Laboratóriumi vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben: Új lehetőségek, régi dilemmák

Nagy Eszter

ORFI, Immunológiai Laboratórium

Immunológiai betegségek laboratóriumi diagnosztikája

Diagnózis alapja:

Anamnézis, fizikális vizsgálat 30% Rutin laboratóriumi vizsgálatok 20%

vérkép, gyulladásos aktivitás (süllyedés,CRP), biokémiai és vizeletvizsgálat, stb. Képalkotó eljárások 20% 

(röntgen, ultrahang, MR, CT, EKG stb.) Szövettani vizsgálatok 20% Immunológiai vizsgálatok 10‐20%

Autoantitest vizsgálatok

Autoantitestek szerepe az autoimmun kórképek diagnózisában

Antitest szerepe Kórkép Antitest

Diagnosztikus

SLE ANA, dsDNS, Sm, aPL (CL, β2‐GPI , LA)

MCTD U1‐RNP

SjS SSA, SSB

APS aPL (CL, β2‐GPI , LA)

RA CCP, RF

Diagnózis megerősítése

SSc Centromer, Scl‐70, U3‐RNP

PM/DM tRNS‐szintetáz (Jo‐1), PL‐7, SRP, PL‐12, Mi‐2

Vasculitis MPO, PR3, GBM

Autoantitestek laboratóriumi kimutatása• Klasszikus módszerek:

‐ Immunfluoreszcencia (IFA)‐ Immundiffúzió (ID)‐ Counterimmunelektroforézis‐ Radioimmunassay (RIA)‐ Enzim immunassay (EIA)

• Új módszerek:‐ Line immunoassay (LIA)‐ Bead‐alapú assay‐k‐ Antigén‐microarray‐k‐ Fehérje chip‐ek

Kritikus Pontok:

Szenzitivitás / specificitás , klinikai interpretáció Irányelvek hiánya az új módszerek alkalmazására és interpretációjára Standardizáció :  kalibráció, új referencia minták  szükségessége  Tesztek harmonizálásaNemzetközi bizottságok: IUS / WHO / CDC Committee for the Standardization of Autoantibodies in Rheumatic Diseases, ACR ANA bizottsága

Az ANA szűrés dilemmája: IFA, ELISA vagy Immunoblot?

‐ AMA (PBC)‐ Ribosoma (SLE)‐ Jo‐1, SRP, PL‐7, PL‐12 (PM )‐ Midbody‐ CENP‐F (tumorok)‐ Golgi‐ Lysosoma‐ Proteasoma‐ Mitótikus orsó‐ F‐Actin (AIH)‐ Vimentin‐ DNS

‐ Histon‐ Nucleosoma

‐ SSA‐ SSB‐ Sm‐ RNP‐ Scl‐70‐ PM‐Scl‐ Ku (PM)‐ Mi‐2 (PM)‐ Sp‐100 

ENA IFA előnye:‐ Intakt Hep‐2 sejtek, az antigén natív 

formában (a minőség  a fixálás függvénye)‐ Magas szenzitivitás: 

SLE‐ben 95 % ‐ ANA + anamnézis + fizikális   vizsgálat kombinációjában(De alacsony  specificitás ! – 57% SLE‐ben)

IFA: nukleáris és citoplazma mintázatok 

Az ANA szűrés dilemmája: IFA, ELISA vagy Immunoblot?

IFAFontos tényező a hígítás:  1: 40 ‐ az egészséges populáció 31,7 %‐a 1: 80 ‐ az egészséges populáció 13,3 %‐a          Pozitív 1:160 ‐ az egészséges populáció  5     %‐a

(Tan EM et al., 1997)• Ajánlás az IFA optimális hígításának  kiválasztására: egészséges kontrollok 95 

percentilisének megfelelően  ‐ DE a hígítás emelésével a szenzitivitás csökken!!!• Konszenzus hiánya: hígítás gyerekminták esetén (<16  év), 1:40? 

ELISA / ImmunoblotFontos tényezők:    ‐ antigén forrása és tisztasága

‐ antigén szerkezete, hordozóhoz való rögzítése‐ szűrőtesztek esetén az antigén keverék összetétele  ‐mit szűrünk?ha csak néhány mag elleni at.‐et szűr  ANA, csak annak része!!! (eredmény közlés ennek függvényében)

A 2007‐ben alakult ACR  ANA munkacsoport állásfoglalása az ANA irodalmának áttekintése alapján  ‐ arany standard még mindig az IFA teszt: az IFA teszt  helyettesítésére a szolid‐fázisú immunassay‐k még nem teljesen alkalmasak ‐ az SLE‐s betegek kb. 35%‐a elveszíthető!!! (Meroni et al., 2010)

IFA Automata rendszer egyik példája

• dsDNS ELISA: ssDNS kontamináció miatt – álpozitivitás

• Antigén szerkezete: konformációs / lineáris  (konformációs  antigének: PT , néhány β2‐GPI, SSA‐60)

• Antigén szilárd fázishoz való rögzítése: releváns epitópok hozzáférhetősége ‐ PR3 ELISA: direkt, capture, anchor‐ PT ELISA: foszfatidilszerin rögzítése, majd PT hozzáadása  Ca2+ jelenlétében

ELISA tesztek eltérő szenzitivitása és specificitása az antigén tulajdonságaiból adódóan

ACPA antitestKörkontroll célja: új ACPA standard?Konszenzus: erősen pozitívEWRR ECS on autoantibodies (2014‐2015)

0 Negatív, 1 Határérték, 2 Gyengén pozitív, 3 Pozitív, 4 Erősen pozitív

n=36

Körkontroll vizsgálat összesített eredményei egy minta kapcsán

His‐tRNS szintetáz (Jo1) Nincs konszenzusEWRR ECS on autoantibodies(2014‐2015)

50%

1 IB2 IB12 ELISA5 IB1 CIE

7 ELISA2 IB

2 ELISA4 IB

n=36

0 Negatív, 1 Határérték, 2 Gyengén pozitív, 3 Pozitív,   4 Erősen pozitív

Körkontroll vizsgálat összesített eredményei egy minta kapcsán

ANA‐IFA

Diagnosztikai algoritmus CTD‐ben

POZITÍVMintázat függvényében

Centromer

titrálás

Citoplazma

AMA, RIB, Myositis sp.

Nuclear Dots

Sp‐100

NEGATÍV

STOP

RNP, Sm, SSA, SSB, Jo‐1, PCNA, Histon

Más

titrálás

ha ≥ 1:160vagy erős a klinikai gyanú CTD‐re

dsDNS

PM, SjS klinikai gyanúja

ENA szűrés  + ENA profil

POZ 

Mennyiségi meghatározás és konfirmálás

NEG

Erős klinikai gyanú SLE‐re

NucleosomaWiik, 2004; Bizzaro et al., 2007

Vizsgálati algoritmus ‐ SLE

SLE DIAGNÓZIS:Immunológiai vizsgálatok• Antinukleáris antitest (ANA)• dsDNA at., Nucleosoma (Kromatin)• ENA at. (SS‐A,SS‐B, Sm, RNP)• komplement (C3, C4, CH50) • aPL at. (CL, β2‐GPI (G/A/M), LA)• RF• Direkt CoombsKémiai, hematológiai vizsgálatok• CRP• Vérkép• VizeletKiegészítő vizsgálatok• P Ribosoma at. (negatív dsDNS és Sm, 

neurológiai manifesztációk esetén)• PCNA at. (ANA mintázat ‐ konfirmáció)

dsDNS Sm U1‐RNP

SSA PRIB PCNA

Különböző ANA mintázatok Hep‐2 sejteken

SLE KÖVETÉS:Immunológiai vizsgálatok• C1q (elsősorban veseérintettség esetén)• dsDNA at., Nucleosoma

(szintje az aktivitás, lupus nephritis jelzője)• komplement (C3, C4, CH50)Kémiai, hematológiai vizsgálatok• CRP• Vérkép• Vizelet

NEONATÁLIS LUPUS (NLE):

• SS‐A (Ro‐52, Ro‐60), U1sn‐RNP

GYÓGYSZER INDUKÁLT LUPUS (DLE):• Histon antitest (diagnosztikai kritérium)

Aktív SLE‐ben 3 ‐ 6 havonta

Vizsgálati algoritmus – Sjögren Szindróma (SjS)

SjS DIAGNÓZIS:Immunológiai vizsgálatok• ANA• ENA antitestek: SSA, SSB, Sm, RNP• RFTovábbi kiegészítő vizsgálatok:• Pajzsmirigy at. (TPO, TG)• Szervpscifikus at. (APA, AMA, SMA)• Komplement (C3, C4, CH50), Kryoglobulin (vasculitis miatt)• Szérum immunglobulin szintek (Ig G, IgA, IgM) / immunfixáció (M 

komponens miatt)

Kiegészítő kémiai, hematológiai vizsgálatok:• TSH• Szérum elektroforézis (monoklonális gammopátia miatt)• Vérkép (esetleges leukopénia miatt)

Vizsgálati algoritmus ‐ RA

ACPA(CCP / MCV)

pozitív negatív RF IgM

pozitív negatív

RA nagyon valószínű< 4 ACR kritérium 

esetén is

RA‐33RF IgA

CarP at.?

RA 4 ACR krit.

pozitív

RA Diagnózis: CRP, We, C3, C4RA Követés / Biológiai terápia:CRP, RF, ANA / dsDNS, PL at. (CL)

ANA ‐ IIF

pozitív negatív

Differenciál diagnózis

SS‐A SS‐BSm

dsDNS

ACAScl‐70 

Nucleoláris

Sec. Sjögren SLE Scleroderma

negatív

RA nem valószínű

Vizsgálati algoritmus – Szisztémás Sclerosis (SS)

Centromer

Slerodermaizületi, izom manif. 

vagy MCTD 

+

Scleroderma vagy PM

Sclerodermaoverlap sy

+

ANA‐IFA

Pozitív (mintázat függvényében) – Konfirmálás: ENA‐ELISA / Immunoblot

RNS Polim. III

Scl‐70 U1‐RNP

++

Sleroderma főként diffúz forma

NucleolárisRNS Polim. I FibrillarinPM/SclTh/To+

Sclerodermalimitált forma(Crest sy.)

Vizsgálati algoritmus – PM / DM

ANA ‐ IIF

Finom / diffúz szemcsés citoplazma pozitivitás

Granulált nucleáris / homogén nucleolárispozitivitás

SRP PL‐7 PL‐12Jo‐1 

PM/SclKu

Mi‐2 U1‐RNP

MCTD PolymyositisAnti‐SRPSzindróma 

PolymyositisAnti‐szintetázSzindróma 

Dermatomyositis

Scleroderma/ Myositisoverlap 

CITOPLAZMA negatív

CK, LDH, GPT, GOTAldoláz

Myositis antitestek konfirmációja Immunoblot vizsgálattal

MYOSITIS SPECIFIKUS antitestek:• Jo‐1* (ASS)• PL‐7 (ASS)• PL‐12 (ASS)• EJ (ASS)• OJ (ASS)• SRP (Nekrotizáló Myositis)• Mi‐2 (DM)• TIF‐1g (p155/140) (DM, CDM)• MDA‐5 (C‐ADM, ILD)• SAE (DM, ILD)• NXP2 (p140) (JDM, kalcinózis)MYOSITIS ASSZOCIÁLT antitestek: • PM‐Scl* (PM, DM, Scleroderma overlap)• Ku (Scleroderma overlap)• U1‐snRNP* (MCTD)• SSA (Ro‐52, Ro‐60)*

ASS: anti‐szintetáz szindróma, CDM: tumor asszociált DM, C‐ADM: amyopathiás DM, JDM: juvenilis DM*ELISA teszt is elérhető

1.2.

1.

2.

1. Minta IFA képe(Citoplazma neg!!!)

? ?

Vizsgálati algoritmus – Szisztémás Vasculitis

Wegener gran.Mikroszk. Poliang.Churg‐Strauss sy.

Mikroszk. Poliang.Wegener gran.Churg‐Strauss sy.

C‐ANCA PR3

Etanollal fixáltgranulocitákon

Formalinnal fixáltgranulocitákon

ANCA – IIF / ELISA

pozitív

P‐ANCA MPOAtípusos 

ANCA

További vizsgálatok:• ANA IIF• C3/C4• RF• Kryoglobulin• CRP• We

CL (G/M), Β2GPI (G/M), LA

mind negatív legalább 1 +CL gyengén +

CL (A) / Β2GPI (A) ?

negatív

további PL at. ?

negatív

Nem APS 

CL (G/M), Β2GPI (G/M), LA ismétlés 3 hónap múlva

legalább 1 +

gyengén +negatív

CL (A) / Β2GPI (A)további PL at. ?

legalább 1 +

APS lehetséges  ? Követés

pozitív

APS 

Vizsgálati algoritmus – APS

MCTD DIAGNÓZIS:Immunológiai vizsgálatok• Antinukleáris antitest (ANA)• ENA ‐ U1‐snRNPKémiai, hematológiai vizsgálatok• Vérkép• Vizelet• CRP

JUVENILIS IDIOPÁTHIÁS ARTHRITIS (JIA)Immunológiai vizsgálatok• Antinukleáris antitest (ANA), pozitivitás esetén ENA• RF, CCP• AST, TB szűrés (Quantiferon)Kémiai, hematológiai vizsgálatok• CRP, WeGenetikai vizsgálatok• HLA‐B27

Mycobacterium tuberculosis fertőzés kimutatása IGRA teszttel (IFN‐ releaseassay) – Quantiferon teszt bevezetése

• Szenzitív: látens és aktív TB fertőzés kiszűrése• Specifikus: BCG oltás vagy más, nem tuberkulózis Mycobacterium‐al való fertőzés 

nem befolyásolja• Biztonságosabb interpretáció (pozitív / negatív kontroll)

TNF‐ gátló terápia laboratóriumi vonatkozásai ‐ látens TB szűrés

0

20

40

60

80

100

RB ED H

8763

50,8

11

3746,7

2 0 2,5

negatív pozitív nem értékelhető%

Quantiferon eredmények %‐os megoszlása a reumatológiai betegek (RB), hajléktalanok (H), és az őket ellátó egészségügyi dolgozók (ED) csoportjában (saját adatok)

Gyártó szerint: • TBAg Cut‐Off: 0,35 IU / mL

• Mitogén (PK) Cut‐Off: 0,5 IIU/mL

Saját tapasztalat alapján:• TBAg szürke zóna: 0,300 – 0,800 

IU / mL

• Mitogén (PK): 0,5 ‐ 2 IU / mL nem egyértelmű

TNF‐ gátló terápia laboratóriumi vonatkozásai ‐ Gyógyszer és ellenanyag szint meghatározása

Ajánlott algoritmus primer vagy szekunder hatásvesztés esetén

Gyógyszer és EA szint meghatározása

Terápiára nem reagálók

Optimális gyógyszerszint,Nincs EA

Optimális gyógyszerszint,Van EA

Szuboptimálisgyógyszerszint,Nincs EA

Szuboptimálisgyógyszerszint,Van EA

Nem TNF‐mediáltgyulladásos folyamat? Más terápiás lehetőség mérlegelése 

Álpozitív teszt , funkc. inaktív  / kis avidit. EA? (Funkcionális,neutralizációs teszt)

Nem EA mediáltfarmakokinetikai foly.Nagyobb dózis / gyakoribb adagolás

Gyógyszert neutralizáló specifikus EA

TNF gátló váltás

Bendtzen, K., Discovery Medicine, , 2013, 15 (83), 201‐211 

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!