NMP Colif y E.coli

Fecha emisión: 23-08-2002 Revisión: 8

NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI EN

ALIMENTOS Fecha revisión: 01-06-2011

Sección Microbiología de Alimentos

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1. OBJETIVO

Estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes, como indicador sanitario. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos en las cuales se presume que tienen baja contaminación microbiana y a las cuales según reglamento sanitario o a petición del interesado se requiere este análisis. 3. FUNDAMENTO

Los métodos utilizados en la determinación de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua o como indicador de las condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos, se basan en la fermentación de la lactosa. El método de número más probable NMP, es un método estadístico, compuesto por una etapa presuntiva y una confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la muestra en medios líquidos, basándose en la combinación de tubos positivos se puede estimar el número de microorganismos presentes por gramo de alimento, con el uso de la tabla estadística aportada por la referencia. 4. REFERENCIAS

4.1 Bacteriological Analytical Manual online. September 2002. Capítulo 4 puntos C, D, E y F

4.2 Bacteriological Analytical Manual online, apéndice 2 “Most Probable Number from Serial Dilutions”, Tabla Nº1, Robert Blodgett, Octubre 2010.

5. TERMINOLOGÍA

5.1 Grupo coliformes: El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 48 hrs.a 35ºC. Este grupo incluye a los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter.

5.2 Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativos aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 24 hrs a 45,5 ± 0,2ºC para análisis de alimentos.

5.3 Escherichia coli: E. coli es una bacteria cuyo hábitat es el intestino del hombre y animales y debido a esto se ha usado como índice de contaminación fecal. Dentro del grupo coliformes, es el microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperación se hace de acuerdo a la metodología establecida para la enumeración de coliformes.





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6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Equipos

Incubadora a 35º ± 1ºC

Baño de agua termorregulado a 45,5º ± 0,2º C con agitación y con cubierta

6.2 Materiales

Sensor de temperatura calibrado a 35 ± 0,5ºC

Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL

Placas Petri de 100 mm de diámetro

Tubos o botellas de dilución, de vidrio borosilicato con tapas herméticas

Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm

Asa de 3 mm de diámetro

Propipeta

6.3 Medios de cultivo y reactivos

Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)

Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)

Caldo EC

Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)

Agar Levine Eosina Azul de Metileno (LEAM)

Caldo Triptona

Caldo RM-VP

Caldo citrato Koser

Agua de Dilución Buffer Fosfato

Agua Peptonada 0,1%

Reactivo Kovacs

Rectivos solución de α Naftol y solución KOH al 40 %

Reactivos Tinción de Gram





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Indicador Rojo de Metilo

Agar TSI

Agar LIA

Agar MIO

6.4 Cepas Control

Control positivo: cepa de Escherichia coli ATCC 25922

Control negativo: cepa de Staphylococcus aureus. ATCC 6538

Control negativo (coliformes fecales): cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 7. DESARROLLO

7.1 TEST PRESUNTIVO PARA COLIFORMES

7.1.1 Preparar la muestra y diluciones, según PRT-712.02-002 “Procedimiento Procesamiento de las muestras de alimentos y agua para análisis microbiológico”, item 7.4.2.1. Derivar al laboratorio según PRT -712.02-001 “Procedimiento Recepción de las muestras para análisis microbiológico”.

7.1.2 Una vez recibida la dilución 1:10 en el laboratorio 348, agitar en Vortex por 7 segundos y proceder a realizar las diluciones 1:100 y 1:1000. Inocular 9 tubos de caldo LST (3 diluciones y 3 tubos por dilución). Dejar descansar el borde de la pipeta contra el tubo y drenar por 2 a 3 segundos.

3 tubos con 1 mL de la dilución 1:10, preparada en 7.1.1.

3 tubos con 1 mL de la dilución 1:100

3 tubos con 1 mL de la dilución 1:1000

7.1.3 Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo. El tiempo entre la preparación de la muestra y su inoculación en un medio no debe ser superior a 15 minutos.

7.1.4 Incubar a 35º ± 1ºC por 24 horas y observar la formación de gas, si existen tubos que no presentan formación de gas, incubar nuevamente hasta completar 48 h. y observar la formación de gas, en los tubos de fermentación. Si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de temperatura indicado, el análisis debe ser invalidado y se debe iniciar procedimiento de gestión control de trabajo no conforme, según el PRG-700.00-006.





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7.1.5 Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli como control positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incluir tubos sin inocular para realizar control de esterilidad de medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de ambiente.

7.1.6 En la eventualidad de que los controles no se comportasen de manera normal, es decir, si la cepa de E.coli no se presenta con formación de gas, la cepa de S. aureus presentase formación de gas o el control de esterilidad presentase desarrollo, se debe invalidar el resultado e iniciar procedimiento de control de trabajo no conforme, según el PRG-700.00-006.

7.1.7 La presencia de gas o efervescencia significa un Test Presuntivo positivo para coliformes y se registra como positivo, cualquiera sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas a las 48 horas significa un Test Presuntivo negativo para coliformes.

7.1.8 Anotar los resultados del test presuntivo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos control en el registro RG-712.00-004, de la esterilidad de los medios en el registro RG-712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-712.00-009.

7.2 TEST CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES

7.2.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se transfieren a caldo BVB para confirmar coliformes.

7.2.2 Mezclar por agitación el tubo del test presuntivo y transferir un inóculo con un asa de 3 mm. de diámetro, si se ha formado una película en la superficie del medio se debe evitar tomar ésta en el inoculo, a tubos de fermentación conteniendo caldo BVB. Se debe tener la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable.

7.2.3 Incubar los tubos con caldo BVB a 35ºC por 48 +/- 2 hrs.

7.2.4 Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli como control positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo.

7.2.5 Al término del período de incubación se observa la formación de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo BVB. Si los controles positivo y negativo no se comportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de temperatura indicado repetir el análisis desde el punto 7.2.2.

7.2.6 La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo BVB significa test confirmativo positivo para coliformes, ausencia de gas constituye un test negativo para coliformes.





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7.2.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG 712.00-072 y de los cultivos control en el registro RG-712.00-004 y RG-712.00-006.

7.3 METODO CALDO EC PARA PARA COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACIÓN PARA Escherichia coli

7.3.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se transfieren a caldo EC para confirmar coliformes fecales. y consecutivamente E. coli.

7.3.2 Mezclar por agitación el tubo del test presuntivo y transferir un inóculo con un asa de 3 mm. de diámetro o con aplicador de madera, a tubos de fermentación conteniendo caldo EC. Se debe tener la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable.

7.3.3 Los tubos con caldo EC se incuban en un baño de agua con cubierta a 45.5 º ± 0,2º C por 24 horas +/- 2 horas, examinar si se produce producción de gas, si la producción de gas es negativa incubar nuevamente hasta completar 48 +/- 2 horas. El nivel de agua del baño debe sobrepasar el nivel de caldo dentro de los tubos.

7.3.4 Se deben incluir cultivos control en el baño de agua, se usa como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una cepa de Enterobacter aerogenes. Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incubar también medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios empleados.

7.3.5 Al término del período de incubación se observa la formación de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo EC. Si los controles positivo y negativo no se comportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de temperatura indicado, repetir el análisis desde el punto 7.2.2.

7.3.6 La presencia de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo EC significa un test confirmativo positivo para coliformes fecales; la no formación de gas significa test negativo para coliformes fecales.

7.3.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos control en el registro RG-712.00-005 y de la esterilidad de los medios en el registro RG-712.00-006.

7.4 CONFIRMATIVO PARA E.coli

7.4.1 De cada tubo de caldo E.C. que presente formación de gas, transferir un inóculo a una placa de agar LEAM para obtener colonias aisladas.

7.4.2 Incubar las placas invertidas 18 a 24 horas a 35ºC.





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7.4.3 Al término del período de incubación observar las colonias sospechosas, con centro oscuro con o sin brillo metálico en el caso de usar Agar LEAM.

7.4.4 Anotar los resultados en el registro RG-712.00-072.

7.4.5 De cada placa de agar transferir 5 colonias aisladas a un tubo de agar nutritivo o agar standard, incubar por 18 a 24 horas a 35ºC para realizar pruebas: morfológicas mediante Tinción de Gram según IT-712.00-066 y bioquímica utilizando las reacciones IMViC (Indol, Rojo Metilo, Vogues Prokauer y Citrato). Repetir la inoculación en caldo LST para confirmar la producción de gas. Alternativamente se puede realizar un API 20 E o VITEK. Agregar TSI, LIA y MIO. Si una de las 5 colonias es identificada como positiva para E. coli, se considera el tubo EC como positivo y no es necesario realizar pruebas a la demás colonias.

7.5 INTERPRETACIÓN

Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de 48 hrs a 35ºC, aparezcan como bacilos Gram negativos no esporulados y cuyo test IMVIC sea + + - - (biotipo 1) o - + - - (biotipo 2), son considerados E. coli.

7.6 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS COLIFORMES TOTALES

7.6.1 La combinación de tubos positivos y/o negativos en los tests confirmativos de caldo BVB, es referida a la Tabla Nº 2 (BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1) y se expresa como: NMP de coliformes/g o ml. De muestra

7.6.2. Si en vez de las porciones de muestra 0,1-0,01-0,001, se utiliza 0,01-0,001-0,0001, se lee el resultado de la tabla y se multiplica por 10.

7.6.3. Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla de N.M.P.y multiplicar por 10, 100, 1000, etc. Según las porciones de muestra consideradas.





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7.7 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Escherichia coli

7.7.1 Calcular el NMP de E. coli, basándose en el número de tubos de caldo EC, en que se confirmó la presencia de E.coli en 3 diluciones sucesivas y anotar los resultados en el registro RG-712.00-072.

Tabla Nº 1: Ejemplos de determinación de NMP en series de 3 tubos

Ejemplo Cantidad muestra (g. o ml. ) Lectura NMP 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 a 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3 2 0 930 b 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3 2 0 9300 c 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0 1 0 30 d 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3 2 2 2100 e 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3 3 3 >110000

Número de tubos positivos / Número de tubos inoculados

Tabla Nº 2. Para serie de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g. NMP por gramo con un 95% de confianza. ((BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1) Tubos Positivos

Lim. Conf. Tubos Positivos NMP/g Lim. Conf.

0.10 0.01 0.001

NMP/g

Bajo Alto 0.10 0.01 0.001 Bajo Alto 0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430





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Tabla Nº 2. Para serie de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g. NMP por gramo con un 95% de confianza. ((BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1) Tubos Positivos

Lim. Conf. Tubos Positivos NMP/g Lim. Conf.

0.10 0.01 0.001

NMP/g

Bajo Alto 0.10 0.01 0.001 Bajo Alto 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

8. REGISTROS

8.1 Registro cepas control de incubadora

8.2 Registro cepas control baños de agua para análisis de coliformes fecales

8.3 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, coliformes fecales y E.coli

8.4 Registro control de ambiente

8.5 Registro de resultados análisis de coliformes, E. coli y Salmonella en muestras de alimentos

9. ANEXOS

Anexo Nº1 Registro cepas control de incubadoras RG-712.00-004.

Anexo Nº 2 Registro cepas control baños de agua para análisis de coliformes fecales RG-712.00-005.

Anexo Nº 3 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli RG-712.00-006.

Anexo Nº 4 Registro control de ambiente RG-712.00-009.

Anexo Nº 5 Registro de resultados análisis de coliformes, E. coli y Salmonella en muestras de alimentos RG-712.00-072.





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Anexo Nº1

Registro cepas control de incubadoras RG-712.00-004.

Incub. Nº inventario

----------------------


----------------------


----------------------

Incub.Nº inventario

----------------------

FECHA CONTROLES CONTROLES CONTROLES CONTROLES INIC: LST

(+ , - ) BVB (+ , - )

VRB (+ , - )

LST (+ , - )

BVB (+ , - )

VRB (+ , - )

LST (+ , - )

BVB (+ , - )

VRB (+ , - )

LST (+ , - )

BVB (+ , - )

VRB (+ , - )

Anexo Nº 2

Registro cepas control baños de agua para análisis de coliformes fecales RG-712.00-005

Baño Nº inventario

----------------------


----------------------


----------------------


----------------------

FECHA CONTROLES CONTROLES CONTROLES CONTROLES INIC: ( + ) ( - ) ( + ) ( - ) ( + ) ( - ) ( + ) ( - )





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Anexo Nº 3

Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli RG-712.00-006

FECH

A Caldo Lauril Sulfato Triptosa concentra

d

Caldo Lauril Sulfato Triptosa simple

Agar Rojo

Neutro Cristal Violeta (VRB)

Caldo Bilis Verde

Brillante

Caldo EC

Caldo

A-1

Agar Rojo Neutro Cristal

Violeta -Glucosa (VRBG)

Agar MacConkey Sorbitol

Agar glucosa

(enterobac-teria)

INIC

Anexo Nº 4 Registro control de ambiente RG-712.00-009.

LABORATORIO:.......................................................MES :...........................................AÑO :..............................

CONTROL AMBIENTE MESON DE TRABAJO Lado izquierdo Lado derecho

FECHA/ LOTE MEDIO

Placa abierta Placa cerrada Placa abierta Placa cerrada

INIC





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Anexo Nº 5 Registro de resultados análisis de coliformes, E. coli y Salmonella em

muestras de alimentos RG-712.00-072

Nº:.................................Tipo de muestra:.........................................................Analista..................................................

Fecha /hora recolección.............................Fecha/hora análisis:.....................Tº Ambiental…………….

E. coli y coliformes

Medios CLST (S) #

CBCB #

Diluyente #

VRBA #

Caldo EC #

C. Tripotona #

C. RM-VP #

C. Koser #

Pipeta 1/5 mL #

Incubadora/ Baño term.

PORCION DE MUESTRA (mL) COLIFORMES PRESUNTIVO

CLST o VRBA 24 / 48 hrs.a 35ºC COLIF. CONFIRMATIVO

CBVB 24 / 48 hrs. a 35 ºC

E.coli CONFIRMATIVO Caldo E.C: a 44,5ºC 24 h / 48 h

PRUEBAS BIOQUÍMICAS IMViC

Indol

RM

V. P

Citrato





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Salmonella P/A Medios Pre-enriq.

# TT #

Rapa. #

Iodo #

Verde Bri. #

XLD #

Hecktoen #

Bismuto #

TSI #

LIA #

MIO #

Pipeta 1/5 mL #

Incubadora /Baño ter.

Caldos enriquecimiento

Tetrathionato T°C……

Rappaport T°C……





Agares Selectivos

Agar Bismuto Sulfito Colonias: Colonias:

Agar Hektoen Colonias: Colonias:

Agar XLD Colonias: Colonias:

TSI

LIA

MIO

SEROLOGIA

Otros

N.M.P. Coliformes:......................................germ/g Rto coliformes....................ufc/g

N.M.P. E. coli :.............................................germ /g Rto de E. coli......................ufc/g

P/A E.coli /g:.............................................................

P/A Salmonella en 25 o 50 g :..............................................Fecha informe……………………………

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