• Einführung

• Ribozyme I

• Ribozyme II

• Ribozyme III, In vitro Evolution

• in vitro Evolution neuer Ribozyme

• SELEX

• Display-Techniken:

In vitro Evolution von Proteinen

• RNA-basierte Regulation: Riboswitches

• RNA Interferenz

• small noncoding RNA

• Influenza – ein RNA-Virus

RNA Biochemie 02/1

MSc-Modul RNA-Biochemie

Protein-

Welt

RNA-

Welt

Prä-RNA-

Welt

RNA Biochemie 02/2

Ribozyme

viele verschiedene Seitengruppen

variable 3D Strukturen

4 Bausteine

viele negative Ladungen

• Proteine:

• RNA/DNA:

RNA Biochemie 02/3

Ribozyme

tRNA-Prozessierung durch RNase P

T. CechBoulder, USA

S. AltmanYale, USA

Nobelpreis für Chemie 1989:

RNA-Splicing in Tetrahymena

RNA Biochemie 02/4

Ribozyme

RNA Biochemie 02/5

Eukaryontische Gene enthalten Introns

RNA Biochemie 02/6

Eukaryontische Gene enthalten Introns

G100U100… …A100G100…A100…

A100U100… …A100C100…A100…

GT-AG Regel

AT-AC Intron

RNA Biochemie 02/7

Eukaryontische Gene enthalten Introns

RNA Biochemie 02/8

Eukaryontische Gene enthalten Introns

RNA Biochemie 02/9

Eukaryontische Gene enthalten Introns

Tetrahymena thermophila

rRNA

Intron

RNA Biochemie 02/10

Autokatalytische Introns

Spuren 1-4: Inkubationszeit (5-60 min.)

Spur 5: 26S rRNA Marker

• isolierte Kerne aus Tetrahymena

• spezifische Transkription der rRNA-Gene

• radioaktiv markierte RNA wurde auf einem

denaturierenden Gel aufgetrennt

T. Cech, Nobel-Vortrag, Stockholm 1989

Tetrahymena thermophila

Kernextrakt

Splicing?

RNA Biochemie 02/11

Autokatalytische Introns

RNA

t

Promotor(T3, T7, SP6)

lineare DNA(geschnittenes Plasmid, PCR)

RNA Polymerase(T3, T7, SP6)

NTPs

lineare RNA: Primärtranskript

Tetrahymena-Proteinextrakt

in vitroSplicing

Spleißreaktion mit in vitro Transkript:

RNA Biochemie 02/12

Autokatalytische Introns

Promotor(T3, T7, SP6)

lineare DNA(geschnittenes Plasmid, PCR)

RNA Polymerase(T3, T7, SP6)

NTPs

lineare RNA: Primärtranskript

in vitroSplicing

+

RNA Biochemie 02/13

Autokatalytische Introns

lineare RNA: Primärtranskript

Self-splicing?

RNA Biochemie 02/14

Autokatalytische Introns

zirkuläres Intron

Not treated Pronase Proteinase

lineares Intron

MgCl2

T. Cech, Nobel-Vortrag, Stockholm 1989RNA Biochemie 02/15

Autokatalytische Introns

das erste bekannte Ribozym!(Ribonucleinsäure + Enzym)

lineares Intron!pppGp

RNA Biochemie 02/16

Autokatalytische Introns

RNA Biochemie 02/17

Autokatalytische Introns

GTP-Bindung des Introns,

erste Transesterifizierung

Bass & Cech, 1984

RNA Biochemie 02/18

Autokatalytische Introns

GTP-Bindung des Introns,

erste Transesterifizierung

Bass & Cech, 1984

RNA Biochemie 02/19

Autokatalytische Introns

Bass & Cech, 1984Golden et al., 2005

RNA Biochemie 02/20

Autokatalytische Introns

RNA Biochemie 02/21

Autokatalytische Introns

Fedor & Williamson, 2005

trigonale Bipyramide

Strahley et al., 2005

RNA Biochemie 02/22

Autokatalytische Introns

Strahley et al., 2005

Chval et al., 2011

RNA Biochemie 02/23

Autokatalytische Introns

> 400 Phosphodiester-Bindungen!

Exon 1

Exon 2

Intron

RNA Biochemie 02/24

Autokatalytische Introns

IGS,internal guide sequence

RNA Biochemie 02/25

Autokatalytische Introns

2

Haugen et al., 2005

>500 Sequenzen (400-1000b)

Protisten

Pilze

Pflanzen

Bakterien

Phagen

RNA Biochemie 02/26

Autokatalytische Introns

aber: keine Konservierung auf Sequenzebene!

RNA Biochemie 02/27

Autokatalytische Introns

Schröder et al., 2004RNA Biochemie 02/28

Autokatalytische Introns

Aminosäure

CCA

5‘

3‘

RNA Biochemie 02/29

RNase P – das zweite Ribozym

5‘

3‘RNase P

RNA Biochemie 02/30

RNase P – das zweite Ribozym

Protein-Untereinheit

RNA-Untereinheit

~130 kDa

14 kDa

RNA Biochemie 02/31

RNase P – das zweite Ribozym

RNA Biochemie 02/32

RNase P – das zweite Ribozym

Protein-Untereinheit

tRNA

RNA-Untereinheit

RNA Biochemie 02/33

RNase P – das zweite Ribozym

prä-tRNA

tRNA

5‘-leader

Cell 35, 849-857 (1983)

RNase P

RNA

RNA Biochemie 02/34

RNase P – das zweite Ribozym

prä-4.5S rRNA

• RNA-Präparation enthielt keine Protein-Kontamination

• in vitro transkribierte RNA-Untereinheit zeigte ebenfalls

katalytische Aktivität

• Protein-Untereinheit alleine war katalytisch nicht aktiv

• Holo-Enzym hat 2x höhere Aktivität als isolierte RNA-Untereinheit

• RNA-Untereinheit schneidet 4.5S rRNA-Precursor nicht

RNA Biochemie 02/35

RNase P – das zweite Ribozym

RNase P ist nur in Gegenwart beider Komponenten voll aktiv!

Reich et al., 1988

RNA-

Untereinheit

RNA-

Untereinheit

RNA-Untereinheit alleine

Protein-Untereinheit

Holo-Enzym

Protein-Untereinheit: - unterstützt korrekte Faltung der RNA

- titriert lokale negative Abstoßung von Ribozym und

tRNA-Substrat

(kann durch hohe Ionenstärke (NH4+) kompensiert werden)

RNA Biochemie 02/36

RNase P – das zweite Ribozym

RNA Biochemie 02/37

RNase P – das zweite Ribozym

Willkomm & Hartmann, 2007

RNA Biochemie 02/38

RNase P – das zweite Ribozym

Hydrolyse durch RNase P: Transesterifizierung:

Kazantsev & Pace, 2006 RNA Biochemie 02/39

RNase P – Katalyse

Willkomm & Hartmann, 2007

RNase P in humanen Mitochondrien:

keine RNA-Komponente!

Holzmann et al., 2008

RNA Biochemie 02/40

RNase P – das zweite Ribozym

RNA Biochemie 02/41

RNase P – das zweite Ribozym

RNase P in humanen Mitochondrien:

keine RNA-Komponente!

Holzmann et al., 2008

RNA Biochemie 02/42

RNase P – das zweite Ribozym

RNase P in humanen Mitochondrien:

keine RNA-Komponente!

Holzmann et al., 2008

Präparation 1Präparation 2

Präparation 3

Aktive Komponenten:

3 Proteine!

RNA Biochemie 02/43

RNase P – das zweite Ribozym

RNase P in humanen Mitochondrien:

keine RNA-Komponente!

Holzmann et al., 2008

RNA Biochemie 02/44

RNase P – das zweite Ribozym

RNase P in humanen Mitochondrien:

keine RNA-Komponente!

Holzmann et al., 2008

MRPP1-3:

nicht verwandt mit euk./bakt.

RNase P-Proteinen

MRPP1:

tRNA-Methylase

Funktion: vermittelt tRNA-Spezifität

MRPP2:

Dehydrogenase/Reduktase

Funktion: ?

MRPP3:

Unbekanntes Protein, Metallo-Nuclease?

Funktion: Schnitt?

Walker & Engelke, 2008

RNA Biochemie 02/45

RNase P – das zweite Ribozym

RNA Biochemie 02/46

Das zentrale Dogma

zirkuläres Intron

Not treated Pronase Proteinase

lineares Intron

MgCl2

T. Cech, Nobel-Vortrag, Stockholm 1989RNA Biochemie 02/47

Gruppe I Intron: Zirkularisierung

Zaug et al., 1983

RNA Biochemie 02/48

Gruppe I Intron: Zirkularisierung

weitere Reaktionen…

Große Ribozyme:

• Autokatalytische Introns

• RNase P RNA

Kleine Ribozyme:

• Hammerhead

• Hairpin Ribozyme

• Hepatitis Delta Virus Ribozym

RNA Biochemie 02/49

Weitere Ribozyme

Große Ribozyme:

• Autokatalytische Introns

- Gruppe I

- Gruppe II

Einteilung aufgrund von ähnlichen

Sekundärstrukturen

RNA Biochemie 02/50

Weitere Ribozyme

>500 Sequenzen

(400-1000b) keine Konservierung auf Sequenzebene!

auch bei Gruppe II Introns

RNA Biochemie 02/51

Gruppe II Introns

• zentrales Rad

• 6 Domänen

Sekundärstruktur von Gruppe II Introns:

5‘-E

xo

n 3‘-E

xon

RNA Biochemie 02/52

Gruppe II Introns

Vorkommen von Gruppe II Introns:

Phagen

Bakterien

Pflanzen

Pilze

Protisten

RNA Biochemie 02/53

Gruppe II Introns

Gruppe I Introns: Gruppe II Introns:

RNA Biochemie 02/54

Gruppe II Introns

• zentrales Rad

• 6 Domänen

Branch Point (Verzweigungspunkt)

RNA Biochemie 02/55

Gruppe II Introns

EBS 1EBS 2

IBS 2

IBS 1

3‘ exon

RNA Biochemie 02/56

Gruppe II Introns

Kern-Introns:Spleißmechanismus Gruppe II Introns:

RNA Biochemie 02/57

Gruppe II Introns