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PHYSIQUE CELLULAIREIntroduction à la Neurobiologie

-2-Potentiel d’action et canaux ioniques

Jean-Pierre HENRY 18 Février 2010

Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique

• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963

• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991

• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003



Travaux commencés à Cambridge en 1930et publiés en 1952

Andrew Huxley est le demi-frère d’AldousHuxley (Le meilleur des mondes)



Un matériel d’étude privilégié:l’axone de calmar

• Le calmar possède une axonegéant impliqué dans le réflexede fuite

• Le diamètre est de 0,5 mm• Plus le diamètre est grand, plus

la conduction de l’influx estrapide

La préparation utilisée• A l’aide d’un rouleau en

caoutchouc, on peutextruder le milieuintracellulaire, puisperfuser avec un milieusalin

• On peut introduire uneélectrode dans leneurone; la préparationest équipotentielle (pasde propagation)

• Par dépolarisation, onobtient des centainesde potentiels d’action,identiques à ceux duneurone initial

(Kuffler et Nicholls (1976)

Origine du potentiel de repos

385A-

-6056052Cl-+5544050Na+

-7520400K+

mVmMmM

PotentieldeNernst

Milieuexterne

CytoplasmeIon

•Le potentiel de repos (Vi - Vo) est de - 70 mV, voisin du potentiel deNernst de K+

•Le potentiel de repos est fixé par la perméabilité aux ions de lamembrane•La perméabilité à K+ est dominante

Origine du potentiel de repos

• Si on varie laconcentration de K+

extracellulaire, le potentielde repos varie

• Mais il s’écarte de la loi deNernst à bassesconcentrations

Origine du potentiel de repos• La membrane n’est pas seulement perméable à K+

• Il y a un courant entrant faible, associé à une faibleperméabilité à Na+

• A l’équilibre, le courant sortant I K+ est égal aucourant entrant I Na+

• Les ions Cl- se répartissent en fonction du potentielcréé par les cations

• Le potentiel réel est donné par l’équation deGoldman, Hodgkin et Katz! !

!

E = 59logPk Ko[ ] + PNa Nao[ ] + PCl Cli[ ]Pk Ki[ ] + PNa Nai[ ] + PCl Clo[ ]

La pompe à sodium

• L’existence de courants INa+ et IK+ impose la présence d’unepompe

• Dans la membrane, une ATPase utilise l’ATP intracellulaire pourexpulser 3 ions Na+

• La deuxième partie du cycle est le pompage de 2 ions K+

• La pompe polarise négativement l’intérieur de la cellule• Il n’y a jamais de correspondance intérieur:extérieur

La pompe à sodium

• Son activité est nécessaire pour maintenir les cellulesà un potentiel négatif

• Elle est présente dans toutes les cellules, nerveusesou non

• Son inhibition conduit à la mort cellulaire• Des substances végétales sont des inhibiteurs de la

pompe: ouabaïne et digitaline• Ces poisons ont été utilisés à petites doses comme

stimulants cardiaques• Le « découvreur » de la Na,K ATPase, JC Skou a

reçu le Prix Nobel en 1997

Le potentiel d’action:hypothèse de base (1)

• Un potentiel d’action estobtenu par dépolarisation

• Au delà d’un seuil, lepotentiel monte rapidement àdes valeurs positives, puisdiminue

• Les valeurs atteintes sontproches du potentiel deNernst de Na+

• On peut faire l’hypothèsed’une augmentation de laperméabilité au Na+, induitepar la dépolarisation (B)

Le potentiel d’action:hypothèse de base (2)

• L’augmentation de laperméabilité à Na+ induit uncourant entrant

• Ce courant entrant augmentela dépolarisation

• En C, un deuxièmeévénement augmente laperméabilité relative au K+ etpermet la restauration desconditions initiales

• Ceci nécessite que lesgradients ioniques ont étépeu modifiés pendant lepotentiel d’action

Circuit électrique équivalent à un élémentde membrane

• Les perméabilités sontéquivalentes à un générateur(gradient ionique) et uneconductance en série

• La membrane a une capacitéC

• Vm est le potentielmembranaire

• Les conductances gK et gNasont variables avec lepotentiel Vm

Formulation électrique du potentield’action

• Les éléments de basesont:

• Une augmentationexplosive de laconductance Na+

• Une augmentationdécalée de laconductance K+

Mesures expérimentales:le voltage-clamp

• La difficulté vient du lienentre conductance etpotentiel

• On impose un potentiel etun amplificateur mesure ladifférence entre ce potentielet Vm

• Il injecte un courant pourque cette différencedisparaisse

(Hodgkin et al(1952) JPhysiol,116, 424)

Les résultats (1)

• On dépolarise depuis- 65 mV de 56 mV

• On observe 3 phases• Courant capacitatif

rapide• Courant entrant

transient• Courant sortant

retardé

Les résultats (2)

• La même expérience (A)est faite en supprimant lesions Na+ dans le milieuextérieur

• Le courant entrant estsupprimé et seul subsiste lecourant K+ (B)

• Par différence, on obtient lecourant Na+ (C )

Les toxines, des outils pharmacologiquesprécieux

• Le Fugu (tétrodon) est un poissonconsommé au Japon

• Mal préparé, il est mortel (plusieursdizaines des cas/an)

• Il contient une toxine,tétrodotoxine, bloquant les canauxNa+

Séparation pharmacologique

• Courants obtenus pardépolarisations à différentesvaleurs

• A, courants complexes• B, traitement par la

tétrodotoxine: seuls les courantssortants (K+) sont visibles

• C, Lavage• D, traitement par le TEA, un

bloquant des canaux Na+

Exploitation des résultats

• Les conductances Na+ et K+

ont été mesurées à toutevaleur du potentiel imposé

• On remarque quel’augmentation de laconductance Na+ esttransitoire: elle est suivied’une inactivation

• Des équations empiriquesdécrivant ces comportementsont été établies

Exploitation des résultats

• A partir des équations empiriques, il est possible de retrouverla forme du potentiel d’action avec une bonne exactitude

Le Modèle Hodgkin-Huxley décrit bien lepotentiel d’action

• L’existence d’un seuil critique correspond au point oùles courants entrants l’emportent sur les courantssortants

• L’existence d’une valeur maximale correspond àl’ouverture différée des canaux K+

• Après un potentiel d’action, il y a une périoderéfractaire où une dépolarisation est inefficace

• Cette période réfractaire est due à la conductance gKtoujours ouverte

Propagation du potentiel d’action

• Les charges positivesentrantes (Na+) déchargentla capacité membranaire, depart et d’autre

• Cela induit unedépolarisation qui au seuilamorce le potentiel d’action

• Propagation dans les deuxsens

Vitesse de propagation

• Elle dépend des propriétés de cable de l’axone:résistances axiale et membranaire, capacité de lamembrane

• La vitesse augmente si le diamètre augmente(diminution de la résistance axiale)

• La vitesse de propagation varie de 1 à 100 m/s.• Les vitesses élevées s’observent dans les neurones

de fort diamètre• Dans les neurones myélinisés, l’axone est « isolé » et

la conduction est rapide et saltatoire.

Neurone myélinisé

• Une cellule, dite gliale,s’enroule autour de l’axone

• Cette cellule a unemembrane riche en uneprotéine hydrophobe, lamyéline

• Le long de l’axone la gainede myéline s’interrompt àdes points réguliers, lesnœuds de Ranvier

Conduction saltatoire

• La gaine de myeline agit comme un isolant limitant lesmouvements de charge

• La dépolarisation progresse par saut jusqu’auxnœuds de Ranvier où le potentiel d’action apparait

Conclusions

• Les potentiels de repos sont dus à:– l’existence de gradients ioniques et pompes– des différences de perméabilité entre les ions

• Le potentiel d’action est dû à:– La variation de conductance/perméabilité avec le potentiel– Na+ et K+ sont des « canaux excitables »

• La conductance Na+ augmente avec la dépolarisationet s’inactive très rapidement

• La conductance K+ augmente avec la dépolarisation• La théorie de Hodgkin-Huxley ne préjuge pas des

mécanismes: transporteurs ou canaux





Un exemple de transport d’ion partransporteur: la valinomycine

• La valinomycine est un peptide cyclique extrait de champignons• Sa couronne (résidus hydrophobes) lui permet de s’insérer dans

une bicouche• Les radicaux cabonyl chélatent spécifiquement un ion K+• La vitesse de passage est de l’ordre de 104 ions/s

Val Val

Val-K+ Val-K

+

K+

membrane

K+

Valinomycin

O

O O

O O

Hydrophobic

O

K+

Le « patch-clamp » permet de mesurerl’activité d’un canal unique

• Le principe est d’isoler àl’extrémité d’une micropipetteun fragment de membraneportant des canaux ioniques

• Plusieurs solutions existent• Le scellement entre la

membrane cellulaire et lapipette a une résistance del’ordre du Gigaohm

• On mesure le courantpassant à travers le fragmentmembranaire à V constant

(Hamill et al (1981) Pfugers Arch,391, 85)

Exemples d’enregistrement de canauxuniques

• On observe des transitions entre 2 niveaux, représentant lecanal ouvert ou fermé (en D, canal double)

• A et B sont des canaux K+, C un canal Na+ et D un canal Cl-

Exploitation des donnéesexemple d’un canal dimérique

• Tracé à différents potentiels• Mesure de la conductance• Mesure de la probabilité

des états en fonction dupotentiel imposé

(Thieffry et al (1988) EMBO J,7, 1449)

Canal Na+ de l’axone de calmar

• En haut, canaux unitaires enréponse à une dépolarisation

• Remarquez l’inactivation rapide• En bas, les enregistrements

d’une centaine de canaux ontété moyennés

• L’enregistrement moyennécorrespond au courant entrantobservé macroscopiquement

• Un courant de 1 pA correspondà 6 x 106 ions/s

Canal K+ de l’axone de calmar

• En haut, enregistrement decanaux individuels

• En bas, moyennage d’unecentaine de canaux,analogue au courantmacroscopique

• On n’observe pasd’inactivation dans l’échellede temps observée

• Remarquez l’ouverture lentedu courant moyenné

Conductance des canaux Na+

• Les mesures permettent d’obtenir la conductance ducanal et sa densité surfacique

• D’autres canaux Na+ ont été analysés• Pour le canal K+ de neurone de calmar, γ = 6 pS avec

une densité de 70

Sélectivité des canaux Na+

• La perméabilité relativepar rapport au Na+ a étémesurée pour unensemble d’ions pour lesdifférents canaux

• D’une manière générale,la sélectivité est voisinede 20

• Pour les canaux K+, lasélectivité est de 100

Questions et réponses

• L’étude des canaux uniques permet de retrouver lespropriétés macroscopiques (activation par lepotentiel, inhibition, sélectivité)

• Comment expliquer l’efficacité du transfert (voisin deslimites de la diffusion) et la grande sélectivité?

• Les différents canaux Na+ et surtout K+(plusieursdizaines, avec des propriétés différentes)correspondent-ils à des espèces moléculairesdifférentes?

• Nécessité de caractériser biochimiquement lescanaux

Clonage des canaux Na+ et K+:Isolement des gènes et production de la protéine

• Canal Na+:– Purification de la protéine à l’aide des toxines (TTX)– Isolement du gène chez la torpille (laboratoire de Shosaku

Numa, 1984)

• Canal K+:– Analyse de mutants chez la drosophile– Le mutant shaker correspond à un canal K+ (laboratoire de

Jan,1987)

Le canal Na+ (sous-unité α)

• Une très grosse chaîne polypeptidique (plus de 2000résidus)

• Nombreuses traversées de la membrane cellulaire (24)• Un domaine répété 4 fois, contenant 6 hélices trans-

membranaires

Les canaux K+

• La canal shaker possède 6hélices transmembranaires

• Les 6 hélices sont organiséescomme un domaine du canal Na

• Le canal K est composé de 4sous-unités identiques

• D’autres canaux K ont 2, 3, 4, 5hélices dans leurs sous-unités

• Les 2 hélices blanches (5 et 6)représentent la structureminimum des canaux de cettefamille (sensible au potentiel)

La famille des canaux sensible aupotentiel

• Plus de 140 membres (Yu et al, 2005, PharmacolRev, 57, 387)

Propriétés moléculaires des canauxexcitables

• Les canaux appartiennent à une même grandefamille

• La structure minimale est composée de 4 sous-unitéscomportant chacune 2 hélices trans-membranaire

• Le canal Na est vraisemblablement plus jeune,résultant d’une fusion de gènes

• Tous les canaux K possèdent une séquencecommune de 8 acides aminés, placée entre leshélices 5 et 6: c’est la signature des canaux K

Propriétés fonctionnelles des protéinesrecombinantes

• Le « truc » le plus populaire estd’introduire le « gène » (ARN)dans un ovocyte de grenouille(Xenopus)

• Cette cellule exprime la protéine(canal) dans sa membrane

• On peut alors mesurer l’activitéélectrique par « patch-clamp »ou « voltage-clamp »

• Le gène peut être manipulé pourtester des protéines mutantes ouchimérique

• Par exemple, le changementd’un acide aminé donne un canalNa résistant à la TTX





Roderick MacKinnon

• Initialement formé comme électrophysiologiste,MacKinnon, après 10 ans de recherche, décide à 42ans, sans expérience de s’intéresser à la structureatomique des canaux K, avec une petite équipe

• Chez les bactéries, des protéines membranairesportent la signature des canaux K.

• Il entreprend la cristallisation du canal KcsA, deStreptomyces lividans, dont la sous-unité necomporte que 2 segment trans-membranaires

L’hypothèse initiale

• D’après des expériences demutagénèse faites sur lecanal à 6 segments trans-membranaires, la boucleentre les segments 5 et 6 estimportante pour la sélectivité

• Cette boucle serait repliée àl’intérieur du pore

Structure atomique de KcsA

• Le canal est vu de côté, lamembrane est coupée

• Seules les hélices 6(extérieure) et 5 (intérieure)de 2 sous-unités sontmontrées

• Les densités dans l’axe sontdes ions K+

• Le canal est fermé; letroisième K+ est dans unecavité centrale

(Doyle et al, 1998, Science,280, 69)

Extérieur de la cellule

Cytoplasme

Le problème de la sélectivité est résolu

• Analyse plus fine des cations dansla protéine

• 4 cations deshydratés sont visiblesà l’intérieur du canal

• Un cinquième est rehydraté dans lacavité

• La deshydratation est possible carles 4 ions sont coordinés à descarbonyl de la protéine

• La coordination du Na+ deshydratéest impossible

• Le Na+, bien que plus petit, nepasse pas

(Zhou and MacKinnon, 2004, Biochemistry,338, 839)

Vue du canal en coupe: extérieur

Structure d’un canal K+ bactérien ouvert

• Canal de Methanobacterthermoautotrophicum (MthK)

• A, MthK, Transmembranaires 5 et6 de deux sous-unités; le canalouvert est au milieu

• B, KcsA : même échelle, le canalest fermé

• C, Superposition de A et B: lafermeture est due à undéplacement de la partiecytosolique de l’hélice6

• D, vue du dessus; le canal est lapartie centrale

A C

B D

(Jiang et al, 2002,Nature,417, 523)

Le canal ouvert possède une cavitécentrale importante

• Le canal MthK est vu depuisle cytoplasme

• Le point vert est un ion K+

engagé dans le filtre desélectivité

• La cavité peut accueillir desmolécules de grande taille

• Ces molécules sont desbloquants

Potentiel électrique à travers lamembrane

• Le potentiel électrique a étécalculé pour KcsA (fermé) etMthK (ouvert)

• L’ouverture du canal diminueénormément la dépenseénergétique requise pour lefranchissement de lamembrane

Conclusion sur les canaux à 2 hélices:sélectivité et perméabilité

• 1- la cavité du canal ouvertdiminue l’épaisseur hydrophobeà franchir

• 3- la disposition des O descarbonyl permet unecomplexation sélective de K+

• 4- plusieurs ions en lignepeuvent occuper le filtre desélectivité

• 2- les charges négatives àl’extrémité de l’hélice stabilise lecation dans la cavité

Le problème de la sensibilité au potentiel

• Les canaux K+ sont sensibles au potentiel: ilspassent de fermés à ouverts en 50 mV

• Cela suppose un senseur de potentiel très chargé: aumoins 12 charges positives par canal

• Les canaux à 4 x 2 hélices sont insensibles• L’hélice 4 porte au moins 4 charges (Arg) selon le

type de canal: c’est un candidat senseur• En fait, les hélices 1 à 4 sont structuralement

indépendantes de 5 et 6 (pore)• On peut faire des chimères en échangeant ces 2

parties

Structure d’un canal K+ à 6 hélicestransmembranaires

• Ce canal est une chimèreentre deux canaux deneurones de rat

• Vue en coupe: le pore estdans la partie centrale

• Les charges positives(portées principalement parl’hélice 4) sont en rouge

• Les domaines H1 à H4 etH5H6 sont clairementindépendants

(Long et al, 2007, Nature, 450, 376)

Extérieur

Intérieur

Modèle de sensibilité au potentiel

• La structure obtenue est uncanal ouvert (a et c), b et dreprésentent la structurefermée hypothétique

• On postule un basculementde S4, portant les chargespositives

• Le mouvement transmis parl’hélice jaune appuie surl’hélice bleue S6 qui decoudée devient droite

• Le mouvement de S6 fermele pore

Résumé de la potentiel-dépendance

• Le modèle est en pagaïe (paddle): la pagaïe est l’hélice S4qui passe d’un côté à l’autre de la membrane; cemouvement est transmis au pore qui se ferme

• Le canal a les propriétés d’un transistor (F. Sigworth)

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