Z. Zellforsch. 93, 126--141 (1969)

Morphologische Veranderungen im Diencephalon und Telencephalon nach Stfrungen

des Regelkreises Adenohypophyse -- Nebennierenrinde I I I . E r g e b n i s s e b e i m M e e r s c h w e i n c h e n n a c h V e r a b r e i c h u n g v o n C o r t i s o n

u n d H y d r o c o r t i s o n *

K. AUS D~R Mi~HLEI~ u n d H. OCKE~FELS

Abteilung fiir Experimentelle Biologie im Anatomischen Insti tut der Universiti~t Bonn (Prof. Dr. med. E. HAOENt)

Eingegangen am 5. August 1968

Morphological Alterations in the Dieneephalon and Telencephalon Following Disturbances to the Feedback Mechanism Adenohypophysis-Adrenal Cortex HI. Studies on the Guinea Pig a/ter Administration o/Cortisone and Hydrocortisone

Summary. 44 male guinea pigs were injected with 6 mg/kg cortisone, alternatively 18 mg/kg hydrocortisone, daily over a period of 28 days. A reduction of ACTH secretion was ascer- tainable by numerical decrease of the R-cells in the anterior lobe of the hypophysis and by the "regressive transformation" of the adrenal cortex, as observable in histological prepara- tions.

The diminished secretory activity of the adenohypophysis is reflected by morphological reactions in the nucleus infundibularis, nucleus suprachiasmaticus, nucleus paraventricularis thalami and in the hippoeampus. The alterations, i.e. the irreversible pyknosis of the nerve cell nuclei and the enlargement of the remainder in the same area, were independent of the type kind of glucocorticoid administered. After intensive stress, comparable lesions appeared in the three aforementioned diencephalic nuclear areae. By means of the sodium-hypochlorite- Schiff reaction, the pyknotic nuclei and the intact ganglionic cells of all four of the nerve cell regions referred to could be selectively demonstrated as is the case with nerve cells in these regions of normal animals. By employing the coupled tetrazonium reaction, only the shrunken cell nuclei were stained.

The results confirm the significance of these regions in the control of the adrenocortico- tropic partial function of the adenohypophysis.

Zusammenfassung. 44 m~nnliche Meersehweinchen erhielten 28 Tage lang 6 mg/kg Cortison bzw. 18 mg/kg Hydrocortison. Die dadurch bedingte Herabsetzung der ACTH- Sekretion konnte durch die verminderte Zahl der R-Zellen im Hypophysenvorderlappen und die ,,regressive Transformation" der Nebennierenrinde histologisch nachgewiesen werden.

Die reduzierte sekretorische Aktivitiit der Adenohypophyse zog morphologiseh faBbare Reaktionen im Nucleus infundibularis, Nucleus suprachiasmaticus, Nucleus paraventrieularis thalami und im Hippocampus nach sich. Die Veriinderungen in Form yon irreversiblen Kern- pyknosen und reversiblen VergrSBerungen der restlichen Nervenzellkerne innerhalb eines Kern- gebietes waren v o n d e r Art des verabfolgten Glucocorticoids unabhiingig. Nach intensivem Stress traten vergleichbare Sch~digungen in den drei genannten Kerngebieten des Zwischen- hirns auf. Durch die Natriumhypochlorit-Schiff-Reaktion kamen die pyknotischen Zellkerne und die ungesch~digten Ganglienzellen der vier Nervenzellregionen selektiv zur Darstellung; auch bei Normaltiercn sind die Nervenzellen dieser Gebiete mit der Natriumhypochlorit- Sehiff-Reaktion f~rbbar. Mit der Tetrazonium-Kupplungsreaktion f~rbten sich nur die geschrumpften Zellkcrne.

Die Ergebnisse best~tigen die Bedeutung der aufgefiihrten Areale ffir die Kontrolle der adrenocorticotropen Partialfunktion des Hypophysenvorderlappens.

* Dvm Andenken unserer hochverehrten Lehrerin, Frau Professor Dr. EMMI HAGEN, gewidmet.

Ver~nderungen im Diencephalon und Tetencephalon naeh Glucocorticoidzufuhr 127

Exper imen te l l erzeugte Abweichungen der ACTH-Sek re t i on yon der Norm gehen mi t morphologischen Reak t ionen der Gangl ienzel len b e s t i m m t e r cerebraler Kerngeb ie te einher: Bei ve rs t~rk te r ACTH-Aussch i i t t ung zeigen die Zellen des Nucleus infundibular is , des Nucleus suprachiasmat icus , des Gr iseum per ivent r i - culare t h a l a m i und des H i p p o c a m p u s histologische Ver~nderungen (A~S DV, R MOHLEN und OCKV, NFWLS, 1968b). Auf eine Herabse t zung der Cor t icot ropin- Sekre t ion reagieren die Ganglienzel len der genaImten vier Kerngeb ie t e mi t K e r n p y k n o s e n u n d Vo lumenzunahmen der Kerne in den i ibr iggebl iebenen ungeschi idigten Zellen (AUS DER MfTHL~N und OCKV, NF•LS, 1968a).

Eine groBe Zahl physikaliseher, pharmakologischer oder psychischer Reize (,,Stress": SELY~, 1946) fiihren zu einer erhShten Ausschiittung yon ACTH durch die Adenohypophyse; dem Anstieg der ACTH-Sekretion ist bei der Ratte ein Abfall des Aseorbins~ure-Gehaltes in den Nebennieren proportional (SAYERS und SAYE~S, 1947). Direkte Bestimmungen der Cor- tieotropin-Konzentration im Blut best~tigen den Stress-induzierten Sekretionsanstieg (SYDNOR und SAYERS, 1954; HODGES und VERNIKOS, 1959); dieser Anstieg unterbleibt jedoch - - bei entsprechend hoher Dosierung - - nach Vorbehandlung mit Corticosteroiden (SAYERS und SAYERS, 1947). Aueh die Synthese des corticotropen Hormons wird durch akuten Stress ver- st~rkt, wie sich durch in vivo Einbaumarkierung yon Corticotropin mit Serin-l-C 14 zeigen l~iBt (JACoBowrrz, MARKS und VERNIKOS-DANELLIS, 1963).

AuBer durch Stress kann auch auf humoralem Wege in den homSostatischen Mechanismus des Regetkreises Hypophyse-Nebennierenrinde eingegriffen werden �9 Nach langzeitiger Verab- reichung yon Glucocorticoiden sind der ACTH-Gehalt der Hypophyse deutlieh herabgesetzt (F~a~REr~ und LAQUEUR, 1955) und die ACTH-Sekretion stark vermindert (SAYERS und SAYERS, 1949; SArERS, 1950).

Die Kontrolle der ACTH-Sekretion soll durch den Cortieotropin-releasing-factor (CRF) erfolgen, der in der Median eminence gebildet wird (HARRIS, REED und FAWCETT, 1966) und fiber das Pfortadersystem zur Adenohypophyse gelangt. Nach Stress steigt die CRF- Aktivit~t in der Median eminence schuell an (VERN~Os-DAN]~LLIS, 1964 und 1965a); ebenso erhSht sich der CRF-Gehalt im Blut (ANDv.RSON, 1966). Der Anstieg der CRF-Aktivit~t nach Stress wird durch vorausgehende Verabreichung von Hydrocortison verhindert. Da auch der CRF-Gehalt in der Median eminence nach Zufuhr von Hydroeortison deutlich herabgesetzt ist, muI~ der Blocker-Effekt dieses Glucocorticoids auf einem Eingriff in die CRF-Synthese be- ruhen (VEttNIKOS-DANELLIS, 1965a). Nach Injektionen yon Extrakten der Median eminence f~llt bei der normalen Ratte der ACTH-Gehalt der Hypophyse innerhalb yon 40 min auf 36 % des Ausgangswertes (VERNIKOS-DANELLIS, 1965b). Diese Befunde lassen keinen Zweifel zu, da~ die ~bermittlung von Reizen aus dem Hypothalamus fiir den Vorderlappen auf neuro- humoralem Wege erfolgt. Aus Hypothalamus-Extrakten yon Schafen kSnnen versehiedene Faktoren mit Corticotropin-re|easing-Aktivit~t angereichert werden; an der Reindarstellung und Sequenzanalyse dieser Oligopeptide wird gearbeitet (GuILLEMIN, 1967).

Die StSrung des Regelkreises Adenohypophyse -Nebenn ie ren r inde erfolgte in unserer je tz igen Unte r suchung durch A p p l i k a t i o n von Cortison und Hydroeor t i son . Die ver r inger te cor t ico t rope Sekre t ionsak t iv i t~ t der Adenohypophyse nach Zufuhr yon Glucoeor t ieoiden miiBte mi t morphologischen Reak t ionen in denjenigen Kern- gebie ten des H y p o t h a l a m u s und des l imbischen Sys tems einhergehen, in denen wir berei ts nach ACTH-Verabre ichung Ver~inderungen yon Nervenzel len beobach- te ten . H ie rdureh wiirde die Bedeu tung dieser cerebralen Zel lregionen als Steue- rungszen t ren fiir die Cor t i co t rop in-Sekre t ion des Vorder lappens e rneut be s t a t i g t und erhs AuBerdem wird durch den Cort icosteroid-Versuch ausgeschlossen, d a b die nach ACTH-Zufuhr beobach te ten Ver~nderungen der Gangl ienzel len ledig- lich immunologisehe Reak t ionen auf das FremdeiweiB dars te l len, das mi t dem e x t r a k t i v gewonnenen P r ~ p a r a t zwangsl~iufig zugefi ihr t wurde.

128 K. AUS DER Mi~HLEN und H. OCKENFELS:

Material und Methode Wir untersuehten 68 m~nnliche Meerschweinchen mit einem mittleren KSrpergewicht yon

275 g. Die Tiere bekamen Frischkost und Pellets 1 ad libitum. 22 Meerschweinchen erhielten Cortison 2 (6 mg/kg K6rpergewicht) und 22 Tiere 18 mg/kg Hydrocortison 3 28 Tage lang ein- mal t~glich intramuskul~r injiziert. W~hrend des Versuehes starben eines der mit Cortison und vier der mit Hydroeortison behandelten Meerschweinehen. Die Mortalit~t zeigte eine deut- liche Abh~ngigkeit vonde r applizierten Dosis. In Vorversuchen betrug die Sterblichkeit 60 % nach Verabreiehung von 24 mg/kg/die Hydrocortison und stieg auf 80% nach 30 mg/kg/die.

Bei Versuchsende wurden 15 Tiere der Cortison-, 12 der Hydroeortison-Gruppe und 12 Kon- trolltiere in Nembutalnarkose mit physiologiseher KochsalzlSsung und dann mit einer 4% Formaldehyd enthaltenden physiologischen Kochsalzl6sung perfundiert, ihre Gehime in Bouinseher LSsung fixiert und in Paraffin eingebettet. Die F~rbung der 10 ~ dicken Gehirn- sclmitte erfolgte naeh der Chromalaun-H~matoxylin-Phloxin-Methode (GoMoRI, 1941 ; BARG- MA~N, 1950).

AuBerdem wandten wir zwei histochemische Methoden an: 6 mit Corticoiden behandelte und zwei normale Meersehweinchen wurden mit 4%iger Formaldehydl6sung durchspfilt, ihre Ge- hirne in 6 % iger FormaldehydlSsung fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Sagittalsehnitte wurden der Tetrazonium-Kupplungsreaktion (DANIELLI, 1947; BVRSTON~, 1955) und der Natriumhypochlorit-Schiff-Reaktion naeh HEss (1953) unterzogen.

Bei der vorschriftsgetreuen Durchffihrung der Methode yon HESS 16sten sich die Schnitte in der alkalischen Oxydationsl6sung (pH 11,1) yon den Objekttr~gern. Dies lieB sieh dutch Oxydation mit einer sauren Hypochloritl6sung (pH 1,0) verhindern, die aus 100 ml Wasser, 5 ml NatriumhypochloritlSsung (5,9% freies Chlor) und 1 ml konz. Sehwefels~ure bestand. Der negative Ausfall der Reaktion an nieht oxydierten Kontrollsehnitten bewies, daft die Schiff-positiven Substanzen erst durch die Hypoehlorit-Oxydation entstanden waren.

Zum histologisehen Nachweis einer verminderten ACTH-Aussehfittung wurden die Hypo- physenschnitte yon je 3 Tieren der Cortison- und Hydroeortison-Gruppe mit modifizierter Bouinscher LSsung (HOLLANDE, 1918) durehspfilt und nach der Perameisens~ure-Aleianblau- PAS-Orange G-Methode (ADAMS und SWE~rENHA~, 1958) gef~rbt.

Die Wirkung der Corticosteroide fiberprfiften wir histologiseh an Nebenniere (H~ma- toxylin-Eosin-F~rbung) und Pankreas (Chromalaun-Gallocyanin-Methode nach BocK und ULLMAN~, 1967). Zum Nachweis des zu erwartenden Steroiddiabetes bestimmten wir den Blutzucker mit Glucose-Oxydase und Peroxydase (B~RoMErER und BERET, 1962; Bint- entnahme am Versuehsende aus dem linken Ventrikel des Herzens unter Nembutalnarkose).

Ein intensiver Stress k6nnte fiber eine verst~rkte ACTH-Sekretion ebenfalls auf die yon uns beschriebenen Nervenze|lregionen Einflui~ nehmen. Um dies zu kl~ren, lieBen wir 3 Meer- schweinchen 7 Tage lang einmal t~glich in Wasser yon 24~ bis zur ErschSpfung (10--20 rain) schwimmen und duschten sie anschliel]end ca. 2 rain mit Leitungswasser (LINsEN, 1968). Am 7. Tag wurden die Tiere unmittelbar nach dem Stress unter Nembutalnarkose durch Peffusionsfixation getStet, die Gehirne in Bouinscher L6sung fixiert und der Gomori-F~rbung unterzogen.

Nach Anoxie auftretende Pyknosen (CAMMERME~ER, 1962) sollten in ihren f~rberisehen Eigenschaften mit den nach ver~nderter ACTH-Sekretion beobachteten Pyknosen verglichen werden. Hierzu wurden 3 Meerschweinchen in einem mit Leuchtgas durchstrSmten Zylinder innerhalb weniger Minuten getStet und anschliel3end durchspfilt.

Die Restitutionsf~higkeit der ver~nderten Ganglienzellen sollte an den Gehirnen yon 4 Meerschweinchen untersucht werden. Zur Erzeugung ausgepr~gter Kernpyknosen erhielten die Tiere einmal r 100 E Depot-ACTH/kg KSrpergewicht intramuskul~r fiber 6 Woehen. Die Durchspfilung erfolgte 6 Woehen naeh dem Absetzen der ACTH-Applikation.

Zur Messung der Kernvolumina an den nach GOMORI gef~rbten Schnitten diente die yon EICH~R (1963) besehriebene Apparatur.

Die H~ufigkeitsverteilungen der Zellkernvolumina bei den Versuchstieren (Abb. 2, 3) er- geben sieh als Mittelwerte aus den individuellen Verteilungskurven. Als Normalwerte liegen

1Alleinfutter ffir Meerschweinchen. (A. HSveler GmbH, Langenfeld-Immigrath). Cortison Ciba: Kristallsuspension yon 17u-Hydroxy-11-dehydro-cortieosteron-aeetat.

aHydrocortison-Kristallsuspension ,,Hoechst": Hydrocortisonaeetat. Ffir die freundiiehe ~berlassung dieser Substanz danken wir Herrn Prof. Dr. E. VON WASI~L~WSKI, Farbwerke Hoechst AG (Frankfurt a. M.-H6chst).

Ver/~nderungen im Dieneephalon und Telencephalon nach Glucocorticoidzufuhr 129

die yon Aus PER )/[tiHLE~r (1966) angegebenen Kurven zugrunde, yon denen die stichproben- artig bestimmten Verteihngskurven der Kontrolltiere nur unwesentlich abweichen. Die in der Tabelle angegebenen Werte ffir die Kernvolumina der Ganglienzellen im Nucleus para- ventricularis thalami und der Pyramidenzellen im Hippocampus stellen Mittelwerte der Maxima in den Verteilungskurven der Einzeltiere~: Standardabweichung dar; die statistische Aus- wertung erfolgte nach deln Studentschen t-Test (Signifikant: P=< 0,05).

Die Messung der Kernvolumina und die photographischen Arbeiten fiihrte Fraulein I~GE BODE aus.

B e f u n d e

I. Wirkung der Glucocorticoide au/ Hypophyse, Nebenniere und Pankreas

Die Corticotropin-Produktion wird heute in die mukoiden R-Zellen der Adeno- hypophyse lokalisiert (KRAc~T, ZIM~ER~A~N und HACHMEISTER, 1966; BROZ- MAN,C, 1967 ; CA~LON, 1967). Bei den mit Corticoiden behandelten Meerschweinehen ist die Zahl der R-Zellen in den Hypophysen-Vorderlappen gegenfiber derjenigen bei unbehandelten Tieren stark verringert. Dieser histologische Befund entsprieht der herabgesetzten ACTH-Ausschfittung, die durch die langfristige Verabreichung yon Cortison bzw. Hydrocortison erreicht werden sollte. - - Eine entsprechende Be- einflul~barkeit der ACTH-Sekretion dutch Glueoeorticoide stellten bereits SAYERS und SAYERS (1949) auf biochemischem Wege fest.

Der verminderten cortieotropen Aktivit/~t der Adenohypophyse entsprechend, weisen die Nebennierenrinden aller Versuehstiere in ~Ybereinstimmung mit frfiheren Versuchen yon INGLE und KI~NDALL (1937) sowie KRACHT (1958) eine schmaler gewordene Zona fasciculata auf (,,Regressive Transformation"; TOI~UTTI, 1942, 1951). Das relative Nebennierengewicht ist gegeniiber demjenigen yon Normal- tieren deutlich verringert.

Bei mehr als der tt/ilfte der Tiere beider Versuchsgruppen finder sieh ein ausge- pr/~gter Steroiddiabetes mit Glneosurie und Blutzuekerwerten bis zu 294 mg%, w/~hrend bei 28 normalen Meerschweinchen unter den gleiehen Bedingungen der Blutentnahme als Mittelwert ( i Standardabweichung) 104 • 17 mg % gefunden wurde. Das Pankreas der diabetischen Versuchstiere weist eine starke Vermehrung und VergrSBerung der Langerhansschen Inseln auf; die fl-Zellen sind deutlich de- granuliert. Diese Beobachtungen wurden auch yon HAUSBERGER und RAMSAY (1953, 1955) sowie yon ABELOVE nnd PASCHKIS (1954) erhoben. Bei den Tieren ohne Diabetes fehlen Ver~nderungen des Inselorgans. Die morphologisehen Be- funde an den Nervenzellen der untersuchten Gehirnareale zeigen keinen Unter- schied zwisehen diabetischen Tieren und Versuchstieren mit normalen Blutzueker- werten. Beobachtungen am groBzelligen Hypothalamus wurden nieht bertick- sichtigt.

II. Histologische und karyometrische Be/unde am Zwischenhirn und im limbischen System

Die Behandlung mit Glucocorticoiden ffihrt zu gleichartigen Ver/~nderungen an den Ganglienzellen im Diencephalon und Telencephalon, wie wir sie bereits nach ACTH-Zufuhr beobachten konnten. Die morphologischen Besonderheiten in bei- den Experimenten beschr/~nken sich auf die gleichen Kerngebiete.

Wieder weisen der Nucleus infundibularis, der Nucleus suprachiasmaticus, das Griseum periventrieulare thalami (insbesondere der Nucleus paraventricularis thalami) und der Hippocampus in der Region H1 und H 2 morphologisch ver- /inderte Nervenzellen auf. In den vier Kerngebieten linden sich viele atypische

9 Z. Zellforsch., Bd. 93

130 K. AUS DER MUttLEN und H. OCKENFELS:

Abb. 1. Regressiv ver~nderte Pyramidenzellen des Hippocampus nach Verabreichung yon Glucocorticoiden. Die Ganglienzellen mit Kempyknosen fallen in dem Mikrophotogramm

durch ihre starke Schw~rzung auf. Meerschweinchen. Tetrazonium-Kupplungsreaktion. Vergr. 32fach

Ganglienzellen, deren pyknot i sche Kerne bei Anwendung der Gomori-Methode in tens iv mi t Ph lox in f~rbbar s ind; eine charakter i s t i sche Folge der Zellver~nde- rung stel len die durch Schrumpfung en t s t andenen perieellul~ren Spal t r~ume dar. I m Nucleus infundibular i s zeigen 85% der Versuchstiere Kernschrumpfungen , w~hrend sieh im Nucleus suprachiasmat ieus pyknot i sehe Kerne in den Ganglien- zellen nur bei 24 % der Tiere auff inden lassen. I m Nucleus paravent r icu la r i s tha lami l inden sieh - - wie im H i p p o c a m p u s (Abb. 1) - - bei 43% der Tiere regressive Ver~nderungen. - - Bei den Kont ro l l t i e ren lieBen sich keine vergle ichbaren Seh~- d igungen an den Nervenzel len beobachten .

Die Zunahme der Ke rnvo lumina in den Ganglienzellen, die keine pykno t i schen Kerne aufweisen, is t im Nucleus infundibular is (Abb. 2) viel ausgepri igter als im

Tabelle. Zunahme des Kernvolumens im Nucleus paraventricularis thalami und im Hippocampus nach Verabreichung yon Glucocorticoiden beim Meerschweinchen

Tiergruppen Zellkern- P N volumen (tz 3)

Nucleus paraventricularis thalami Kontrolltiere 302 • 34 - - 8 Versuchstiere 397=~ 58 ~ 0,001 12

Pyramidenzellen des Hippocampus

Kontrolltiere 818 ~ 106 - - 8 Versuchstiere 1055 • 231 < 0,05 20

Ver~nderungen im Diencephalon und Telencephalon nach Glucocorticoidzufuhr 131

%

~0

h / \

3o i \

lo \

p

1,6 1,8 2,0 2,2 Z/~ 2,6 2:8 log des Zellker nvotumens

Abb. 2. H~iufigkeitsverteilung der Zellkernvolumina im Nucleus infundibularis beim Meer- schweinchen. Nach Verabreichung yon Cortison- und Itydrocortison ( . . . . . ) sind die Volumina der Ganglienzellkerne gegeniiber den Volumenwerteu der Normaltiere ( - - ) stark vergrSBert. Die VergrSBerung der Kerne, die auch naeh Zufuhr yon Depot-ACTH auftritt, ist reversibel; die Kernschwellungen haben sich 6Wochen nach Absetzen der ACTH-Gabe (-- . - - )

ann~hernd zuriickgebildet

3O

10

1,6 1,8 2,0 2,2 2,/* 2,fi 218 log des Zetlker nvolumens

Abb. 3. H~ufigkeitsverteilung der Zellkernvolumina im Nucleus supraehiasmaticus des Meer- sehweinchens. Nach Applikation yon Glueocorticoiden ( . . . . . ) sind die Kerne der Nervenzellen

vergrSBert. Normaltiere ( - - )

Nucleus suprachiasmaticus (Abb. 3) ; dies entspricht der grSl3eren H~ufigkeit, mit der die Pyknosen im Nucleus infundibularis auftreten.

Die Kerne der ungesch~digten Ganglienzellen im Nucleus paraventricularis thalami und der Pyramidenzellen im Hippocampus sind gegentiber den Kontroll- werten statistiseh signifikant vergrSl~ert (Tabelle). Die Ausmal~e dieser Volumen- zunahmen nach Verabreichung von Cortison und Hydrocortison sind wenig unterschiedlieh; die H/~ufigkeit des Auftretens und die Art der regressiven Ver- ~nderungen sind in beiden Versuchsgruppen gleieh. - - Im Hippocampus finder sich in den geschwollenen Kernen der Pyramidenzellen eine Verdichtung des Kernchromatins. Aul~erdem enthalten die Zellen h~ufig mehrerc Nueleoli, die meist am Rand des Zellkerns gelegen sind. Diese Ver~nderungen und die Zunahme der Kemvolumina sprechen fiir eine gesteigerte Funktion der Pyramidenzellen (BucHE~, 1962; BfTCHNER, 1966).

9 *

Abb. 4a u. b. Nucleus paraventricularis thalami des Meerschweinchens nach Gabe von Glu- cocorticoiden. V I I I ~ I I I . Ventrikel. AusschlieBlich in diesem Kerngebiet f~rben sich die Nervenzellen des Griseum periventriculare thalami a durch die Natriumhypochlorit-Schiff- Reaktion, Vergr. 32fach, und b durch die Tetrazonium-Kupplungsreaktion,, Vergr. 63fach

I I I . Histochemische Be/unde im Zwischenhirn und im limbischen System

Die Natrinmhypochlori t-Schiff-Reaktion nach HESS (1953) dient zum Nachweis freier ~-Aminogruppen in wenig wasserlSslichen Proteinen; der oxydative Abbau der ~-Aminos~ure zu dem um 1 C-Atom niedrigeren Aldehyd l~uft nu t dann ab, wenn auch die zugeh5rige Carboxylgruppe frei ist.

Abb. 5a u. b. Nucleus suprachiasmaticus nach Zufuhr yon Cortison und Hydrocortison bei Meerschweinchen. Die Ganglienzellen mit pyknotischen Kernen zeigen auf dem Mikrophoto- gramm eine auffallende Schw~rzung. R e c s Recessus supraopbicus, T R O Tractus opticus. a Natriumhypochlorit-Schiff-Reaktion. Vergr. 32fach, b Tetrazonium-Kupplungsreaktion.

Vergr. 50fach

Mit d iesem Verfahren k o m m t es f iberraschenderweise zu einer se lekt iven Dar- s te l lung der pykno t i s chen Zellkerne und der ungesch/~digten Ganglienzel len ira t t i p p o c a m p u s , im Nucleus pa raven t r i cu la r i s t ha l ami (Abb. 4a), im Nucleus supra-

134 K. AUS DER MUHLEN und H. OCKENFELS:

Abb. 6a u. b. Nucleus paraventricularis thalami des Meerschweinchens nach Verabreichung yon Cortison und Hydrocortison. Die pyknotischen Nervenzellkerne werden mit der Tetra- zonium-Kupplungsreaktion selektiv gef~rbt; im Mikrophotogramm fallen sic durch ihre inten- sive Schw~rzung auf. V I I I III . Ventrikel, CA Commissura anterior, a Vergr. 12,8fach,

b Vergr. 32fach

ch iasmat icus (Abb. 5 a) und im Nucleus infundibular is der Versuchstiere. Auch bei normalen Meerschweinchen f~rben sich diese Kerngeb ie te mi t der N a t r i n m h y p o - chlorit- Schiff-Methode. Das gleichart ige his tochemische Verhal ten - - sowohl un te r exper imente l len als auch un te r normalen Bedingungen - - weist auf eine glcich- ar t ige F u n k t i o n der Zellregionen hin. Ein gemeinsames Reak t ionsve rha l t en der vier Zent ren l a n d sich berei ts in unseren frfiheren Versuchen. - - Von den groG- zelligen Kerngeb ie ten des H y p o t h a l a m u s s te l l t sich mi t der Na t r iumhypoch lo r i t - Schi f f -Reakt ion noch der Nucleus paraven t r icu la r i s h y p o t h a l a m i dar.

Ver/inderungen im Dieneephalon und Telencephalon nach Glucocorticoidzufuhr 135

Abb. 7. Ganglienzellen mit pyknotischen Kernen im Nucleus infundibularis des Meerschwein- chens nach Applikation yon Glueocortieoiden. Eine Anh~ufung der geschi~digten Ganglien- zellen (im Mikrophotogramm schwarz) findet sieh dicht unter dem Ependym des Recessus infundibuli mad des Recessus praemamillaris. Rec in Reeessus infundibuli, Rec pm Recessus

praemamillaris. Tetrazonium-Kupplungsreaktion. Vergr. 50fach

Die Tetrazonium-Kupplungsreaktion (DAmELLI, 1947; BURSTONE, 1955) galt urspriing- lich als spezifische Methode zur Darstellung der aromatischen Aminosiiuren Tryptophan, Tyrosin und Histidin. Da jedoch noch andere Gruppen der Proteine mit Diazoniumverbin- dungen reagieren kSnnen (HowARD und WILD, 1957), kann die Tetrazoreaktion nach den Erfahrungen yon P]~ARSE (1960) lediglich als allgemeiner t~roteinnachweis angesehen werden. Die Anfi~rbung yon Nucleoproteiden durch diese Methode beruht auf deren EiweiBkompo- nente ( B A R ~ D und DA~ELLI, 1956); reine Desoxyribonucleins/iure und Ribonucleins~ure zeigen keine Reaktion (PEARS]~, 1953).

Mit der Te t r azo reak t ion s ind bei den Versuchst ieren ausschliel~lich die pykno- t i schen Kerne der Gangl ienzel len in den vier Kerngeb ie ten f i i rbbar (Abb. 1, 4b , 5b , 6, 7), die sich auch mi t der Na t r i umhypoch lo r i t -Sch i f f -Reak t ion dars te l len . Nich t pykno t i sche Zel lkerne ble iben bei der T e t r a z o n i u m - K u p p l u n g s r e a k t i o n ungef/ irbt .

I V. Zur Restitutions/dhigkeit und Spezi/itdt der Kernpyknosen

Die Ke rnpyknosen , die nach langfr is t iger H e r a b s e t z u n g der A C T t t - S e k r e t i o n in den Gangl ienzel len ents tehen, s ind 6 Wochen nach Versuchsende unver / inder t nachweisbar . Die Anzah l der geschrumpf ten Zel lkerne l iegt nach dieser Res t i tu - t ionszei t in der gleichen GrSl3enordnung 4 wie nach 6wSchiger A p p l i k a t i o n yon ACTH. Die Kernschwel lungen der fibrigen NervenzeUen b i lden sich im Gegensatz zu den i r revers ib len K e r n p y k n o s e n zur i ick; die Zel lkerne erreichen nach e iner

aIn friiheren Versuchen wurde das Verh/~ltnis der gesch/idigten zu den ungeschi~digten Ganglienzellen im Nucleus infundibularis yon 10 Meerschweinchen bestimmt. Nach 6 Wochen fanden sich unter 1000 Zellen pro Tier 279-4-50 pyknotische Zellkerne bei t/~glicher Verab- reichung yon 80 E/kg synthetischem ACTH.

136 K. Aus DER ~V~UHLE~ und H. OCKENFELS:

Restitutionszeit von 6 Wochcn wieder ann~hernd normale Volumina (Abb. 2). Die Reversibilit~t der Kernschwellung zeigt, dab es sieh um eine echte VergrSBerung der Nuclei handelt, denn es besteht die MSglichkeit, dab zwei funktionell unter- schiedliche Zelltypen verschiedener GrSfle in demselben Kerngebiet vorkommen. Bei einer selektiven Sch~digung der kleineren Ganglienzellen k6nnte dann die Messung nur an den ungesch~digten grSl3eren Zellkernen erfolgen. Dadurch wfirde eine Vergr6Berung der Nuclei in diesem Kerngebiet vorget~uscht. Die Rfickbfldung der Kernschwellung spricht gegen die Existenz zweier Zellkollektive im gleichen Kerngebiet.

Die Tiere, die einem Schwimmstress unterzogen wurden, zeigen im Nucleus infundibularis, Nucleus suprachiasmatieus und Nucleus paraventricularis thalami regressiv ver~nderte Nervenzellen mit Kernpyknosen, w~hrend in den anderen diencephalen Kerngebieten und im Hippoeampus derartige Ver~nderungen fehlen. Die Stress-induzierte ErhShung der ACTH-Ausschfittung beeinflul3t somi~ auch die Nervenzellareale, die bereits auf Eingriffe in den humoralen Mecha- nismus des Hypophysen-Nebennierenrindensystems reagierten und deswegen ffir die Steuerung der Corticotropin-Sekretion verantwortlich gemacht wurden.

Bei den unter anox~mischen Bedingungen (Leuchtgas) getSteten Meerschwein- chen linden sieh im Gomori-Pr/~parat zahlreiche Ganglienzellen mit pyknotischen Kernen, die diffus fiber das diencephale zentrale H6hlengrau verteilt sind. Da- neben lassen sich imHippocampus und imMittelhirn Kernschrumpfungen beobach- ten. Bei Anwendung der Tetrazonium-Kupplungsreaktion auf benachbarte Ge- hirnsehnitte kommt es zur F~rbung der pyknotischen Kerne im Hippocampus, im Nucleus paraventricularis thalami, Nucl. suprachiasmatieus und Nuel. infundibularis. Bereits bei der Natriumhypochlorit-Schiff-Rcaktion und bei langzeitigen Vers der ACTH-Sekretion zeigten diese vier Ganglien- zellareale ein einheitliehes reaktives Verhalten. - - Aul3erdem werden gesch~digte Ganglienzellen der Area praeoptica und des Mittelhirns sowie pyknotische Kerne der Purkinje-Zellen durch die Tetrazoreaktion dargestellt.

Diskussion

Nach Applikation von Cortison bzw. Hydrocortison kommt es zu einer vermin- derten Ausschfittung von Corticotropin, wie die Verringerung der R-Zellenzahl im Vorderlappen, die regressive Transformation der Nebennierenrinde und die Ab- nahme des relativen Nebennierengewichtes zeigen. Der langanhaltenden Abwei- chung der ACTH-Sekretion yon der Norm folgen morphologische Ver~nderungen der Ganglienzellen im Nucleus infundibularis, Nucleus suprachiasmaticus, im zen- tralen H6hlengrau des Thalamus und im I-Iippocampus. Hierdurch wird die Be- deutung dieser Nervenzellareale ffir die Steuerung der ACTH-Sekretion best/~tigt, denn bereits frfiher wurden in diesen vier Kerngebieten Pyknosen und in den ungesch/~digten Ganglienzellen Kernsehwellungen nach anderen Eingriffen in das Hypophysen-Nebennierenrindensystem beobachtet (AVS Dr, R MOHLEN und OCKEN]~ELS, 1968a, 1968b).

Der gesteigerte Funktionszustand dieser Ganglienzellen kommt durch eine reversible ZellkernvergrSBerung zum Ausdruck. Auch die Vermehrung der Nucleoli und ihre gelegentlich zu beobachtende Ausschleusung durch die Kernmembran entsprechen einer gesteigerten RNS-Synthese und somit einer erhSh~en Protein-

Ver/~nderungen im Diencephalon und Telencephalon nach Glucocorticoidzufuhr 137

Produktion. Die irreversible Sch~digung der Zellkerne scheint aus der intensiven und plStzlich einsetzenden funktionellen Uberbelastung zu resultieren (BOcHN~R, 1966), entsprechend einer verst/~rkten Regulationst/~tigkeit der Nervenzellen.

Bei Stress (z. B. Schwimmen) werden diese Zentren in ihrer Regulationst/~tig- keit infolge der erhShten ACTH-Sekretion verst/~rkt beansprucht; wieder linden sich gesch/~digte Ganglienzellen im Nucleus infundibularis , Nucleus suprachias- maticus und Nucleus paraventricularis thalami. Eine Stress-Situtation zieht eine vermehrte ACTH-Ausschfittung nach sich. Deshalb treten auch bei anderen Experimenten, die fiir das Versuchstier eine erhebliche Belastung bedeuten, vergleichbare Ver/s an den Nervenzellen auf: So linden sich beim Hund nach Alloxandiabetes (OcKE•FELS und W~CER, 1967) und )kthioninpaukreatitis (Bocx und OCXENFV, LS, 1967), beim Meerschweinchen naeh AuslSsung eines Kon- taktekzems (Avs DV, R Mt:mLEN und HAO~,~r 1968) Kernpyknosen in periventricu- l/~ren Bereichen des Zwischenhirns. BeimMeerschweinchen ist aul~erdem der Hippo- campus ver/~ndert, beim t tund die Area praeoptica. Diesen Experimenten ist eine StSrung des Hypophysen-Nebennierenrindensystems gemeinsam.

Da der Nucleus infundibularis, Nucleus suprachiasmaticus, Nucleus paraven- tricularis thalami und der Hippocampus gegenfiber bestimmten histochemischen Methoden gleichartig reagiercn, kann auf eine gemeinsame funktionelle Aufgabe der Kerngebiete geschlossen werden: So werden die pyknotischen Zellkerne durch die Tetrazonium-Kupplungsreaktion und die Natriumhypochlorit-Schiff-F/~rbung in diesen Kerngebieten dargestellt. Mit der letztgenannten Methode kommt es, auch bei normalen Meerschweinchen, in den beschriebenen vier Arealen zu einer selektiven Darstellung der ungesch/~digten Ganglienzellen.

Die vier Nervenzellregionen, die nach unseren Befunden bei der Regulation der ACTH-Ausschfittung mitwirken, gehSren zum Zwischenhirn und zum End- hirn. Die drei Kerngebiete des Dieneephalon - - Nucleus infundibularis, Nucleus suprachiasmaticus und Nucleus paraventricularis thalami - - z/~hlen zum ,,zen- tralen HShlengrau", dessen besondere Merkmale abgesehen yon der Ventrikeln/~he markarme Nerven und eine reiche Gef/~13versorgung sind.

Nach allen Eingriffen in das Hypophysen-Nebennierenrindensystem zeigen die gesch~digten Abschnitte des Griseum periventriculare thalami und des Nucleus infundibularis eine Anh~ufung der pyknotischen Ganglienzellen dicht unter dem Ependym des III . Ventrikel bzw. des Reeessus infundibuli. Auf die Bedeutung des Griseum periventriculare weisen aueh die Ergebnisse von RuF und STEI~ER (1967) hin: Durch Mikroelektrophorese lieBen sich Steroid-empfindliche Neurone in diesem Bereich lokalisieren und damit das Griseum periventriculare mit der Regulation des CRF und/oder der ACTH-Sekretion in Zusammenhang bringen.

Obwohl die yon uns diskutierten Areale topographisch welt voneinander ge- t rennt sind, lassen sic sich durch Faserverbindungen (Abb. 8) zu einem Leitungs- system zusammenschliel3en: Die Kerngebiete im zentralen HShlengrau des Zwi- schenhirns sind durch afferente Bahnen mit dem Frontalpol fiber das mediale Vorderhirnbfindel, mit dem Gyrus einguli und dem Hippocampus durch den Fornix verbunden. Die Fibrae thalamo-hypothalamicae schaffen Kontakt mit den Ner- venzellen des Griseum periventriculare thalami und den Ganglienzellen der klein- zelligen hypothalamischen Kerngebiete. Aul~erdem stehen diese kleinzelligen, peri- ventrikul/~ren Kerne durch afferente und efferente Bahnen mit der Haubenregion

138 K. AUS DER Mi)ItLEN und H. OCKENFELS:

Abb. 8. Schema eines paramedianen Sagittalschnittes durch das Gchirn des Meerschwcinchens. Die Fasersysteme wurden in die Zeichenebene projiziert. Eingezeichnet sind die Verkniipfungen der Kerngebiete, die sich nach unseren Vorstellungen an der Steuerung der ACTH-Sekretion beteiligen. CA Commissura anterior; CC Corpus callosum; CM Corpus mamillare; Hi Hippo- campus; H H L Hypophysenhinterlappen; H VL Hypophysenvorderlappen; Lam Q Lamina quadrigemina; N D T Nucleus dorsalis tegmenti; N I Nucleus infundibularis; N P V th Nucleus paraventricularis thalami; NSCh Nucleus suprachiasmaticus; M I Massa intermedia; Tr 0 Tractus optieus; V I I I III. Ventrikel; V I V IV. Ventrikel; 1 Fibrae thalamo-hypothalamicae; 2 Fasciculus longitudinalis dorsalis (Sehfitz'sches Biindel); 3 Fibrae hippocampo-hypothala- micae; 4 Tractus hippocampo-habenularis; 5 Fibrae hippocampo-tegmentales; 6 Mediales

Vorderhirnbfindel (MFB). (Zeichnung: Helga FaBbinder-Ullmann)

des Mittelhirns in Verbindung; die bekannteste Bahn stellt der Fasciculus longi- tudinalis dorsalis (Schfitz'sches Bfindel) dar. Er entspringt aus noch nicht n/~her bekannten Abschnitten des Griseum periventriculare hypothalami und hat Faser- verbindungen zum Thalamus, Hypothalamus und zum Mittelhirndach. Entlang dem Schiitz'schen Biindel finden sich die Nervenzellen des zentralen H6hlengraus, das als fibergeordnetes Koordinationszentrum fiir alle nerv6sen vegetativen Funk- tionen angesehen wird (KaIv, o, 1966).

GroBe Anteile des Hippocampus, die nicht im Dienste des Geruchssinnes ste- hen, sind fiir die Regulation vegetativer Abl/~ufe ebenfalls yon Bedeutung (CLARA, 1959). Es muB daher hervorgehoben werden, dal3 die efferenten Bahnen der Hippocampusformation durch die Gebiete verlaufen oder in den betreffenden Arealen endigen, die wir fiir die Steuerung der ACTH-Sekretion verantwortlich machen. Die Fibrae hippocampo-hypothalamicae, die aus den Zellen der Pyra- midenschicht entspringen, ziehen durch das zentrale H6hlengrau des Diencephalon und endigen im Bereich der Area praeoptica sowie in der Umgebung des Tuber cinereum. Durch diese Fasern k6nnten die Ganglienzellen des Nucleus infundibu-

Ver~nderungen im Diencephalon und Telencephalon nach Glucocorticoidzufuhr 139

laris, des Nucleus suprachiasmaticus und des Griseum periventr iculare tha lami mi t den Pyramidenzel len des Hippocampus verkni ipf t sein. - - Auch der Nucleus habenular is medialis, der nach ACTH-Appl ika t ion Ver/ inderungen aufwies, s teht mi t dieser Pyramidenschich t durch den Trac tus h ippocampo-habenular is in Be- ziehung. Da die Hippocampusformat ion nu r durch efferente Fasern mi t den Zen- t r en des diencephalen HShlengraus in unmi t t e lba rem K o n t a k t steht, scheint der Hippocampus diesen Kerngebie ten in der F u n k t i o n fibergeordnet zu sein. Durch die afferenten u n d efferenten Verb indungen des Hippocampus mi t dem Tegmen- turn en ts teh t ein geschlossenes System, das Mittelhirn, Hippocampus u n d zentrales H6hlengrau des Diencephalon mi te inander verkniipft .

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Dr. K. AUS D~,R Mi2HLEN, Dr. H. OCKE~FELS Abt. ffir Experimentelle Biologic Anatomisches Insti tut der Universitat 53 Bonn, NuBallee 10