EcoRI-digested, separated in a 0.8 % agarose gel, cutout, purified from gel slices by glass bead techniques (QIAExII, QIAGEN,

Table 1. Location of the DNA probes (cosmid, PAC, BAC) used for theFISH studies on four benign primary thyroid tumors and two SV40-trans-formed cell lines derived from benign thyroid tumors all showing aberrationsaffecting 19q13.

Hilden, Germany) and cloned in the pGEM11zf(+) vector (Promega, Madi-son, WI). The plasmid, cosmid, PAC and BAC DNA were isolated using astandard alkaline lysis protocol and purified by anion-exchange columns(QIAGEN, Hilden, Germany). DNA digestions were performed followingthe standard procedures according to the manufacturers (Sambrook et al.,1989). Sequencing was performed on a 373 DNA sequencer (Applied Biosys-tem, Weiterstadt, Germany) using standard and internal primers. To mapthe new STSs, cosmids, PACs and BACs, DNA was digested with EcoRI,BamHI and HindIII, respectively, separated on a 0.8% agarose gel, andtransferred onto a Hybond-N+ nylon membrane (Amersham Pharmacia,Freiburg, Germany). PCR-amplified STS or plasmid DNAs were labeled byrandom primed incorporation of DIG-dUTP (Roche, Mannheim, Germany)and used as molecular probes. For both prehybridization and hybridizationthe ExpressHyb hybridization solution (Clontech Laboratories, Palo Alto,USA) was used. Probes were detected by chemiluminescence (Roche, Mann-heim, Germany). Polymerase chain reaction was performed using primersand annealing temperatures reported in Table 2. PCR analyses were carriedout following standard procedures in a final volume of 50 Ìl. About 60 ngtemplate was amplified in a standard PCR reaction with 400 nM of eachprimer, 300 ÌM dNTPs, 1 × PCR buffer (containing 1.5 mM MgCl2) and2.5 U AmpliTaq (Perkin Elmer Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany).PCR products were separated in a 1.5% agarose gel, cut out, purified from gelslices by glass bead techniques (QIAExII, QIAGEN, Hilden, Germany), andcloned into the pCR2.1 vector (Invitrogen, San Diego, CA).

Fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses were performed afterGTG banding of the same metaphase spreads. Treatment of metaphases andsubsequent FISH experiments were performed using the protocol of Kievitset al. (1990). Cosmid, PAC and BAC DNAs were labeled with biotin-14-dATP by nick translation (Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggen-stein, Germany). For every cosmid, PAC or BAC probe 20 metaphases wereexamined except for case S532.1 where only two metaphases were scored.Chromosomes were counterstained with propidium iodide, analyzed on aZeiss Axiophot fluorescence microscope using an FITC filter (Zeiss, Oberko-chem, Germany) and recorded with the Power Gene Karyotyping System(PSI, Halladale, U.K.).

Total RNA was isolated from the two cell lines and non-neoplastic adultthyroid tissue and fibroblasts using TRIzol reagent (Gibco BRL, Life Tech-nologies GmbH, Eggenstein, Germany) based on the single-step acid-phenolRNA isolation method (Chomczynski and Sacchi, 1987). Poly(A)+ RNAswere purified by Oligotex dC10 T30 adsorption (QIAGEN, Hilden, Germa-ny). Approximately 5 Ìg of poly(A)+ RNAs were denatured and fractionatedon a 1% agarose, 6 % formaldehyde gel, and transferred onto a Hybond-N+

nylon membrane (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany). As a molecu-lar probe we used a partial cDNA clone (bp 17–1108) of ZNF331. The probewas labeled with 32P using a random primer extension protocol (Feinbergand Vogelstein, 1983). For both prehybridization and hybridization theExpressHyb hybridization solution (Clontech Laboratories, Palo Alto, USA)was used. Prehybridization was carried out for 30 min and hybridization for1 h at 68 °C. The membranes were washed twice for 20 min at room temper-ature in 2 × SSC, 0.05 % SDS, and twice for 20 min at 68 ° C in 0.1 × SSC,0.1% SDS. Signals were visualized by using a STORM imager (MolecularDynamics, Sunnyvale, USA).

Table 2. Primers for PCR amplification of STS markers which were physically mapped

50 Cytogenet Cell Genet 93:48–51 (2001)

Fig. 1 . (a) Metaphase of the cell line S141.2with t(2;19)(p12;q13) after G-banding; the chro-mosomes 19, der(19), and der(2) are marked (ar-rows). (b) The same metaphase after FISH withthe BAC clone 280723; the hybridization signalsare located on chromosome 19, der(19), andder(2) (arrows).

Fig. 2. Schematic representation of the breakpoint cluster region in benign thyroid tumors with 19q13 aberrations. The FISH mappingdata obtained for the six tumors tested in this study show that the breakpoints of the benign thyroid tumors with 19q13 translocations map ina region of about 150 kb 3) of RITA (ZNF331). The cosmid, BAC, and PAC clones are in accordance with the chromosome 19-physical mapof Lawrence Livermore National Laboratory. Circled numbers refer to newly established STS markers RSTS1–RSTS10 (for comparison seeTable 2).

Results

FISH studies were performed on four primary thyroidtumors with 19q13 aberrations. The results of the FISH experi-ments revealed that in all newly investigated tumors (S476.1,S141.2, S172, S532.1) the breakpoints map within a region cov-ered by a single BAC clone, i.e. 280723. With this BAC clonehybridization signals were obtained on the normal chromo-some 19 and on both derivative chromosomes (Fig. 1, Table 1).In contrast, further FISH studies with cosmids 15841 and29573, PAC 13174 and BAC 41372 on cells of these tumorsshowed hybridization signals proximal to the breakpoint,whereas BAC 829651 showed signals distal to the breakpoint.As for the two cell lines previously described (Rippe et al.,

1999) FISH results obtained with the cosmid and BAC clonesare also given in Table 1.

The results of these FISH analyses revealed that the break-point of chromosome 19 in all tumors investigated mappedwithin a segment of about 150 kbp close to the 3) region ofZNF331 between the cosmid clone 15841 and BAC clone829651 (Fig. 2).

Based on an assembled contig (for details of restrictionmaps see http://www-bio.llnl.gov/rmap/) four BACs, one PACand four cosmids were finally retained for further characteriza-tion and were assembled in an EcoRI and STS content basedcontig shown in Fig. 2. Ten new STSs were generated fromsequence data obtained either from plasmid/cosmid cloneinsert-end or cosmid, PAC or BAC internal sequencing. Oligo-

Cytogenet Cell Genet 93:48–51 (2001) 51

Fig. 3. Results of Northern blot hybridizationon RNA isolated from the thyroid adenoma cellline S121/SV40 and fibroblasts using a 1,092-bpcDNA probe from exon 1 to exon 5. The 5.5-kband 6.2-kb transcripts were found in the fibro-blasts and adenoma cell line.

nucleotide sequences for these PCR assays as well as the size ofthe product generated from template are presented in Table 2.The contig spans 470 kb in length and most of the newlydefined STS markers are located within ZNF331 or the break-point cluster, respectively. The analyses of these sequence dataand comparison with the chromosome 19 EcoRI restrictionmaps of LLNL enabled us to revise the transcriptional orienta-tion of ZNF331 (Fig. 2).

Northern blot analyses were performed using RNA isolatedfrom the cell lines S121/SV40, S325/SV40, normal thyroid tis-sue, and fibroblasts from a healthy normal donor. Whereas the5.5-kb and 6.2-kb transcripts were found in the fibroblasts andadenoma cell line (Fig. 3) the normal thyroid tissue (data notshown) revealed 4.7 kb and 5 kb transcripts akin to those pre-viously described in many other human tissues (Rippe et al.,1999).

Discussion

Interestingly, so far specific chromosome translocationshave been described in many more leukemias, lymphomas, andsoft tissue tumors than in epithelial neoplasms. Consequently,the number of genes found to be affected by the latter aberra-tions is still low. Certainly, 19q13 translocations constitute oneof the most frequent types of specific chromosomal transloca-tions in human epithelial tumors (Mitelman, 1998). In anattempt to elucidate the molecular background of these rear-rangements we were recently able to map the breakpoint of twocell lines derived from thyroid tumors showing t(1;19)(p35→36.1;q13) and t(5;19)(q13;q13) between the two cosmids 15841and 29573 in a region of approximately 25 kbp. Sequence anal-ysis of PAC clone 13174 crossing the breakpoint region led usto identify ZNF331, a KRAB zinc finger protein encodinggene, as a possible candidate gene affected by the 19q13 rear-rangements in thyroid hyperplasias and neoplasias. Now wehave established a 470-kbp BAC, PAC and cosmid contig byphysical STS mapping and mapped the breakpoints of four pri-mary thyroid tumors with chromosome changes in 19q13. Theresults indicate that all breakpoints map within a narrow regionof about 150 kbp including the previously identified breakpointregion. The results revealed by these additional FISH experi-ments offer further evidence that ZNF331 is a likely candidategene for the 19q13 aberrations and implicate a clustering ofbreakpoints 3) of ZNF331. The transcripts detected in a cellline with the typical 19q13 translocation did not differ fromthose in cell cultures derived from normal fibroblasts and thusmost likely indicates no more than the expression pattern ofZNF331 in rapidly dividing cells. Future studies will be aimedat possible 3) regulatory elements of ZNF331 located within thebreakpoint cluster region identified herein but will also addressthe identification of other genes within or close to that region.

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Anhang 55

Rippe V, Drieschner N, Meiboom M, Murua Escobar H, Bonk U, Belge G,

Bullerdiek J.

Identification of a gene rearranged by 2p21 aberrations in thyroid adenomas.

Oncogene 22:6111-6114 (2003).

Eigenanteil: RNA-Isolierung und Herstellung des Northern-Blots, Beteiligung an

FISH-Studien.

¸

Anhang 56

Meiboom M, Belge G, Bol S, El-Aouni C, Schoenmakers EF, Bullerdiek J.

Does conventional cytogenetics detect the real frequency of 19q13 aberrations in benign thyroid lesions? A survey of 38 cases.

Cancer Genet Cytogenet 146:70-72 (2003a)

Eigenanteil: Auswahl der FISH-Sonde, alle FISH-Analysen, Verfassen des Artikels.

Cancer Genetics and Cytogenetics 146 (2003) 70–72

Short communication

Does conventional cytogenetics detect the real frequency of 19q13aberrations in benign thyroid lesions? A survey of 38 cases

Maren Meibooma, Gazanfer Belgea, Silvia Bola, Chiraz El-Aounia, Eric F. Schoenmakersb,Jorn Bullerdieka,*

aCenter for Human Genetics, University of Bremen, Leobenerstrasse ZHG, D-28359 Bremen, GermanybDepartment of Human Genetics, University Hospital, P.O. Box 9101, NL 6500 HB Nijmegen, The Netherlands

Received 9 December 2002; received in revised form 7 March 2003; accepted 19 March 2003

Abstract Structural aberrations involving chromosomal band 19q13.4 are examples of clonal cytogeneticdeviations that have been detected in subgroups of follicular thyroid adenomas and goiters. About45% of the adenomas and 8% of the goiters showed clonal aberrations, about 20% of which involve19q13. The aberrations are translocations with a remarkable variation of the translocation partnersof chromosome 19. Considering that structural changes involving small chromosome segments donot always have a characteristic band to be accurately identified, one may assume an even higherrate of these aberrations in thyroid lesions. To detect hidden 19q13 translocations, we performedfluorescence in situ hybridization analyses with a subtelomeric 19q specific probe on a subset of38 thyroid adenomas with an apparently normal karyotype. No hidden chromosome abnormalitywas detected in our study, indicating that conventional cytogenetics reflects the true percentage of19q13 aberrations in follicular thyroid adenomas. � 2003 Elsevier Inc. All rights reserved.

1. Introduction

Structural chromosomal aberrations involving 19q13 ob-served in benign thyroid lesions belong to the most frequentspecific chromosomal abnormalities at all in human tumors.They can be found in adenomas as well as in goiters, usuallyconsidered as representing hyperplastic rather than neo-plastic growth. Only ~8% of the goiters show clonal ab-normalities whereas ~45% of the adenomas revealed clonalabnormalities. Recurrent aberrations are t(5;19)(q13;q13),t(2;19)(p12;q13), and t(1;19)(p35 or 36;q13). These involvechromosome segments that can easily be identified by cyto-genetic banding techniques; however, it may well be possiblethat the actual frequency of the 19q abnormalities is underes-timated due to the small size of the translocated segment ofchromosome 19. To identify possible hidden aberrationsof that type, we performed a series of fluorescence in situhybridization (FISH) experiments on thyroid adenomas totest the integrity of the terminal segments of chromosome 19.

* Corresponding author. Tel.: �49-421-218-3589; fax: �49-421-218-4239.

E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).

0165-4608/03/$ – see front matter � 2003 Elsevier Inc. All rights reserved.doi: 10.1016/S0165-4608(03)00131-6

2. Materials and methods

For cell culturing and chromosome analyses, a methodpreviously described for pleomorphic adenomas of the pa-rotid gland was used [1]. Briefly, the tumor tissue was cutup with a sterile scalpel and enzymatically disaggregatedby incubation in 200 U/mL collagenase solution (0.35%,Serva, Heidelberg, Germany) for ~5 hours at 37�C in 5% CO2.Preparation of metaphases was done as early as possible,usually in primary culture or first passage. The resultingsuspension was cultivated in 25-cm2 flasks in medium 199(Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Germany) supplemented with20% fetal calf serum and 2% antibiotics. Karyotypes weredetermined according to the International System for HumanCytogenetics Nomenclature (ISCN 1995) [2]. FISH wereperformed after GTG banding of the same metaphasespreads. Treatment of metaphases and subsequent FISHexperiments were performed using the protocol of Kievitset al. [3] with minor modifications. A BAC clone represent-ing part of the subtelomeric region of chromosomal arm 19qwas used as the probe; this probe has been described indetail [4]. BAC DNA was labeled with dig-11-dUTP bynick translation (Roche, Mannheim, Germany). For eachcase, 10–20 metaphases were examined. Chromosomes werecounterstained with propidium iodide, analyzed on a Zeiss

mailto:[email protected]

M. Meiboom et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 146 (2003) 70–72 71

Axiophot fluorescence microscope using a fluorescein iso-thiocyanate (FITC) filter (Zeiss, Gottingen, Germany) andrecorded with the Power Gene karyotyping system (PSI,Halladale, UK).

3. Results

All 38 cases reported herein showed an apparently normalkaryotype as revealed by conventional cytogenetic investiga-tions. The FISH studies performed on metaphase spreadsusing a BAC probe representing part of the subtelomericregion of chromosomal arm 19q showed hybridization sig-nals only on both chromosomes 19 (Fig. 1). Thus, hiddentranslocations involving 19q13 may exist in benign thyroidlesions but their percentage seems to be low, allowing theconclusion that conventional cytogenetics accurately reflectsthe frequency of structural aberrations involving 19q13 inbenign thyroid tumors.

4. Discussion

The incidence of thyroid nodules in the general populationis 4%–6%, with nodules being more common in femalesthan in males [5]. Clonal aberrations have been found in~8% of thyroid goiters and in ~45% of the adenomas. Theoverall high incidence of these lesions makes some ofthe structural cytogenetic abnormalities occurring in thesetumors the most frequent specific clonal abnormalities inhuman epithelial tumors at all. Due to the small size of thetranslocated segment of 19q, it is tempting to assume aneven higher rate of aberrations due to cryptic changes. Subtletranslocations in apparently normal karyotypes have been

recently identified using subtelomeric probes (e.g., in twocases of childhood acute myelocytic leukemia [6] and ina case of multiple congenital anomalies/mental retardation{syndrome} [7]). Using whole chromosome painting and com-parative genomic hybridization, Alvarez et al. [8] found gainof chromosome 19 or of 19q the most common abnormalityin AML-M7. In none of the primary samples was this abnor-mality detected by G-banding analysis. Chromosomal region19q13 harbors breakpoints often seen in leukemias [9], butalso in some solid tumors (e.g., in mesenchymal hamartomasof the liver [10,11] and thyroid adenomas [12,13]).

For the present study, we used a subtelomeric chromo-some-specific probe of chromosome 19qter taken from theset of subtelomeric clones established by Knight et al. [4]to identify cryptic translocations of chromosomal arm 19q.These subtelomeric clones are known to be located atdistances between 100 and 800 kb from the end of thechromosomes. Therefore they are well suited to detectsubtle translocations or terminal deletions. All 38 cases ex-amined in this study showed an apparently normal karyotypebased on G-banding patterns. With respect to the problemof fibroblast contamination in tumor cell cultures, great carehas been taken in culturing tumor cells and only early-passage thyroid adenoma cells have been used in thisstudy. With FISH analysis with a subtelomeric chromosome19q-specific probe, no telomeric abnormality could bedetected. Only signals on both long arms of chromosome 19qwere found. Thus, it is not very likely that the rate of clonalaberrations involving chromosome 19 in thyroid goiters andadenomas is much higher than already determined by stan-dard cytogenetic methods. Nevertheless, because some chro-mosomal changes (e.g., small interstitial deletions) couldhave escaped detection in the present study, there still might

Fig. 1. (A ) Metaphase of a thyroid adenoma showing a normal karyotype after G-banding; the chromosomes 19 are marked (arrows). (B ) The samemetaphase after FISH with a subtelomeric probe for chromosome 19; the hybridization signals are located only on the chromosomes 19 (arrows).

M. Meiboom et al. / Cancer Genetics and Cytogenetics 146 (2003) 70–7272

be a small percentage of cases with apparently normal karyo-type but hidden chromosomal changes.

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Anhang 57

Meiboom M, Murua Escobar H, Pentimalli F, Fusco A, Belge G, Bullerdiek J.

A 3.4-kbp transcript of ZNF331 is solely expressed in follicular thyroid adenomas.

Cytogenet Genome Res 101:113-117 (2003b)

Eigenanteil: Verfassen des Artikels, alle Arbeiten bis auf Herstellung und

Hybridisierung des Northern Blots aus Karzinomzellinien, radioaktive

Hybridisierungen und Zellkultur.

º

Original Article

Cytogenet Genome Res 101:113–117 (2003)DOI: 10.1159/000074165

A 3.4-kbp transcript of ZNF331 is solelyexpressed in follicular thyroid adenomasM. Meiboom,a H. Murua Escobar,a F. Pentimalli,b A. Fusco,b G. Belgea andJ. Bullerdieka

a Center for Human Genetics, University of Bremen, Bremen (Germany);b Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare, Facoltà di Medicina e Chirurgia,Università di Napoli ‘Federico II’, Naples (Italy)

Supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Received 2 June 2003; manuscript accepted 11 July 2003.

Request reprints from Dr. J. Bullerdiek, Center for Human GeneticsUniversity of Bremen, Leobener Str. ZHG, DE–28359 Bremen (Germany)telephone: 49-421-218-4239; fax: 49-421-218-4239e-mail: [email protected]

ABC Fax + 41 61 306 12 34E-mail [email protected]

© 2003 S. Karger AG, Basel0301–0171/03/1012–0113$19.50/0

Accessible online at:www.karger.com/cgr

Abstract. Translocations involving chromosomal region19q13 are a frequent finding in follicular adenomas of the thy-roid and might represent the most frequent type of structuralaberration in human epithelial tumors. By positional cloning, aputative candidate gene, ZNF331 (formerly RITA) locatedclose to the breakpoint was identified. Recently, aberrantexpression of ZNF331 has been described in two cell lines offollicular thyroid adenomas with aberrations in 19q13 indicat-ing an involvement of ZNF331 in tumorigenesis. Nevertheless,knowledge about structure and expression of ZNF331 is lim-

ited. We performed RACE-PCR and genomic sequence analy-ses to gain a deeper insight into its molecular structure. To elu-cidate ZNF331 expression patterns we performed Northernblot analyses on various normal tissues as well as on thyroidcarcinoma and adenoma cell lines. Herein, unique expressionof a 3.4-kbp transcript is described in thyroid adenoma celllines with 19q13 aberrations, which was not detected either innormal tissues or in thyroid carcinoma cell lines.

Copyright © 2003 S. Karger AG, Basel

By positional cloning of the 19q13 breakpoints found in fol-licular adenomas of the thyroid gland, we had recently beenable to identify a candidate gene (Rippe et al., 1999) which weprimarily referred to as RITA (Rearranged in Thyroid Adeno-mas) and which was renamed ZNF331 according to the HUGOhuman gene nomenclature. ZNF331 is considered a candidategene relevant for development of thyroid adenomas due to thefact that aberrations of chromosomal band 19q13.4 are themost frequent structural chromosomal alterations in thyroidfollicular adenomas and hyperplasias (Belge et al., 1998).ZNF331 was characterized as a KRAB zinc finger protein andis therefore most likely considered to be a transcriptionalrepressor. Molecularly, so far only about 2 kbp of cDNA

sequence, including the open reading frame, from ZNF331have been characterized. The cDNA encodes a 463 amino acidprotein consisting of a 42-aa KRAB-A domain and a 332-aaDNA-binding zinc finger region separated by an 89-aa spacerregion (Rippe et al., 1999; Wu et al., 2001). In contrast to theresults of Wu et al. (2001) who found expression of ZNF331 (orhere called ZNF463) only in testis as an approximately 2.1-kbptranscript, we found expression of ZNF331 also in Northernblot analyses from normal thyroid, myometrium, testis tissues,and two cell lines from follicular thyroid adenomas with aberra-tion in chromosomal band 19q13.4 (Rippe et al., 1999). Twotranscripts of about 4.0 and 4.8 kbp were seen in each of thenormal tissues tested. In addition, expression of a 2.1-kbptranscript was seen in testis only. Each of the cell lines fromthyroid adenomas showed expression of two transcripts ofapproximately 5.5 and 6.2 kbp.

To get further information on expression profiles we testedvarious normal tissues as well as cell lines of various thyroidcarcinoma cell lines for expression of ZNF331. Northern blothybridizations were performed with a probe representing partof the 5)UTR and parts of the gene encoding the KRABdomain, spacer region, and part of the zinc finger domain.

114 Cytogenet Genome Res 101:113–117 (2003)

Although sequence alignments of this probe with sequencesfrom the NCBI database did not show homologies critical forhybridization, we performed additional Northern blot hybridi-zations with a ZNF331-specific probe derived from a part ofthe gene presenting neither the zinc finger region nor the KRABdomain to overcome potential cross-hybridizations with trans-cripts of other zinc finger genes.

In an effort to characterize the larger transcripts detected inNorthern blot hybridization we performed RACE experimentson cDNA from normal thyroid and testis tissue and from mate-rial of a cell line of a thyroid adenoma. The results of thesestudies also enabled us to establish part of the genomic struc-ture of ZNF331. Here we present molecular data of novel splicevariants of ZNF331 and of the genomic sequence of this gene aswell as novel data of its expression patterns in various tissues.

Materials and methods

Tissue samples and cell linesTissue samples were frozen in liquid nitrogen immediately after surgery

and stored at –80 °C. The human thyroid carcinoma cell lines used in thesestudies were TPC1, NIM1, NPA, FRO and ARO (Pang et al, 1989; Fagin etal., 1993; Zeki et al., 1993; Cerutti et al., 1996, Cassoni et al., 2002). Thyroidadenoma cell lines with t(5;19)(q13;q13) and t(1;19)(p35 or p36.1;q13),respectively, were obtained by transfecting primary cells of a thyroid adeno-ma and a thyroid goiter, respectively, with a construct containing the SV40large T-antigen, as reported previously (Belge et al., 1992).

RNA isolation and Northern blot analysisPoly(A)+ RNAs were purified by Oligotex dC10T30 adsorption (QIA-

GEN, Hilden, Germany) or oligo (dT) cellulose (Roche, Monza, Italy) fromfive thyroid carcinoma cell lines, two thyroid adenoma cell lines, normalfibroblasts, and normal adult tissues. Approximately 5 Ìg of poly(A)+ RNAswere denatured and fractionated on a 1 % agarose, 6% formaldehyde gel, andtransferred onto a Hybond-N+ nylon membrane (Amersham Pharmacia,Freiburg, Germany). Additionally, expression patterns of ZNF331 in normaltissues were analysed by using the human MTN IV (multiple tissue Northernblot IV) membrane (Clontech, Palo Alto). As molecular probes we used par-tial cDNA clones of ZNF331 i.e. one cDNA clone representing the spacerregion and one cDNA clone containing the KRAB domain, spacer region andzinc finger domain. Probes were generated either by EcoRI digestion (174 bpfragment, spacer region) or by PCR with primers ACG CAA CCG CTG TGTCTC C and AGG CCT TCC CAC ATT CTT GAC (1,092 bp, KRABdomain, spacer region, zinc finger domain). Probes were labeled with 32Pusing a random primer extension protocol (Feinberg and Vogelstein, 1983).Signals were visualized using a STORM phosphorimager (Molecular Dy-namics, Sunnyvale, USA).

cDNA synthesisFor cDNA synthesis 5 Ìg of total RNA from normal testis and thyroid

tissue as well as from cell line S40.2T/SV40 was reverse transcribed into firststrand cDNA by SuperScriptTM Reverse Transcriptase (LifeTechnologies,Karlsruhe, Germany) following the manufacturers instructions. For use in 5)RACE experiments two downstream gene specific primers, TCG GCG AACGTC ACC AAA and CCT TCC CAC AGT CCT TAC ATT CAA, were usedas start for the transcription. cDNA was tailed with dCTP creating a bindingsite for 5) anchor primer CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACTAGT ACG GGI IGG GII GGG IIG.

Rapid amplification of cDNA endsFor 5) RACE experiments dC-tailed cDNA was amplified using 400 nM

of 5) anchor primer with either primer CAU CAU CAU CAU TCG GCGAAC GTC ACC AAA or primer CAU CAU CAU CAU CTC TGG AGCGCT GTG GTC TTT CAA. Alternatively, the adaptor-ligated double-stranded Marathon-Ready cDNA library from human testis (Clontech Labo-ratories, Palo Alto, CA) was used as template. 5 Ìl of the library were used for

amplification with the upstream adaptor primer AP1 (CCATCCTAATAC-GACTCACTATAGGGC) (Clontech Laboratories, Palo Alto, USA) and agene specific downstream primer (TCA CAT ATC CAG TTA CGG CCAAGG GAT TTA CTT C) in a touchdown PCR reaction. PCR products wereseparated in a 1.5% agarose gel and recovered by glass bead techniques(QIAExII Gel Isolation Kit, QIAGEN, Hilden, Germany), cloned into thepGEM-T Easy (Promega, Mannheim, Germany) or into the pAMP1 vectorsystem (Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein, Germany) and subjectedto DNA sequence analysis.

DNA sequence analysisDNA sequence analysis and primer design were performed with the

Lasergene software package (DNAstar, Madison, USA). Analyses for se-quence homologies were performed using the BLAST program from NCBI(Altschul et al., 1997). Accession numbers for ZNF331: AF272148; ZNF331splice variants: AF412398; AF412399; AF412400; AF412401; AF412402;AF412403; AF412404; BF057584; BC009433; AF251515; BF685522.

Results

RACESequencing of 5) RACE products revealed seven new splice

variants of ZNF331 (Fig. 1). In each investigated clone theexons 5, 4, and 3 representing the zinc finger region, the KRABdomain and the part of 5) UTR including the ATG start codonwere identical. Differences in cDNA sequence were upstreamof exon 2 except for two clones, i.e. ZNF331b and ZNF331f,which had an additional 30-bp insertion between exon 2 and 3.Clone ZNF331c revealed an extended exon 2, clonesZNF331d, e, f, and g contained a 67-bp exon upstream of exon2, which differs by only 4 bp from exon 2. Clones ZNF331d, e,f, and g containing the duplicated exon 2 revealed sequencehomology with ESTs from the NCBI database. All sequencescorrespond to the known genomic sequence.

Northern blot hybridizationNorthern blot hybridization of a ZNF331-specific probe

containing the KRAB domain, spacer region and zinc fingerdomain on poly(A)+ RNA of several normal tissues (humanMTN IV membrane, Clontech) revealed a transcript of about4.8 kbp in all tissues. A much fainter signal is seen at about4.0 kbp. In testis, an additional 2.1-kbp transcript is clearlyseen (Fig. 2A). Hybridization of the same probe on poly(A)+RNA from thyroid carcinoma cell lines and normal thyroid tis-sue revealed two transcripts of about 4.0 and 4.8 kbp in normalthyroid tissue and cell lines TPC1, NIM1, FRO and ARO. Inthyroid tissue, the expression of the 4.8-kbp transcript is muchstronger than in the cell lines. In ARO, an additional transcriptis seen at about 2.1 kbp corresponding to the band seen in tes-tis. Cell line NPA did not show expression of ZNF331(Fig. 2B). Hybridization of a probe derived from the spacerregion of ZNF331 (174 bp, EcoRI fragment) on poly(A)+Northern blots revealed two signals of approximately 4.0 and4.8 kbp in normal thyroid tissue and normal fibroblasts(Fig. 2C and 2D). In testis RNA, a strong band of 2.1 kbp wasdetected. None of these transcripts was found in the two celllines with 19q aberrations, which instead expressed three dis-tinct transcripts of about 3.4, 5.5 and 6.2 kbp (Fig. 2C). Hybrid-ization of this probe on normal fibroblasts showed additionalweak signals at 5.5 and 6.2 kbp which were not detected by

Cytogenet Genome Res 101:113–117 (2003) 115

Fig. 1. Schematic genomic organization of ZNF331. Splice variants of ZNF331, three representative ESTs from the databasesand ZNF463 (Wu et al., 2001) are aligned above. For a clearer presentation we indicated the newly found exons by letters and keptthe numerical indication for the known exons (Rippe et al., 1999) and exon 5 has been graphically given the same size although ESTsequences did not fully cover this region. Squares and lines, respectively mark exons lying in duplicated regions. The nearlyidentical exons 2 and F, representing the starting points of the duplicated regions, are presented in a lighter tone.

Fig. 2. Expression studies of ZNF331. (A) Northern blot analysis ofpoly(A)+ RNA from various human tissues (MTN IV, Clontech, Palo Alto).An expression of a 4.8-kbp transcript is seen in all tissues. Most tissues alsoshow a weaker expression of an approximately 4.0-kbp transcript. In testicu-lar tissue, an additional band of 2.1 kbp is seen. (B) Northern blot analysis ofpoly(A)+ RNA from normal thyroid tissue and thyroid carcinoma cell lines.Two transcripts of about 4.0 and 4.8 kbp are seen in normal thyroid tissueand cell lines TPC1, NIM1, FRO and ARO (lanes 2, 3, 5, 6). In ARO, anadditional transcript is seen at about 2.1 kbp. Cell line NPA (lane 4) shows noexpression of ZNF331. Compared to normal thyroid tissue (lane 1) theexpression of these transcripts is strongly reduced. The gel shift occurringhere was adjusted by consideration of ribosomal bands. (C) Northern blotanalysis of poly(A)+ RNA isolated from testis, normal thyroid tissue, cell lineS40.2T/SV40, and cell line S121T/SV40 revealing two transcripts of about4.0 and 4.8 kbp, respectively, of different intensity in thyroid (lane 2). Anadditional transcript of about 2.1 kbp is found exclusively in testis (lane 1).Cell lines S40.2T/SV40 and S121T/SV40 (lanes 4, 5) express three distincttranscripts of approximately 3.4, 5.5 and 6.2 kbp, respectively. (D) Compara-tive Northern blot analysis of poly(A)+ RNA isolated from cultured normalfibroblasts (lane 1) and cell line S121T/SV40 (lane 2) with fibroblasts show-ing two transcripts of 4.0 and 4.8 kbp and additional weak signals at 5.5 and6.2 kbp and cell line S121T/SV40 expressing three transcripts of 3.4, 5.5 and6.2 kbp.

116 Cytogenet Genome Res 101:113–117 (2003)

using a probe containing the KRAB domain, spacer region, andzinc finger domain of ZNF331 (data not shown). The 3.4-kbptranscript was not detected in normal fibroblasts with either ofthe probes and was thus solely found to be expressed in the celllines with 19q13 aberrations.

Genomic characterizationAlignment of cDNA sequences with genomic DNA allowed

the prediction of three transcription start sites for ZNF331splice variants. Transcription start sites for ZNF331 andZNF331a, b, and c (Fig. 1) are supposed to be upstream of exon1 indicating that these splice variants span about 23 kbp on thegenomic level. Further transcription start sites are most likelyabout 16 kbp (ZNF331d, e) and 32 kbp (ZNF331f, g) upstreamthe transcription start point for ZNF331 and ZNF331a, b, andc. Taking this into account, at the genomic level ZNF331 spansapproximately 56 kbp.

Discussion

During the past ten years, the number of genes known to beaffected by recurrent chromosomal translocations in humansolid tumors has continuously increased. Interestingly, most ofthese gene rearrangements have been found in tumors of mes-enchymal origin, whereas only a few specific chromosomaltranslocations have been described in epithelial tumors. Ac-cordingly, the number of genes known to be affected by the lat-ter aberrations is still low. The 19q13 translocations found in acytogenetic subgroup of thyroid follicular adenomas representone of the most frequent types of specific translocations inhuman epithelial tumors if not even representing the most fre-quent translocation at all. Chromosome 19 appears to be par-ticularly enriched for zinc finger genes with ZNF loci distribut-ed within three gene clusters corresponding to chromosomalbands p12, q13.2 and q13.4 (Bellefroid et al., 1993; Shannon etal., 1996). In KRAB zinc finger genes the KRAB domainrecently has been shown to function as a critical domain forprotein-protein interaction (Friedman et al., 1996; Kim et al.,1996). Although these genes may theoretically be involved intranscriptional activation or repression, all KRAB zinc fingergenes studied so far have been shown to act only as transcrip-tional repressors (Margolin et al., 1994; Witzgall et al., 1994;Vissing et al., 1995). Accordingly, engineered chimeric fusionproteins consisting of KRAB domains combined with differentDNA binding domains of oncogenic transcription factors havebeen shown to target their respective oncogene and specificallyinhibit malignant growth and suppress tumorigenesis (Freder-icks et al., 2000; Nawrath et al., 2000). As altered expression ofsuch strong transcriptional repressors might well be the cause oftumor development, we have put effort not only to elucidatefurther the genomic structure of ZNF331 but also to extend ourknowledge about the expression patterns of ZNF331.

In various normal tissues, ZNF331 is expressed as twotranscripts of 4.0 and 4.8 kbp. An additional transcript of about2.1 kbp is seen only in testis tissue (Fig. 2A). In papillary andanaplastic thyroid carcinoma cell lines TPC1, NIM1, FRO, andARO, expression of the 4.0- and 4.8-kbp transcripts is seen.

However, compared to normal thyroid tissue, the expression ofthese transcripts is strongly reduced. The anaplastic carcinomacell line ARO showed an additional transcript of about 2.1 kbpas it is also seen in normal testis tissue. Cell line NPA showedno expression of ZNF331 (Fig. 2B). These results are in con-trast to the findings in follicular thyroid adenoma cell lines with19q13.4 alterations. Here expression of three transcripts ofabout 3.4, 5.5 and 6.2 kbp is seen (Fig. 2C) (Rippe et al., 1999).However, the 5.5- and 6.2-kbp transcripts are also expressed ata very low level in cultured cells of normal fibroblasts (Fig. 2D),which was only detected by using a probe of ZNF331 contain-ing only the spacer region. These spacer regions are known to behighly variable and are often used to distinguish between differ-ent members of the KRAB zinc finger gene family (Bellefroid etal., 1993). Apparently, the spacer probe was more sensitivethan the probe containing the KRAB domain, spacer region,and zinc finger domain because the latter probe gave no signalat 5.5 and 6.2 kbp when applied to the fibroblast Northern blot.Thus, only the 3.4-kbp transcript is solely expressed in follicu-lar thyroid adenomas with the 19q13.4 aberration. The correla-tion of expression of the 5.5- and 6.2-kbp transcripts and chro-mosome 19q13.4 aberration must be reconsidered, as thesetranscripts are also found in normal cultured fibroblasts point-ing to an influence of cell culturing on the expression profile.However, in thyroid adenoma cell lines, expression of thesetranscripts is significantly stronger. In thyroid carcinoma celllines, ZNF331 transcripts differing from those found in thenormal tissues are not found. Here, expression of ZNF331 isstrongly reduced compared to normal thyroid tissue with themolecular background behind this alteration still remaining tobe elucidated. Considering the different transcript sizes ofZNF331 in follicular thyroid adenoma cell lines with 19q aber-rations and thyroid carcinoma cell lines or normal tissues,respectively, it could be deduced that expression of the 3.4-kbptranscript is strongly associated with tumor type and involve-ment of chromosome 19q13.4 alteration.

By performing RACE experiments, we found seven differ-ent cDNAs coding for ZNF331. For a clearer presentation ofthe results, we used letters to name the newly found exons andkept the numerical indication of the exons described by Rippeet al. (1999). The differences in the new cDNAs were found tobe only in the 5) UTR. 3) RACE experiments as well as data-base research confirmed the previously described 3) end ofZNF331 (Rippe et al., 1999). Four of these new cDNAs, i.e.ZNF331d, e, f and g, contained a new exon (F) which is nearlyidentical to the previously described exon 2. Genomic charac-terization showed this 67-bp exon F lying about 17 kbpupstream of exon 2. The genomic region surrounding exon Fwith about 660 bp has a 93% homology to the region surround-ing exon 2. Further sequence analyses of the genomic regionsurrounding exon F showed a segment of about 1,300 bp tohave high homology to the corresponding region, i.e. exon 1,intron 1 and exon 2 of ZNF331. An overall homology of about90% is found between the two regions with a sequence segmentof about 500 bp lacking in the region surrounding exon F. It hasbeen discussed that the clustered localization of zinc finger pro-teins results from duplication of genomic segments which wassupported by various repeat sequences lying in these regions i.e.

Cytogenet Genome Res 101:113–117 (2003) 117

pericentromeric and telomeric regions (Eichler et al., 1998).Sequence homology of ZNF331d, e, f and g with ESTs from thedatabases strongly indicates that these mRNAs represent rele-vant transcripts.

In summary, we have characterized most of the genomicstructure of ZNF331. This KRAB zinger finger gene lies in closevicinity to a frequent breakpoint region of follicular adenomas.In thyroid adenoma cell lines with alterations in 19q13.4 expres-sion studies revealed expression patterns different from those

seen in normal tissues, normal cultured cells, and carcinoma celllines. This is most likely the result of the structural aberration in19q13.4 altering the transcription of ZNF331. The uniqueexpression of a 3.4-kbp transcript of ZNF331 in the tumor cellwith 19q13 alterations strongly supports the hypothesis thatZNF331 is involved in the development of follicular adenomas.The molecular characterization of the 3.4 kbp transcript as wellas a characterization of the promoter and functional analysesremain to be performed in future studies.

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Anhang 58

Meiboom M, Murua Escobar H, Winkler S, Nolte I, Bullerdiek J.

Molecular characterization and mapping of the canine KRAB zinc finger gene ZNF331.

Anim Genet 35:262-263 (2004)

Eigenanteil: Verfassen des Artikels, Screening des cDNA-Phagemid-Klons in

Zusammenarbeit mit Hugo Murua Escobar, RACE und PCR Analysen, in silico

Analysen und Alignments, Herstellung der Screening-Sonde für den BAC-Klon,

canine FISH-Studien und deren Auswertung in Zusammenarbeit mit Susanne

Winkler.

»

524/01/0903). We thank Mrs Marketa Hancova for technical

assistance.

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doi:10.1111/j.1365-2052.2004.01146.x

Molecular characterization and mapping of thecanine KRAB zinc finger gene ZNF331

M. Meiboom*, H. Murua Escobar†,*, S. Winkler*,I. Nolte† and J. Bullerdiek*

*Center for Human Genetics, University of Bremen, Bremen,

Germany. †Small Animal Clinic, Hannover School of Veterinary

Medicine, Hannover, Germany

Accepted for publication 12 April 2004

Source/description: ZNF331 is a KRAB zinc finger protein gene

consisting of a KRAB-A box and a zinc finger domain with

12 zinc fingers and has recently been identified as putative

target gene in thyroid tumorigenesis.1,2 For characterization of

canine ZNF331, a canine testis cDNA library (Center for Hu-

man Genetics, Bremen, Germany) was screened with primers

specific for human ZNF331 (acc.-no. NM_018555; Primer Up:

GTA AAT CCC TTG GCC GTA ACT G; Lo: AGG CCT TCC CAC

ATT CTT GAC). To obtain a full-length cDNA clone 5¢RACE-

PCRs with a vector-specific primer [Primer Up: AGC GGA TAA

CAA TTT CAC ACA GG (M13rev)] and a gene-specific primer

(Primer Lo: TAT TTT CTC TAC AAG TGG GCG TTT T) were

performed using the cDNA library as template. Sequence ana-

lysis of the isolated clone and the 5¢ RACE products allowed the

assembling of the mRNA sequence of ZNF331. The composed

canine ZNF331 cDNA (GenBank acc. no. AY375188) consists

of 2148 bp including the full ORF and shows 85.3% sequence

identity in the cds to the human ZNF331 gene.

Expression studies using Northern blots containing mRNA

from several canine tissues including testis and a canine

ZNF331 spacer-specific probe did not reveal transcripts of

canine ZNF331 which points to a very low expression level of

this gene (data not shown).

Fluorescent in situ hybridization: A cDNA probe representing the

spacer region of canine ZNF331 was used to screen the canine

RCPI 81 BAC/PAC filter (BACPAC RESOURCES, Childrens

Hospital, Oakland, CA, USA). The probe was generated by

EcoRI digestion of a PCR product of primers CTG TAC TGG GAC

GTG ATG TTG GAG AA and AGA GTA AAG AGG TGG GAT

GGT GAT GG resulting in a 300-bp fragment. The fragment

was cloned and sequenced for verification. Hybridization was

performed as previously described.3 BAC 138K24 gave a pos-

itive signal which was verified by ZNF331-specific PCR, and

sequence analysis of the PCR product. A 4 ng/ll volume of dig-

labelled BAC 138K24 DNA (Dig-Nick-Translation-Kit; Roche

Diagnostics, Mannheim, Germany) was used as probe for

fluorescence in situ hybridization (FISH) in a hybridization

Figure 2 Radiation hybrid map of porcine chromosome 28 showing

position of GDF9 gene.

� 2004 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 35, 245–264

Brief notes262

mixture also containing 1 lg/ll salmon sperm DNA, 20 ng/ll

sonicated dog DNA, 1 · SSC, 1· SSPE, 50% formamide and

10% dextran sulphate. FISH was performed using the protocol

of Fischer et al.4 with some modifications5 on metaphase

preparations obtained from blood samples of different dogs.

FISH analyses were performed after GTG banding of the same

metaphase cells. Counterstaining of the chromosomes was

carried out using propidium iodide/antifade solution. G-banded

chromosomes were identified according to Reimann et al.6

Sixteen metaphases were examined and all showed a signal on

CFA1q33 on both chromatids of both chromosomes 1 (Fig. 1).

According to previous mapping data,7 this region is homolog-

ous to HSA19q13. Furthermore, two genes, i.e. CRX and

GRLF1, located on HSA19q13.3, recently have been mapped to

the telomeric region of CFA1.8,9

Comments: During the past few years, the dog has become

an interesting model organism for several human diseases

and tumours. Cytogenetic hotspots in canine tumours that

have been found in the dog genome so far include chro-

mosomes 1, 19 and 25 which are preferentially involved in

chromosomal fusions.10 Aberrations in tumours of the dog

involving chromosome 1 were described earlier by several

authors in various tumours of the dog such as leukaemias,

melanomas and breast cancer.11–14 With the assignment of

ZNF331 to CFA1q33, a region of frequent breaks in human

follicular thyroid adenomas has been mapped in the canine

genome.

Accession numbers: human ZNF331: NM_018555; canine

ZNF331: AY375188.

References1 Rippe V. et al. (1999) Genes Chromosomes Cancer 26,

229–36.

2 Meiboom M. et al. (2003) Cytogenet Genome Res 101,

113–7.

3 Murua Escobar H. et al. (2001) Cytogenet Cell Genet 94,

194–5.

4 Fischer P. et al. (1996) Mamm Genome 7, 37–41.

5 Murua Escobar H. et al. (2003) Cytogenet Genome Res 101,

33–8.

6 Reimann N. et al. (1996) Cytogenet Cell Genet 73, 140–4.

7 Yang F. et al. (1999) Genomics 62, 189–202.

8 Akhmedov N.B. et al. (2002) Mol Vis 8, 79–84.

9 Zangerl B. et al. (2002) Gene 294, 167–76.

10 Reimann N. et al. (1999) J Natl Cancer Inst 91, 1688–9.

11 Bartnitzke S. et al. (1992) Cytogenet Cell Genet 60, 135–7.

12 Mayr B. et al. (1993) Vet Pathol 30, 311–3.

13 Reimann N. et al. (1998) Cancer Genet Cytogenet 101,

49–52.

14 Horsting N. et al. (1999) Res Vet Sci 67, 149–51.

Correspondence: Dr J. Bullerdiek ([email protected])

doi:10.1111/j.1365-2052.2004.01147.x

Linkage mapping of ovine cysteine andhistidine-rich protein gene (CYHR1)to chromosome 9

J. H. Calvo*, S. Marcos*, A. E. Beattie†, J. J. Jurado*and M. Serrano*

*Departamento de Mejora Genetica Animal, INIA, Madrid, Spain.†AgResearch Molecular Biology Unit, Department of Biochemistry

and Centre for Gene Research, University of Otago, Dunedin, New

Zealand. Present address: J. H. Calvo, Unidad de Tecnologia en

Produccion Animal, CITA-Gobierno de Aragon, Zaragoza, Spain

Accepted for publication 12 April 2004

Source/description: Cysteine and histidine-rich cytoplasmic

protein (CYHR1) is involved in cellular trafficking transport of

galectin 3.1 Furthermore, CYHR1 has a broad range of biolo-

gical activities including DNA and RNA binding, enzyme

catalysis, protein–protein interactions, and signal transduction,

because it contributes a metal-binding domain multimeric

protein. In cattle, the gene encoding this protein has been

mapped in the centromeric region of BTA14 (at 8 cM proximal

to CSSM66) and linkage disequilibrium between the bovine

CYHR1 gene and a QTL with significant effects on milk, fat and

protein yield has been demonstrated.2

Figure 1 Canine metaphase spread after GTG-banding (a) and the same metaphase after FISH with BAC 138K24 showing signal on both

chromosomes 1q33 (b).

� 2004 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 35, 245–264

Brief notes 263

Anhang 59

Meiboom M, Murua Escobar H, Belge G, Bullerdiek J.

FISH-Sonden zur molekularzytologischen Charakterisierung von Schilddrüsentumoren.

Posterpräsentation, Bremer Krebskongress 2003, Bremen, Deutschland

Eigenanteil: Verfassen des Posters, Zusammenstellung und Optimierung des FISH-

Sonden-Mixes

¼

FISH-Sonden zur molekularzytologischenCharakterisierung von Schilddrüsentumoren

Maren Meiboom1,3, Hugo Murua Escobar2, Gazanfer Belge1, Jörn Bullerdiek1

1Zentrum für Humangenetik, Leobener Str. ZHG, D-28359 Bremen; 2Tierärztliche Hochschule, Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover; 3alcedo biotech GmbH, Leobener Str. ZHG, D-28359 Bremen

Nach einer Studie der Schilddrüsen-Initiative „Papillon“ in Zusammenarbeit mit der

Deutschen Gesellschaft für Nuklearmedizin haben etwa 8% der in der Studie untersuchten

Personen eine vergrößerte Schilddrüse und 25% haben Knoten in der Schilddrüse oder

eine knotig vergrößerte Schilddrüse (Knotenstruma). Die meisten dieser Knoten sind

gutartig, jedoch können sie im Laufe der Jahre maligne entarten.

Ein wichtiges präoperatives, diagnostisches Instrument zur Beurteilung des Tumorrisikos

von Schilddrüsenknoten ist die zytologische Untersuchung nach Feinnadelbiopsie. Diese

zytologische Untersuchung hinterläßt jedoch eine „diagnostische Lücke“ aufgrund der

zytologisch nicht möglichen Unterscheidung zwischen benignen und malignen Tumoren

follikulären Ursprungs.

Etwa die Hälfte der follikulären Schilddrüsentumoren weisen spezifische chromosomale

Veränderungen auf, bei denen strukturelle Aberrationen des Chromosoms 19 und des

Chromosoms 2, sowie numerische Aberrationen des Chromosoms 7 überwiegen (Abb. 1)

Der Nutzen der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die Beurteilung von Schilddrüsentumoren

Auswahl der FISH-Sonden

Die Zusammenstellung der FISH-Sonden ist von der apparativen Ausstattung und der

verfolgten diagnostischen Strategie abhängig. Für die Darstellung der Bruchereignisse in

Chromosom 2 bzw. Chromosom 19 können Sonden gewählt werden, die

• den Bruchpunkt überspannen, d.h. ein geteiltes Signal weist auf einen Bruch

in der Region hin

• den Bruchpunkt flankieren, d.h. ein geteiltes Signalpaar weist auf einen

Bruch in der Region hin

Für die Darstellung der Bruchereignisse in Interphase-Kernen haben flankierende DNA-

Sonden den Vorteil, dass mit der Trennung der Signalpaare sicher gezeigt wird, dass ein

Bruch stattgefunden hat, Die Verwendung von zwei Fluorochromen in der Darstellung von

Bruchereignissen mit Bruchpunkt-flankierenden Sonden bietet sich für ein primäres

Screening von chromosomalen Veränderungen an. Mit einfachen Mitteln ist so eine

Einschätzung der Integrität der DNA möglich, allerdings ohne Zuordnung der

Bruchereignisse zu den spezifischen Chromosomen (Abb. 2 und 3). Mit Verwendung von

vier Fluorochromen (zwei für Sonden von 2p21, zwei für Sonden von 19q13.4) ist die

Identifizierung der spezifischen Chromosomen gegeben, ein erhöhter apparativer Aufwand

ist jedoch nötig.

Diese spezifischen Veränderungen in der Chromosomenstruktur und in der

Chromosomenzahl können mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durch

den Einsatz spezifischer DNA-Sonden schnell und einfach nachgewiesen werden.

Ein Vorteil der FISH ist zudem, dass sie sowohl an geringen Materialmengen, z.B. aus

Feinnadelpunktaten, als auch Gewebeschnitten vorgenommen werden kann.

Einschätzung von Korrelationen zwischen chromosomalen Veränderungen und der Progression von Schilddrüsentumoren

Die zytogenetische Analyse von über 500 Schildrüsenläsionen hat gezeigt, dass die

häufigsten wiederkehrenden chromosomalen Veränderungen bei benignen

Schilddrüsentumoren strukturelle Aberrationen im Chromosom 2 in der Bande p21 und im

Chromosom 19 in der Bande 19q13.4 sowie numerische Veränderungen des Chromosoms

7 sind. Von den chromosomalen Brüchen der Chromosomen 2 und 19 sind zwei Gene

direkt betroffen: das Gen THADA in 2p21 und das Gen ZNF331 in 19q13.4. Obwohl die

Auswirkungen der veränderten Expression dieser Gene auf die Tumorentstehung noch

nicht vollständig geklärt sind, wird mit dem Nachweis der genetischen Veränderungen auf

der chromosomalen Ebene über die FISH die Einschätzung des Zusammenhangs

zwischen Genveränderung und Tumorentwicklung ermöglicht.

Abb. 1: Darstellung der Häufigkeiten der zytogenetische Subgruppen bei benignen Schilddrüsen-tumoren

Abb. 2: Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit zwei Bruchpunkt-flankierenden Sonden aus der Region 19q13.4 (grün und rot), zwei Bruchpunkt-flankierenden Sonden aus der Region 2p21 (grün und rot) und einer Chromosom-7-spezifischen Sonde (blau) an Metaphase-Chromosomen und einem Interphase-Zellkern von normalen Lymphozyten. Im Interphase-Kern zeigen vier grün/rote Signalpaare die strukturelle Integrität der chromosomalen Regionen 2p21 und 19q13.4. Zwei blaue Signale identifitzieren zwei Chromosomen 7.

Abb. 3: Am Beispiel eines Interphase-Kerns einer Zellinie eines follikulären Schilddrüsen-Adenoms ist die Darstellung von chromosomalen Veränderungen mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung veranschaulicht. Zwei Bruchpunkt-flankierenden Sonden aus der Region 19q13.4 (grün und rot), zwei Bruchpunkt-flankierenden Sonden aus der Region 2p21 (grün und rot) und eine Chromosom-7-spezifischen Sonde (blau) wurden eingesetzt.. Im Interphase-Kern zeigt die Trennung eines grün/roten Signalpaars einen chromosomalen Bruch in der Region 2p21 oder 19q13.4. Drei blaue Signale identifizieren eine Trisomie 7.

University of Bremen

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Molekulargenetische Charakterisierung der Bruchpunktregion