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Annual Meeting, DASNE; Wartburg / Eisenach 21. – 23.11.2018
R. Schüle, M. Synofzik
NGS – Befundinterpretation (Level 2)
Für Kliniker!
Einzelgen
Sanger Sequenzierung /
spezifische Technik
spezifischerPhänotyp
Next Generation Sequencing
variabler Phänotyp, viele Gene
disease panelswhole exome sequencing
(WES)
whole genome sequencing
(WGS)
2 - ~200 Genevariabel
25K Gene50 Mio Basen
25K Gene3.3 Mrd Basen
ü Was wurde überhaupt untersucht?
Befund mit 0-10 Varianten
ü Verständnis für den Prozess
ü Genetik liefert (meist) keine ja/nein Antwort
disease panelswhole exome sequencing
(WES)
whole genome sequencing
(WGS)
< 100 Varianten
40K Varianten 4 MioVarianten
?
Klinischer KontextGenetische Evidenz
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
Parkin-Mutation:
Chr6:162206852G>A (hg19)
Protein
Transkript (mRNA)
5‘ UTR 3‘ UTRCDS
Gen
Chromosom
PARK2: g.941952C>T
NM_004562.2: c.823C>T
NP_004553: p.R275Woder p.Arg275Trp
Modifiziert nach Katja Lohmann
Begriffsdefinition
Missense – Variante
Nonsense – Variante / Stop -Variante:
Splice - Variante:
Strukturelle Variante
Insertion/Deletion/Indel- Variante
ü Wird die Funktion des Proteins beeinträchtigt?
+++ (fs)
+++
+++
+++
?
ü Kausalität hieraus nicht ableitbar!
LOF
Austausch einer Aminosäure
Entstehung eines präterminalen Stop-Codons
Veränderung des Splicing, z.B. Exon-Skipping
Fehlen oder Hinzufügen von einer oder mehreren Basen; kann in frame oder out of frame sein
copy number variation (CNV), Deletion / insertionmehrerer Exone, …
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
Hypothese: Kausale Varianten für seltene Phänotypen sind selten
www.exac.broadinstitute.org
60,706 exome sequences
Disease specific and population genetic studies
Data freeze 2016
www.gnomad.broadinstitute.org
125,748 exome sequences / 15,708 whole-genome sequences
Disease specific and population genetic studies
Regularly updated
ü Minor allele frequency (MAF)<< 0.1% für dominante Erkrankungen<< 1% für rezessive Erkrankungen
ü Für seltene Phänotypen meist noch deutlich seltener!
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
In silico Prädiktions-Algorhithmen
Unterstützen in der Interpretation von Varianten
Sagen den Effekt von Varianten auf Aminosäure- oder Proteinebene voraus
2 Kategorien: Effekt von Missense-Varianten, Vorhersage von Splice-Effekten
Kriterien für Missense-Varianten: z.B. evolutionäre Konservierung, Kontext innerhalb des Proteins, biochemische Konsequenzen des Aminosäure-Austausches, …
Teilweise niedrige Spezifität
z.B. sift, Polyphen, CADD, MutationTaster
ü Algorithmen nutzen ähnliche Kriterien à keine additive Aussagekraft der Scores!
ü Cave vor Überinterpretation!
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
Funktionelle Analysen in Erkrankungsmodellen
z.B. ITPR1-Varianten: Effekt auf Kanalfunktion?
IP3-induzierter Calcium-Ausstrom in HEK293-Zellen
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
cis/trans(bei aut-rezessiv)
Kosegregation de novo
> 30% in cis! • Betroffene und Gesunde• bei aut-dom: mehrere Generationen
+ Familienzweige
Segregation
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp-und Mutation-Phänotyp –Beziehung
3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)
Fall 1
Fall 1: POLG p. Gly517ValGenetische Argumente
funktionell:
Mutationstyp? Vererbungsweg? Häufigkeit In silico Prädiktionen
è 80-90% wildtyp POLG Aktivität
Phänotypisches Spektrum POLG:
• von frühbeginnender Epilepsie mit Hepathopathie bis spätbeginnende Ataxie
• häufig (>90%) cPEO, oftmals der Ataxie vorausgehend
• selten (<1%) Spastik
J
LL
Cohen & Naviaux, 2010
Fall 1: POLG p. Gly517ValKlinische Argumente
Fall 2
11jähriger JungeLangam progrediente spastische ParapareseEM: frühe Kindheit
Familienanamnese: autosomal dominant
Klinische Diagnose: Autosomal-dominante Hereditäre Spastische Spinalparalyse (HSP)
SPAST:NM_014946.3:c.1567T>C:p.Cys523Arg
HSP-Panel (>150 Gene)
SPAST-Varianten sind für >50% aller AD HSPs verantwortlich!
SPAST:NM_014946.3:c.1567T>C:p.Cys523Arg
Genetische Evidenz
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
Missense Mutation
GnomAD: C: 4 / T: 249726 à MAF 1.6*10-5
MutationTaster: pathogenicCADD Score: 9.8PolyPhen: 0.001
Mutation in der funktionell relevanten AAA Domäne
Klinischer Kontext
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp-und Mutation-Phänotyp –Beziehung
3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)
ü Immer ALLE verfügbare Evidenz nutzen
T/T
T/C
Fall 3
Männlich, 41J, PalästinaProgrediente afferente Stand- und Gangataxie, links- und distal betonte Hypästhesie und schmerzhafte Parästhesien, symmetrische distale ParesenGeneralisiert schmächtige Muskulatur, MER ausgefallen
Elektrophysiologisch sensibel und beinbetonte axonale Polyneuropathie
MRT: langstreckige Verschmächtigung des Myelons
Klinische Verdachtsdiagnose: • Charcot-Marie-Tooth Erkrankung• Friedreich-Ataxie
Familienanamnese: Konsanguinität möglich (gleiches Dorf), Schwester mit MS diagnostiziert, habe ähnliche Symptome
Friedreich-Genetik: keine Repeat-Expansion im FXN-Gen
Exomsequenzierung (Forschung):
• GLA NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175Glu• UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser
NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175GluchrX:100656642G>T
GnomAD: MAF 1 / 183473 = 5.45 * 10-6
GLA
• GLA kodiert für alpha-Galactosidase• Mutationen verursachen M. Fabry, eine lysosomale Speichererkrankung
Genetische Evidenz
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
Missense-Mutation; hemizygot
In silico Prädiktionen: uneinheitlich
Keine funktionelle Evidenz vorhanden.
NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175GluchrX:100656642G>T
+ schmerzhafte Polyneuropathie- Keine Beteiligung von Niere, Herz, Haut- Keine Cornea verticillata
ü Diagnostischer Biomarker verfügbar!
GLA
Nicht möglich: Familie in Palästina
Alpha-Galactosidase Aktivität normwertig
Klinischer Kontext
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp- und Mutation-Phänotyp – Beziehung
3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)
Friedreich-Genetik: keine Repeat-Expansion im FXN-Gen
Exomsequenzierung (Forschung):
• GLA NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175Glu• UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser
UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>T
GnomAD: MAF 50 / 168234 = 2.97 * 10-4; hemizygot 14, homozygot 0
• UBQLN2 kodiert für ubiquilin-2, involved in proteosomal protein degradation• Mutationen verursachen ALS-FTD
Genetische Evidenz
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
Missense-Mutation; hemizygot
In silico Prädiktionen: uneinheitlich
Keine, aber: bekannte krankheitsverursachende Mutation (CM117623)!
UBQLN2
Human Gene Mutation Database (HGMD)
Deng et al. Nature 2011
UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>TUBQLN2
Klinischer Kontext
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp- und Mutation-Phänotyp – Beziehung
3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)
Deng et al. Nature 2011
Deng et al. Nature 2011
UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>TUBQLN2
Erkrankungsalter Tod nach X Monaten
ü Literatur kritisch prüfen!
Nicht möglich: Familie in Palästina
Keiner etabliert.
Klinischer Kontext
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp- und Mutation-Phänotyp – Beziehung
3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)
UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>TUBQLN2
Assoziation zu ALS gut belegt (Gen-Ebene)Schwache Assoziation zu ALS (Mutations-Ebene
Fall 4
Fall 4: KCNA1 p. Ille221Val
Frau Müller
Fall 4: KCNA1 p. Ille221ValGenetische Informationen
Was wurde gemacht?
Genetische Informationen
Nennung Gene fehlt
è keine Infos zu MAF, in silico Prädktionen, funktionelle Analysen, etc L
è p. Ile221Val• MAF: 0.03%• in silico Prädiktionen: CADD 0.07, Polyphen 0, Mutation Taster: benign• funktionelle Analysen: gibt keine
Fall 4: Klinische InformationenRe-Phänotypisierung klinischer Phänotyp:
• wirklich keine Ataxie, auch keine episodische
• wirklich kontinuierliche Paraspastik
• Paraspastik für KCNA1 nicht systematisch beschriebenL
Re-Phänotypisierung cMRT
L
Re-Phänotypisierung Labor-Biomarker
Genetische Evidenz Klinischer Kontext
1. Mutationstyp
2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)
3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)
4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)
1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)
2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp-und Mutation-Phänotyp –Beziehung
3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)