Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. u. Pharmak. 247, 412--418 (1964)

Aus dem Ph~rmakologischen Institug der Universit~t Tiibingen (Direktor: Prof. Dr. F. L~M~eK)

Nitrosobenzol im Blute yon Katzen nach Yerabreiehung yon Nitrobenzol

VorI

t[ARTMUT UEHLEKE

Mit 2 Texgabbildungen

(Eingegan~en am 9. M~irz 1964)

Aromatisehe Nitroverbindungen werden neben anderen Umwand- lungen im Stoffweehsel in vivo und in vitro zn Aminen reduziert. Ffir eine sehrittweise Reduktion aromatiseher Nitrogruppen fiber die Nitroso- und t~ydroxylaminverbindungen spreehen eine Reihe yon Beob~ehtun- gen. LIPSCHITZ konnte bereits 1920 mit einiger Sieherheit m-Nitro- phenylhydroxylamin bei der l~eduktion yon m-Dinitrobenzol dutch Nuskelbrei naehweisen. Naeh oraler Gabe yon Trinitrotoluol wurde im Urin yon Kaninehen neben Aminodinitroluolen wenig l - t Iydroxyl - ~mino-2,6-dinitrotoluol gefunden (C~A~o~r, M~LLS u. WrLLIA~S). BV~Dr~G u. JOLLIF~E fanden dieses I-Iydroxylamin ~ueh bei der In- kubat ion yon Trinitrotoluol mit Lebersehnitten oder Aeetonextrakt aus

Sehweineleber. Naeh Gaben yon Nitrobenzol erseheinen im Urin yon Versuehstieren

eine ganze Reihe yon Stoffweehselprodukten (WILLIAMS 1959a). Amino- und Nitrophenole bflden den grSBten Teil der Ausseheidungsprodukte. P ~ E (1956) fiihrte sorgfgltige Untersuehungen mit orM verabreiehtem 14C_markiertem Nitrobenzol dureh und land im Urin kein Nitrosobenzol oder Phenylhy~ 'oxylamin und aueh keine Folgeprodukte wie Azoxy-

benzol oder Benzidin. Die Bildung von Meth/~moglobin dutch Nitrobenzol im Organismus

mugte man wie bei Anilin auf Stoffweehselprodukte zurfiekfiihren, d~ beide Substanzen in vitro Hi~moglobin nieht oxydieren. Wahrend die enzymatisehe Oxydation yon Anilin zu Phenylhydroxylamin und Ni- trosobenzol im KSrper (KIESE 1959 a) und in vitro dureh isolierte Leber- mikrosomen (U~HL]~KE 1960, 1961 ; KIESE u. UEHLEKE 1961) weitgehend aufgekliirt wurde, gelang es bisher nur in vitro, die Zwisehenstoffe bei der t~eduktion yon Nitrobenzol naehzuweisen und ihre Konzentrationen zu best immen (U]~LE~:]~ 1963 ~, b).

Nitrosobenzol im Blute nach Nitrobenzol 4i3

Manche Katzen bildeten naeh Injektion hoher Dosen Nitrobenzol mit grol~er Gesehwindigkeit Methgmoglobin und wir haben im Blute dieser Tiere 2qitrosobenzol gemessen.

Methoden Xatzen erhielten zur N~rkose 0,05 g Clfloralose und 0,5 g Urethan in 2,0 ml

Wasser je Kilogramm intraperitoneal. 2,5 m~{ole (308 rag) reines, dest. Nitrobenzol in 700 mg Oliven51 je Kilogramm Gewich~ warden verteilt an zwei Stellen intra- peritoneal und an beiden Oberschenkeln subcutan injiziert. Blutproben wurden aus einer freigelegten A. carotis mit I-Iilfe einer eingebundenen Kuniile entnommen.

Methgmoglobin wurde nach H~imolyse des Blutes an Hand der Auderung der Lichtabsorption bei 550 m# nach Zugabe yon Cyanid gemessen. Der Gesamt- blutfarbstoff wurde nach Oxydation darch Ferricyanid als Methiimoglobin be- stimmt.

2Vitrobenzol mal~en wir im TetI'acklorkohlenstoffex"0rakt der Blutproben mlt Hilfe seines Absorptionsm~ximums bei 260 rote.

Anilin bestimmten wir mit der Methode yon t~ODIE u. AXZLROI) (1948). iVitrosobenzol wurde aus himolysiertem Blut mit Tetrachlorkohlenstoff ex-

trahiert und, nach Auswaschen yon Anilin darch 0,1 n H2S0 t, diazotiert und ge- kuppelt und der entstehende Farbstoff optisch gemessen (1K~I~ u. KI~s~ 1959). Zar weiteren Identifizierung wurde die UV-Absorption yon 5~itrosobenzol in den Blutextrakten und das Verhalten yon 57itrosobenzol der eingeengten Extrakte n~ch Dfinnschichtchromatographie herangezogen. Chromatographiert wurde auf Glaspl~tten mit Kieselgel G (~erck) und verschiedeneu Gemischen als Laufmittel. Nitrosobenzol wurde nach Reduktion mittels SnCI~ daroh Anspriihen mit Dimethyl- aminobenzaldehyd oder Echtblausalz B (Merck) sichtbar gemacht.

Ergebnisse Naeh gleichzeitiger intraperRonealer und subcutaner Injektion von

insgesamt 2,5 m~olen (308 rag) Nitrobenzol je Kilogramm bfldeten die meisten yon zw6lf untersuehten Katzen nur langsam Meth~moglobin (Abb. 1). Die Oxydationsgesehwindigkeit stieg bei diesen Tieren nieht fiber eine Zunahme des Methi~moglobins yon 0,005 des Ges~mtblutfarb- stoffs pro Minute an. I~ier wurde Nitrosobenzol teilweise gar nicht und maximal iu Konzentrationen bis 4,5 m#~o l (0,5#g) je Milliliter ge- funden (UEm~]~KE 1963a).

Zwei Katzen bfldeten jedoeh nach 4er Injektion yon Nitrobenzol mat auffallend groBer Geschwindigkeit Meth~moglobin, wobei maximal eine Oxydationsgesehwindigkeit yon 0,022 des Gesamtblutfarbstoffs je Minute erreicht wurde. Die h6chste Konzentration yon Nitrosobenzol im Blute dieser beiden Tiere betrug 44 m#]~ole (4,7 #g)/ml. Maximale Konzentrationen wurden bei den einzelnen Tieren zwisehen 35 und 90 rain nach Injektion gefunden. Zur Zeit des )/[aximums yon ~qitroso- benzol wurde auch die gr6Bte Oxydationsgeschwindigkeit yon I{i~mo- globin beobaehtet. Nitrosobenzol war fast immer nachweisbar, ehe Meth~moglobin im Blute auftrat. In der Abb.2 sind Mittelwerte der

414 H~tn~r~vT UEI]iLEKE :

zwei K ~ z e n ~ufge~r~gen, die n~ch Injektion voa ~NiSrobenzol mit grol3er Geschwindigkeir Meth~moglobin bilde~en und bei denen das Ma~rnum der Konzentration von Nitrosobenzol 60 rain n&ch Injektion gemessen wurde. DJese beiden n~rkotisierten und etw~ ~b 60 rain nach Injektion ktinstlich be~tme~en K~tzen ]ebten nicht l~nger ~Is 120 rain.

10

0 20 r 5"0 80 100 1~0 7#0 7~0 7s

Abb. 1. ]~onzentrationen yon l~e~h~moglobin im ]~hlte yen 12 K~tzen n~ch Injektion yon 2,5 mXolen (308 mg) h~itrobenzo] je Kilogramm

., 8~ /~e#l~'tzlo~lobin lO, 8

. I I N f f r o s o - / I \ , , " ~, "~ 20-] g benzol o / / ~ , . , 012

I # , , , , o _ . ,o

0 20 go 60 80 100 720rain Ahb,2.r der Btutkonzentrationen yon 2 K~tzen n ~ h intraperitoneaIer und suhctt~aner

Injektion vo• ins~esarat 2,5 ml~Ioleu (308 rag) Nitrobenzol pro Kilogramm

Ni~robenzol stieg nach Injektion schnell im Blute an und erreichte Konzent r~ionen bis zu 0,5 #Mol (61,5 ffg)/ml. Die Blutkonzentrationen yon Ni~robenzol l~gen bei den K~tzen mit schneller Bfldung yon Met- hs nicht deutlich hSher ~is bei den Tieren, die nur langsam Blutf~rbs~off oxydierten. Nitrobenzol beg~nn erst 5--8 Std n~ch In- jektion l~ngs~m im Blute wieder abzunehmen. Anilin s~ieg im ]~lute

Nitrosobenzol im Blu~e nach Nitrobenzol 415

der einzelnen Katzen nut langsam an und erreiehte etwa 60 min nach dem Maximum yon Nitrosobenzol ~hnliehe Konzentrationen wie Nitroso- benzol zur Zeit des Maximums.

Diskussion Die sehr untersehiedliche 0xydationsgeschwindigkeit des Blutfarb-

stoffes nach Injektion yon Nitrobenzol bei Katzen ist schon yon Sc~w~.T- xE u. Lo SInG (1938) sortie yon Bt~EDOW u. JI~XG (1942) beobaehtet worden. Sie ist naeh unseren Messungen nicht auf Untersehiede der Resorptionsgeschwindigkeit zurtickzufiihren, hTach intraperitonealer und gleichzeitig subeutaner Injektion yon 2,5 mMolen (308 rag) Nitrobenzol je Kilogramm bei zwSlf Katzen betrug naeh 40 rain tier Mittelwert der Blutkonzentrationen 415 :[: 72,5 m#Mole (51,0 :~ 8,9 #g) je Milliliter (Mittelwert H-Standardabweiehung der Einzelwerte). Bei den zwei Katzen mit der grSSten Bildungsgeschwindigkeit yon Meth~moglobin fanden wJr nach 40 rain im Blur 451 re#Mole (55,5 #g) Nitrobenzol pro ~iniliter.

Es wurden hier m/~nnliche und weibliche Katzen yon sieherlieh ver- sehiedenem Alter benutzt. Wit wissen nicht, ob das die alleinige Ursaehe far die grofen Streuungen bei tier Meth~moglobinbildung bzw. bei der Reduktion von Nitrobenzol ist.

Ge15ste eytoplasmatische Leberenzyme reduzieren Nitrobenzol in vitro anaerob sehr vie1 sehneller zu Nitrosobenzol als bei Gegenwart yon Sauerstoff (U~r~LEK~ i963a). Unter beiden Bedingungen wird die l~e- duktionsgeschwindigkeit dureh zugesetzte Flavine (z. B. Ribottavin-5- phosphat, Flavin-Adenin-Dinucleotid) stark besohleunigt (FocTs u. Bl~Oni~ 1957). Es ist nieht gekl/~rt, ob und wieweit der Flavingehalt der Leber in vivo eine l~olle spielt. Die Sauerstoffspannung in Leber und Geweben kSnnte ebenfalls einen Einfluf3 auf die l~eduktionsgeschwindig- keit yon Nitrogvuppen aus/iben. Jedoeh bildeten Katzen, die in Narkose mit einer Atempumpe kiinstlieh sehr stark beatmet wurden, Meth/~mo- globin nicht langsamer. Wegen der sehr gro$en Streuungen der Met- h~moglobinbildung war es wenig sinnvoll, solche MSgliehkei~en der Be- einflussung mit grol3en Tierzahlen welter zu untersuchen.

Nitrobenzol oxydierte in den meisten untersuehten Katzen bei ver- gleiehbaren Blutkonzentrationen den Blutfarbstoff viel langsamer als Ardlin. lqach i.v. Injek~ion yon 200~Molen (18,6 nag) Anilin pro Kilo- gramm f/~llt dessen Blutkonzentra~ion schnell ab. Nach 10 min fanden HOLZ~I~ u. KIESE (1960) 290 m#Mole (27,0 #g) Anilin je Milliliter, naeh 20 rain 220 m~Mole (20,5 #g)/ml und nach 40 rain 150 re#Mole (14,5 #g)/ ml. Meth~moglobin stieg w/~hrend dieser Zeit ziemlich gleiehm~$ig um etwa 0,004 veto Gesamtblutfarbstoff pro Minute an. Naeh i.v. Injektion yon 60 #Molen (7,4 rag) Nitrobenzol je Kilogramm (w~6rige iibers~ttigte

416 ~_4.RT~UT U~Et~LE1KE :

L6sung) fanden wir die entspreehenden Blutkonzentrationen naeh 20 und 40 rain bei 195 m#Molen (24,0 #g) bzw. bei 130 m#3/[olen (t6,0 #g) im Milliliter (UEgL~KS 1963b). tIier beobaehteten wit keine oder nut sehr geringe Bildung von Meth~moglobin aneh naeh 60--120 rain.

Die auftretenden Konzentrationen yon Nitrosobenzol entspreehen der beobaehteten Gesehwindigkeit der Bildung yon Methgmoglobin. Nach Gaben hoher Dosen Nitrobenzol fanden wit bei den beiden Katzen mit der gr6Bten Bildungsgesehwindigkeit yon ~ethamoglobin zwisehen 45 und 65 min nach Applikation eine durehsehnittliehe Konzentration yon etwa 33 m#Molen (3,6#g) Nitrosobenzol je Milliliter ]~lut. Die maximale Oxydationsgesehwindigkeit betrug in diesem Zeitraum etwa 0,02 des gesamten Blutfarbstoffs pro Minute. In Katzen wnrde naeh i.v. Injektion yon 0,2 mMol Anilin/kg bei Blutkonzentrationen yon etwa 7,5 m#Molen (0,8 #g) Nitrosobenzol je Milliliter zwisehen 10 und 30 min naeh Injektion eine Oxydationsgeschwindigkeit yon 0,006 des Blutfarb- stoffes pro 1VIinute beobaehtet (I-IOLZEa u. KIESE 1960).

Bei Dauerinfusion yon Phenylhydroxylamin an t tunden land KIEsE (1959b) naeh Einstellung eines Gleiehgewiehtes nach 20 rain analytiseh etwa 7,5 m#Dgole (0,8 #g) Nitrosobenzol/mt. (Phenylhydroxylamin und Nitrosobenzol wurden analytiseh zusammen erfaBt, wirkten aber gleieh.) I-Iier wurde Meth~moglobin mit einer Gesehwindigkeit yon etwa 0,005 des Gesamtblntfarbstoffs pro iVfinute gebildet. In vitro war naeh ein- maliger Zugabe yon 16,7 m#Molen (1,7#g) Phenylhydroxylamin pro Milliliter Erythrocytensuspension und einer analytisch gemessenen Kon- zentration yon 6,4 m#lVfolen (0,7/~g)/ml direkt naeh Zugabe die Bil- dungsgeschwindigkeit yon Meth~moglobin mit etwa 0,0045 des gesamten roten l%rbstoffs je Minute sehr ~hnlieh (Ifx~s~, Rsrswv, i~ u. WALns~ 1950).

Naeh Injektion yon Nitrobenzol haben wir in Xatzen bei Konzen- trationen yon 35 m#?C[olen (3,75 #g) Nitrosobenzol je Milliliter Blur die Oxydationsgesehwindigkeit yon tIamoglobin zu etwa 0,02 yore Blut- farbstoff je Minute gemessen. Versuche in vitro (KIESE, I~EINWEIN n. WAnL]S~ 1950) zeigten, dag die Gesehwindigkeit der Meth/~moglobin- bildung etwa der Konzentration ~ yon Nitrosobenzol proportional ist. Ungef/~hr ffinffaehe Xonzentrationen in unseren Xatzen sollten naeh dieser ]3eziehung theoretiseh zu einer Verdoppelung der Oxydations- gesehwindigkeit fiihren, tI/imoglobin wurde aber etwa viermal sehneller oxydiert. Wir wissen allerdings nieht, ob diese Relation (Kiosk, R~I~- wsIN n. WALLV,~ 1950) annghernd aueh in vivo gfiltig ist.

Auffallend gegenfiber der Anilinvergiftung ist die naeh Applikation yon Nitrobenzol fiber viele Stunden fast konstant bleibende Konzentra- tion von Meths die dann erst ganz allm~hlich wieder absinkt. Bei unseren 1/~nger lebenden Katzen mit verh~ltnismaBig schneller Met-

Nitrosobenzol im Bhte nach Nitrobenzol 417

h~imoglobinbildung war aber naeh 3 Std kein Nitrosobenzol mehr im Blur zu finden, obgleich das Meth~moglobin noch nieht abnahm.

Von anderen m6gliehen Stoffwechselprodukten des Nitrobenzols bilden p-Aminophenol und p-Nitrosophenol ebenfalls Meth~moglobin, allerdings wesentlich langsamer als Phenylhydroxylamin oder Nitroso- benzol, p- und o-Nitrophenol haben wir nur im Blur einiger Katzcn und dann nicht mehr als zusammen 3,6 m#Mole (0,5 #g)/m] gcfunden. Die Konzentrationen yon p-Aminophenol und o-Aminophenol blieben sehr niedrig und stiegen hie fiber 3,0 m#Mole (0,32/zg)/ml (U~HL~K~ 1963 b). p-Nitrosophenol haben ~ ira Blute nicht mit Sicherheit nach- weisen k6nnen.

Die im Blare gefundenen Konzentrationen yon Anilin geben nlcht die gesamte Reduktion yon ~itrobenzol zu Anllin wieder. So waren die Anilinkonzentrationen in der Leber hSher a]s im Blute. Aueh ~itrobenzol lag in einigen Organen in hSheren Konzentrationen vor als im B]ut.

Mit diesen Versuchen konnte im Tiere die ,,gfftigo Phase" (WIL- L ~ S 1959b) bei der Reduktion yon Nitrobenzol erfal~t werden. Nitroso- benzol bzw. Phenylhydroxy]amin sind die Reduktionsprodukte, welche fiberwiegend ffir die Oxydation des Blutfarbstoffs verantwortlich sind.

Summary i. The velocity of methaemoglobin formation was found extremely

variable in cats after injection of nitrobenzene. There was no appearant relation between the velocity of methaemoglobin formation and the blood concentrations of nitrobenzene.

2. In the blood of animals oxydizing haemoglobin repidly, nitroso- benzene could be estimated. The velocity of methaemog]obin formation was maximal just at the time of maximal concentration of nitroso- benzene.

3. Other metabolites of nitrobenzene which are also able to oxydize haemoglobin were present in the blood in very small amounts only. They are, accordingly, hardly involved in the oxydation of haemoglobin after incorporation of nitrobenzcne.

Fri~ulein ANTJ]~ Mw~O~T~ danke ich ffir gewissenhafte Mitarbeit.

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