Neue Einsatzmöglichkeiten von Polyphenoloxidasen und ... · Neue Einsatzmöglichkeiten von Polyphenoloxidasen und Peroxidasen zur Synthese von Hybrid-molekülen und Wirkstoffen und

Neue Einsatzmöglichkeiten von Polyphenoloxidasen

und Peroxidasen zur Synthese von Hybrid-

molekülen und Wirkstoffen und Entwicklung des

Gebiets der Kombinatorischen Biochemie

Prof. Dr. F. Schauer, Institut für Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald


Enzyme mit Fähigkeiten zur Kopplung von Substanzen und zur Herstellung von Hybridmolekülen

Polyphenoloxidasen Laccase

TyrosinasePeroxidasen

LigninperoxidaseManganperoxidaseMeerrettichperoxidase

Laccase

ein bekanntes pilzliches Enzymmit neuen biotechnologischen Anwendungen



Zählt zum extrazellulären, ligninolytischen Enzymsystem

von Weissfäulepilzen

Erstmals im Saft des japanischen Lac-Baumes

Toxicodendron verniciflua 1883 entdeckt

Nachweis in Pflanzen, Insekten, Bakterien und Pilzen

Vorkommen und natürliche Bedeutung der Laccase


Vorkommen und natürliche Bedeutung der Laccase

Meist extrazelluläres Glycoprotein

Ligninabbau

Konidienfärbung bei der Morphogenese in Pilzen

Zellwandbiosynthese in Pflanzen

Pigmentbildung und Cuticula-Härtung bei Insekten


Laccase = Polyphenoloxidase (EC 1.10.3.2)

Zur Gruppe der blauen Kupfer-Oxidasen gehörend

Oxidation zahlreicher phenolischer Verbindungen

Substratoxidation verbunden mit gleichzeitiger

Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser

Breites Substratspektrum

Unterschiedliche pH- sowie Temperatur-Optima

Merkmale der Laccase

Die Laccasereaktion - Bildung von Chinonen

Beispiel: Oxidation von Methoxyhydrochinon

1. Schritt: Bildung eines Phenoxy-Radikals

2. Schritt: nicht-enzymatische Disproportionierung unter Bildung vonMethoxy- p- Benzochinon.

O

O

OMe

OH

OH

OMe

+

OH

OH

OMe

OH

OMe

O

2 2Laccase, O2 spontan



Anwendungsmöglichkeiten der Laccase

Schadstoffeliminierung

Einsatz in der Lebensmittelindustrie

Herstellung von Verbundwerkstoffen

Biosensor- und Diagnostik-Anwendungen

Biokombinatorische Reaktionen


Am Institut für Mikrobiologie verfügbare Laccasen

Pycnoporus cinnabarinus Trametes villosaTrametes spec.

Myceliophthora thermophila

Nutzung der Laccasereaktion für eine gerichtete Produkt-bildung Patent PCP/EP 01/07152, 2001

Homologe Oligomerbildung

Heterologe Oligomerbildung

R

R

RRR

+2

R

+ + ReagensR

Reagens



Transformation von Umweltschadstoffen durch Laccase

O

OH

O

OH

O

OH2

2-Hydroxydibenzofuran

O

OHO

OH

O

OH

2

2-Hydroxydiphenylether


Schultz, A.; Jonas, U.; Hammer, E., ;Schauer, F. Dehalogenation of chlorinated hydroxybiphenyls by fungal laccaseAppl. Environ. Microbiol. 67 (2001) 4377-81

HO

Cl

HO

HOLaccase

3-Chlor-4-hydroxybiphenyl 3,3‘-Di-(4-hydroxybiphenyl)

2

Dechlorierung von 3-Chlor-4-hydroxybiphenyl durch Laccase


Beispiel einer homomolekularen Kopplung

Ciecholewski, S.; Hammer, E.; Manda, K.; Bose, G.; Nguyen, V. T. H.; Langer, P.; Schauer,F. Laccase-catalyzed carbon-carbon bond formation: oxidative dimerization of salicylic esters by air inaqueous solution. Tetrahedron 61 (2005) 4615-4619

OH

O

O

OH

O

OOH

O

O

2 Laccase

Salicylsäure-DerivateC-C-gekoppeltesDimerisationsprodukt


Einsatz von Laccase in der organischen Synthese

O

N

NH

NH

O

NNH2

ONH

*n

O

N

N

NH

NH

n

O

2

N-(2-Alkylamino-4-phenyl-imidazol-1-yl)-acetamid

Mikolasch, A.; Schauer, F.; (2003): Characterization of N-(2-alkylamino-4-phenylimidazol-1-yl)-acetamides in kinetic studies byusing cells and laccase from Trametes versicolor. J. Basic Microbiol. 43, 508-521


Laccasevermittelte Biotransformationen

dihydroxylierteraromatischer

Reaktionspartner

Fungizide

NH

NN

R

NH

N

R

R

Zytostatika

N NH

N

R

R

N

N

N

R

RAnthelminthika

NH

NR

R

Aminosäuren

R

NH2O

OH

Naturstoffderivate

N

NH2 O

R

OHR

R

R

+

+ +

++


Nutzung der Laccasereaktion für eine gerichtete Produktbildung

Laccasesubstrate

Aromaten mit 2 ortho-ständigenHydroxygruppenAromaten mit 2 para-ständigenHydroxygruppen Ligninbausteine oder Biaryl-verbindungen mit 1 Hydroxygruppe

Tausende von Reaktionsmöglichkeiten über C-C, C-O, C-N und C-S- Kopplung

Reaktionspartner

Aromaten mit 2 ortho-ständigen oder 2para-ständigen OH-Gruppen

Hydroxygruppen tragendeVerbindungen

Aminogruppen tragende Verbindungen

Thiogruppen tragende Verbindungen

Beispieltransformation eines Wirkstoffes

Hydrokaffeesäure

Hexylamin Hydrokaffee-säure

1,2,4-Tri-hydroxybenzen

2-Aminobenzoe-säure

3-Aminobenzoe-säure 4-Aminobenzoe-

säure

1 Produkt 1 Produkt

>3 Produkte>5 Produkte1 Produkt

1 Produkt



Laccase als Katalysator für eine Derivatisierung von aromatischen Aminen

OH

OH

R3R1

R2

NH2

R4

O

ONH

R4

R1 R3

R2

O

ONH

NH

R3

R3

R2

R3

+

alkylierte para-Hydrochinone

4-Aminobenzoesäurederivate,para-substituierte Aniline

2,5-Dihydroxybenzoesäurederivate

4-Aminobenzoesäurederivate,para-substituierte Aniline


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 25 50 75 1000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 25 50 75 1000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 25 50 75 1000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 25 50 75 100

Kon

zent

ratio

n [ µ

mol

/ m

l ]

Zeit [min]

Substrate: 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid (■), 4-Aminobenzoesäure ( )Produkt: 2-(4'-Carboxy-anilino)-N-(2''-hydroxyethyl)-3,6-dioxo-1,4-cyclohexadien-1-carboxamid (▲)

Kinetik des Laccase-vermittelten Substratverbrauchs


Ausgangsstoffe und Laccase in entsprechenden Puffersystemen pH 5,0 oder pH 7,0,

mit Substraten in Gegenwart von Sauerstoff inkubieren

Erfassung der Produktbildung mittels HPLC ( oftmals mit Farbveränderung verbunden)

Aufarbeitung über Festphasenextraktion

Strukturaufklärung gebildeter Produkte mittels GC, GC-MS, LC-MS-NMR-Kopplung

Versuchsoptimierung und Maßstabsvergrößerung

Durchführung von Laccase-Umsetzungen

Bedarf an neuen bioaktiven Substanzen

Wirkstoff-ForschungMedizinVeterinärmedizinPflanzenschutz

MaterialwissenschaftenKatalyseKosmetik


Quellen neuer Wirkstoffe Effizienz

Naturstoffscreeningchemische Synthese kombinatorische ChemieBiotransformation

14

33001-10

ca. 1000Biokombinatorik


Biologisches Derivatisierungs-verfahren für Wirkstoffe unter Einsatz des BiokatalysatorsLaccase

Gewinnung des Enzyms mit breitem Substratspektrum ausWeißfäulepilzen

Pycnoporus cinnabarinus,Zinnoberroter Zunderschwamm



Derivatisierung von Wirkstoffen mittels Laccase

Dihydroxylierte oder monohydroxylierte aromatische Verbindungen als

Laccasesubstrat

Radikalisierung des Substrates durch Laccasezusatz

Reaktion des radikalisierten Laccasesubstrates mit Wirkstoffgrundstrukturen

(z.B. Aminogruppen tragend)

Entstehung eines neuen potentiellen Wirkstoffes

OH

OH

R

R

Wirkstoff-grundstruktur

+ Laccase neues Wirkstoff-derivat


Laccase als Katalysator für eine Derivatisierung von Antibiotika

Wirkstoff A / Substrat A + Wirkstoff B Wirkstoff AB

OH

OH

R1

NH2

R3

O

O

R1

R2 R2NHR3

+

ß-Lactame,Amino-glycoside

2,5-Dihydroxybenzoesäure-Derivate, alkyliertepara-Hydrochinone


Testung der Wirkstoffeigenschaften

Antimikrobielle Testung in vitrogramnegative Keime: Escherichia coli

grampositive Keime: Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis

ZytotoxizitätAntimikrobielle Wirksamkeit in vivoInfektionsmodell „mit Staphylococcus aureus infizierte Maus“

Vorteile der biokombinatorischen Derivatisierung

Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen innerhalb kurzer Zeit

Breites Substratspektrum der Enzyme

Hohe Umsatzgeschwindigkeit und Substratumsätze

Umsatz von empfindlichen Naturstoffen möglich (RT, Normaldruck, etc.)

Verknüpfung von Wirksubstanzen möglich

Reaktion ohne chemische Katalysatoren, Lösungsmittel,etc.

Leichte Enzymgewinnung, hohe Enzymstabilität



Derivatisierung von Aminosäuren mittels Laccasen

2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid

+ NH

O

OH

OH

OH

L-Tryptophan

NH2

O

NH

OH

Kopplungsprodukt

O

O

NH

NH

O

OH

NH

O

OH


Transformation von 2,3-Dimethylhydrochinon und L-Phenylalanin mittels Laccase

Derivatisierung von Phenylalanin mittels Laccase

OH

OH

O

O2,3-Dimethyl-hydrochinon

2,3-Dimethyl -benzochinon

O

O

NH

COOH

DMHC + PHE - P1

COOHNH2+

-2H+

L-Phenylalanin-2H+, -2e-


Kopplungsversuche zur Entwicklung neuer Kleb-stoffe auf Strukturbasis von MAP`s

MAP`s = mussel adhesive proteins

Enzymatische Vernetzung von Peptidsequenzen

Beispiel


Beispiele für Anwendungen derKombinatorischen Biokatalyse mittels Laccasen

Herstellung von Funktionsmusternentsprechend dem Patent "Biologisch aktive Verbindungen aus G. pfeifferi" Ganomycin Gesellschaft für biomedizinischeForschung mbH Greifswald

Derivatisierung von Antibiotika

Landesforschungsschwerpunkt (LFS)Anwendungsoptimierung neuer Wirkstoffeund Biomaterialien durch Derivatisierungund Strukturveränderung mittels Laccasen

Derivatisierung von AminosäurenDerivatisierung von N-analogenCorollosporinen

Technologieberatungsinstitut (TBI)Untersuchungen zur Erweiterung des Anwendungsspektrums Laccase-vermittelter biokombinatorischer Reaktionen

Derivatisierung von Purinen undPyrimidinen (Zytostatika)Derivatisierung von Imidazolen undTriazolen (Antimykotika)

Riemser Arzneimittel AGStiftung Industrieforschung (SIF)Verbesserung der Anwendungseigenschaftenvon Wirkstoffen durch Biotransformation

Derivatisierung von 4-Hydroxyprolin Derivatisierung von aromatischen Aminen und aliphatischen Aminen

Zusammenfassung einiger Vorteile des Einsatzes von Laccasen


Breites Substratspektrum (ca. 200 Substrate)Reaktion mit Tausenden von Nicht-Laccase-Substratenhohe Enzymstabilitätaußer O2 keine Cofaktoren erforderlichEnzymproduktion im technischen Maßstab bereits möglichEnzymreaktoren in der Entwicklungsphasebreite mögliche Anwendungsgebiete: Organische Synthese,C-C-Kopplungen, Protein-Modifizierung, Oligomerisierungen, Polymer-Chemie,Umsatz und Derivatisierung von hochempfindlichen Natur- und Wirkstoffen möglich.

Forschungsbedarf: Für welche Reaktionen kann die kombinatori-sche Biochemie als umweltfreundliches Syntheseverfahren konkretnutzbar gemacht und ökonomisch sinnvoll eingesetzt werden?

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