nIRECTION DE LENVIRONNEMENT ET DE LAMENAGEMENT LfITORAL

ESSAIS DE DECROCHAGE DE BACTERIES

DE SEDIMENTS COTIERS

PAR ACTION CHIMIQUE ET PHYSIQUE

DERRIEN A DUPRAY E CAPRAIS MP

DEL -lABORATOIRE MICROBIOLOGIE

DEL 9212

IFREMER-DEROIEL

II~ 111111111 111111111111111 11111 1111 OEL04439

IFREMER Centre de BREST SDP BP 70 29280 PLOUZANE Teacutel 98224040 Teacutelex 940 627

DIRECTION DE L E~VIRONNENE)lT ET DE Lf~~NAGEMENT LITTORAL (DEL)

Laboratoire de Microbiologie

ALlTEUR (S ) DERRIEN A DUPRAY E CAPRAIS MP

CODE

Ndeg DEL 2212

TITRE ESSAIS DE DECROCHAGE DE BACTERIES DE SEDIMENTS COTIERS PAR ACTION CBIMIQUE ET PHYSIQUE

Date Mars 1992

Tirage nb 20

CONTRAT (intituleacute)

Ndeg

DIFFUSION

Libre X Restreinte Confidentielle

RESUME

Min dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes du seacutediment nous avons testeacute diffeacuterentes meacutethodes physiques et chimiques pour relarguer les bacteacuteries des particules Une eacutetude preacuteliminaire a permis de deacutefinir des concentrations et des temps daction non toxiques pour des bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire

Les diffeacuterentes techniques testeacutees ne permettent daugmenter la numeacuteration dans le meilleur des cas (action du lauryl sulfate de sodium) que dune demi uniteacute log

ABSTRACT

Mots-cleacutes Bacteacuteries seacutediments adheacutesion techniques de deacutecrochage

Key words

rrREJlIlER

1

IFREMER Centre de BREST SDP BP 70 29280 PLOUZANE Teacutel 98224040 Teacutelex 940 627

DIRECTION DE L E~VIRONNENE)lT ET DE Lf~~NAGEMENT LITTORAL (DEL)

Laboratoire de Microbiologie

ALlTEUR (S ) DERRIEN A DUPRAY E CAPRAIS MP

CODE

Ndeg DEL 2212

TITRE ESSAIS DE DECROCHAGE DE BACTERIES DE SEDIMENTS COTIERS PAR ACTION CBIMIQUE ET PHYSIQUE

Date Mars 1992

Tirage nb 20

CONTRAT (intituleacute)

Ndeg

DIFFUSION

Libre X Restreinte Confidentielle

RESUME

Min dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes du seacutediment nous avons testeacute diffeacuterentes meacutethodes physiques et chimiques pour relarguer les bacteacuteries des particules Une eacutetude preacuteliminaire a permis de deacutefinir des concentrations et des temps daction non toxiques pour des bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire

Les diffeacuterentes techniques testeacutees ne permettent daugmenter la numeacuteration dans le meilleur des cas (action du lauryl sulfate de sodium) que dune demi uniteacute log

ABSTRACT

Mots-cleacutes Bacteacuteries seacutediments adheacutesion techniques de deacutecrochage

Key words

rrREJlIlER

1

SOMMAIRE

INTRODUCIION middot bull S

1 - ETUDE DE LA TOXICITE DES TECHNIQUES UTILISEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES S

11 Souches bacteacuteriennes S

12 Traitements physiques 7

121 Protocole 7 122 Reacutesultats 7 123 Conclusion 8

13 Produits chimiques testeacutes 9

131 Protocole 9 132 Reacutesultats 10 133 Conclusion 11

n - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT 11

21 Mateacuteriel et meacutethodes 11

22 Reacutesultats middot 11

ESSAI Ndeg 1 middot 12 ESSAI Ndeg 2 middot 12 ESSAI Ndeg 3 middot 13 ESSAI Ndeg 4 middot 14 ESSAI ~ 5 14 ESSAI Ndeg middot lS ESSAI Ndeg 7 1S

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION 16

BmUOGRAPHIE ~ 18

5

INTRODucnON

Dans le cadre de diffeacuterentes eacutetudes notamment du projet rejets urbains nous avons eacutetudieacute la population bacteacuterienne de seacutediments cocirctiers vase ou sable La majoriteacute des bacteacuteries dans un tel eacutecosystegraveme adhegravere aux particules Le meacutecanisme dadheacutesion fait intervenir un reacuteseau de fibres polysaccharidiques seacutecreacuteteacutees par la bacteacuterie le glycoca1yx permettant agrave la bacteacuterie de coller agrave un support quelconque et de pieacuteger les eacuteleacutements nutritifs preacutesents dans le milieu (figure 1) Afin dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes deacutechantillons de seacutediment il est neacutecessaire de disperser les bacteacuteries et donc de les deacutecrocher par clivage des chaines polysaccharidiques Nous avons donc testeacute diffeacuterentes techniques physiques (agitation ultrashysons) et chimiques (oxydants cheacutelateurs deacutetergents)

1 - ETUDE DE lA TOXICITE DES TECHNIQUES UTlUSEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES

Afin de choisir les concentrations en produits chimiques ou les temps de traitements physiques qui seront appliqueacutes pour les tests de deacutecrochage il eacutetait neacutecessaire deacutetudier leur toxiciteacute vis-agrave-vis de bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire

11 Souches bacteacuteriennes

Les six souches testeacutees ont eacuteteacute isoleacutees agrave partit de preacutelegravevements provenant de lestuaire de Morlaix

- deux enteacuterobacteacuteries Escherichia coli et Salmonella spp

- quatre autres espegraveces Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Streptococcus faecium

Les souches sont traiteacutees de la faccedilon suivante

middot Preacute-ensemencement des souches dans un bouillon nutritif Trypto-caseacuteine-soja (Oxoid) incubation 18 h agrave 37 oC

middot Ensemencement de 1 ml de la culture dans 19 ml de bouillon nutritif incubation 4 h agrave 37 oC

middot Centrifugation (20 min agrave 3 500 tmin) et lavage du culot agrave leau physiologique

6

bull middot middot middotbull

bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull

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bull middot bull- lshy middot bullbullbull bullbull middotbull bullbull middot middot bullbullbullmiddotbullbull

middot middotbullmiddotbullbull middot middot middot middot middot bullbull

] Support

Fibre Irlysaxharidique

Membrane externe de la bacteacuterie

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eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ

Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)

7

middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml

middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute

12 Traitements physiques

121 Protocole

Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)

- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents

- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)

- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation

Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium

122 Reacutesultats

Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)

a) Ultra-sons

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl

US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104

US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp

US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104

8

b) Agitation magneacutetique

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans AM 88 let 96 let 18 104

AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104

AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3

AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3

c) Vortex

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans V 65 104 11 10 213 104

V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104

V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3

123 Conclusion

Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant

Ultra-sons 10 min

Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)

Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)

9

13 Produits chimiques testeacutes

131 protocole

Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)

Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)

NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS

TESTEES

Sel de sodium Peacuteriodate de sodium

01

001

0001

Sel de sodium Pyrophosphate de sodium

001 M

0001 M

00001 M

Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique

01

001

0001

Sel dazote Ureacutee

01

001

0001

Deacutetergent PRIL 2

02

Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium

01

001

0001

Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

5

INTRODucnON

Dans le cadre de diffeacuterentes eacutetudes notamment du projet rejets urbains nous avons eacutetudieacute la population bacteacuterienne de seacutediments cocirctiers vase ou sable La majoriteacute des bacteacuteries dans un tel eacutecosystegraveme adhegravere aux particules Le meacutecanisme dadheacutesion fait intervenir un reacuteseau de fibres polysaccharidiques seacutecreacuteteacutees par la bacteacuterie le glycoca1yx permettant agrave la bacteacuterie de coller agrave un support quelconque et de pieacuteger les eacuteleacutements nutritifs preacutesents dans le milieu (figure 1) Afin dameacuteliorer les numeacuterations bacteacuteriennes deacutechantillons de seacutediment il est neacutecessaire de disperser les bacteacuteries et donc de les deacutecrocher par clivage des chaines polysaccharidiques Nous avons donc testeacute diffeacuterentes techniques physiques (agitation ultrashysons) et chimiques (oxydants cheacutelateurs deacutetergents)

1 - ETUDE DE lA TOXICITE DES TECHNIQUES UTlUSEES SUR SIX SOUCHES BACTERIENNES

Afin de choisir les concentrations en produits chimiques ou les temps de traitements physiques qui seront appliqueacutes pour les tests de deacutecrochage il eacutetait neacutecessaire deacutetudier leur toxiciteacute vis-agrave-vis de bacteacuteries dinteacuterecirct sanitaire

11 Souches bacteacuteriennes

Les six souches testeacutees ont eacuteteacute isoleacutees agrave partit de preacutelegravevements provenant de lestuaire de Morlaix

- deux enteacuterobacteacuteries Escherichia coli et Salmonella spp

- quatre autres espegraveces Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Streptococcus faecium

Les souches sont traiteacutees de la faccedilon suivante

middot Preacute-ensemencement des souches dans un bouillon nutritif Trypto-caseacuteine-soja (Oxoid) incubation 18 h agrave 37 oC

middot Ensemencement de 1 ml de la culture dans 19 ml de bouillon nutritif incubation 4 h agrave 37 oC

middot Centrifugation (20 min agrave 3 500 tmin) et lavage du culot agrave leau physiologique

6

bull middot middot middotbull

bull middot middot middotbull bullmiddot middot middot bullmiddot middot middot bullmiddotmiddot middot bull middot middot middotmiddot bull middot bullbull middot middot middotbull bullbull bullmiddotmiddot middot middot bull bullbull bull bull bullmiddot middot bull bull bull bull bullbull bull middot bullbull bull middotbull middot middot bull bullbull bull bull middotmiddotbullbull bull bull bullmiddot bull

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bull middot bull- lshy middot bullbullbull bullbull middotbull bullbull middot middot bullbullbullmiddotbullbull

middot middotbullmiddotbullbull middot middot middot middot middot bullbull

] Support

Fibre Irlysaxharidique

Membrane externe de la bacteacuterie

4 LE GtyCOCUlX io pordt la __

dau UctftI W ~ l1li coaJUNH 4 moillCliUCJ li (cM _ecuac CI ici tt (or_ crlUM foree cie w J uas HIIC1Le MM mer egraveiaeI 1(UI rrvnij1AaUOMtVuccllU1ftIIIIl PV1_ru ta tMftJotaDC tA~I CltUWll4t 4middot GlUN 1 4bra H-cau- fuh U1f~ bullbull ~_J C CDIIfIl

CIltIMI4 ~ _Cabri~uagraved~ Ma~ (1frNl liuml U 1 liposhyias LeI a Cl~ -elU alt swtaces 0 -ampi sw(anoiotrurf nC6btorat usicirc la Nccecircr_ 4hm MIII1aWU snw (tCl-lII KitMI IIIUIMI (JUNfn ft TJ 4t lIJ Qg 1 au 1

eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ

Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)

7

middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml

middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute

12 Traitements physiques

121 Protocole

Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)

- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents

- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)

- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation

Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium

122 Reacutesultats

Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)

a) Ultra-sons

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl

US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104

US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp

US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104

8

b) Agitation magneacutetique

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans AM 88 let 96 let 18 104

AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104

AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3

AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3

c) Vortex

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans V 65 104 11 10 213 104

V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104

V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3

123 Conclusion

Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant

Ultra-sons 10 min

Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)

Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)

9

13 Produits chimiques testeacutes

131 protocole

Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)

Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)

NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS

TESTEES

Sel de sodium Peacuteriodate de sodium

01

001

0001

Sel de sodium Pyrophosphate de sodium

001 M

0001 M

00001 M

Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique

01

001

0001

Sel dazote Ureacutee

01

001

0001

Deacutetergent PRIL 2

02

Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium

01

001

0001

Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

6

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] Support

Fibre Irlysaxharidique

Membrane externe de la bacteacuterie

4 LE GtyCOCUlX io pordt la __

dau UctftI W ~ l1li coaJUNH 4 moillCliUCJ li (cM _ecuac CI ici tt (or_ crlUM foree cie w J uas HIIC1Le MM mer egraveiaeI 1(UI rrvnij1AaUOMtVuccllU1ftIIIIl PV1_ru ta tMftJotaDC tA~I CltUWll4t 4middot GlUN 1 4bra H-cau- fuh U1f~ bullbull ~_J C CDIIfIl

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eampi1uM r QUaamp ilnM MUUce MC Jet 1WoWMJ

Figure 1 Meacutecanisme dadheacutesion bacteacuterienne (dapregraves Costerton et al)

7

middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml

middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute

12 Traitements physiques

121 Protocole

Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)

- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents

- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)

- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation

Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium

122 Reacutesultats

Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)

a) Ultra-sons

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl

US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104

US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp

US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104

8

b) Agitation magneacutetique

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans AM 88 let 96 let 18 104

AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104

AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3

AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3

c) Vortex

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans V 65 104 11 10 213 104

V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104

V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3

123 Conclusion

Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant

Ultra-sons 10 min

Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)

Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)

9

13 Produits chimiques testeacutes

131 protocole

Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)

Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)

NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS

TESTEES

Sel de sodium Peacuteriodate de sodium

01

001

0001

Sel de sodium Pyrophosphate de sodium

001 M

0001 M

00001 M

Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique

01

001

0001

Sel dazote Ureacutee

01

001

0001

Deacutetergent PRIL 2

02

Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium

01

001

0001

Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

7

middot Inoculation de 01 ml des suspensions laveacutees dans 500 ml deau de mer naturelle steacuterile (filtreacutee sur 022 Il et autoclaveacutee 20 min agrave 120 0q de faccedilon agrave obtenir des concentrations bacteacuteriennes approchant lOS bactml

middot Les flacons ensemenceacutes sont placeacutes une nuit agrave 20 oC afin de tester les techniques de deacutecrochage sur des bacteacuteries ayant subi un stress saleacute

12 Traitements physiques

121 Protocole

Trois techniques deacutejagrave testeacutees par certains auteurs ont eacuteteacute utiliseacutees (Puleo 1967 EUery 1984 Schallenberg 1989 Le Guyader 1988)

- Ultra-sons (US) les tubes contenant les preacutelegravevements sont placeacutes dans une cuve agrave US (48 kHz 50 W) pendant trois temps diffeacuterents

- Agitation magneacutetique (AM) agrave 500 tmin pendant 3 temps diffeacuterents (flacon avec preacutelegravevement et barreau aimanteacute)

- Agitation au vortex (V) preacutelegravevements dans des tubes avec 2 temps dagitation

Trois souches ont eacuteteacute testeacutees avec 3 reacuteplicats middot Escherichia coli middot Salmonella spp middot Streptococcus faecium

122 Reacutesultats

Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec la numeacuteration moyenne de 3 reacuteplicats t eacutecart-type (par ml)

a) Ultra-sons

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans US 88 x Hl 96 x Hl 18 x Hl

US 2 min 887 (t 235) Hl 127 (t 016) lOS 887 (t 235) 104

US 6 min 973 (t 235) 104 651 (t 30) llr 787 (t 323) 1amp

US 10 min 843 (t 156) 104 907 (t 162) 104 168 (t 099) 104

8

b) Agitation magneacutetique

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans AM 88 let 96 let 18 104

AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104

AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3

AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3

c) Vortex

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans V 65 104 11 10 213 104

V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104

V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3

123 Conclusion

Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant

Ultra-sons 10 min

Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)

Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)

9

13 Produits chimiques testeacutes

131 protocole

Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)

Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)

NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS

TESTEES

Sel de sodium Peacuteriodate de sodium

01

001

0001

Sel de sodium Pyrophosphate de sodium

001 M

0001 M

00001 M

Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique

01

001

0001

Sel dazote Ureacutee

01

001

0001

Deacutetergent PRIL 2

02

Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium

01

001

0001

Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

8

b) Agitation magneacutetique

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans AM 88 let 96 let 18 104

AM 5 min ~3 (plusmn 185) 104 125 (t 035) 10 198 (t 107) 104

AM 15 min 693 (plusmn 162) 104 106 (t 057) 10 57 (t 132) lQ3

AM 30 min 846 (t 175) 104 144 (t 016) 10 996 (t 607) lQ3

c) Vortex

E coli Salmonella spp S faecium

M (t 0) M (t 0) M (t 0)

Sans V 65 104 11 10 213 104

V 5 min 67 (t 171) let 117 (t 015) 10 137 (t 074) 104

V 20 min 717 (t 150) let 143 (t 013) 10 40 (t 095) lQ3

123 Conclusion

Les traitements physiques testeacutes affectent peu la numeacuteration bacteacuterienne donc leacutetat physiologique des souches A partir des reacutesultats obtenus nous avons choisi pour la suite du travail des temps daction suivant

Ultra-sons 10 min

Agitation magneacutetique 10 min ou 1 heure (30 min dAM ne diminuant pas les numeacuterations bacteacuteriennes nous avons testeacute un temps dagitation plus important 1 heure)

Vortex 10 min (20 min faisant chuter la numeacuteration de S faecium)

9

13 Produits chimiques testeacutes

131 protocole

Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)

Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)

NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS

TESTEES

Sel de sodium Peacuteriodate de sodium

01

001

0001

Sel de sodium Pyrophosphate de sodium

001 M

0001 M

00001 M

Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique

01

001

0001

Sel dazote Ureacutee

01

001

0001

Deacutetergent PRIL 2

02

Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium

01

001

0001

Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

9

13 Produits chimiques testeacutes

131 protocole

Le choix des produits a eacuteteacute fait dapregraves la litteacuterature (Corpe 1973 Bryant 1984 Albright 1986 Yoon and Rosson 1990 Le Guyader 1988)

Ceux-ci ont eacuteteacute utiliseacutes agrave des concentrations variables et sont des oxydants (peacuteriodate) des deacutetergents (pRIL LSS) ou des cheacutelateurs (EDTA pyrophosphate)

NATURE DU PRODUIT NOM DU PRODUIT CONCENTRATIONS

TESTEES

Sel de sodium Peacuteriodate de sodium

01

001

0001

Sel de sodium Pyrophosphate de sodium

001 M

0001 M

00001 M

Sel disodique EDTA Ethylegravenediamineteacutetrashyaceacutetique

01

001

0001

Sel dazote Ureacutee

01

001

0001

Deacutetergent PRIL 2

02

Deacutetergent LSS Lauryl sulfate de sodium

01

001

0001

Nous avons rechercheacute la concentration maximale non toxique (naffectant pas la croissance)

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

10

Apregraves une nuit agrave 20 oC une numeacuteration bacteacuterienne est reacutealiseacutee sur chaque flacon puis les suspensions sont distribueacutees dans des tubes steacuteriles de 10 ml auxquels on ajoute les produits chimiques aux concentrations deacutesireacutees

Apregraves 5 min de temps de contact et une agitation au vortex une numeacuteration sur chaque tube est faite afm deacutevaluer la toxiciteacute

132 Reacutesultats

Ci-dessous est indiqueacutee la concentration maximale des produits ne modifiant pas le nombre initial de bacteacuteries donc sans effet toxique

1 Peacuteriodate de Na

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Ps aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

001 lt 001 0001 001 001 001

2 Pyrophosphate de Na concentration 001 M (la plus forte) aucun effet toxique sur les 6 souches

3 Ureacutee concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

4 EDTA concentration 01 aucun effet toxique sur les 6 souches

5 PRIL

Souche E coli SalmoneUa spp

A hydrophila Pa aeruginosa

Acinetobacter spp

S faecium

Concentration produit

2 2 2 2 lt 02 lt 02

6 LSS

Souche E coli Salmonella spp

A hydrophila Pa aeruginosa

AcinetolHuter spp

S faecium

Concentration produit

0001 0001 0001 01 0001 0001

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

11

133 Conclusion

Pour les essais de deacutecrochage des bacteacuteries du seacutediment nous avons donc choisi les concentrations suivantes

Produits Periodate de Na

Pyropho de Na

Ureacutee EDTA PRIL LSS

Concentrations 0005 01 M 1 1 002 0001

fi - DECROCHAGE DES BACTERIES DU SEDIMENT

21 Mateacuteriel et meacutethodes

Les seacutediments proviennent de lElom et sont dilueacutes avant traitement 10 g de seacutediment dans 90 ml deau saleacutee agrave 9 0 (dilution 10-1

)

A laction chimique nous avons parfois associeacute une action physique

- Ultra-sons (US) dans une cuve ou avec une sonde - Agitation magneacutetique (AM) barreau aimanteacute et agitateur - Agitation physique (V) avec un vortex

Pour certaines eacutetudes nous avons fait des reacuteplicats Les numeacuterations bacteacuteriennes sont faites par eacutetalement sur une geacutelose nutritive non

seacutelective (geacutelose Trypto-caseine soja) incubeacutee 24 heures agrave 37 oC (recherche de la flore dinteacuterecirct sanitaire)

22 Reacutesultats

Plusieurs essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes le plus souvent sur des reacuteplicats Les reacutesultats sont preacutesenteacutes sous forme de tableaux avec

M =Moyenne des reacuteplicats t eacutecart-type en nombre de bacteacuteries par g de seacutediment humide

1 = de bacteacuteries deacutecrocheacutees = Nb bact apregraves traitement - Nb bact initial x 100 Nb bact initial

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

12

ESSAI Ndeg 1

Etude de laction du vortex pendant 2 min et des US pendant 10 min (cuve 50 W 48 kHz) les tubes contenant le seacutediment eacutetant placeacutes dans la cuve remplie deau (aucune action chimique)

Seacutediments vase de lElom 5 reacuteplicats

M (t cr) M (t cr) l sans traitement apregraves traitement

Vortex 544 (t 118) Hf 506 (t 117) Hf lt0

US 496 (t 173) Hf 644 (t 279) Hf 2984

ESSAI Ndeg 1 Seacutediment vase sableuse US 10 min dans une cuve (puissance 50 Wet freacutequence 48 kHz) AM Agitation magneacutetique pendant 10 min agrave 500 tmin V Vortex pendant 10 min

2 reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Traitement M (z cr) 1

Sans traitement 865 (z 092) 1(t

Pyrophosphate US 615 (z 233) 1(t lt0 de Na 001 M AM 625 (z 035) 1(t lt0

V 104 (z 022) 1(t 2023

EDTA US 71 (z 014) 1(t lt0 01

AM 745 (z 064) 1(t lt0

V 80 (z 424) 1(t lt0

UREE US 10 (z 014) lOS 1561 01

AM 875 (z 176) 1(t 116

V 86 (z 198) 1(t lt0

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

13

ESSAI Ndeg 3 seacutediment =vase

US 10 min dans la cuve V vortex pendant 10 min 2 reacuteplicats

Dans cet essai ainsi que le suivant nous avons testeacute un autre produit le Tween 80 surfactant agrave la concentration de 1

Traitement M (t 0) 1 shy -~

Sans traitement 76 (1 028) 104

Tween 1 US 625 (plusmn 049) 104 lt0

V 53 (1 099) 104 lt0

Pyrophosphate de Na 01 M

US

V

50 (1 169) 1Q4

46 (1 155) 104

lt0

lt0

UREE US 62 (1 113) 104 lt0 1

V 50 (1 198) 1Q4 lt0

EDTA 1

US

V

53 (1 042) 1Q4

455 (1 134) lQ4

lt0

lt0

Sans traitement 63 (1 127) 104

PRIL US 76 (1 042) 104 2063 002

V 805 (t 332) 1Q4 2778

Periodate de Na

0005

US

V

76 (1 099) 1Q4

56 (1 014) 104

2063

lt0

LSS 0001

US

V

156 (plusmn 131) lOS

114 (1 08) lOS

14762

8095

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

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ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

14

ESSAI Ndeg 4 Seacutediment = Vase sableuse

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure Pas de reacuteplicat

Traitement Nb Bactml 1

Sans traitement 64 Hr

Periodate de Na 0005

AM 67 Hr 469

Pyrophosphate de Na 01 M

AM 41 104 lt0

UREE 1 AM 63 104 lt0

EDTA 1 AM 67 Ur 469

LSS 0001

AM 78 104 2187

Tween 80 1

AM 55 ur lt0

ESSAI Ndeg 5

Nous avons testeacute uniquement deux produits mais en reacutealisant 3 reacuteplicats sans traitement et 5 reacuteplicats avec traitement

AM =Agitation magneacutetique agrave 600 tmin pendant 1 heure

Traitement Mto 1

Sans traitement 333 (t 042) 104

Periodate de Na

0005

AM 286 (t 050) 1Q4 lt0

LSS 0001

AM 376 (t 068) 1Q4 1291

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

76

ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

17

Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

18

BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

15

ESSAI Ndeg (

Ici seul le LSS a eacuteteacute eacutetudieacute mais avec une action physique diffeacuterente et des reacuteplicats ont eacuteteacute faits

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique agrave 850 tmin pendant 1 heure US = Ultra-sons pendant 20 s agrave laide dune macrosonde (400 W 20 kHz)

Traitement M (t 0) 1

Sans traitement 5 reacuteplicats

256 (t 040) 104

LSS 0003

5 reacuteplicats

AM 216 (t 083) 1Q4 lt0

LSS 0003

3 reacuteplicats

US 266 (t 015) 104 78

ESSAI Ndeg 7

Nous avons testeacute laction de 3 autres deacutetergents sur le deacutecrochage des bacteacuteries (sans eacutetude de toxiciteacute) le triton N 101 le marlophen 83 et le brij 35 agrave la concentration commune de 003 (utiliseacutee par les chimistes)

Seacutediment = vase sableuse AM =agitation magneacutetique pendant 1 heure Vi =broyage par Virtis (homogeacuteneacuteiseur agrave lames) pendant 10 min agrave 7 500 tmin 2 reacuteplicats

16

M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

10

Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

428

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ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

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Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

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BIBUOGRAPIllE

ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

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M(plusmn 0) sans traitement

M(plusmn 0) apregraves traitement

1

Triton 35 (plusmn 071) 104

515 (plusmn 021) 104

AM

Vi

50 (plusmn 127) 104

51 (plusmn 071) 104

428

lt0

Marlophen 35 (plusmn 071) 104

48 (plusmn 071) 1~

AM

Vi

395 (plusmn 035) 104

485 (plusmn 106) 1~

143

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Brij 35 (plusmn 071) 1~

46 (plusmn 028) 1~

AM

Vi

50 (plusmn 042) 104

495 (plusmn 049) 104

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ID - DISCUSSION ET CONCLUSION

De nombreuses eacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees concernant l~eacutelioration des techniques de deacutenombrement des bacteacuteries associeacutees agrave du mateacuteriel particulaire ou agrave des supports solides (cf bibliographie) Les techniques tregraves diverses ne donnent que des reacutesultats faibles quant au nombre de bacteacuteries deacutecrocheacutees (dans la mecircme uniteacute log) n semble que la nature du seacutediment ou du support ainsi que la preacutesence de matiegravere organique interviennent dans lefficaciteacute du traitement de deacutecrochage des bacteacuteries

Cest pourquoi nous avons voulu refaire des tests sur du seacutediment et notamment sur de la vase dans le cadre dune probleacutematique sanitaire Nous avons associeacute une action physique (agitation ultra-sons) de faccedilon agrave dissocier meacutecaniquement les flocs de matiegravere organique que lIon rencontre freacutequemment dans ce type de seacutediment agrave un agent chimique pour relarguer les bacteacuteries de leur support Linocuiteacute de ces traitements sur la viabiliteacute bacteacuterienne a eacuteteacute testeacutee au preacutealable

Le produit le plus actif pour le deacutecrochage des bacteacuteries semble ecirctre le lauryl sulfate de sodium (LSS) La diffeacuterence entre les actions physiques associeacutees nest pas significative Laugmentation du nombre de bacteacuteries nlest de toutes faccedilons que dun demi-log au maximum Cette action nlest pas constante variant certainement selon la nature du seacutediment Dans ce contexte nous ne recommandons pas de technique particuliegravere n faut eacutegalement garder en meacutemoire que nous avons effectueacute les numeacuterations bacteacuteriennes sur geacutelose

En milieu liquide le problegraveme de la sous-estimation du nombre de bacteacuteries preacutesentes du fait de leur aggreacutegation sur les particules est moins crucial bien que les dilutions preacutealables agrave lensemencement soient eacutegalement fausseacutees (reacutepartition non homogegravene)

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Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

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ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

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Lutilisation de la conductance-meacutetrie (systegraveme Malthus ou autre) reacutesoudrait peut-ecirctre ce problegraveme car la mesure est faite directement sur leacutechantillon n reste que pour une eacutetude bacteacuteriologique nutilisant pas la culture mais lobservation directe au microscope comme leacutepifluorescence pour la flore totale ou limmunofluorescence pour une recherche orienteacutee la dissociation bacteacuteriesparticules est utile

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ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600

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ALBRIGHT LJ Mc CRAE SK MAY BE 1986 Attached and free floating bacterioplankton in How-sound British Columbia a coastal Marine Fjord Embayment Appl Environ Microbio 51 (3) 614-621

BRYANT RD COSTERTON JW lAISHLEY EJ 1984 The role of Thiobacuumllus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfura Can J Microbio 30 81-90

CORPE WA 1973 Detachment of marine periphytic bacteria from surfaces of glass slides Dev Inol Microbio 15 251-287

COSTERTON JW GEESEY GG and CHENG lU 1978 Comment collent les bacteacuteries Pour la Science 5 100-110

ELLERY WN SCHLEYER MH 1984 Comparison of homogenization and ultrasonication as techniques in extracting attached sedimentary bacteria Mar Ecology Prog Ser 15 247-250

LE GUYADER F 1988 Thegravese de doctorat de lUniversiteacute de Rennes I Colonisation bacteacuterienne et implantation de E coli dans le seacutediment dorigine littorale

PULEO JR FA VERO MS PETERSEN NJ 1967 Use of ultra-sonic energy in assessing microbial contamination on surfaces Appl Microbiol 15 (6) 1345-1351

SCHALLENBERG M KALFF J and RASMUSSEN JB 1989 Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct counts App Environ Microbiol 55 (5) 1214-1219

VEU MI ALBRIGHT LJ 1986 Microscopic enumeration of attached marine bacteria of seawater marine sediment fecal matter and kelp blade samples following pyrophosphate and ultrasound treatments Can J Microbiol vol 31 121-126

YOON WB ROSSON RA 1990 Improved method of enumeration of attached bacteria for study of fluctuation in the abundance of attached and free-living bacteria in response to diel variation in seawater turbidity Appl Environ Microbiol 56 (3) 595-600