• Einführung

• Ribozyme I

• Ribozyme II

• Ribozyme III, In vitro Evolution

• in vitro Evolution neuer Ribozyme

• SELEX

• Display-Techniken:

In vitro Evolution von Proteinen

• RNA-basierte Regulation: Riboswitches

• RNA Interferenz

• small noncoding RNA

• Influenza – ein RNA-Virus

MSc-Modul RNA-Biochemie

RNA Biochemie 06/1

Isolierung der

gewünschten RNA

RT/PCR

Mutagenese

(PCR)

Systematic Evolution of Ligands

by Exponential amplification

RNA Biochemie 06/2

SELEX

Heydenreich et al., 1993

spezifische Bindungstaschen in Proteinen:

RNA Biochemie 06/3

SELEX

tRNA-

Synthetase

Komplex

RNA Biochemie 06/4

SELEX

Faltung

Protein RNA

RNA Biochemie 06/5

SELEX

randomisiertT7 Promotor

Säule

Anlagerung

in vitroTranskription

RNA Pool

Sequenzpool: 1013-1015

(sequence space: 1024)

RT/PCR

RNA Biochemie 06/6

SELEX

lat. „aptus“, passend

Selektierte RNA Moleküle, die andere Moleküle spezifisch binden:

Aptamere

RNA Biochemie 06/7

SELEX

target

target

target

target

PCR mutagenesis

RNA Biochemie 06/8

SELEX

KD-Werte von Aptameren:

90.03hairpin1130mod.

RNA

Vascular

Endothelial

Growth Factor

111bulge1032RNAHIV rev Protein

1410G-

quartet1740ssDNAElastase

13100hairpin1530mod.

RNAElastase

10700bulge8120RNAATP

?18 000?7120RNAD-Tryptophan

FreqKD [nM]MotifRdsNtsLibraryTarget

RNA Biochemie 06/9

SELEX

Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH

Agarose-Säule

ATP

Anfangskomplexität:

1014 RNA-Moleküle

RNA Biochemie 06/10

SELEX: ATP-Aptamer

Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH

RNA

Säulen-Matrix= Säulenbinder

RNA Biochemie 06/11

SELEX: ATP-Aptamer

1. Inkubation von RNA

mit Säulenmatrix

RNA

vorselektierte

RNA

2. Inkubation von RNA

mit immobilisiertem

Zielmolekül

Selektion

selektierte RNA (Aptamer)

RNA Biochemie 06/12

SELEX: ATP-Aptamer

ATP

gebundene RNA auf der Säule

Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH

ATP

ATP

ATP

RNA

RNA

RNA

kompetitive Elution

RNA Biochemie 06/13

SELEX: ATP-Aptamer

Agarose-O-C(NH)NH-(CH2)6-NH

Agarose-Säule

ATP

RNA-Pool

flow through:

ungebundene RNA

Affinitätschromatographie

mit ungebundenem ATP

reverse Transkription

PCR

in vitro Transkription

Analyse

RNA Biochemie 06/14

SELEX: ATP-Aptamer

Consensus-Motiv

Sassanfar & Szostak, 1993

RNA Biochemie 06/15

SELEX: ATP-Aptamer

Consensus-Motiv und Consensus-Struktur:

Sassanfar & Szostak, 1993

RNA Biochemie 06/16

SELEX: ATP-Aptamer

• KD < 50 µM (später: 700 nM)

• Bestimmung der Ligand-Spezifität

durch modifizierte Elution

• Keine Bindung bei Methylierungen

an Positionen 1, 2, 3 und 6 an der

Base bzw. am 3‘OH der Ribose

• Entfernen der Aminogruppe an

Position 6 oder der 2‘OH-Gruppe

interferiert mit Bindung

• N7 und C8 sind nicht beteiligt

• Anzahl der Phosphate ist irrelevant

Sassanfar & Szostak, 1993

RNA Biochemie 06/17

SELEX: ATP-Aptamer

die Base wird erkannt!

ATP-Bindung: induced fit

Kethoxal

• Kethoxal interagiert mit N1

und N2 von ungepaarten

Guanosin-Resten

• Abwesenheit von ATP:

keine Modifikation

• Anwesenheit von ATP:

Konformationswechsel im

Aptamer: G6, G7, G17 im

Loop werden modifiziert

Sassanfar & Szostak, 1993

RNA Biochemie 06/18

SELEX: ATP-Aptamer

• Purin-reicher Loop bildet Bindungstasche

• Ausbildung von G-G Hoogsteen-Basenpaaren

• AMP interkaliert zwischen A10 und G11

• H-Brücken zwischen AMP und G8, A12

NMR-Struktur:

Jiang et al., 1996

Jhaveri et al., 2000

RNA Biochemie 06/19

SELEX: ATP-Aptamer

Base Stacking H-Brücken

Jiang et al., 1996

RNA Biochemie 06/20

SELEX: ATP-Aptamer

RNA-Aptamer

ATP

DNA-Aptamer

Hermann & Patel, 2000

RNA Biochemie 06/21

SELEX: ATP-Aptamer

Theophyllin

randomisiertT7 Promotor

Säule

Anlagerung

in vitroTranskription

RNA Pool

Sequenzpool: 1013-1015

(sequence space: 1024)

RT/PCR

RNA Biochemie 06/22

Theophyllin-Aptamer

10.0000-fach schlechtere Bindung!

Hermann & Patel, 2000

Theophyllin-Aptamer:

RNA Biochemie 06/23

Spezifität von Aptameren

Test auf Spezifität: kompetitive Bindungsexperimente

Jenison et al., 1994

RNA Biochemie 06/24

Spezifität von Aptameren

randomisiertT7 Promotor

Säule

Anlagerung

in vitroTranskription

RNA Pool

Sequenzpool: 1013-1015

(sequence space: 1024)

RT/PCR

Arginin

RNA Biochemie 06/25

Aptamere gegen Aminosäuren

Arginin Citrullin

Hermann & Patel, 2000

Arginin-Aptamer Citrullin-Aptamer

RNA Biochemie 06/26

Aptamere gegen Aminosäuren

RNA Biochemie 06/27

Aptamere gegen Aminosäuren

Knight & Landweber, 2000

CGA

CGG

CGC

CGU

AGAAGG

R-Codons sind prädestiniert für R-Bindung!

Ähnliche Codon-Anreicherung für:

Phe, Ile, Leu, His, Gln, Tyr, Trp (Ausnahme: Glu)

RNA Biochemie 06/28

Aptamere gegen Aminosäuren

Evolution des Genetischen Codes:

• zufällige Festlegung der Codons

• funktionale Festlegung der Codons

RNA Biochemie 06/29

Aptamere gegen Aminosäuren

Evolution des Genetischen Codes:

Carl Woese(1928 – 2012)

Gruppe 1: Phe, Leu, Ile, Met, Val

Gruppe2: Ser, Pro, Thr, Ala

Gruppe 3: Cys, Arg, Ser, Gly

TLC

RNA Biochemie 06/30

Aptamere gegen Aminosäuren

Laufverhalten der Aminosäuren

korreliert mit Codon Assignment!

Evolution des Genetischen Codes:

Knight & Landweber, 2000

RNA Biochemie 06/31

Aptamere gegen Aminosäuren

Evolution des Genetischen Codes:

Wolf & Koonin, 2007

RNA Biochemie 06/32

Aptamere gegen Aminosäuren

Evolution des Genetischen Codes:

Wolf & Koonin, 2007

= primitives Ribosom

RNA Biochemie 06/33

Aptamere gegen Aminosäuren

• Aromatische Verbindungen

• Aminosäuren

• Oligosaccharide (Antibiotika)

• Peptide/Proteine

RNA Biochemie 06/34

SELEX: Liganden

• Alternative zu Antikörpern

• Vorteile:

- leichter herzustellen

- z. T. höhere Spezifität

• Nachteile:

- geringe Stabilität in der Zelle

RNA Biochemie 06/35

Anwendungen

Que-Gewirth & Sullenger, 2007

RNA Biochemie 06/36

Anwendung: Targeting

Que-Gewirth & Sullenger, 2007

RNA Biochemie 06/37

Anwendung: Targeting

Macugen (Pegaptanib: PEGylated aptamer inhibitor):

Macula-Degeneration:

Ng et al., 2006

RNA Biochemie 06/38

Anwendung: Targeting

RNA Biochemie 06/39

Anwendung: Targeting

RNA in humanem Serum:

0 sec 60 sec

original Länge

Abbau-Produkt

RNA Biochemie 06/40

Problem: RNA Degradation

+

RNA Hydrolyse:

His

His

RNA Biochemie 06/41

Problem: RNA Degradation

RNA Hydrolyse:

RNA Biochemie 06/42

Problem: RNA Degradation

RNA Hydrolyse:

RNA Biochemie 06/43

Problem: RNA Degradation

RNA ist im Alkalischen sehr instabil

RNA wird durch RNasen schnell zerstört

+

RNA Hydrolyse:

H2‘-Deoxy-NTPs

DNA-Aptamere

RNA Biochemie 06/44

Problem: RNA Degradation

+

RNA Hydrolyse:

• funktionelle OH-Gruppe fehlt: Faltung

• teuer

• nicht alle modifizierten NTPs werden

von RNA Polymerase akzeptiert

• geringere Ausbeute bei TranskriptionRNA Biochemie 06/45

Problem: RNA Degradation

unmodifizierte RNA:

0 sec 60 sec0 h 48 h

2‘-Amino-modifizierte RNA:

RNA Biochemie 06/46

Problem: RNA Degradation

Enantiomere:

all-D-Proteine:

Protease-resistent

all-L-RNA:

RNase-resistent

RNA Biochemie 06/47

Spiegelmere

Inkubation in humanem Serum:

Klussmann et al., 1996

RNA Biochemie 06/48

Spiegelmere

Spiegelmere (L-RNA):

• stabil in biologischen Systemen

mit neutralem pH

• instabil im Alkalischen

Enantiomere:

Noxxon Pharma AG

RNA Biochemie 06/49

Spiegelmere

Klussmann et al., 1996

erkennt Target,

ist aber instabil

ist stabil,

erkennt aber nur Spiegelbild des Targets

RNA Polymerase kann nur D-RNA synthetisieren, aber keine L-RNA (Spiegelmer)

RNA Biochemie 06/50

Spiegelmere

Vater & Klussmann, 2003

RNA Biochemie 06/51

Spiegelmere

RNA als Informationsspeicher: zu instabil!

1. 2‘OH-Gruppe der RNA: Hydrolyse-Risiko

Uracil (U)

(Ribose)

Austausch

gegen

2‘H-Gruppe

RNA Biochemie 06/52

Stabilisierung des Erbguts

RNA als Informationsspeicher: mutationsanfällig!

2. Uracil: Desaminierungsprodukt von Cytosin

Uracil (U)

(Ribose)

Uracil (U)

Desaminierung

Austausch

Uracil gegen

Thymin

RNA Biochemie 06/53

Stabilisierung des Erbguts

RNA als Informationsspeicher: zu instabil!

Uracil (U)

(Ribose)

Ein

führu

ng d

es D

oppels

trangs

3. Einzelstrangbruch: Informationsverlust

RNA Biochemie 06/54

Stabilisierung des Erbguts

RNA als Informationsspeicher: zu instabil!

Reparaturenzyme

RNA Biochemie 06/55

Stabilisierung des Erbguts

3. Einzelstrangbruch: Informationsverlust

2‘OH-Gruppe 2‘H-Gruppe

Uracil Thymin

Einzelstrang Doppelstrang

RNA Biochemie 06/56

DNA ersetzte RNA als Erbgut

Nimjee et al., 2005

RNA Biochemie 06/57

Aptamere