Molekuler Genetik_HaftaVIII

7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII

1/18

31.10.2007

1

Hafta VIIIRekombinant DNA Teknolojileri

Do.Dr. Hill zda

GENETK

111-503

Rekombinant DNA TeknolojisiAma

Spesifik DNA dizilerinin yerlerinin belirlenmesi.

DNAnn belirli noktalardan kesilmesi

Belirli bir DNA parasnn milyarlarca kopyasnn

karlarlarak mteakip ilemlerin mmknklnmas.

DNA paralarnn mutasyona uratlp birarayagetirilmesi suretiyle istenen dizilimlerinoluturulmas.

Oluturulan DNA diziliminin transferi.


2/18

31.10.2007

2

Rekombinant DNA Teknolojisi

Aamalar Doku veya hcrelerden DNA izolasyonu.

DNAnn belirlenen restriksiyon endonkleazlarla kesilmesi.

Restriksiyon enzimleri ile oluturulan DNA paralarnn vektrlerlebirletirilmesi. Rekombinant DNA moleklnn oluturulmas.

Rekombinant DNAnn konak hcreye aktarlmas. Konak hcre iindeoalarak klonlarn oluturmas.

Konak hcrenin oalarak rekombinant DNA molekln oulhcrelere aktarmas.

Klonlanm DNAnn konak hcrelerden izole edilip incelenmesi. Klonlanm DNAnn gerekirse konak hcrede ifadelenmesi. lgili

proteinin tayin ve analizi.

Restriksiyon Endonkleazlar

HindIII

Yapkan U

PvuII

Kt U

Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,


3/18

31.10.2007

3

Restriksiyon Endonkleazlar

Palindrom


Kes Yaptr


Kt u oluturan enzimlerle yaplan kesimlersonras oluan fragmentleri birarayagetirebilmek iin nce terminildeoksinkleotidil transferaz enzimi ile polyTve/veya polyA kuyruu taklr sonrasnda DNAligaz ile fragmentler birletirilir.


4/18

31.10.2007

4

Vektrler (Tayclar) Kendisini ve tad DNA molekln bamsz olarak replike

edebilmelidir.

Vektr zerinde pekok restriksiyon enzimin sadece bir kesilme blgesiolmaldr. Bu blge restriksiyon enzimi ile kesilerek ayn enzimle kesilenbaka bir DNA parasnn bu blgeye sokulmas iin kullanlr.

zerinde seilebilir bir belirte (marker) tamaldr bir antibiyotik direngeni veya konak hcreden olmayan bir enzime ait gen). Bu belirte

vektr ieren konak hcreleri vektr iermeye konak hcrelerdenayrmak iin kullanlr.

Vektr konakdan kolayca izole edilebilir olmaldr.

Vektrler (Tayclar) Plazmid vektrler

Bakteriyofaj vektrler

Kozmit ve mekik vektrler

Bakteriyel yapay vektrler (BAC)

Maya yapay vektrler (YAC)


5/18

31.10.2007

5

Vektrler (Tayclar) Plazmid vektrler

Kktrler.

Mesela pUC19 konaksnda 500 kopya olacak ekildeoalabilir.

oklu klonlama blgesi barndrrlar.

Belirte olarak lacZ genini tar pUC19.


Vektrler (Tayclar)

Bakteriyofaj vektrler Lambda faj genlerinin hepsi tanmlanm btn genomu

karlm bir bakteriyofajdr.

Genomunun 1/3lk ksm ok hayati olmad iin fajnhcreleri enfekte etmesini ve plak oluturmasn engellemedenyabanc bir DNA ile deitirilebilir.

M13 ise tek zincirli bir fajdr. Bakteri hcresini enfekte ettiindeift zincirli, replikatif formu (RF) alr.


6/18

31.10.2007

6

Vektrler (Tayclar) Bakteriyofaj vektrler

http://bioweb.wku.edu/courses/biol566/Images/LambdaGenome.jpg Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Vektrler (Tayclar)

Kozmit vektrler Kozmit vektrler lambda kromozomunun bir ksm ile

plazmit DNAnn birletirilmesiyle oluturulmutur.

Lambdann protein klfnn paketlenmesi iin gerekli

olan cos dizileri ile plazmitin replikasyonu iin gereklidizileri tar.

Belirte olarak antibiyotik diren geni tar.

Hemen btn faj genomu karld iin 50 kbbyklnde fragmentleri tar (fajlar 15 kb,plazmitler ise 5-10 kb tayabilir).


7/18

31.10.2007

7

Vektrler (Tayclar)


Vektrler (Tayclar)

Mekik vektrler

Deiik kaynaklardan tretilen ve kendi replikasyonbalama blgelerini ieren dier hibrit vektrlerbirden fazla konak hcrede replike olabilirler.

ki konak sistemde de seilebilen belirteler tarlar.

Genellikle gen ifadesi almalarnda kullanlrlar.


8/18

31.10.2007

8

Vektrler (Tayclar) Bakteriyel yapay vektrler (BAC)

karyotik genomlarn analiz ve haritalanmasndaihtiya duyulan byk DNA paralarnnklonlanabilmesi iin gelitirilmi vektrlerdir.

Bakterilerdeki reme plazmitleri (F plazmit) kendikendine eleyebilme zelliine sahiptir.

BAClar yaklak 300 kb DNA tayabilir.

Replikasyon iin F faktr genlerini, belirte olarakantibiyotik diren genlerini ve oklu klonlamablgesini tarlar.

Vektrler (Tayclar)

Maya yapay kromozomlar (YAC)

Bir YAC her iki uta telomer yaps, bir replikasyonoda (otonom olarak replike olan diziler, ARS) ve

mayaya ait bir sentromer ierir. ki adet belirte (TRP1 ve URA3) bulunur.

oklu klonlama blgesi mevcuttur.

2 megabaz (2 milyon b) uzunluunda DNA paralarYAClarn iine girebilir.


9/18

31.10.2007

9

Vektrler (Tayclar) Maya yapay kromozomlar (YAC)

Hartl Jones, Genetics

Konak Hcreler

Prokaryotlar

Bakteriler

karyotlar: zellikle YAC gibi vektrler karyotik hcrelere DNAaktarmnda kullanlr. Vektr plazmit ise hcre iine DNA girii transformasyonolarak eer vektr virus ise transfeksiyon olarak adlandrlr.

Bitki hcreleri

Memeli hcreleri


10/18

31.10.2007

10

Konak Hcreler

Bitki Hcreleri


Konak HcrelerMemeli Hcreleri



11/18

31.10.2007

11

Mutajenez


Genomik Ktphaneler

Bir genomik ktphane genomdaki tmdizilerden en az bir kopya ierir.

DNA izolasyonu

Restriksiyon endonkleazlarla muamele

Uygun vektrn seilmesi


12/18

31.10.2007

12

Genomik Ktphaneler

f)(

P)(N

=

1ln

1ln

N: Gerekli klonlarn saysP: Verilen DNA parasn alma olaslf: Her bir klondaki genom fraksiyonu

Genomik Ktphaneler



13/18

31.10.2007

13

Kromozoma zgl Ktphaneler Flow cytometry

www.chrombios.com/Service/FlowKar.jpg

Pulsed Field Gel Electrophoresis

cDNA Ktphaneleri

mRNA zerinden reverse transcriptase ile cDNAsentezi

Sentezlenen cDNAnn her iki ucuna bir

restriksiyon enziminin tanma dizisini ieren ksaift zincirli DNA taklp klonlanmas

cDNA ktphaneleri hcre/doku spesifik olarakhazrlanr


14/18

31.10.2007

14

cDNA Ktphaneleri


Genom ve Transkriptom Ktphanelerinden

Yararlanmak

DNA problar

Ktphanenin taranmas: plak hibridizasyonu

Komu genlerin tanmlanmas: Kromozomdayrme


15/18

31.10.2007

15


Yararlanmak


DNA problar


Yararlanmak


Plak hibridizasyonu


16/18

31.10.2007

16


Yararlanmak


Kromozomda Yrme

Balant analizi sonras belirlenenbalantl blgelerden balayp hedefgene ulamay hedefleyen bir yaklamdr.

Her aamada DNA dizi analizini ve akokuma erevesini bulmay hedefler.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu

(PCR)



17/18

31.10.2007

17

Southern Blot


Restriksiyon Haritalama

faculty.plattsburgh.edu/.../restmap/Figure6.GIF Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,


18/18

31.10.2007

DNA Dizi Analizi


Documents

Molekuler Genetik_HaftaVIII