1172 Kurze wissenschaftliche Mitteilungen Klin. Wschr.

bolischen Alkalose (s. Methodik) mi t Zunahme des H a r n - p H (s. Tabelle).

Zusammen]assung. Lacbat wird fil triert u n d tubu- lar reabsorbier~. Die maximale tubul/~re Reabsorpt ion yon Lac ta t (Tm-Lactat) betrug beim nierengesunden, ruhenden Menschen u m 20 mg/min u n d wurde bei einer Blu t l ac ta tkonzen t ra t ion yon 13--18 rag-% er- reicht. Bei weiterer Steigerung des Blu t lac ta t l and sich sehlieBlich eine Abnahme der berechneten tubu- 1/tren Reabsorpt ion bis zum Auf t re ten einer zu- nehmenden tubul/ t ren Laetatsekret ion. Dieser be- merkenswer~e Vorgang 1/tuft in dem gemessenen Be- reich unabhgngig vom Harn-pI~ u n d der Ha rn f lu f - gr6Be ab.

Summary. Lacta te is filtered in the glomeruli and reabsorbed in the tubules. The maximal rate of lactate reabsorpt ion (Tm-Lactate) was 20 mg/min in normal and resting subjects. This value was reached by blood lactate concentrat ions between 13--18 mg/ 100 ce. At higher levels there was a fall in the cal- culated tubu la r reabsorpt ion and tubu la r secretion of lactate appeared. This remarkable process occured independent ly of u r ine-pH and urine-flow.

Literatur 1. Burns, J. J., T.F. Yfi, A. Ritterband, J. i~I. Perel, A.B.

Gutman, and B. B. Brodie: A potent new uricosuric agent,

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2. Chasis, H , J. Redish, W. Goldring, H. Ranges, and H. Smith: The use of sodinm-para-aminohippurate for the functional evaluation of the hnman kidney. J. clin. Invest. '24, 583 (1945).

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Dr. N. K. Man H6spital I~ecker (Service Pr. J. Hamburger) F 75 Paris

Dr. W. Hallauer Med. Univ.-Klinik 78 Freiburg

Dr. P. Keller Prof. Dr. med. J. Sehirmeister 7500 Karlsruhe, Moltkestr. 14 I. Med. Klinik

Kurze wissenschaftliche Mitteilungen

NAD/NADH, NADP/NADPH and GSSG/GSH in mensehliehen Erythrocyten

D. ]3use~ und K. BOIE Medizinische Universit~tsklinik Freiburg i. Br.

(Direktoren: Prof. Dr. G. W. LO~R und Prof. Dr. W. GE~OK)

Eiugegangen am 11. Juni 1969

NAD 1 und NADP - - in oxydierter und reduzierter Form - - bilden zusammen mit Glutathion in funktioneller Wechsel- beziehung mit Pyruvat/Lactat sowie HEmo-/H~miglobin die ffir Stoffwechsel und Funktion des Erythroeyten wiehtigsten Redoxsysteme. Angaben tier Literatur fiber ihren Gehalt und Redoxstatus in der roten Zelle divergieren. Eigene Messungen hatten die folgenden Ergebnisse.

Methoden NAD, NADP. Perchlors~ure (PCA)-Extrak~ion des Blutes

(3,2 ml 0,6 M PCA/ml Blur). Zentrifugation und Neutralisa~ion des ~)berstandes auf pi t 7. AHe Prozcduren in der K~lte. Bestimmung yon NAD und NADP nebeneinander im enzyma- tiseh-optischen Test nach Holzer et al (1958) (J~thanot 40 raM, Semiearbazid mit 10 mM, Pyrophosphatpuffer 25 raM, pH 8,8; Start (1) (= NAD) mit ADH, 3 IE/ml; G-6-P 1 raM, MgSOt

1 ADH ~ Alkoholhydrogenase; G-6-P = Glucose-6- Phosphat; G-6-PDH ~ Glucose-6-Phosphatdehydrogenase; GDH/TI1V[ = Glycerophosphatdehydrogenase/Triosephosphat- isomere; GlDH ~ G]utamatdehydrogenase; GSH, GSSG = reduziertes bzw. oxydiertes Glutathion; ~-KGS := ~-Keto- glutars~ure; NADH, NAD ~ reduziertes bzw. oxydiertes Nieotinamiddinucleotid; NADPH, NADP ~ reduziertes bzw. oxydiertes Nieotinamiddinncleotidphosphat, PeA = Per- chlors~ure; TP = Triosephosphate; TRAP = Tri~thanol- amin-Puffer.

Substanzen und HAlfsencyme wurden yon der Fa. Boeh- ringer, Mannheim, bezogen. Reinheitsgrade s. Bergmeyer et al. (1962) und Pr~parateverzeichnis Boehringer-Biochimica.

Diese Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen For- schungsgemeinschaft unterstfitzt.

5 mM; Start (2) (= NADP) mit G-6-PDH, 1,4 IE/ml; Extr.- Vol. = 3,0 ml, Test-Vol. = 4,0 ml, d = 4 cm, l ~ 366 nm).

NADH, NADPH. Alkalische Extraktion des Blutes nach Klingenberg (1962) in/ithanoloischer KOH (3,6 ml 1 M KOH in 96% ~thanol/6 ml Blur). Nach 10 rain EiweiBf~llung durch langsames Zuf~gen yon 3,0 mt ges~ttigter, zuvor mit konzen- trie~em Ammoniak auf pH 7,9 eingestellter Ammonsulfat- 15sung. Einstellung auf pH 8 mit 1 M KH~PO 4. Zentrifugation (20 rain, 30000 g). Alle Prozeduren in der K~lte. Der ~berstand wurde unverdfinnt in den Test eingesetzt oder, bei geringer Opalescenz, zuvor bis zum doppelten Volumen mit 0,05 M TRAP, pH 8, verdiinnt. Eine Opaleseenz des Extraktes stSrt den Test empfindlich, so dab ein stark opaker Extrakt zu ver- werfen ist. Eine geringe opake Gelbf~rbung ist vereinzelt auch durch Plasmaabtrennung vor der KOH-Extraktion des Blutes nicht vermeidbar, Sorgfalt and Teehnik der Ammonsulfat- Eiweillfiillung sowie zumindest 16stfindiger Fettkarenz des Probanden vor der Blutentnahme sind wesentlich. - - Be- stimmung yon NADH und NADPH nebeneinander irn enzyma- tisch-optisehen Test naeh Holzer et aI. (1.e.) (TP 0,9 raM, TRAP 35 raM, pH 8; Start (1) (= NADH) mit GDH-TI~¢I 0,6 resp. 4 IE/ml; c~-KGS 7,5 raM; Start (2) (= NADPH) mit GIDH 0,3 IE/ml; Extr.-Vol. = 2,8 ml, Test-Vol. = 4,0 ml, d = 2 cm, 1 = 366 nm).

In Wiederfindungsversuehen nach Zusatz der gemessenen Substanzen unmittelbar naeh F/illung des Blares mit PeA resp. KOH betrug das Recovery 80--110%.

Ergebnisse und Diskussion Der Gehalt an Pyridin-Nucleotiden zeigt in verschiedenen

K5rpergeweben Untersehiede bis zu 2 Zehnerpotenzen- Er erreieht in Erythroeyten - - fibercinstimmend mit dem geringen Umfang seines Glueosestoffwechsels - - die niedrigsten Werte. Ergebnisse unserer Messtmgen sind in der Tabelle zusammen mit Werten aus der IAteratur - - gewonnen mit anderer Metho- dik - - zusammengestellt.

Wir heben den im Vergleieh zu anderen Geweben niedrigen NADPH/NADP-Quotienten hervor. Dieses Nueleotid liegt racist fiberwiegend oder fast ausschlieBlich in der reduzierten Form vor, mit Ansnahme nur yon Skeletmuskel (NADPH/

g7. Jg., Heft 21, 1969 Kurze wissenschaftliche Mitfeilungen 1173

Tabelle. Pyridinnukleotidgehalt toter Blutzellen

Aut~ren Herkunft N NAD NADH NAD + NAD/ NADP NADPH NADP ~- NADP/ der Ery- NADH NADH NADPH NADPH throcyten

Eigene Mensch 14 42 22 64 66/34 24 51 75 32/68 Ergebnisse (30--63) (14 40) (20--32) (34---81) LShr et al. Mensch 4 73 ~ 10 83 88/12 26 36 62 42/58 (1961) Szeinberg Mensch - - 52 - - - - - - 38 - - - - - - at al. (1964) Gross et, at. Mensch 32 66 a 50 116 57/43 38 29 67 57/43 (1966) Loder et at. Mensch - - 41--72 2- -6 93/7 . . . . (1967) Glock et al. Rat te - - 185 b 120 305 61/39 15 9 24 63/37 (1955) Lowry et al. l~atte 244 a 193 437 56/44 31 26 57 54/46 (1961) Glock et al. Kaninchen - - 110 b 13 123 90/10 9 < 6 - - - - (1955) Jedeikin (1955) Rat te - - 151 b 44 195 77/23 . . . .

Angaben in m~Clol/ml Erythrocyten. Mittelwert und/oder Extreme der Einzelwerte. a Originalangaben in ~zMol/1 Blur, b in g.g/g Blur - - umgerechnet unter Annahme eines H~imatokritwertes yon 45%. N : Zah] der untersuchten Normalpersonen.

NADP ~1) , H i m und Lunge (2:1). In der Leber erreicht dieser Quotient 30--40 (Glock et al., 1955; Hotzer et al., l.c.). Unter solchen Bedingungen reguliert die 0xydationsrate yon IqADPH den Umfang der direkten Glucoseoxydation, da diese NADP benStigt.

Das gleiehe karm in Erythroeyten nieht der Fall sein. Etwa ein DritteI des Nueleotids ]iegt bier in der oxydierten Form vor, wobei allerdings der absolute NADP-Gehalt den- jenigen anderer Gewebe nieht wesentlich iiberschreitet. NADPH-Wasserstoff flieBt im Erythrocy~en in fiir diesen cha- rakteristischer Weise nahezu ausschlieBlich nur einem Accep- for, ni~mlich Glu~athion, zu. Fiir den hochspezialisierten und damit rudiment~ren Stoffweehsel der roten Zelle ist der ira Vergleieh zu anderen Geweben einzigartig hohe Glutathion- gehalt kennzeichnend; seine sti~ndige Reduktion ist fiir die Funktionserhattung der roten Zelle obligat. Wie man seit der Einfiihrung neuer Methoden fiir die Bestimmung yon GSSG dureh Giintherberg et al. (1965) weiB, ]iegt GlutaShion 2 im Erythrocyten nahezu total in reduzierter Form vor [in guter ~e re in s t immung mit Giintherberg fanden wir (Busch, 1966) ffir GSH 2,27 (S.D. = 0,32), fiir GSSG 0,035 (S.D. : 0,04) ~ ~Mol/ml Erythrcyten, also einen Redoxquotienten yon 98,4:1,6 (S.D. ~ 0,4)]. Eine Oxydation yon GSH in der roten Zelle wird mit einer Steigerung der direkten Glucoseoxydation im Pen- tosephosphateyclus beantwortet. - - So konnte vermutet wer- den (Busch, 1.c.), dab im Erythrocyten im Unterschied zu der ~Iehrzahl anderer KSrpergewebe nicht die Relation NADPH/ INADP, sondern der GSH/GSSG- Quotient die Rate der direk- ten Glueoseoxydation kontrolIiert. Jacob et al (1966) haben eine solche Regulation durch ~iessungen der Stoffwechsel- raten in Erythroeyten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen nachgewiesen.

Zusammen/assung. Die Gehalte mensehlicher Erythrocyten an Pyridinnucleotiden wurden in kombinierten optischen Testen gemessen: NAD und NADP mit ADt t und G-6-PDH, NADH und NADPH mit GDtt -TIM und G1DH. Mittelwerte in nMol/ml Erythrocyten: NAD 42, NADH 22, NADP 24, N A D P H 51. Diskussion der Ergebnisse im HinbIick auf Pro- bteme der Regulation der direkten Glueoseoxydation, fiir die im Erythrocyten wahrscheinlich nicht der N A D P H ~ . d D P - Quotient, sondern der GSH/GSSG-Quotient ( : 99:1) eine regulative Ftmktion besitzt.

Summary. The pyridine nucleotide content of human erythroeytes, measured by combined optical tests with ADH and G-6-PDH (NAD, NADP) and GDH-TIM and G1DH (NADH, NADPH) is: NAD 42, NADH 22, NADP 24, NADPH 51 nMol/ml red cells (mean values). The results are discussed

2 lNaeh einer neuesten Verbesserung der Gfintherberg- sehen Methode dureh Srivastava u. Beutler (1968) liegt der GSSG-Gehalt <0,005 ~zMot/ml Ze]len.

80 Klin. ~¥schr.,47. Jahrg.

especially in respect to problems of regulation of the direct glucose oxydation. They support the suggestion, that not NADPH/NADP but GSH/GSSG (99:1) is responsible for this pathway.

Literatur Bergmeyer, It . U., H. Klotzseh, H. l~f61lering, 5~[. NelbrSck-

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1174 Kurze wissenschaftliehe Mitteilungen Klin. Wachr.

Szeinberg, A., and S. Pipano: Oxidized pyridine nueleotides in normal and glucese-6-phosphate dehydrogenase deficient red cells. Prec. Tel-Hashomer Hosp. 8, 41 (1964).

Priv.-Doz. Dr. Dieter Busch K. Boie Medizinisehe Universi~tsklinik 78 Freiburg i. Br., Hugstetterstr. 55

Vergleiehende Untersuchungen fiber ein Lipotropin aus Humanhypophysen

P, SCHWANDT, P. WEISWEILER and R. EIOatER I. Mediziniseho Klinik dor Universitgt Miinchen

(Direktor: Prof. Dr. reed. H. Schwiegk)

Eingegangen am 15. Juli 1969

Durch die Strukturaufkli~rung der aus Schafshypophysen isolierten Polypeptidhormone fl- und 7-LPH a, ~ hat die Er- forschung der Lipotropine neue Impulse erfahren. So wurden

werden gepoolt, 24 Std gegen aqua bidest, dialysiert [13] und lyophilisiert. Der Proteingehalt wird navh L o ~ y [10] bestimmt.

Zur Messung des Absorptionsspektrums im L~traviolett- bereich wurden jewefls 1,5 mg des Lipotropins in je 3 ml Aqua bidest. (pH 4,0) bzw. 0,1 n NaOH gelSst und die Extinktionen in dem Bereieh yon 240---310 m F m i t einem Spektralphoto- meter gemessen.

])as immunologisehe Vorhalten wurde im Ouchterlony- Doppoldiffusionstest mit Antiserum gegen Lipotropin aus Schwoinohypophyson ontspreehend friiher~n Angabon [6] ge- priift ~.

Die lipolytische Aktivit~t untersuehten wir in vitro am perirenalen Fettgewebe yon Kaninchen und am subcutanen Fet¢gewebe yon Stoffwechselgesunden (die Lipolyse ~=urde wie friiher angegeben [14] bestimmt); in rive nach s.c.-Injektion yon 250 ~g bei Kaninchen (3 kg, Altrumin-Pellets ad libitum). Die freien Fetts~uren wurden nach Dole und Meinertz [5] bestimmt.

Ergebnisse Von den beiden Peaks des in Abb. 1 a dargestellten Chro-

matogramms war nut der zweite lipolytisch aktiv. Die Rechro- mategraphie der Sammelfraktionen 70--73 ergab einen ein-

E 278 mp O,3m ~ j - L e i t = pH?,4 f~.higkeit

2,5 3k 8[pH

2,0 2t- 71-

1.5 ' lh6h . . . . . 0,01~ pH5,~ -~ L

1,0 • 0 E 5 L

a

/ ~J ~::::1::-:.~-~I . . . . . . . . .

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0 - 0 5 ~ . . . . I t ~ i , 1 I , I I i - i J ] l i

b 0 10 20 30 40 50 50 70 80 90 100140 150 Abb . 1. a S~ulenchromat~)gramm yon 200 mg Roh f rak t i on attf O~{-Sephadex C 25 (39 X 2,2 cm, ~qu i l i b r i e rung m i t 0,01 m Natriumphosphatpuffer, pH 5,8, kontinuier]iche Gradientenelution mit je 200 ml 0,01 m, pH 5,8, und 0,3 m, pH 7,4, Natriumphosphatpuffer). SammelfrakCionen 3,6 ml, DurchfluBrate 140ml/h. b Rechromatogramm yon 20rag Lipotropin= Fraktion J bei gleichen Bedingungen. Extinktion 278 ~m , pH . . . . . . , Leitf~higkeit . . . . . . Abszisse: Gl~schenzahl

aus Hypophysen vom Mensehen bisher yon Friesen [7], Burns et al. [1], Trygs~d [16] sowie Cseh et al. [4] lipidmobilisierende Polypeptide extrahier t.

Nachdem wir friihor die yon uns aus Sehwoino- und ){ensehonhypophysen oxtrahiorton Lipotropino hinsiehtlich ihres chromatographisehen Verhaltens sowio ihrer immuno- logischen und biologisehen Eigensehaften gegoniibergestellt haben [12], sol1 nacb~olgend unsor Humanlipotropin mit den yon anderen Autoren aus Menschenh3~pophysen extrahierten Lipotropinen verglichen werden.

Methodik Tiefgefrorene Menschenhypophysen 1 werden entspreehend

dem frfiher besehriebenen Vorgehen [13] extrahiert, diaIysiert und lyophylisiert. 200 mg dieser Rohfraktion werden in 5 ml )Iatriumphosphatpuffer (pH 5,8) gel6st, bei 8000 g zentrifugiert und der ~berstand auf eine CM-Sephadex C-25-S~ule (2,2× 39 cm) aufgetragen. Die Gradientenchromatographie erfolgt mit je 200 ml 0,01 m (pH 5,8) und 0,3 m (pH 7,4) Natrium. phosphatpuffer bei einer Durchflul3geschwindigkeit yon 140ml je Std. Die Extinktion der in 3,6 ml Portionen gesammelten Eluate wird bei 278 m F gegen aqua dest. gemessen. Die den Peaks entsprechenden Sammelfraktionen 11--14 bzw. 70--73

1 Wir danksn Herrn Prof. Dr. Doerr (Direktor d, Pathol. Inst. d. Univ. Heidelberg) fiir die freundliche ~berlassung yon Hypophysen.

heitlichen Peak an identischer Stelle (Abb. 1 b). Die Ausboute an aktiver Substanz botrug 1 mg Protein/1 g lyophilisiorte Hyt~physen.

Das UV-Absorptionsspektrum zeigto 2 Maxima bei 280 und 290 m F (pH 12) bzw. 1 Maximum bei 280 mF (pH 4).

Mit Antiserum gegen Lipotropin veto Schwoin kam es zwar gegen Schweinolipotropin zur Ausbildung yon Pr~zipi- tationslinion, nieht jedoeh gogeniiber Humanlipotropin.

Bei Kaninchen wirkt Humanlipotropin sowohl in rive wie in vitro stark lipolytisch: Nach s.c.-Injektion steigen die freien Fetts~uren im Serum I h p.i. yon 0,34 ~: 0,07 mval/1 auf 2,894- 0,10royal/1 (n=6) an; bereits boi oiner Lipotropinkonzen- tration yon 0,1 ~zg/ml wurdo die Spontanlipolyse yon 0,24=]= 0,19 (n = 6) auf 0,66 ± 0,05 (n = 8) y2¢Iol/100 mg 13 h signifi- kant ( r < 0,0005) stimuliert. Dagegen bowirkCe Humanlipo- tropin bis zu der maximal gepriiften Konzen¢ration yon 100 Fg/ml am subcutanen Fettgewebe des Menschen keino Lipolysestoigorung.

Diskussion Obwohl Csoh otal. [4] nach dem Extraktionsvorfahren yon

Li et al. mit sgulenchromatischor Vorreinigung auf CM-Cellu- lose gearbeitet haben, zoigt das Chromatogramm dos yon diesen Autx)ren gewonnenen Lipotropins auf CM-Sephadex C-25 ein

2 tterrn Dr. Fateh-Moghadam aus unserer K1inik danken wit fiir die Durehfiihrung diesor Untersuchungen.