Annual Meeting, DASNE; Wartburg / Eisenach 21. – 23.11.2018

R. Schüle, M. Synofzik

NGS – Befundinterpretation (Level 2)

Für Kliniker!

Einzelgen

Sanger Sequenzierung /

spezifische Technik

spezifischerPhänotyp

Next Generation Sequencing

variabler Phänotyp, viele Gene

disease panelswhole exome sequencing

(WES)

whole genome sequencing

(WGS)

2 - ~200 Genevariabel

25K Gene50 Mio Basen

25K Gene3.3 Mrd Basen

ü Was wurde überhaupt untersucht?

Befund mit 0-10 Varianten

ü Verständnis für den Prozess

ü Genetik liefert (meist) keine ja/nein Antwort

disease panelswhole exome sequencing

(WES)

whole genome sequencing

(WGS)

< 100 Varianten

40K Varianten 4 MioVarianten

?

Klinischer KontextGenetische Evidenz

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

Parkin-Mutation:

Chr6:162206852G>A (hg19)

Protein

Transkript (mRNA)

5‘ UTR 3‘ UTRCDS

Gen

Chromosom

PARK2: g.941952C>T

NM_004562.2: c.823C>T

NP_004553: p.R275Woder p.Arg275Trp

Modifiziert nach Katja Lohmann

Begriffsdefinition

Missense – Variante

Nonsense – Variante / Stop -Variante:

Splice - Variante:

Strukturelle Variante

Insertion/Deletion/Indel- Variante

ü Wird die Funktion des Proteins beeinträchtigt?

+++ (fs)

+++

+++

+++

?

ü Kausalität hieraus nicht ableitbar!

LOF

Austausch einer Aminosäure

Entstehung eines präterminalen Stop-Codons

Veränderung des Splicing, z.B. Exon-Skipping

Fehlen oder Hinzufügen von einer oder mehreren Basen; kann in frame oder out of frame sein

copy number variation (CNV), Deletion / insertionmehrerer Exone, …

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

Hypothese: Kausale Varianten für seltene Phänotypen sind selten

www.exac.broadinstitute.org

60,706 exome sequences

Disease specific and population genetic studies

Data freeze 2016

www.gnomad.broadinstitute.org

125,748 exome sequences / 15,708 whole-genome sequences

Disease specific and population genetic studies

Regularly updated

ü Minor allele frequency (MAF)<< 0.1% für dominante Erkrankungen<< 1% für rezessive Erkrankungen

ü Für seltene Phänotypen meist noch deutlich seltener!

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

In silico Prädiktions-Algorhithmen

Unterstützen in der Interpretation von Varianten

Sagen den Effekt von Varianten auf Aminosäure- oder Proteinebene voraus

2 Kategorien: Effekt von Missense-Varianten, Vorhersage von Splice-Effekten

Kriterien für Missense-Varianten: z.B. evolutionäre Konservierung, Kontext innerhalb des Proteins, biochemische Konsequenzen des Aminosäure-Austausches, …

Teilweise niedrige Spezifität

z.B. sift, Polyphen, CADD, MutationTaster

ü Algorithmen nutzen ähnliche Kriterien à keine additive Aussagekraft der Scores!

ü Cave vor Überinterpretation!

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

Funktionelle Analysen in Erkrankungsmodellen

z.B. ITPR1-Varianten: Effekt auf Kanalfunktion?

IP3-induzierter Calcium-Ausstrom in HEK293-Zellen

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

cis/trans(bei aut-rezessiv)

Kosegregation de novo

> 30% in cis! • Betroffene und Gesunde• bei aut-dom: mehrere Generationen

+ Familienzweige

Segregation

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp-und Mutation-Phänotyp –Beziehung

3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)

Fall 1

Fall 1: POLG p. Gly517ValGenetische Argumente

funktionell:

Mutationstyp? Vererbungsweg? Häufigkeit In silico Prädiktionen

è 80-90% wildtyp POLG Aktivität

Phänotypisches Spektrum POLG:

• von frühbeginnender Epilepsie mit Hepathopathie bis spätbeginnende Ataxie

• häufig (>90%) cPEO, oftmals der Ataxie vorausgehend

• selten (<1%) Spastik

J

LL

Cohen & Naviaux, 2010

Fall 1: POLG p. Gly517ValKlinische Argumente

Fall 2

11jähriger JungeLangam progrediente spastische ParapareseEM: frühe Kindheit

Familienanamnese: autosomal dominant

Klinische Diagnose: Autosomal-dominante Hereditäre Spastische Spinalparalyse (HSP)

SPAST:NM_014946.3:c.1567T>C:p.Cys523Arg

HSP-Panel (>150 Gene)

SPAST-Varianten sind für >50% aller AD HSPs verantwortlich!

SPAST:NM_014946.3:c.1567T>C:p.Cys523Arg

Genetische Evidenz

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

Missense Mutation

GnomAD: C: 4 / T: 249726 à MAF 1.6*10-5

MutationTaster: pathogenicCADD Score: 9.8PolyPhen: 0.001

Mutation in der funktionell relevanten AAA Domäne

Klinischer Kontext

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp-und Mutation-Phänotyp –Beziehung

3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)

ü Immer ALLE verfügbare Evidenz nutzen

T/T

T/C

Fall 3

Männlich, 41J, PalästinaProgrediente afferente Stand- und Gangataxie, links- und distal betonte Hypästhesie und schmerzhafte Parästhesien, symmetrische distale ParesenGeneralisiert schmächtige Muskulatur, MER ausgefallen

Elektrophysiologisch sensibel und beinbetonte axonale Polyneuropathie

MRT: langstreckige Verschmächtigung des Myelons

Klinische Verdachtsdiagnose: • Charcot-Marie-Tooth Erkrankung• Friedreich-Ataxie

Familienanamnese: Konsanguinität möglich (gleiches Dorf), Schwester mit MS diagnostiziert, habe ähnliche Symptome

Friedreich-Genetik: keine Repeat-Expansion im FXN-Gen

Exomsequenzierung (Forschung):

• GLA NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175Glu• UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser

NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175GluchrX:100656642G>T

GnomAD: MAF 1 / 183473 = 5.45 * 10-6

GLA

• GLA kodiert für alpha-Galactosidase• Mutationen verursachen M. Fabry, eine lysosomale Speichererkrankung

Genetische Evidenz

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

Missense-Mutation; hemizygot

In silico Prädiktionen: uneinheitlich

Keine funktionelle Evidenz vorhanden.

NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175GluchrX:100656642G>T

+ schmerzhafte Polyneuropathie- Keine Beteiligung von Niere, Herz, Haut- Keine Cornea verticillata

ü Diagnostischer Biomarker verfügbar!

GLA

Nicht möglich: Familie in Palästina

Alpha-Galactosidase Aktivität normwertig

Klinischer Kontext

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp- und Mutation-Phänotyp – Beziehung

3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)

Friedreich-Genetik: keine Repeat-Expansion im FXN-Gen

Exomsequenzierung (Forschung):

• GLA NM_000169.2: c.525C>A, p.Asp175Glu• UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser

UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>T

GnomAD: MAF 50 / 168234 = 2.97 * 10-4; hemizygot 14, homozygot 0

• UBQLN2 kodiert für ubiquilin-2, involved in proteosomal protein degradation• Mutationen verursachen ALS-FTD

Genetische Evidenz

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

Missense-Mutation; hemizygot

In silico Prädiktionen: uneinheitlich

Keine, aber: bekannte krankheitsverursachende Mutation (CM117623)!

UBQLN2

Human Gene Mutation Database (HGMD)

Deng et al. Nature 2011

UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>TUBQLN2

Klinischer Kontext

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp- und Mutation-Phänotyp – Beziehung

3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)

Deng et al. Nature 2011

Deng et al. Nature 2011

UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>TUBQLN2

Erkrankungsalter Tod nach X Monaten

ü Literatur kritisch prüfen!

Nicht möglich: Familie in Palästina

Keiner etabliert.

Klinischer Kontext

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp- und Mutation-Phänotyp – Beziehung

3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)

UBQLN2 NM_013444.3: c.1573C>T, p.Pro525Ser chrX:56591879C>TUBQLN2

Assoziation zu ALS gut belegt (Gen-Ebene)Schwache Assoziation zu ALS (Mutations-Ebene

Fall 4

Fall 4: KCNA1 p. Ille221Val

Frau Müller

Fall 4: KCNA1 p. Ille221ValGenetische Informationen

Was wurde gemacht?

Genetische Informationen

Nennung Gene fehlt

è keine Infos zu MAF, in silico Prädktionen, funktionelle Analysen, etc L

è p. Ile221Val• MAF: 0.03%• in silico Prädiktionen: CADD 0.07, Polyphen 0, Mutation Taster: benign• funktionelle Analysen: gibt keine

Fall 4: Klinische InformationenRe-Phänotypisierung klinischer Phänotyp:

• wirklich keine Ataxie, auch keine episodische

• wirklich kontinuierliche Paraspastik

• Paraspastik für KCNA1 nicht systematisch beschriebenL

Re-Phänotypisierung cMRT

L

Re-Phänotypisierung Labor-Biomarker

Genetische Evidenz Klinischer Kontext

1. Mutationstyp

2. Häufigkeit in der Normalbevölkerung(z.B. GnomAD, ExAC)

3. In silico Prädiktionen(z.B. CADD, sift, …)

4. Funktionelle Analysen(in Modellsystemen)

1. Segregationsanalyse(cis/trans, Co-Segregation, de novo)

2. Evidenzlage zu Gen-Phänotyp-und Mutation-Phänotyp –Beziehung

3. Diagnostische Marker(z.B. Klinik, MRI, Biomarker, etc.)