Nukleare RezeptorenNukleare RezeptorenEin ÜberblickEin Überblick

Inge SchusterInge SchusterInstitut für Pharmazeutisch ChemieInstitut für Pharmazeutisch Chemie

Universität WienUniversität Wien

Überblick Signaltransfer in ZellenSignaltransfer in Zellen Was sind Nukleare Rezeptoren?Was sind Nukleare Rezeptoren? Ursprung und Evolution Nuklearer RezeptorenUrsprung und Evolution Nuklearer Rezeptoren Relevanz Relevanz Strukturelemente Nuklearer RezeptorenStrukturelemente Nuklearer Rezeptoren Liganden Liganden Allgemeine MechanismenAllgemeine Mechanismen

Signaltransfer in ZellenSignaltransfer in Zellen Alle Zellen prüfen und verarbeiten permanent Alle Zellen prüfen und verarbeiten permanent

Information aus der „Umgebung“ Information aus der „Umgebung“ Detektion der Information durch RezeptorenDetektion der Information durch Rezeptoren Information in Form von Mediatoren/ Hormonen: Information in Form von Mediatoren/ Hormonen:

hochspezifischehochspezifische Schlüssel in RezeptorenSchlüssel in Rezeptoren Konformationsänderung des RezeptorsKonformationsänderung des Rezeptors Signal auf Gen-ExpressionSignal auf Gen-Expression Veränderte FunktionVeränderte Funktion

Signaltransfer durch RezeptorenSignaltransfer durch Rezeptoren

Intrazelluläre RezeptorenIntrazelluläre Rezeptoren MembranrezeptorenMembranrezeptoren

TranskriptionTranskription

Lipophiles Lipophiles Hormon Hormon aktiviert aktiviert Rezeptor im Rezeptor im NukleusNukleus

Extrazelluläre Peptid-Peptid-hormone, Cytokine...hormone, Cytokine...

Signal über Kaskade Signal über Kaskade von Protein-Protein von Protein-Protein Wechselwirkungen zum Wechselwirkungen zum NukleusNukleus

Definition: Nukleare Rezeptoren• Multi-funktionelle Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren

• Regulieren die Expression von Targetgenen

DNADNA

RezeptorRezeptor

„„Schlüssel-Gene“ Schlüssel-Gene“ inin

EntwicklungEntwicklung

ReproduktionReproduktion

HomeostaseHomeostase

MetabolismusMetabolismus

CytosolCytosol

NucleusNucleus

LigandLigand

Superfamilie: Nukleare Rezeptoren (NR)Superfamilie: Nukleare Rezeptoren (NR) Sehr große (größte) Gen-Superfamilie, die für eukaryo-Sehr große (größte) Gen-Superfamilie, die für eukaryo-

tische Transkriptionsfaktoren kodierttische Transkriptionsfaktoren kodiert NR auf das Tierreich beschränktNR auf das Tierreich beschränkt NR stammen von einem gemeinsamen Vorläufer abNR stammen von einem gemeinsamen Vorläufer ab NR haben den NR haben den gleichen molekularen Aufbau aus gleichen molekularen Aufbau aus

definierten Modulen; MW 50 000 – 100 000 Ddefinierten Modulen; MW 50 000 – 100 000 D >> 200200 verwandte Gene identifiziert:verwandte Gene identifiziert:

– Caenorhabditis elegans (Nematode) ....... > 270 Caenorhabditis elegans (Nematode) ....... > 270

– Drosophila melanogaster......................... 21Drosophila melanogaster......................... 21

– Homo sapiens.......................................... 48Homo sapiens.......................................... 48

Phylogenetische AnalysePhylogenetische Analysein Säugetieren 48 (49) NR in 6 Subfamilienin Säugetieren 48 (49) NR in 6 Subfamilien

NR-VorläuferNR-Vorläufer

RXR (RXR ())

HNF-4HNF-4 (())

COUP-TF COUP-TF (())

TLXTLX

PNRPNR

TR2 (TR2 ())

NGFI-B NGFI-B ((

SF-1/FTZ-F1 SF-1/FTZ-F1 ((

GCNFGCNF

SHPSHP

DAX-1DAX-1

Liganden bekanntLiganden bekanntLiganden unbekannt : Orphan ReceptorsLiganden unbekannt : Orphan Receptors

TR (TR (

RAR (RAR ())VDRVDRPPARPPARPXRPXRLXRLXRFXRFXR

CAR (CAR ())Rev/Erb (Rev/Erb ())

RZR/ROR RZR/ROR (())

URUR

GRGR

ARAR

PRPR

MRMR

ER (ER (

ERR (ERR (

Steroid-RezeptorenSteroid-Rezeptoren

Chronologie von NR‘sChronologie von NR‘sEcdyson erzeugt Puffs am ChromosomEcdyson erzeugt Puffs am Chromosom

Steroidhormon – Rezeptoren Steroidhormon – Rezeptoren (AR, ER, GR, MR)(AR, ER, GR, MR)VDR , TRVDR , TR

RARRARPPAR , RXRPPAR , RXRGCNF, ROR, SF-1; FXR, LXRGCNF, ROR, SF-1; FXR, LXR Orphan receptorsOrphan receptors

19591959

19701970

19801980

19901990

20002000

NR in Körperzellen NR in Vielfalt von Zelltypen eines Organismus vorhandenNR in Vielfalt von Zelltypen eines Organismus vorhanden Diese Zellen sind Target für Wirkung der spezifischen Diese Zellen sind Target für Wirkung der spezifischen

NR-LigandenNR-Liganden Pleiotrope Effekte auf Zell-/Organ Entwicklung, Pleiotrope Effekte auf Zell-/Organ Entwicklung,

Homeostase, Metabolismus und ApoptoseHomeostase, Metabolismus und Apoptose Beispiel:Beispiel: Vitamin D Rezeptor (VDR)Vitamin D Rezeptor (VDR)

- In praktisch allen Körperzellen und TumorgewebenIn praktisch allen Körperzellen und Tumorgeweben

- Reguliert > 60 Gene Reguliert > 60 Gene - Calcium HomöostaseCalcium Homöostase- Proliferation /DifferenzierungProliferation /Differenzierung- ImmunmodulationImmunmodulation

Welche Bedeutung haben NR für Medizin und Pharmazie?

NR und Steroidhormon-Analoga: Publikationen 1960 - 2003 (NIH-library)

Agonisten – Antagonisten klassischer NR‘s: herausragende Rolle Agonisten – Antagonisten klassischer NR‘s: herausragende Rolle in Prevention/Therapie benigner und maligner Defektein Prevention/Therapie benigner und maligner DefekteGigantisches Potential von Liganden von Orphan Receptors Gigantisches Potential von Liganden von Orphan Receptors (Reverse Endocrinology)(Reverse Endocrinology)

20032003 The Role of Nuclear The Role of Nuclear

Receptors in Receptors in Cardiovascular Cardiovascular

DiseaseDisease October 8 - 12, 2003 October 8 - 12, 2003 Hotel Del Coronado, Hotel Del Coronado,

Coronado Island in San Diego, Coronado Island in San Diego, CACA

Neue Aspekte

Sessions will present the latest developments in nuclear receptor structure and function and will spotlight the emerging roles of key nuclear receptors (PPARs, aldosterone, estrogen and thyroid) in cardiovascular disease. The cutting-edge presentations will range from basic nuclear receptor biology to clinical investigation of agents that target these receptors.

Modulstruktur von NR

NR: Modul-OrganisationNR: Modul-Organisation

NH2 COO-

variable N-terminale variable N-terminale RegionRegion

Konservierte DNA-Bindungs Konservierte DNA-Bindungs RegionRegion: 60-70 aa : 60-70 aa

(42-94 %)(42-94 %)

Konservierte Konservierte Liganden-Liganden-

BindungsregionBindungsregion(15–57 %)(15–57 %)

Variable Variable „Hinge“ „Hinge“ RegionRegion

variabelvariabel

A/B C D E/F

Konstitutive Aktivierungsfunktion

AF-1

Aktivierungsfunktion AF-2

Modulaufbau von NR‘sModulaufbau von NR‘s

NH2--COO- ER (estrogen R): 595 aa

-COO- RAR (Retinsäure R): RAR (Retinsäure R): 432 aa432 aaNH2-

-COO- TR (thyroid hormone R): TR (thyroid hormone R): 408 aa408 aaNH2-

-COO- VDR (Vitamin D RVDR (Vitamin D R): 420 aa): 420 aaNH2-

A/B C D E/F

-COO- PR (progesterone R):PR (progesterone R): 934 aa 934 aaNH2-

DNA-Bindungs Domäne – DNA Response Elements

DNA-Bindungs-Domäne (DBD)DNA-Bindungs-Domäne (DBD)

Sequenzerkennung

Sequenzerkennung

DimerisierungDimerisierung

A/B C D E FA/B C D E F

DNADNA

ZnZn

ZnZn

2 Zink-Finger 2 Zink-Finger (60-80 aa)(60-80 aa)

NH2 COO-

Response elementResponse element

Recognition -helix

DNA-Response Elements (RE)DNA-Response Elements (RE)

Symmetrisch (PalindromSymmetrisch (Palindrom))

GR-GRGR-GR

PR-PRPR-PR

AR-ARAR-AR

ER-ERER-ER

MR-MRMR-MR

RXR-RXRRXR-RXR

5‘5‘ AGAACAnnnTGTTCT 3‘AGAACAnnnTGTTCT 3‘

Nukleare Rezeptoren binden an RE‘s alsNukleare Rezeptoren binden an RE‘s als

Homo-Dimere Hetero-Dimere MonomerHomo-Dimere Hetero-Dimere Monomer

5‘ AGGTCA (n)5‘ AGGTCA (n)x x AGGTCA 3‘ AGGTCA 3‘ oderoder

RXRRXR

Direct Repeat Direct Repeat oderoder

Inverted PalindromeInverted PalindromeRXR-RAR (DR2, DR5)RXR-RAR (DR2, DR5)

RXR-VDR (DR3, IP9)RXR-VDR (DR3, IP9)

RXR-PPAR (DR1)RXR-PPAR (DR1)

RXR-PXR (DR3)RXR-PXR (DR3)

RXR-CAR (DR5).....RXR-CAR (DR5).....

RZR/RORRZR/ROR

SF-1 (M, D,H)SF-1 (M, D,H)

Rev-Erb (M,D)Rev-Erb (M,D)

Hinge domainHinge domainNH2 COO-

Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen LBD und Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen LBD und Hinge D – Rolle in Liganden-Bindung, Dimerisierung Hinge D – Rolle in Liganden-Bindung, Dimerisierung Signal für nukleare LokalisationSignal für nukleare Lokalisation

COO -

NH2

Unterschiedliche Länge und Sequenz bei unterschied-Unterschiedliche Länge und Sequenz bei unterschied-lichen NRlichen NR

Konservierte Domäne bei Isoformen eines NRKonservierte Domäne bei Isoformen eines NR

D

Liganden-Bindungsdomäne (LBD)

Liganden-Bindungsdomäne (LBD)Liganden-Bindungsdomäne (LBD)A/B C D E FA/B C D E F

NH2 COO-

Liganden-Bindungsdomäne (LBD)Liganden-Bindungsdomäne (LBD)

• Konservierte Struktur aus 12 HelicesKonservierte Struktur aus 12 Helices• Konformationsänderung bei Bindung des LigandenKonformationsänderung bei Bindung des Liganden• Ligand im hydrophoben „Core“Ligand im hydrophoben „Core“

H12

H11

Apo-RXR

H12

H11

Holo-RAR

Bilder nach Aranda & Pascual, 2001

Crystallographic structure of the VDRmt Crystallographic structure of the VDRmt bound to 1,25(OH)bound to 1,25(OH)22DD33

Rochel, N., Wurtz, J.M., Mitschler, A., Klaholz, B. & Moras, D. (2000) The crystal structure of the nuclear receptor for vitamin D bound to its natural ligand. Mol. Cell 5, 173–179

X-Ray Analysen der Ligandenbindungs-Domäne X-Ray Analysen der Ligandenbindungs-Domäne (LBD) von > 15 NR‘s(LBD) von > 15 NR‘s

Bindung des Liganden führt zur Konformationsänderung Bindung des Liganden führt zur Konformationsänderung der LBD – Ligand vollständig eingebettet im hydrophoben der LBD – Ligand vollständig eingebettet im hydrophoben CoreCore

Hochaffine, spezifische Bindung (KD 10-9 – 10-12 M)

Mausefalle-Modell

LBD -multifunktionellLBD -multifunktionellA/B C D E FA/B C D E F

NH2 COO-

Bindung des LigandenBindung des Liganden

Dimerisierung (H 10,11,Dimerisierung (H 10,11, 7.8.9 7.8.9))

Reguliert transkriptionelle Reguliert transkriptionelle Funktion durch Funktion durch Interaktion mit Interaktion mit „Accessory Factors„Accessory Factors“ “

H12

H11

H10

AF-2AF-2

LBD-Dimerisierung

LBD

DBD

LBD-Dimerisierung >> DBD-Dimerisierung

RE

Mechanismus der NR-Funktion

TATA

NCoA: Receptor coactivator complexNCoA: Receptor coactivator complexTBP: TATA-Box binding proteinTBP: TATA-Box binding protein

NCoABasal Basal factorsfactors

TBP

RNA Pol IIRNA Pol II

CBP/CBP/p300p300

Histone acetylationHistone acetylation

Aktiver NR

DimerbildungDimerbildung

Liganden von NR‘s

NR-Liganden sind lipophile, kleine Moleküle Steroide, Retinoide, Eicosanoide, Thyronin........... MW 300 - 500 (< 1000) D Passive Penetration durch Zellmembranen

Templates für Synthese neue Wirkstoffe:Strukturelle Modifikation der Liganden zur gezielten, spezifischen Kontrolle der NR-Funktion

Optimierung der pharmakokinetischen Eigenschaften

Woher kommen Liganden der NR?Woher kommen Liganden der NR?

Endogene MetaboliteEndogene Metabolitedes Lipid-, Steroid-, Vitamin-Stoffwechselsdes Lipid-, Steroid-, Vitamin-Stoffwechsels

Exogene VerbindungenExogene Verbindungen

Nahrung, Umwelt, Nahrung, Umwelt, Pharmaka.........Pharmaka.........

parakrinparakrin

endokrinendokrin

autokrinautokrin

O

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

I O

I

I

NH2

OOH

1,25(OH)1,25(OH)22 Vitamin D Vitamin D33

(VDR)(VDR)

All-trans RetinsäureAll-trans Retinsäure

(RAR)(RAR)

13-cis Retinsäure13-cis Retinsäure

(RXR)(RXR)

ProgesteronProgesteron

(PR)(PR)

TestosteronTestosteron

(AR)(AR)

OestradiolOestradiol

(ER)(ER)

Trijod-ThyroninTrijod-Thyronin

(TR)(TR)

Liganden - Beispiele

Autokrine – parakrine Regulierung:Autokrine – parakrine Regulierung:

OOHH

25252424

DD

25(OH)D25(OH)D33CYP27BCYP27B

11,25(OH),25(OH)22DD33

CYP24CYP24

Calcitroic acid Calcitroic acid (Seitenkettenspaltung)(Seitenkettenspaltung)

11

7-DHC7-DHC

VDRVDR

Vitamin D Vitamin D SyntheseSynthese und und InaktivierungInaktivierung ebenso wie ebenso wie VDRVDR in Keratinocyten der Hautin Keratinocyten der Haut

Effekt von Liganden auf Gen-ExpressionEffekt von Liganden auf Gen-Expression

Target GenTarget Gen

Target GenTarget Gen

Target GenTarget Gen

Target GenTarget Gen

Target GenTarget Gen

InaktivInaktiv

AgonistAgonist

AntagonistAntagonist

Inverse AgonistInverse Agonist

Aktive Konformation

Inaktive Konformation

Liganden des Oestrogen Rezeptors (ER)Liganden des Oestrogen Rezeptors (ER)

OH

OH

O

N

OH

OH

OH

HydroxytamoxifenHydroxytamoxifen

OH

OH

O N

( )10

ICI 164384

OH

O

O

OH

OH

Genistein

AgonistAgonist Antagonist (AF2)Antagonist (AF2)

Agonist -Antagonist

NCoANCoA

AF-2

Dimerisierung

AgonistAgonist: Exponierte sites für Dimerisierung und Exponierte sites für Dimerisierung und Rekrutierung der Co-Aktivator Komplexe (NCoA)Rekrutierung der Co-Aktivator Komplexe (NCoA)

AntagonistAntagonist: Unvollständige/Fehlende Sites für Dimeri-ites für Dimeri-sierung und/oder Rekrutierung der NCoA-Komplexe sierung und/oder Rekrutierung der NCoA-Komplexe

RXR (RXR ())

HNF-4HNF-4 (())

COUP-TF COUP-TF (())

TLXTLX

PNRPNR

TR2 (TR2 ())

GRGR

ARAR

PRPR

MRMR

ER (ER (

ERR (ERR (

NGFI-B NGFI-B ((

SF-1/FTZ-F1 SF-1/FTZ-F1 ((

GCNFGCNF

SHPSHP

DAX-1DAX-1

TR (TR (

RAR (RAR ())VDRVDRPPARPPARPXRPXRLXRLXRFXRFXR

CAR (CAR ())Rev/Erb (Rev/Erb ())

RZR/ROR RZR/ROR (())

URUR

Inhalt des SeminarsInhalt des Seminars

JungbauerJungbauer HuberHuber

KlockerKlocker

ThalhammerThalhammer

TATA

NCoABasal Basal factorsfactors

TBP

CBP/CBP/p300p300

Wintersberger

LiteraturLiteratur

Aranda A, Pascual A (2001) Nuclear hormone receptors and gene expression Physiol.Reviews 81:1269-1304

Laudet V (1997) Evolution of the nuclear receptor superfamily: early diversification from an ancestral orphan receptor J.Mol.Endocrinol.19:207-26

Lazar MA (2002) Mechanism of action of hormones that act on nuclear receptors. www.Elsevier-international.com/e-books/pdf/451.pdf