aa1

123

Compui bioactivi de origine vegetal. Abordri biotehnologice IntroducerePlantele sunt surse consacrate de compui farmaceutici, aromatici i industriali, civilizaia fiind indisolubil legat de lumea plantelor, acestea constituind de milenii sursa major de obinere a unor bio-produse eseniale pentru supravieuirea ntregului regn animal. Adevrate uzine biochimice acionate de energia solar, plantele sintetizeaz nu numai compuii de baz necesari supravieuirii lor, din categoria hidrailor de carbon, proteinelor i lipidelor, ci i o gam larg de substane organice ce pot fi extrase n cantiti suficiente pentru a prezenta importan semnificativ ca materii prime cu variate aplicaii tiinifice, tehnologice i comerciale. i n prezent zestrea botanic a planetei stocheaz numeroase resurse nc insuficient cunoscute, care pot reprezenta alternative rentabile pentru obinerea unor materii prime deficitare n diferite domenii economice. Regnul vegetal continu s reprezinte principalul furnizor de compui fitochimici utilizai n diferite ramuri industriale cum sunt cele ale produselor farmaceutice, alimentare, cosmetice, agrochimice, cu valori comerciale exprimate n miliarde de dolari. Plantele constituie surse de nenlocuit pentru uleiuri industriale (volatile i fixe), arome, parfumuri, rini, gume hidrocoloidale, saponine i ali surfactani, colorani, pesticide, cauciuc natural, substane medicamentoase i muli ali compui speciali. Fitochimicalele cele mai cunoscute includ medicamente ca morfina i codeina (alcaloizi analgezici derivai din latexul de la Papaver somniferum), cocaina (alcaloid anestezic local, derivat din frunze de coca), chinina (alcaloid antimalaric derivat din scoar de Cinchona), curare i digitalina; parfumuri i esene ca uleiul de trandafir i jasminul; materii prime industriale ca acizi grai, ulei de pin i cauciuc natural; pesticide ca piretrinele i nicotina (figura 1). Statisticile recente evideniaz faptul c peste 1500 de compui noi sunt identificai anual n diferite specii de plante i c aproximativ un sfert dintre medicamentele prescrise conin substane de origine vegetal. Totodat rapiditatea procesului de extincie a speciilor i de ngustare a bazei genetice a resurselor vegetale n lume a stimulat att reconsiderarea importanei vitale a resurselor genetice ct i interesul pentru obinerea metaboliilor de interes prin metode neconvenionale. Progresele nregistrate n domeniul biologiei moleculare i al manipulrilor genetice ofer perspective promitoare pentru intensificarea biosintezei unor compui secundari, acionnd la nivelul genelor reglatoare. Prin sporirea numrului de copii ale acestora sau prin ataarea genelor respective la un promotor cu capacitate superioar de expresie, se poate realiza intensificarea activitii enzimelor implicate n procesul biosintetic (M. HOLDEN, 1989). Cu toate c exist adesea diferene relevante n ce privete sinteza i acumularea metaboliilor secundari n diferite esuturi sau n faze diferite ale dezvoltrii plantei, genomul fiecrei celule conine informaia necesar pentru a declana ntregul potenial al metabolismului secundar caracteristic speciei.

1

POLIKETIDE NAFTOCHINONE TERPENOIZI COZIZI TERPENOIDICI

LIGNIN? FLAVONOIZI

GLICOZIZI CIANOGENICISI DERIVATI AMINOACIZI ALCALOIZI NON- PROTEICI FENOLI POLIFENOLI TANINURI

CO2 H2O h FOTOSINTEZ

LIGNANI Celuloza Pectina Amidon Gume Mucilagii

GLUCIDE digitoxin steviozid

shikonin

ACID PIRUVIC AMINOACIZI reserpin codein morfin vincristin vinblastin atropin cocain nicotin

ACETIL-CoA MALONIL-CoA

mentol ulei de trandafir ulei de ment mirt terebentin steroli, steroizi caroten cauciuc natural

acizi grasi uleiuri vegetale ceruri

podofilotoxin vanilin

2

Figura 1. Originea biosintetic a unor compui vegetali; grupele majore de metabolii secundari sunt ncadrate n chenare (dup Balandrin i colab., 1985).

1. Semnificaia biologic a metaboliilor primari i secundariMetabolismul const din serii strns coordonate de reacii chimice mediate de enzime care se desfoar n cadrul organismului vegetal, avnd ca rezultat sinteza i utilizarea unei mari varieti de molecule din categoria glucidelor, aminoacizilor, acizilor grai, nucleotidelor i a polimerilor derivai de la acestea (polizaharide, proteine, lipide, ADN, ARN, etc.). Totalitatea acestor procese este definit ca metabolism primar iar compuii respectivi, care sunt eseniali pentru supravieuirea plantei, sunt descrii ca metabolii primari. Pe lng metaboliii primari, cu rol major n meninerea viabilitii plantei (proteine, hidrai de carbon i grsimi), sunt sintetizai i o serie de compui care includ terpene, steroizi, antociani, antrachinone, fenoli i polifenoli, care aparin aa numitului metabolism secundar. Metaboliii secundari sunt prezeni numai la anumite specii, adesea manifestnd specificitate de organ sau de esut, pot fi identificai numai ntr-un anumit stadiu al creterii i dezvoltrii n cadrul unei specii, sau pot fi activai numai pe parcursul perioadelor de stres, cauzate de pild de atacul unor microorganisme sau de srcirea nutrienilor. Sinteza lor pare fr semnificaie direct pentru celula sintetizatoare, dar poate fi decisiv pentru dezvoltarea i funcionarea organismului ca ntreg. Cu toate c sinteza lor nu constituie o parte indispensabil a programului expresiei genice i dezvoltrii, aceti metabolii nu reprezint simpli produi catabolici, deoarece au o structur foarte diversificat i pot fi adesea reinclui n procesele metabolice. De fapt delimitarea ntre metabolismul primar i secundar este incert, ntruct muli dintre intermediarii metabolismului primar ndeplinesc roluri similare i n cadrul metabolismului secundar. Astfel, unii aminoacizi obscuri sunt n mod cert metabolii secundari, n timp ce sterolii sunt compui structurali eseniali ai multor organisme i n consecin trebuie considerai metabolii primari. Suprapunerea rolurilor multor compui asigur o interrelaie strns ntre metabolismul primar i secundar, iar interpretarea delimitrii dintre aceste procese trebuie fcut cu pruden (figura 2). Ca urmare, dat fiind conservarea lor pe parcursul evoluiei regnului vegetal, este foarte plauzibil interpretarea c metaboliii secundari ofer un avantaj selectiv speciilor. De exemplu la speciile la care polenizarea este realizat de ctre insecte, acestea sunt atrase de culoare, parfum sau de prezena nectarului, caracteristici datorate metaboliilor secundari. Rolul pigmenilor este evident i n rspndirea fructelor i a seminelor de ctre psri i alte animale atrase de culorile vii ale structurilor vegetale. Stigmatele foarte colorate de la Crocus sativus, utilizate drept colorant alimentar, ca i culoarea rou intens a ardeilor iui (Capsicum frutescens) i iueala capsaicinei, au efect atractiv sau repelent asupra animalelor. Iat deci c metaboliii secundari vegetali pot servi ca atractani pentru polenizatori, pot reprezenta adaptri chimice la stresul factorilor de mediu sau pot constitui mijloace chimice ofensive, defensive sau protectoare mpotriva microorganismelor, insectelor , animalelor ierbivore i chiar mpotriva altor plante superioare (cum este cazul compuilor alelochimici, numii i ierbicide naturale), fiind evident rolul lor de compui activi n plan biologic, fiziologic i ecologic. Sunt numeroase exemplele de compui bioactivi din categoria metaboliilor secundari, dintre care trebuie s amintim n primul rnd nicotina, piretrinele i rotenona care sunt utilizate ca pesticide i anumii steroizi i alcaloizi utilizai in industria medicamentelor. Balandrin i Klocke (1988) au efectuat o evaluare amnunit a efectelor terapeutice i a valorii comerciale a celor mai importante substane bioactive extrase din plante, care includ sapogenine steroidale (digoxin i digitoxin), alcaloizi cu efect anticancerigen 3

(vincristin i vinblastin), alcaloizi beladonici (atropin, hiosciamin i scopolamin), i numeroi ali compui utilizai n industria medicamentelor, ca de exemplu: cocain, colchicin, alcaloizi de tip opium, fitostigmin, pilocarpin, chinin, chinidin, reserpin i d-tubocurarin (tabelul 1).

Figura 2. Diagram ce exemplific posibilele interaciuni dintre metabolismul primar i metabolismul secundar (dup M. M. Yeoman i C. L. Yeoman, 1996).

Valoarea metaboliilor secundari utilizai in industria farmaceutic poate ajunge la mii de dolari per kg. De exemplu alcaloizii de tip opium purificai (codeina i morfina) au valori de 650 1250 USD/kg iar uleiurile volatile eseniale ca cel de trandafir sunt evaluate la peste 2000 3000 USD/kg. Alcaloizii extrai din Catharanthus roseus ating valori de pn la 20.000 USD/g. Aceste preuri ridicate se datoreaz att metodelor costisitoare de izolare ct i cantitilor extrem de reduse ce pot fi obinute din sursele vegetale. Astfel, cantitatea de vincristin izolat din plante de Catharanthus roseus este de aproximativ 0,0003 0,0005 %, fiind necesare 500 kg de frunze pentru a produce numai 1 g de vincristin purificat, proces care dureaz mai multe sptmni. Cu toate acestea, plantele rmn singurele surse de extracie, ntruct muli dintre metaboliii secundari de interes farmaceutic nu pot fi sintetizai pe cale chimic, fiind stereostructuri complexe cu muli centri chirali care pot fi eseniali pentru activitatea biologic. Metaboliii vegetali primari i secundari de interes economic au cteva caracteristici comune: majoritatea sunt compui chimici non-proteici, pot fi extrai din materialul vegetal prin distilare cu aburi, cu solveni organici sau apoi, iar cu excepia biopolimerilor cauciucului natural, a taninurilor condensate i a unor polizaharide precum gumele, pectinele i amidonul, sunt compui cu greutate molecular mic (sub 2000 Da).

4

Tabelul 1. Exemple de compui de interes farmaceutic obinui la scar comercial din surse vegetale (dup Balandrin i Klocke, 1988) Clasa de compui A. Steroizi Hormoni (derivai ai diosgeninei, hecogenin i stigmasterol) Glicozizi digitalici (digoxin, digitoxin) B. Alcaloizi Alcaloizi beladonici (atropin, l-hiosciamin, scopolamin) Alcaloizi tip opium (codein, morfin) Reserpin Vincristin, vinblastin Physostigmin Pilocarpin Chinin, chinidin Colchicin Cocain d-Tubocurarin Atropa belladonna, Datura stramonium Papaver somniferum Rauwolfia serpentina Catharanthus roseus Physostigma venenosum Pilocarpus sp. Cinchona sp. Colchicum autumnale Erythroxylon coca Strychnos sp., Chondodendron tomentosum Anticolinergici Analgezici Antihipertensivi, psihotropici Anticancerigeni Cholinergic Cholinergic Antimalaric,anti-aritmie cardiac Gut Anestezic local Relaxant muscular Dioscorea sp., Glicine sp. Digitalis purpurea, D. lanata Contraceptivi orali i ali hormoni steroizi Cardiotonici Sursele botanice Utilizarea terapeutic

2. Interdependena dintre plante i mediul nconjurtorPlantele n procesul dezvoltrii lor filogenetice s-au adaptat la anumite condiii de via. Rspndirea geografic a plantelor este determinat de cerinele acestora fa de factorii externi i de gradul lor de adaptare la condiiile mediului nconjurtor. Plantele nu cresc n mod hazardant, la ntmplare; ele sunt aranjate n asociaii i comuniti ecologice bine definite. n timp ce gruprile sau asociaiile ecologice mai mari (pduri, stepe, mlatini etc.) sunt determinate n mare msur de factorii climatici i edafici, asociaiile mai intime i mai restrnse au vegetaia diferit n acelai cadru geografic, sub influena acelorai factori climatici i edafici. n acest ultim caz, pe lng factorii menionai acioneaz i ali factori 5

externi i interni, fapt ce determin o grupare mai restrns a plantelor. Pentru ca plantele s supravieuiasc i s dea producii sporite la hectar ele trebuie s se adapteze condiiilor mereu schimbate ale mediului nconjurtor. Dac plantele nu se adapteaz mediului lor de via, creterea i dezvoltarea este redus foarte mult i, ntr-un timp relativ scurt, plantele vor dispare. Pe msur ce unul sau mai muli factori de cretere nu sunt asigurai la un nivel corespunztor, omogenitatea condiiilor de via este schimbat i determin limitarea productivitii plantelor. Dac n cursul creterii i dezvoltrii plantelor apar anumite condiii nefavorabile, plantele vor suferi anumite dereglri, n funcie de potenialul de rezisten biochimic i fiziologic de care dispun speciile sau soiurile respective fa de factorii duntori. Prin noiunea de rezisten fiziologic se nelege nsuirea organismelor de a supravieui sub influenele duntoare din mediul nconjurtor i capacitatea lor de a asigura o desfurare normal a proceselor vitale. Prin rezisten biochimic se nelege nsuirea organismelor de-a se opune modificrii sensibile a proceselor metabolice sub aciunea unor factori de mediu nefavorabili. Plantele reuesc s se adapteze mediului de via schimbat prin modificarea sistemului lor enzimatic, prin biosinteza unor anticorpi, prin biosinteza unor inhibitori sau activatori, prin acumularea de substane osmotic active etc. Plantele sunt considerate ca fiind produsul interaciunii dintre constituia intern i mediul lor de via. Adaptarea reprezint flexibilitatea (capacitatea) organismului viu de a crete i a se dezvolta ntr-un mediu de via schimbat. Adaptarea plantelor se petrece ntr-o perioad de timp mai ndelungat i se realizeaz complet n decursul mai multor generaii. Prin aclimatizare se nelege adaptarea plantelor la mediul nconjurtor n cadrul unui ciclu biologic de via, n timpul vieii individuale a organismelor. Factorii din mediul nconjurtor care acioneaz asupra plantelor pot fi mprii n cinci grupe: 1. Factorii climatici, care includ temperatura, intensitatea luminii, lungimea de und a radiaiilor absorbite, durata de iluminare, umiditatea, efectul sezonal. 2. Factorii edafici. Toate plantele, cu excepia epifitelor i parazitelor, i procur substanele minerale din sol. n sol se afl, de asemenea, ciupercile ce formeaz micorize pe rdcinile unor copaci, microorganismele fixatoare de azot (la plantele leguminoase), ionii unor metale grele toxice, care mpreun cu excesul de salinitate, excesul de umiditate sau uscciune, determin stresarea biochimic a plantelor. 3. Poluanii nenaturali. n cadrul acestei categorii de factori se includ poluanii atmosferici (praf, gaze industriale, gaze de eapament etc.), poluanii apei i ai solului, urmarea folosirii neraionale a substanelor fitofarmaceutice, a ngrmintelor chimice i a amplasrii unor obiective industriale i zootehnice n zonele de cultur. 4. Animalele. Cu toate c ntre plante i animale exist numeroase raporturi de simbioz (polenizarea, micorize, raporturile n cadrul unor fitocenoze etc.), ierbivorele sunt ostile plantelor deoarece existena lor depinde de prezena plantelor furajere. Se cunosc numeroase i diferite mijloace de aprare ale plantelor fa de aciunea animalelor ierbivore. 5. Competiia ntre plante. Competiia ntre plante se poate realiza att prin intermediul unor relaii interspecifice, ct i n cadrul unor relaii intraspecifice. Plantele conin mult mai muli compui secundari de metabolism dect animalele. Termenul de plant se refer n ecologie, de obicei, la plantele superioare, mai cu seam la angiosperme, gimnosperme i ferigi. Ciupercile, bacteriile i virusurile sunt, n general, denumite ca microorganisme. Algele, muchii i lichenii sunt mai puin exemplificate deoarece biochimia lor ecologic nu a fost studiat n detaliu. Repartizarea n mare a 6

compuilor secundari din plantele superioare este prezentat n tabelul 2. Prezena unor compui secundari n plante se explic prin faptul c plantele fiind fixate prin rdcini n sol, nu se pot deplasa i deci nu pot rspunde deschis ca animalele la aciunea factorilor de mediu. Compuii secundari de metabolism ajut plantele la o mai bun i uoar adaptare la mediu, la stabilirea unor interrelaii ct mai complexe ntre plante i animale. Peste 45 din compuii secundari de metabolism prezeni n animale sunt de origine vegetal. O parte din compuii secundari mresc rezistena plantelor la atacul microorganismelor. Unii compui sun toxici i constituie arme de aprare ale plantelor mpotriva ierbivorelor, insectelor i a altor duntori. Tabelul 2. Principalele clase de compui vegetali secundari implicai n interaciunea dintre organismele vegetale i animale (dup G. Neamu, 1983) Nu mr ul Clasa de Distribuirea compuilor chimici Aciunea fiziologic apr compui vegetali oximat iv de com pui chi mici a. Compui cu 5.500 Larg rspndii n Angiospermae, n Majoritatea sunt azot special n rdcini, frunze i fructe toxici, cu gust amar Alcaloizi Amine 100 Larg rspndii n Angiospermae, Majoritatea au miros predomon n flori respingtor. Unele sunt halucinogene Aminoacizi neproteici Glicozide cianogenetice Glucozide b. Terpenoide Monoterpene Lactone sesquiterpenice Diterpene Saponine Limonoide Cucurbitacin 400 30 75 1000 600 1000 500 100 50 Sunt n general larg rspndii. Predomin n seminele leguminoaselor Sporadice, n special n frunze i fructe Cruciferae i alte 10 familii Larg rspndite n uleiuri eterice Muli sunt toxici Otrvitoare (ca HCN) Gust amar i acid Plcut mirositoare

Predomin n Compositae. Sunt prezente Unele sunt amare, i n alte Angiospermae toxice i alergice Larg rspndite n latex i n rinile plantelor Sunt identificate n peste 700 familii de plante Prezente mai ales n Rutaceae, Meliaceae i Simaroubaceae Predomin n Cucurbitaceae 7 Unele sunt toxice Produc hemoliza globulelor sanguine Gust amar Gust amar, sunt

toxice Cardenolide Carotenoide c. Fenoli Fenoli simpli Flavonoide Chinone d. Ali compui Poliacetilene 150 400 200 1000 500 650 Comune n Apocynaceae, Aschepiadaceae i Scrofulariaceae Universal rspndite n frunze, adesea n flori i fructe Universal rspndii n frunze i alte esuturi Universal rspndite n Angiospermae, Gimnospermae i Ferigi Larg rspndite, predomon n Rhamnaceae Larg rspndite, predomin n Compositae i Umbeliferae Gust amar, toxice Substane colorate Aciune antimicrobian Adesea colorani Colorani Unele toxice

Unii compui secundari ndeplinesc rolul de inhibitori i stimulatori de cretere a plantelor, alii, cum sunt carotenoidele i flavonoidele, absorb energia luminoas i iau parte n procesul de fotosintez, att prin cedarea energiei absorbite clorofilei a, ct i prin aprarea clorofilelor i a altor substane biologic active de degradri fotooxidative. Unele substane secundare determin gustul i aroma fructelor i legumelor, iar eterii, esterii, substanele terpenice etc., prin mirosul lor plcut, au un rol important n polenizarea plantelor. Pigmenii, care, de asemenea, sunt produi secundari de metabolism, au un rol important n reaciile de oxidoreducere. Ei determin culoarea florilor, fructelor, legumelor, a tuturor organelor plantelor. Au un rol nsemnat n procesul de polenizare. Industria alimentar, industria farmaceutic, industria cosmetic i cea textil se bazeaz, n mare parte, pe utilizarea compuilor metabolici secundari din organismele vegetale.

3. Substanele vegetale de origine secundarExist n corpul vegetal o serie de substane organice de o inepuizat diversitate i mulime, rezultate prin biosintez sau care reprezint produse intermediare sau finale pe parcursul proceselor catabolice, fr nici o importan structural, fr rosturi fiziologice fundamentale sau chiar fr nici un rol fiziologic experimental dovedit. Ele au fost numite, de ctre CZAPEK, substane vegetale secundare. Aa sunt glicozizii, acizii organici, lipide de secreie, compuii terpenici, substanele aromatice neazotate, antocianidinele, substanele secundare azotate (amine, betaine, alcaloizi, compui cianici) etc. n plante, aceste substane secundare sunt grupate n diferite clase pe baza structurii chimice i proprietilor asemntoare. Denumirea de substane vegetale secundare a fost adaptat convenional i se refer la originea i nu la importana lor. Substanele secundare apar n organismul vegetal n procesele de formare sau de degradare a substanelor plastice (glucide, lipide, protide). Ele rmn ca atare, depunndu-se la nivelul esuturilor sau se elimin. Substanele secundare reprezint deci produse intermediare i finale ale metabolismului. Sunt produi secundari, cu rol metabolic nc puin cunoscut, cu repartiie foarte neregulat, dar localizai n zone anatomice bine determinate ale plantei. Rolul lor este important att n ceea ce privete calitatea alimentar i gustativ a diferitelor produse ct i interesul tehnic, industrial, agricol, farmaceutic etc. Datorit frecventelor lor aplicaii industriale i terapeutice, multe din ele au fost aprofundat cercetate din punct de vedere chimic, dar ele au format prea puin obiectul unor 8

cercetri fiziologice. La unele din ele se constat sau se bnuiesc oarecare prestaii de ordin metabolic sau ecologic, cele mai multe din ele ns nici nu pot fi nc interpretate din acest punct de vedere. n ultimul timp s-a ncercat s se reconstituie geneza lor n celul, o problem categoric fiziologic i fr ndoial important att pentru mecanismul ei biologic, ct i pentru funciile de secreie i excreie, prea puin cunoscute pn acum, ale plantei. Problema lor s-a ncercat s se elucideze i n perspectiv filogenetic. S-a constatat de drept cuvnt c ele sunt din ce n ce mai numeroase i mai variate n procesul evolutiv al regnului vegetal. Alcaloizii de exemplu lipsesc la Talofite, cu excepia unor ciuperci puine la numr; la ferigi i Gimnosperme sunt excepionali, la monocotile rari i abia la unele familii dicotiledonate devin frecveni. Antocianidinele att de generalizate la Fanerogame apar nti abia la un muchi, ca s nu mai vorbim de varietatea specific de antociani descoperit la indivizii masculi ai algei Chlamydomonas. Cele mai srace vegetale n substane organice secundare sunt tocmai Cianoficeele i Cloroficeele. Garniturile enzimatice ale celulei de asemenea cresc i se diversific pe msur ce ne ndeprtm de aceste grupuri, astfel c i producia substanelor secundare crete, de ndat ce crete diversitatea calitativ a proceselor metabolice principale. Substanele vegetale de origine secundar pot fi grupate n: pigmeni vegetali, glicozide, lignine, taninuri, uleiuri eterice, rini, balsamuri, alcaloizi, substane antibiotice, fitoncide, insecticide vegetale etc. Dintre substanele vegetale de origine secundar se vor prezenta n continuare cele mai importante din punctul de vedere biologic.

3.1. Pigmenii vegetaliSunt diferii dup culoarea pe care o dau: clorofila-verde, carotenul-rou-oranj, xantofila-galben, flavonele-galbene, antocianiipigmenii vacuolari ce variaz de la rou la albastru, dup pH-ul acid sau bazic al sucului celular. Pe lng rolul lor de atragere a insectelor polenizatoare, ei ocup un loc central ca fotoreceptori n fotosintez i fotoperiodism. Pigmenii vegetali sunt colorani naturali ai florilor, frunzelor, fructelor i ai esuturilor plantelor. Unii sunt rspndii n tot regnul vegetal, iar alii se ntlnesc numai n anumite plante sau n anumite organe ale plantelor. n plante, pigmenii se pot prezenta n stare liber sau form de combinaii cu holoproteide i glucide, formnd heteroproteide i glicozide. Pigmenii vegetali dau aroma, gustul i coloritul produselor vegetale. Pigmenii pot intra n constituia coenzimelor redox, unii snt protectori ai enzimelor i ai activitii enzimatice, reglnd potenialul redox al mediului biochimic, alii particip direct sau indirect la procesul fotosintezei etc. n funcie de structura chimic, n general foarte variat, pigmenii vegetali pot fi mprii n mai multe grupe: pigmenii porfirinici, pigmeni carotenoidici, pigmenii chinonici, pigmeni flavonoidici, pigmeni indolici etc. (cromoproteidele cu clorofil i hem, ca i cloroglogina, leghemoglobina, citocromii, catalaz etc.), au rol biocatalitic important. Dintre pigmenii porfirinici, foarte rspndii n regnul vegetal sunt pigmenii clorofilieni, reprezentai prin clorofila-a, clorofila-b i derivaii lor de oxidare (oxiclorofile). Acetia dau culoarea verde i galben verzuie a frunzelor i tulpinilor i particip n procesul de fotosintez.PIGMENII PORFIRINICI

reprezint totalitatea carotenoidelor vegetale. Acetia sunt pigmenii cei mai rspndii din tot regnul vegetal. n regnul animal, aceti pigmeni provin din alimente de natur vegetal. Carotenoidele sunt pigmeni colorai n galben, portocaliu, rou, violet etc. n organismul vegetal se afl n stare liber sau n combinaie cu holoproteidele i glucidele (carotenoproteide, glicozide carotenoidice). PigmeniiPIGMENII CAROTENOIDICI

9

carotenoidici sunt rspndii n toate organele plantelor cu sau fr clorofil (frunze, fructe, tulpin, bulb, semine etc.). Coninutul n pigmeni carotenoidici depinde de natura speciei i de influena condiiilor de mediu (tabelul 3). Tabelul 3. Coninutul mediu al carotenoidelor din legume i fructe (dup G. Neamu i Ghe. Cmpeanu, 1983) Carotenoide Carotenoide PRODUSUL PRODUSUL mg/100 g produs mg/100 g produs Morcovi Spanac Fasole verde Mazre boabe verde Salat verde Tomate Ardei verde Ardei rou 6,0 24,0 5,0 6,5 0,17 0,22 0,4 1,6 0,2 0,25 1,5 2,0 pn la 2,5 10,0 Caise Piersici Mere Viine, Zmeur Mure Fragi Lmi Prune uscate 2,0 2,2 0,76 0,3 0,8 0,3 0,3 0,8 0,3 0,5 0,4 0,1

Datorit structurii de hidrocarbur, pigmenii carotenoidici sunt substane hidrofobe, solubile numai n solveni organici, uleiuri i grsimi. Din punct de vedere chimic, pigmenii carotenoidici se caracterizeaz printr-o structur cu legturi duble conjugate, care determin caracterul nesaturat i deci posibilitatea reaciilor de oxidare i autooxidare (n prezena aerului), capacitatea de absorbie a unor radiaii luminoase etc. Rolul biochimic al pigmenilor carotenoidici este determinat de structura lor chimic i de proprietile menionate mai sus. Carotenoidele, ca i terpenele, sterolii, fitolul, vitaminele K, vitaminele E etc., au ca unitate structural repetitiv izoprenul activat, care poate forma catene de hidrocarburi de tip carotenoidic, steroidic etc. Carotenoidele se mpart n: hidrocarburi carotenoidice i derivai oxigenai ai hidrocarburilor carotenoidice. Hidrocarburi carotenoidice sunt carotenoide cu 40 atomi de carbon, cu formula brut C40H56. Dintre acestea cele mai importante sunt : licopina, -carotenul, -carotenul, -carotenul. Licopina este o substan cristalin, de culoare rou-violet, insolubil n ap, solubil n solveni organici. Este colorantul fructelor i tomatelor. -Carotenul este o substan cristalin de culoarea cuprului, solubil n solveni organici. Prin nclzire, -carotenul este posibil s se transforme n -caroten. n plante se afl n cantiti mai mici dect -carotenul. -Carotenul se prezint sub form de cristale violete, solubile n solveni organici. Este foarte rspndit n tot regnul vegetal nsoind permanent clorofila. Prin hidroliz enzimatic oxidativ, -carotenul se transform n dou molecule de vitamin A1. Carotenul este principala provitamin A. -Carotenul se prezint sub form de cristale roii cu reflexe albastre, solubile n solveni organici. -Carotenul este puin rspndit n regnul vegetal. Cel mai mult se gsete n morcov. Derivaii oxigenai ai carotenoidelor sunt alcooli, cetone, acizi etc., provenii din 10

hidrocarburile carotenoidice. Se cunosc foarte muli reprezentani ai acestor derivai dintre care amintim : xantofilele, cetonele carotenoidice, acizii carotenoidici etc. XANTOFILELE. Sunt derivai hidroxilici ai hidrocarburilor cerotenoidice. Se cunosc mai multe xantofile, dintre care cele mai importante sunt luteina i zeaxantina. Luteina este o substan cristalizat de culoare galben cu luciu violet. nsoete -carotenul i clorofila n toate plantele verzi. Este colorantul galben al florilor. Se gsete de asemenea n glbenuul de ou, n esuturile animale i n special n ovar. Zeaxantina se prezint sub form de cristale portocalii. Structural se deosebete de lutein prin poziia unei duble legturi ( 2 cicluri ionice). CETONE CAROTENOIDICE. Dintre cetonele carotenoidice menionm rodoxantina i astacina. Rodoxantina este o substan de culoare roie-albstruie, rspndit n plantele acvatice i n conifere. Este o diceton carotenoidic. Astacina este o substan de culoare violet. Din punct de vedere chimic este o tetraceton carotenoidic. ACIZI CAROTENOIDICI. Dintre acizii carotenoidici, cu mai puin de 40 atomi de carbon, cei mai importani sunt bixina i crocetina, pigmeni galbeni. Pigmenii carotenoidici intervin n procesul de fotosintez, avnd un rol att n absorbirea energiei luminoase ct i n protejarea de autofotodistrugere a moleculelor de clorofil sau alte substane active (citocromi, peroxidaze, catalaze, pigmeni flavonoidici, vitamina B12, vitaminele E, vitaminele K etc.). Deoarece pot fixa oxigenul formnd compui oxigenai puin stabili, pigmenii carotenoidici intervin n procesele de oxidoreducere. Pot forma metabolii intermediari care s stimuleze sau s inhibe dezvoltarea plantelor. n organismul animal aceti pigmeni ndeplinesc rolul de provitamine A. Sunt importani de asemenea pentru aciunea ce o pot avea n fototropii i fotoaxii. Carotenoidele au utilizri numeroase n industria farmaceutic, cosmetic, industria alimentar (ca antioxidani i colorani naturali), zootehnie (furajarea animalelor) etc. sunt substane care conin n molecul, un nucleu benzochinonic, naftochinonic, antrachinonic sau fenantrenchinonic cu proprieti cromofore. Pigmeni chinonici : p-Benzochinona, Naftochinona, Antrachinona, 3,4-Fenantrenchinona. Parachinonele sunt colorani galbeni, orto-chinonele sunt colorani roii, iar amestecul lor formeaz colorani portocalii. Pigmenii chinonici combinai cu glucidele sub form de glicozide sunt rspndii n tot regnul vegetal, n alge, insecte i animale marine. Pigmenii fenantren chinonici se gsesc rar n natur. Pigmenii chinonici colorai prin reducere trec reversibil n hidrochinone, care sunt substane incolore. n unele organisme vegetale, pigmenii chinonici apar iniial sub form de hidrochinone incolore, iar pe msura creterii organismelor, pigmenii se oxideaz i se formeaz chinone colorate. Prin faptul c se pot reduce reversibil n hidrochinonele corespunztoare, pigmenii chinonici joac un rol nsemnat n reaciile de oxidoreducere. Pot ndeplini rolul de transportori de hidrogen neenzimatici. Pigmenii chinonici intr n constituia unor enzime de oxido-reducere. PIGMENII BENZOCHINONICI. Se gsesc n cantiti mai mari, sub form de glicozide, n plantele medicinale, ciuperci i bacterii. Ca reprezentani mai importani sunt: ubichinona, care intervine n procesul respirator i 2,6-dimetoxibenzochinona, colorant al florilor. PIGMENII NAFTOCHINONICI. Se ntlnesc n plantele superioare. Spre exemplu, juglona (5-hidroxil-1,4-naftochinona) se gsete n coaja nucilor verzi. Vitaminele K conin de asemenea un nucleu naftochinonic, iar vitaminele E un nucleu derivat din naftochinon (croman). Datorit structurii lor aceste vitamine formeaz sisteme oxidoreductoare cePIGMENII CHINONICI

11

intervin n procesele respiratorii.PIGMENII ANTRACHINONICI. Se gsesc predominant n plantele superioare i n

ciuperci sub form de combinaii (glicozide). Reprezentanii cei mai importani sunt: alizarina, purpurina i chinalizarina, substane cristaline colorate n rou portocaliu. Cu cationii unor metale formeaz compleci chelatici folosii ca mordani n vopsitorie. Datorit structurii chimice pigmenii antrachinonici pot participa la sistemele redox din plant. Pe cale chimic, se poate trece de la alizarin i chinalizarin la purpurin. Alizarina - pigment cu structur antracenic, duhidroxilat, utilizat din antichitate drept colorant. Se gsete n cantitate mai mare n plantele din familiile Rubiaceae, Ramnaceae, Polygonaceae etc. ct i n ciuperci. Substan solid, cristalin, de culoare roie, cu p.t. 2800C i p.f. 4300C, insolubil n ap, dar solubil n alcool i n soluii alcaline. Reacioneaz cu metalele i formeaz compleci (chelai) colorai, denumii lacuri, a cror culoare depinde de ionul metalic. Purpurina - pigment antracenic trihidroxilat, de culoare roie-purpurie, folosit din antichitate n vopsitorie. Se afl n aceleai familii de plante ca i alizarina. Cu metalele formeaz compleci ciclici interni (chelai), care diversific nuana culorii. Ca mordant se folosete Al(OH)3, cu care pigmenii antrachinonici formeaz lacuri. Flavonoidele sunt pigmeni fenolici care conin n molecula lor un heterociclu piranic sau furanic condensat cu un inel benzenic. De heterociclu se cupleaz un alt inel benzenic. Inelele au grupri hidroxilice, ceea ce determin caracterul fenolic al acestor pigmeni. Flavonoidele sunt pigmeni vegetali care predomin n plantele superioare. Se gsesc n flori, fructe, frunze, tulpini, rdcini, scoara copacilor etc. n cantitate mic se gsesc n unele alge, n microorganisme i n unele insecte (flavone). Majoritatea flavonoidelor sunt colorate i contribuie n mare parte la formarea culorii florilor i a fructelor. Se gsesc n natur n stare liber, dar mai ales sub form de glicozide. Sub aspect chimic pigmenii flavonoidici sunt glicozide fenolice, solubile n ap. Se gsesc n sucul vacuolar i n cromoplaste. Se cunosc 6 tipuri de flavonoide: flavani, antocianidine, flavone, flavanone, calcone i aurone. Aceste grupe se deosebesc ntre ele prin felul heterociclului i prin numrul i poziia gruprilor hidroxilice i metoxilice, legate de inele benzenice. FLAVANII (cromanii) sunt pigmeni care deriv de la flavan (2-fenil-benzopiran, croman). Ei au n molecul un inel benzopiranic. Au tendin de polimerizare i formeaz catechine care intr n constituia taninurilor catechinice. ANTOCIANIDINE I ANTOCIANI. Antocianidinele sunt pigmeni care deriv de la 2fenil-benzopiren (2-fenil-cromen). Ei sunt principalii pigmeni care dau culoarea roie i albastr florilor i fructelor. Se gsesc n natur de obicei sub form de glicozide, care poart numele de antociani. Cele mai importante antocianide sunt: pelargonidina, cianidina i delfinidina, care se deosebesc ntre ele prin numrul i poziia gruprilor hidroxilice de pe inelul benzenic C. Pelargonidina se afl n florile de mucat, cianidina n florile de cicoare i de centauree, delfinidina n florile de nemior (Delfinum consolida). n antociani, glucidele (monoglucidele, diglucidele) se leag de antocianidine (aglicon), de obicei la hidroxilul de la C-3 de pe heterociclu. n natur predomin antocianii monoglicozidici, dar se cunosc i antociani diglicozidici. Prin metilarea antocianidinelor menionate, se obin noi pigmeni cu culori diferite, cum sunt: peonidina, pentunidina i malvidina. Antocianii se gsesc n flori singuri i mai cu seam n amestec cu ali pigmeni, formnd o varietate mare de culori. Florile roz, roii, rou aprins conin predominantPIGMENII FLAVONOIDICI.

12

pelargonidin, florile purpurii i viinii conin cianidin. Antocianii sunt solubili n ap i alcool, greu solubili n eter, benzen i cloroform. Se extrag cu ap sau alcool n mediu de acid clorhidric. Din extractul obinut, dac se adaug eter, precipit clorura de antocian. Cu acizii minerali antocianii formeaz sruri de culoare roie, stabile la diluare (spre deosebire de flavone). Antocianidinele cu grupri hidroxilice nvecinate formeaz cu metalele (Al, Fe) compleci de culoare albastr. Antocianii i schimb culoarea n funcie de pH, fapt pentru care se utilizeaz ca indicatori acido-bazici. FLAVONE I IZOFLAVONE. Sunt pigmeni galbeni care deriv de la 2-fenilbenzopiron (2-fenil-cromon) i respectiv de la 3-fenil-benzopiron (3-fenil-cromen). n natur, flavonele i izoflavonele se gsesc, de obicei, sub form de glicozide i sunt larg rspndite. Se cunosc peste o sut de flavone care se gsesc n flori, fructe, frunze, n lemn i scoara copacilor. Flavonele i izoflavonele conin pe inelele A i C grupri hidroxilice i metoxilice. Dac pe inelul heterociclic se afl grupri hidroxilice, pigmenii se numesc flavanoli i izoflavanoli. Dintre flavonele mai rspndite, fac parte apigenina, luteolina i quercitrina. Flavonele sunt substane cristaline, de culoare galben, solubile n ap i alcool. n mediu alcalin, inelul piranic se deschide i se formeaz dicetone. Flavonele au maxime de absorbie cuprinse ntre 335-350 nm, iar flavanolii ntre 360-380 nm. Cu metalele, flavonele formeaz compleci. Se dizolv n acid sulfuric concentrat dnd soluii galbene, datorit formrii srurilor de flaviliu. Flavonele prezint n ultraviolet dou sau trei benzi de absorbie caracteristice. Ele protejeaz n organism oxidarea vitaminei C i a adrenalinei. Absorb radiaiile ultraviolete i protejeaz citoplasma i clorofila de aceste radiaii. Se gsesc n cantitate mai mare n plantele tropicale i n cele din regiuni montane i alpine. Flavanolii care au un numr mare de grupri hidroxilice i metoxilice pe inelul A sunt intens colorai n galben. Aa sunt gosipetina, quercetagetina care imprim culoarea galben florilor de bumbac, primulelor, numeroaselor compozite. Florile albe au un coninut redus de flavone i de flavanoli. FLAVANONE, CALCONE I AURONE. Flavanonele deriv de la 2-fenil-dihidrobenzopiron, calconele de la benziliden - aceto - fenon, iar auronele de la 2-benzilidencumaranon. Flavonele sunt pigmeni incolori (datorit ntreruperii sistemului cromoformic) care nsoesc flavonele. n mediu bazic se transform n calcone (prin ruoerea heterociclului), iar acestea n mediu acid se ciclizeaz i refac flavonele. Prin oxidare se transform n aurone, care au o culoare galben-aurie intens i se gsesc predominant n florile unor compozite. Flavanonele, calconele i auronele au de asemenea grupri hidroxilice pe inelele A, C i chiar pe heterociclu. Ele se gsesc n natur de obicei sub form de glicozide. Auronele i calconele apar de obicei n flori, iar flavanonele n flori, frunze, lemn etc. Prezena flavanonelor n organismele vegetale mrete rezistena acestora la atacul insectelor i al microorganismelor. Ele influeneaz gustul, aroma i stabilitatea unor preparate extrase din plante. Unele flavonoide se utilizeaz ca substane antioxidante la conservarea grsimilor, altele se utilizeaz ca produse farmaceutice. Flavonoidele pot forma n celule sisteme de oxido-reducere, care au un rol nsemnat n organism. Unele flavonoide sunt folosite ca vitamine P n terapeutic. Prin diferite reacii de oxidare, reducere, izomerizare etc., diferite grupe de flavonoide se pot transforma reciproc unele n altele, ceea ce constituie un mare avantaj pentru plante. n funcie de necesitile din plante, unele flavonoide se pot transforma n altele, realizndu-se o bun utilizare a acestor pigmeni. fac parte din grupa pigmenilor azotai. Ei se gsesc n regnul vegetal sub form de cromoproteide sau glicozide.PIGMENII INDOLICI

13

Indigoul este un pigment care se utilizeaz din antichitate ca i colorant. Se gsete sub form de glicozid numit indican, n Indigofera tinctoria, plant originar din India i n Isatis tinctoria, plant cultivat n Europa. Prin macerarea plantelor n mediu apos, se produce hidroliza enzimatic a indicanului i se obine indoxilul, care prin autooxidare va forma indigoul. Indirubina este un izomer al indigoului, numit i rou de indigou. Purpura antic este un derivat al indigoului (6,6-dibrom-indigo) care se extrage din unele molute (Murexbranderia) i servete ca i pigment colorat nc din antichitate. Din grupa pigmenilor azotai fac parte i melaninele, care sunt pigmeni de culoare nchis, ce se formeaz din aminoacizi aromatici (fenilalanina i tirozina). Se gsesc n plantele superioare, la animale vertebrate i nevertebrate, n cuticula insectelor. Tot din grupa pigmenilor azotai fac parte unele cromoproteine colorate, cum sunt cloroglobulinele, hemoglobulinele, citocromii etc. Cloroglobulinele au rolul esenial n fotosintez, cel mai important proces de biosintez de pe pmnt.

3.2. AlcaloiziiSunt substane organice azotate complexe, produse doar de ctre organismul vegetal, ce prezint o reacie alcalin mai mult sau mai puin important. Sunt produi finali ai metabolismului azotat. Se cunosc aproximativ 5000 de alcaloizi naturali diferii. Alcaloizii se pot localiza n frunze (ceai, coca), semine (cafea), rdcini i scoar, spermoderm (brndue), "scoara" fructului (mac), canale secretoare, laticifere etc. n general alcaloizii se caracterizeaz prin structuri heterociclice. Datorit azotului din molecul, prezint caracter bazic. Sunt substane insolubile n ap i solubile n solveni organici. Reacioneaz cu acizii minerali i formeaz sruri solubile. n plante se gsesc sub form de sruri ale acizilor oxalic, citric, malic, fumaric etc. Dau reacii caracteristice de precipitare cu numeroi reactivi (iodura de potasiu, clorura de platin, acid picric, acid sulfuric etc.). Exercit efecte fiziologice considerabile asupra omului i asupra animalelor. Alcaloizii sunt folosii n terapeutic ca narcotice i calmante. Unii alcaloizi sunt otrvuri puternice, spre exemplu curara, ce are capacitatea de a paraliza sistemul nervos. Se consider c alcaloizii constituie mijloace de aprare ale plantelor mpotriva insectelor. Unii alcaloizi, de exemplu nicotina, joac rol n procesele enzimatice de oxido-reducere. Plantele productoare de alcaloizi sunt dicotiledonatele, iar n msur mai mic monocotiledonatele i criptogamele. n general o plant conine mai muli alcaloizi. Coninutul n alcaloizi depinde de vrsta plantei, regiune, clim i anotimp. Algele i muchii nu au alcaloizi. Ei sunt rari la ciuperci (ergotamina), la pteridofite (nicotina de la Equisetum, coniina sporilor de Lycopodium) i la gimnosperme (efedrina de la Ephedra). La angiosperme, anumite familii sunt reputate prin bogia lor n alcaloizi : Solanaceae (solanina, nicotina, hiosciamina, atropina .a.), Rubiaceae (cofeina, ernetina, chinina), Papaveraceae (morfina, papaverina, codeina, narseina .a.). Alcaloizii mai importani sunt : coniina, nicotina, tropanul, atropina, cocaina, chinina, papaverina, morfina, codeina, stricnina, cofeina etc. CONIINA se extrage din seminele de cucut. Este o otrav puternic, care n doze mari produce moartea prin paralizia centrului nervos respirator. Acest alcaloid prezint nucleu piperidinic. NICOTINA ( - piridin - N - metilpirolidina) este principalul alcaloid din tutun. n cantiti mici este excitant al nervilor centrali i periferici i provoac contracia vaselor sanguine. n cantiti mari este un toxic puternic. Nicotina este o substan cancerigen. Este un alcaloid care conine un nucleu piridinic legat de un heterociclu pirolidinic. 14

TROPANUL, ATROPINA I COCAINA se extrag din solanaceae, convolvulaceae, dioscoraceae i eritroxilaceae. Din punct de vedere chimic aceti alcaloizi sunt esteri ai unor alcooli derivai de la tropan. Atropina acioneaz asupra sistemului nervos parasimpatic. Ea produce o relaxare a muchilor netezi i se folosete ca medicament antispasmodic. n cantitate mic dilat pupila, n cantiti mari este toxic. Cocaina, n cantiti mici este anestezic local, iar n cantiti mari produce paralizia nervului central. MORFINA I CODEINA se extrag din opiu. Morfina determin o insensibilitate la dureri datorit aciunii asupra sistemului nervos central. Codeina nu posed nsuiri narcotice. n cantitate mic se folosete ca medicament contra tusei. Codeina are structur chimic similar morfinei cu deosebirea c din nucleul A este nlocuit hidroxilul cu o grupare metoxilic. Morfina i codeina conin n molecul un inel fenantrenic parial saturat. CHININA se extrage din arborele de chinin. Se utilizeaz la combaterea malariei. Regleaz temperatura corpului uman. Chinina conine n molecula ei un heterociclu chinolinic. PAPAVERINA se extrage din sucul lptos al capsulelor necoapte de mac (opiu). Ea acioneaz direct asupra musculaturii netede. Papaverina conine n molecul heterociclu izochinolinic. STRICNINA se extrage din seminele i frunzele plantei numit Strychnos nux vomica (turta lupului). Este o otrav puternic. n cantiti mici este toxic general iar n cantiti mari este insecticid. Stricnina conine n molecul heterociclu indol. COFEINA se extrage din boabele de cafea. Este un excitant al sistemului nervos central. Cofeina conine n molecul ciclul purinic. Alcaloizii sunt produi finali de metabolism ai compuilor azotai i constituie mijloace de protecie i de aprare ale plantelor. n cantiti mici pot fi folosii ca substane farmaceutice, iar n cantiti mari acioneaz ca insecticide i otrvuri.

3.3. Uleiurile, rezinele (rinile) i oleorezineleUleiurile eterice i rinile sunt produi finali ai metabolismului plantelor. Aceste substane sunt depuse n anumite esuturi ale plantei, pentru a nu afecta cursul proceselor metabolice. Astfel, pot fi ntlnite n vacuole, pungi intercelulare, solzi, sub scoar sau la suprafaa scoarei copacilor. ULEIURILE ETERICE sunt substane lichide, volatile, cu miros parfumat, aromat, insolubile n ap, solubile n solveni organici sau grsimi. Au rol de condiment, rol antiseptic, antispasmodic, stomachic etc. Uleiurile eterice se extrag din flori, frunze, fructe, coaj i uneori din partea lemnoas (lemnul de camfor), folosind solveni organici sau prin distilare i antrenare cu vapori de ap. Numrul uleiurilor eterice vegetale este foarte mare (peste o mie). Din punct de vedere chimic, uleiurile eterice reprezint amestecuri de substane constituite din hidrocarburi terpenice, hidrocarburi aromatice, alcooli, aldehide, cetone, acizi organici, pigmeni, eteri, esteri etc. Unul i acelai ulei eteric poate conine pn la 50 de substane diferite. Dintre aceti compui, cei mai importani sunt hidrocarburile terpenice sau terpenele i derivaii lor (mircenul, geraniolul, limonenul, mentolul, camforul, borneolul etc.). Mircenul se gsete n hamei, geraniolul n florile de trandafiri, limonenul n chimion, mentolul n ment, camforul n lemnul de Laurus camfora i n pelin, borneolul n lavand etc. RINILE, produse de excreie ale plantelor, apar n deosebi n esutul lemnos, n amestec cu mici cantiti de uleiuri eterice. Deriv din uleiuri prin oxidare i se pot combina, dnd oleorezine. Rinile sunt substane solide sau semisolide, solubile numai n solveni organici. Ele fierb la temperaturi ridicate (peste 300oC), nu sunt distilabile i nu au puncte fixe de topire (sufer nmuiere). Din punct de vedere chimic, rinile sunt formate din acizi rezinici (de tipul acidului abietic) i derivaii lor, substane policiclice cu caracter acid. Au 15

proprieti stupefiante, purgative, expectorante, vermifuge. Se pot acumula n celule izolate (idioblaste), n celulele epidermice, peri, buzunare i canale secretoare. Exemple de rini sunt saczul i tmia. BALSAMURILE sunt rini lichide sau semisolide, cu coninut ridicat n uleiuri eterice (pn la 40%). n contact cu aerul, ca i rinile, i balsamurile se solidific deoarece o parte din uleiurile eterice din constituia lor se volatilizeaz. Copalii sunt rini fosile aflate n sol, sub form de depozite care provin din plante disprute. Lignanii sunt tot rini n care predomin substane nrudite cu elementele structurale ale ligninelor (monomeri, dimeri etc.). Rina de guaiac care conine acid guajaritic se gsete n Guaiacum officinalis i este deosebit de bogat n lignani. Rinile i uleiurile eterice constituie mijloace de aprare ale plantelor fa de parazii. Mirosul lor plcut poate atrage unele insecte favorizndu-se polenizarea. Rinile care se depun pe diferite leziuni ale organismului vegetal au rol protector, de izolare i de vindecare. Uleiurile eterice sunt importante i datorit utilizrilor practice n parfumerie, n industria farmaceutic, industria alimentar etc. Rinile se folosesc n industria textil, la prepararea de lacuri i vopsele, n industria farmaceutic etc.

3.4. Substane antibioticeAntibioticele sunt substane cu aciune bacteriostatic (mpiedic nmulirea microorganismelor) sau bactericid (distrug microorganismele). Dup originea lor se deosebesc antibiotice de origine microbian i antibiotice de origine vegetal. Antibioticele de origine microbian. Sunt substane sintetizate de ctre anumite microorganisme i mucegaiuri. Ele sunt substane folosite ca medicamente n cazul unor boli provocate de microorganisme patogene la om, animale sau plante. Ca reprezentani ai antibioticelor putem meniona: penicilina, streptomicina, cloromicetina, tetraciclina etc. Antibioticele vegetale (fitoncide). Sunt substane cu proprieti antibiotice sintetizate de ctre plante. Fitoncidele prezint aciune antibiotic mult mai redus comparativ cu cea a antibioticelor de origine microbian. Unele fitoncide prezint i proprieti insecticide fa de numeroase insecte, viermi, roztoare etc. se cunosc peste 50 de fitoncide extrase din diferite plante, dintre care cele mai importante sunt: allicina, dihidroallina, acidul benzoic, alilsenevolul etc. Allicina este un antibiotic volatil extras din usturoi, cu aciune distructiv asupra bacilului difteric, holerei, stafilococilor etc. Dihidroaliina este un antibiotic extras din ceap. Acidul benzoic, acidul p-hidroxil-benzoic, acidul vanilic, acidul cafeic, acidul ferulic etc., sunt rspndii n numeroase plante superioare (n special n morcovi), au aciune bacteriostatic, bactericid i antihormonal. Ei mpiedic biosinteza giberelinelor. Alilsenevolul, se extrage din mutar, hrean, ridichii etc. Unii alcaloizi i taninurile prezint de asemenea proprieti fitoncide. Plantele medicinale, florile, rdcinile i tuberculii unor plante (leguminoase, orhidee) reprezint o important surs de antibiotice vegetale.

3.5. Insecticide vegetaleUnele plante superioare pot sintetiza anumite substane cu aciune insecticid, care s exercite o aciune de aprare mpotriva insectelor, viermilor, roztoarelor etc. Din punct de vedere chimic, insecticidele vegetale sunt substane cu structuri foarte diferite ca : cetoalcooli nesaturai (piretrolona), esteri ciclici nesaturai (piretrina i cinerina), benzo-pirani (rotenona, care este toxic pentru animale), glicozide (scilirozida din ceap roie de mare), 16

senevoli (senevolul fenil-etilenic, extras din sfecl, insecticid puternic, de acelai grad cu aldrinul i clordanul), amide ramificate nesaturate. Deci plantele superioare au capacitatea de a sintetiza substane de aprare cu proprieti bacteriostatice, bactericide, fungicide sau insecticide. n florile de Chrysantheum cinerariaefolium, Peonia albiflora, Pyrethrum carneum etc. se gsesc esteri ciclici nesaturai. Prin hidroliza acestora, se formeaz un cetoalcool nesaturat, piretrolona sau cinerolona i un acid ciclopropan monocarboxilic, respectiv dicarboxilic. n unele leguminoase din genurile Derris, Jochocarpus, Tephhrosia, Millelia etc., se gsesc insecticide din grupa rotennoidelor, ce conin n molecul un nucleu benzopiranic sau benzopironic. Ele sunt toxice nu numai pentru insecte, dar i pentru alte animale inferioare i pentru peti. Prezena fitoncidelor n plante, se poate remarca dac se planteaz, ntr-un sol ruderal, un pomior i un b, de aceeai grosime cu pomul. Bul se degradeaz n scurt timp, sub aciunea microorganismelor din sol, n timp ce pomul se apr de aciunea microorganismelor, prin fitoncidele ce le conine. n timp ce bul se degradeaz, pomul crete i se dezvolt, sub aciunea factorilor de mediu.

3.6. LignineLigninele sunt substane macromoleculare care nsoesc celuloza n diferite organe i esuturi ale plantelor. Sunt substane foarte rspndite n regnul vegetal, ocupnd locul al doilea dup celuloz. Se gsesc n lemnul diferitelor specii de plante n proporie de 21-30% din materia uscat. Fibrele de in i de cnep sunt srace n lignin, iar cele de iut conin 19% lignin. n tabelul 4 este dat coninutul n lignine al lemnului de conifere i foioase i al unor fibre textile. Ligninele sunt substane ternare, formate din C, H i O, de natur aromatic. Caracteristic este prezena n molecul a gruprilor metoxil i hidroxil. Substanele constituente de baz din lignine sunt alcoolii aromatici derivai de la fenilpropan: alcoolul coniferilic, alcoolul hidroxiconiferilic i alcoolul sinapinic. Ligninele se formeaz prin condensarea acestor alcooli. Ligninele din diferite plante nu sunt identice, ele difer prin numrul i felul unitilor structurale. Astfel, n ligninele de foioase predomin alcoolul sinapinic, iar n cele ale coniferelor alcoolul coniferilic. Masa molecular a ligninelor variaz ntre 700 100.000 Da. Sunt substane amorfe, de culoare nchis, insolubile n ap, acizi i alcalii diluate. Sunt solubile n acizi tari concentrai i alcalii concentrate. Tabelul 4. Coninutul n lignine al lemnului de conifere i foioase i al unor fibre textile (dup G. Neamu i Gh. Cmpeanu, 1983) Lignine % Lignine % n material uscat Materialul vegetal Materialul vegetal n material uscat Lemn de conifere Brad Molid Pin Lemn de foioase 25-30 28-28,5 26-29 Mesteacn Plop Stejar Fibre textile Bumbac 17 0 19,6-22,2 18,2-20,30 27,3-29,4

Arin Arar Fag

24,3-26,5 24,1 21-24,5

Cnep In Iut

1,4 0,8 19,0

Ligninele se ntreptrund cu fibrele de celuloz prin legturi fizice ct i legturi chimice (eterice). Ele confer fibrelor de celuloz o rezisten mrit la aciunea apei deoarece reduc capacitatea de mbibare, micorndu-le ns elasticitatea. Lignina se separ de celuloz fie prin dizolvarea celulozei i a substanelor nsoitoare n reactivi adecvai, fie prin dizolvarea lor n hidroxizi alcalini concentrai i precipitarea ulterioar din soluie. Ligninele se pot recunoate prin tratare cu o soluie de floroglucin n mediu de acid clorhidric cnd apare o coloraie roie. Ligninele au un rol nsemnat n formarea humusului cu stabilitate mare, deoarece rezist la aciunea agenilor chimici i sunt atacate greu de microorganisme. Ele se utilizeaz pentru obinerea unor materii plastice sintetice, a negrului de fum i ca nlocuitori ai taninurilor vegetale.

3.7. GlicozideGlicozidele sunt substane formate din dou componente: o component glucidic i o component neglucidic, numit aglicon. Componenta glucidic se leag de aglicon prin legtur glicozidic, prin intermediul hidroxilului semiacetalic. Componenta glucidic poate fi monoglucid, diglucid sau o oligoglucid. Predominant se ntlnete glucoza sau oligoglucide ce conin glucoz. Agliconul poate aparine unor clase de substane extrem de diferite ca alcooli, fenoli, steroli, tioalcooli, hidroxichinone, pigmeni, substane cu azot etc. Glicozidele sunt larg rspndite n regnul vegetal. Se gsesc att n plantele superioare: n frunze, flori, fructe, semine, rdcini, lemn etc., ct i n cele inferioare. Sunt substane solide, cristaline, incolore sau colorate (n funcie de felul agliconului), cu gust n general amar. Unele au o arom specific. Glicozidele prezint activitate optic. Majoritatea sunt solubile n ap, alcool, aceton i insolubile n eter. Nu prezint fenomenul de mutarotaie i nu au proprieti reductoare. Se hidrolizeaz cu uurin n mediu acid, bazic sau sub aciunea enzimelor. Numeroase glicozide au aciune fiziologic asupra organismelor animale (curativ sau nociv) i se ntrebuineaz nc din antichitate ca medicamente sau ca otrvuri. Se presupune c unele glicozide reprezint pentru plante forme inofensive de depozitare a unor agliconi toxici. Prin hidroliz parial plantele elibereaz o parte din aglicon n doze netoxice, exercitnd asupra plantei o aciune protectoare. Unele substane farmacologice active, printre care i glicozidele, n cantitate mic se utilizeaz ca medicamente, iar n cantitate mare sunt toxice. Dintre diferitele tipuri de glicozide, cele mai numeroase sunt O-glicozidele, care se deosebesc ntre ele prin felul glucidei i a agliconului. Dintre O-glicozidele formate din -glucopiranoz, alcooli i fenoli, menionm arbutina, extras din Arbutus uva ursi, salicina izolat din Salix helix i coniferina identificat n diferite conifere. Agliconul acestor glicozide, n ordinea prezentat este hidrochinona, alcoolul salicilic i alcoolul coniferilic. n migdalele amare, smburii de caise, piersici, prune, ciree etc., se gsete amigdalina, care prin hidroliz sub aciunea emulsiei formeaz dou molecule de glucoz, aldehid benzoic i acid cianhidric. Glicozidele care conin acid cianhidric sunt substane toxice i se numesc glicozide cionogenice. Unele plante furajere conin glicozide cianogenetice care prin hidroliz elibereaz acid cianhidric. Aceste plante consumate n 18

cantitate mare n stare proaspt produc intoxicri la animale. Prin uscarea sau murarea acestor furaje acidul cianhidric se elimin n mod treptat, n urma reaciilor de hidroliz enzimatic sau acid i astfel crete calitatea acestor furaje. n amigdalin, componenta glucidic se afl sub form de gentiobioz, o diglucid format din dou molecule de glucoz unite prin legtur 1,6- -glicozidic. Dintre O-glicozidele steroidice, care au ca aglicon steroli, mai importante sunt glicozidele cardiotonice i saponinele. GLICOZIDELE CARDIOTONICE n cantitate mic ntresc muchiul inimii i produc o mrire a amplitudinii contraciilor. Acestea, administrate n cantitate mare determin oprirea inimii n sistol. Cele mai utilizate glicozide cardiotonice n medicin sunt digitalina i strofantina. Aceste glicozide se gsesc n Digitalisa lanata, D. purpurea, Strophantus kombi, Scilla maritima etc. Agliconul strofantinei se numete strofantiolin, iar componenta glucidic este o triglucid. SAPONINELE sunt glicozide steroidice, identificate n peste 80 familii de plante. Agliconul lor poart numele general de sapogenin. Saponidele sunt glicozide cu proprieti specifice. Injectate intravenos la om i la animale produc hemoliz. Au aciune iritant asupra mucoaselor i sunt extrem de toxice pentru peti. Au proprieti tensioactive i emulsioneaz grsimile. Prin agitare cu ap formeaz o spum abundent i persistent. Datorit proprietilor lor, saponidele au numeroase utilizri practice. Sunt folosite ca ageni de spumare (n extinctoare), detergeni, coloizi protectori etc. Unele saponide se utilizeaz ca materie prim pentru sinteza hormonilor sexuali i n general a hormonilor steroidici. O alt grup de O-glicozide o formeaz glicoalcaloidele, care au ca aglicon un alcaloid, de regul cu structur steroidic. Dintre acestea se menioneaz solanina i tomatina. Solanina se gsete n Solanum tuberosus. Ea este format dintr-o triglucid i din solanidin, ca aglicon. Triglucida se numete solatrioz i este format din glucoz, galactoz i ramnoz. Tomatina se gsete n Solanum lycopersicum. Agliconul se numete tomatidin, iar componenta glucidic este o tetraglucid. Tot din grupa O-glicozidelor fac parte unele glicozide flavonoidice, carotenoglicozide, glicozide xantonice, glicozide indolice etc. S-glicozidele sunt mai puin rspndite n natur. Ele se gsesc, predominant, n plante din familia cruciferelor. Dintre S-glicozide, importan alimentar mai mare o are sinigrina, care se gsete n seminele de mutar negru (Sinapis nigra), n hrean, ridichii, rapi. Prin hidroliza sinigrinei, sub aciunea mirozinazei, se obin ca produi finali, glucoza, alilsenevolul i KHSO4. Senevolii sunt substane cu miros caracteristic neptor, uneori lacrimogeni, irit pielea i mucoasele. n doze mici, stimuleaz secreia gastric, n doze mari determin paralizia sistemului nervos. n mutarul alb se gsete sinalbina. S-glicozidele se pot forma i din tioglucoz, ce are hidroxilul semiacetalic substituit printr-o grupare tiolic. N-glicozidele sunt substane larg rspndite n natur. Din aceast grup fac parte nucleozidele i nucleotidele. Dintre glicozidele cu azot fac parte i glicozidele cianogenice i glicoalcaloidele, dar la aceste substane legtura glicozidic nu se stabilete la nivelul atomului de azot, de aceea s-au prezentat la O-glicozide.

3. 8. TaninurileTaninurile vegetale sunt substane foarte cunoscute pentru multiplele lor aplicaii practice, n special n medicina tradiional i n industria tbcritului. Literatura de specialitate amintete de vechi triburi din America de Nord care foloseau decocturile i cataplasmele preparate din rdcinile unor plante (cunoscute n prezent ca avnd un coninut ridicat n taninuri, precum crinul de ap canadian Nuphar variegatum) pentru a trata durerile 19

de gt, leucoreea, rceala, rnile, durerile interne sau alte infecii ale pielii. Tbcirea pielii cu ajutorul taninurilor vagatale este cunoscut nc din antichitate i ea era realizat folosindu-se coaja diferitelor specii de copaci, n special specii de stejar. Stabilirea structurii lor moleculare a permis de asemenea stabilirea unor diferene, n ceea ce privete utilitatea practic, ntre diferitele tipuri de taninuri. S-a ajuns astfel la concluzia c n special galotaninurile, dar i elagotaninurile, ambele aparinnd clasei de taninuri hidrolizabile, au aplicaii practice mult mai numeroase dect taninurile condensate. Din punct de vedere chimic taninurile sunt substane polifenolice (derivai ai 3hidroxi-flavanului sau poliesteri ai acidului galic) solubile n ap, cu gust astringent, care prezint reacii caracteristice fenolilor i care precipit cu alcaloizii i cu proteinele, formnd combinaii impermeabile i imputrescibile (caracteristice procesului de tbcire a pielii). Taninurile sunt mult rspndite n natur. Se ntlnesc n cantiti foarte mici la majoritatea plantelor, iar n cantiti mari se gsesc n scoara, lemnul i frunzele de stejar, n scoara de arin, molid, plop, nuc, afin, coronite, mangrove, n fructele unor specii ca Terminalia chebula, Caesalpinia brevifolia etc. Sunt substane astringente, utilizate ca antidiareice. Dup tipul de legtur dintre polifenoli i acizi fenolici se deosebesc : taninuri hidrolizabile i taninuri nehidrolizabile sau condensate. TANINURI HIDROLIZABILE. Prin hidroliz acid sau n prezena tanazelor, pun n libertate o oz, de obicei glucoz i acid galic sau un derivat al acidului galic, ca acid mdigalic sau acid elagic. Taninurile care conin acid galic se numesc galotaninuri, iar cele care conin acid elagic se numesc elagotaninuri. Din categoria galotaninurilor fac parte taninul turcesc i taninul chinezesc. O molecul de tannin turcesc elibereaz prin hidroliz cinci molecule de acid galic i o molecul de glucoz, iar o molecul de tannin chinezesc elibereaz prin hidroliz nou molecule de acid galic i o molecul de glucoz. Prin hidroliza elagotaninurilor rezult acid elagic i glucoz sau acid elagic, acid galic i glucoz. Prin nclzirea galotaninurilor la temperaturi ridicate se formeaz pirogalol. TANINURI NEHIDROLIZABILE (CONDENSATE). Nu pot fi descompuse n prile lor componente dect prin topire alcalin. Ele nu conin glucoz. Taninurile nehidrolizabile rezult prin condensarea derivailor catechinici i au o structur necunoscut pn n prezent. Prin nclzire n prezen de hidroxizi alcalini elibereaz pirocatechin (ortodifenol). Taninurile catechinice sunt foarte rspndite n natur i prezint o mare importan practic. Pe cale industrial, acestea se extrag din scoara de stejar, salcm, mesteacn, salcie etc. Spre deosebire de galotaninuri, taninurile catechinice precipit numai gelatina din piele i nu au proprieti de tbcire. Prin nclzire sau pe cale enzimatic, mai multe molecule de catechine se condenseaz i formeaz tanin condensat, cu proprietile taninului natural. n organismul vegetal, taninurile joac un rol biochimic important. Ele mresc rezistena plantelor fa de virusuri i microorganisme. De asemenea dau gustul i aroma unor produse vegetale (ceai, cafea, vin etc.). Practic, taninurile se folosesc la tbcirea pieilor, fabricarea cernelurilor, limpezirea vinului etc. Tbcirea pieilor cu taninuri este un procedeu cunoscut din vechime. n procedeele moderne de tbcire soluia de tanin, obinut din coaja de stejar, este nlocuit de alte substane ca aldehida formic, sruri de crom etc. Taninurile au largi utilizri n medicin, n industria pielriei, n medicina tradiional. n medicin pot fi administrate intern i cu aciune antidiareic, antimicotic i antiseptic, ca urmare a precipitrii proteinelor bacteriene i fungice. Administrarea intern se face mai ales sub form de decocturi, n tratamentul diareei, ulcerului, colitelor i ca antidot n intoxicaii cu alcaloizi. Administrarea pe cale extern se face prin aplicri locale, pentru tratarea stomatitelor (sub form de caluton i gargarisme), a arsurilor i a hemoroizilor. De asemenea, taninurile acioneaz ca: inhibitori ai peroxidrii lipidelor, captatori de 20

radicali liberi, inhibitori ai formrii de ion superoxid. Au fost descrise efectele inhibitoare asupra implicrii virusurilor. Acestea se datoreaz denaturrii proteinelor virale. Taninurile au efect inhibitor enzimatic manifestat asupra: 5-lipoxigenazei, enzimei de conversie a angiotensinei i activeaz hialuronidaza, glucoziltransferazele microorganismelor implicate n cariogenez. Monomerii i dimerii au proprieti de vitamin P (cresc rezistena i scad permeabilitatea capilarelor, cresc tonusul venos, stabilizeaz colagenul). Taninurile elagice acioneaz asupra mecanismelor imunitare (stimuleaz fagocitoza), efect evideniat i pentru galatul de epicatechol i galatul de epigalocatechol. Din punct de vedere fiziologic, taninurile sunt considerate factori de aprare ai plantelor mpotriva infeciilor bacteriene i virale (precipit proteinele microorganismelor), antioxidani (sunt puternic reductori), transportori de hidrogen (particip la sisteme redox celulare); unii autori consider taninurile substane de rezerv pentru organismele vegetale ntruct dispar din semine n perioada ncolirii.

4. Producerea de metabolii n culturi de celule i esuturi vegetale i potenialul lor aplicativn ultimii ani, interesul pentru metaboliii secundari de origine vegetal a crescut, dat fiind, pe de o parte efectul lor terapeutic, iar pe de alt parte, caracterul lor natural, n prezent aproximativ 60% dintre medicamentele utilizate pentru oameni fiind de natur vegetal. Dar utilizarea plantelor nu se rezum numai la domeniul farmaceutic sau agroalimentar, ci ea se poate extinde la cosmetic i parfumerie. Se apreciaz c un numr mare de compui noi sunt identificai anual n diferite specii de plante, dar este totodat semnalat i rapiditatea procesului de extincie a speciilor i de ngustare a bazei genetice a resurselor vegetale n lume. De exemplu, planta Pilocarpus pabonadi utilizat pentru producerea medicamentului pilocarpin, datorit colectrii neraionale este n prezent declarat specie ameninat cu dispariia n Himalaia i a fost nlocuit cu Pilocarpus microphyllus ca surs de principii farmacologic active (R. GUPTA, 1991). Acest fenomen a stimulat att reconsiderarea importanei vitale a resurselor genetice ct i interesul pentru obinerea metaboliilor secundari prin metode neconvenionale. nc din 1952 J.B. ROUTIEN i L.G. NICKEL au obinut un brevet cu titlul "Cultivarea celulelor vegetale" demonstrnd cu acest prilej c celulele vegetale pot s creasc n medii lichide i c aceste celule pot fi utilizate pentru obinerea de compui chimici utili. Dar abia 30 de ani mai trziu n 1982 Y. FUJITA i colab. au raportat producerea primului produs natural la scar comercial - shikoninul din culturi celulare de Lithospernum erythrorhizon. n ultimii ani numeroase cercetri au fost dedicate producerii de compui utili prin culturi de esuturi vegetale. Ca urmare s-au nregistrat progrese tehnologice remarcabile, astfel c n prezent studiile bazate pe culturi de celule i esuturi se desfoar att la nivel fundamental ct i sub forma cercetrilor aplicative care utilizeaz culturi la scar larg, industrial, pentru producerea comercial a metaboliilor secundari. Deoarece sinteza lor nu constituie o parte indispensabil a programului expresiei genice i dezvoltrii, aceasta poate fi modelat att prin modificri ale materialului genetic ct i prin modificri ale mediului sau prin utilizarea unor substane cu rol de semnal pentru declanarea cii biosintetice respective (M. LUCKNER, 1982; K. LINDSAY i M.G.K. JONES, 1989). Tehnicile "in vitro" i propun stimularea exprimrii complete a unor secvene metabolice care au ca rezultat sinteza unui metabolit dorit, fapt ce ofer importante avantaje economice prin posibilitatea realizrii sintezei la scar industrial, n bioreactoare, ca i prin dirijarea selectiv a unor anumite secvene biosintetice, n funcie de scopul urmrit (B.E. 21

ELLIS, 1982). De regul speciile vegetale productoare de compui secundari cresc numai n anumite zone climatice, iar sinteza acestor metabolii cu structur complex pe cale artificial este neeconomic, dificulti care conduc la fluctuaii considerabile ale materiei prime i implicit ale preului de cost. n plus o serie de reglementri elaborate n multe ri limiteaz utilizarea produselor sintetice n special ca aditivi alimentari sau medicamente. Intensa concentrare a cercetrilor efectuate n diferite laboratoare din lume n scopul utilizrii culturilor de esuturi i celule vegetale ca surse poteniale de metabolii utili poate fi explicat prin avantajele importante oferite de acestea, ca de pild: metaboliii utili pot fi obinui n condiii controlate de mediu, n flux continuu, indiferent de factorii climatici sau de nsuirile solului; culturile celulare sunt necontaminate cu microbi i insecte; celulele oricrei plante, tropicale sau alpine, pot fi uor multiplicate n scopul producerii metaboliilor specifici; controlul automat al creterii celulare i reglarea proceselor metabolice contribuie la reducerea costului forei de munc i la mbuntirea productivitii; ciclurile biosintetice ale culturilor celulare n bioreactoare sunt mult mai rapide dect cele ale plantei n condiii naturale. De exemplu n cazul sikoninului un ciclu de producie n bioreactoare dureaz cteva sptmni, n timp ce numai plantele n vrst de 5 ani sunt recomandate pentru extracia produsului farmaceutic (A.W. ALFERMANN i M. PETERSEN, 1995); prin selecie clonal i mutagenez se pot izola linii celulare care sintetizeaz metaboliii secundari n cantiti chiar mai mari dect cele prezente n organele specializate ale plantei intacte (M. TABATA, 1977); culturile celulare n suspensie pot fi utilizate i pentru biotransformarea unor substraturi pentru obinerea unor noi compui neidentificai n natur sau pentru producerea unor enzime utilizabile n sinteza chimic a compuilor naturali (K. HERBERS i colab., 1995). 0 analiz efectuat de specialitii japonezi privind metodele brevetate, ncepnd cu anul 1975 pentru producerea de compui utili prin culturi de esuturi i celulele vegetale, au evideniat o cretere semnificativ a numrului acestora, n special n domeniul produselor farmaceutice. n l977 M. H. ZENK i colab. au publicat o strategie menit s contribuie la obinerea n cantiti crescute a compuilor chimici naturali prin culturi de celule vegetale care n esen stabilete parcurgerea urmtoarelor etape: 1. - testarea i selecia unor plante iniiale caracterizate prin capacitate crescut de acumulare a compusului natural urmrit; 2. - stabitirea culturilor de calus de la plantele donor selectate; 3. - analize chimice pentru stabilirea concentraiei produsului natural n culturile de calus; 4. - stabilirea de culturi celulare n suspensie; 5. - analize chimice la nivelul liniilor celulare n suspensie; 6. - selecia de linii celulare nalt productoare prin clonri unicelulare ca rezultat al variabilitii somaclonale sau al unor tratamente mutagene; 7. - obinerea de linii celulare nalt productoare stabile n bioreactor; 8. - ameliorarea producerii de metabolii secundari prin optimizarea parametrilor de cultur fizici i chimici. Cu toate c aceast strategie a fost adoptat i utilizat de numeroi specialiti, obinerea la scar comercial a unor astfel de compui prin culturi de celule i esuturi se limiteaz la cteva produse. 22

O dificultate major se semnaleaz de diveri autori const n instabilitatea liniilor celulare n ce privete acumularea de metabolii secundari i faptul c parametrii optimizai individual n faza de laborator nu acioneaz sinergic i nu conduc la rezultate reproductibile n bioreactoare cu volum mare (A.W. ALFERMANM i M. PETERSEN, 1995). Utilizarea eficient a culturilor celulare n scopul producerii de compui secundari, implic satisfacerea urmtoarelor condiii: rata creterii celulare i a biosintezei trebuie s fie suficient de ridicat pentru a se obine o cantitate semnificativ de produs final ntr-o perioad de timp; culturile trebuie s fie stabile genetic pentru a produce cantiti ridicate de metabolii secundari n mod constant; metaboliii s se acumuleze n celule fr a fi catabolizai rapid sau, preferabil, s fie eliberai n mediu lichid; preul produciei, incluznd costul mediului de cultur, precursorii i extracia chimic, s fie suficient de sczut pentru a fi profitabil (M. TABATA, 1977). Pentru rentabilizarea acestor tehnologii n sensul reducerii cheltuielilor de producie, se au n vedere dou obiective: creterea productivitii culturilor celulare i creterea produciei pe unitatea de volum a culturilor din bioreactoare. n acest scop se procedeaz la selecia de linii celulare nalt productoare de la nivelul micilor agregate celulare sau la clonare unicelular, corelate cu optimizarea compoziiei mediului de cultur pentru a stimula capacitatea maxim a celulei de a produce metabolitul de interes. 0 contribuie important la depirea limitelor prezente n acest domeniu este ateptat de la experimentarea unor strategii recente dintre care deosebit de promitoare par a fi: tehnica de cultur a esuturilor i organelor difereniate (ca de exemplu a lstarilor multiplii sau a rdcinilor transformate cu Agrobacterium), biotransformarea precursorilor n compui de baz i stimularea biosintezei prin utilizarea unor elicitori (Y. FUJITA, 1990). Dei celulele din culturi posed ntregul potenial biochimic al genomului plantei ntregi, adesea noile condiii de mediu determin modificri ale metabolismului, exprimate prin tipul i cantitatea metaboliilor sintetizai, pn la dispariia total a unora dintre acetia sau la formarea unui compus cu totul nou. Trebuie deci precizat c incapacitatea unor culturi de a sintetiza anumite substane nu este rezultatul pierderii potenialului biochimic, ci a faptului c acesta nu se poate exprima n anumite condiii, pe parcursul diferenierii biochimice i citochimice (L. MERAVY, 1987). Instabilitatea capacitii biosintetice caracteristic culturilor celulare poate fi i consecina unor modificri la nivelul materialului genetic, att intercromozomale, exprimate prin aneuploidie i poliploidie, ct i restructurri intracromozomale, care au ca rezultat modificri ale tipului de expresie genic (M. J. C. RHODES i colab., 1987). Dar tocmai heterogenitatea caracteristic sistemelor celulare "in vitro" a fcut posibil selecia unor linii celulare de un deosebit interes practic ca de pild celule fotoautotrofe (HUESEMANN i BARZ, 1977; YAMADA i SATO, 1978; YASUDA i colab., 1980); celule rezistente la factori de stress (PALMER i WIDHOLM, 1975; MALIGA i colab., 1976; NABORS i colab., 1980); celule nalt productoare de vitamine (YAMADA i WATANABE, 1980; NATSUMOTO i colab., 1980; WATANABE i YAMADA, 1982) celule nalt productoare de pigmeni (KINERSLY i DOUGALL, 1980; YAMAMOTO i colab., 1982); celule productoare de alcaloizi (ZENK i colab., 1977; OGINO i colab., 1978; YAMADA i HASHIMOTO, 1982). Meninerea unor linii celulare caracterizate printr-o productivitate ridicat i stabil de metabolii secundari poate fi realizat prin modificarea compoziiei mediului de cultur, a parametrilor fizici, prin inducerea, identificarea i selecia unor clone derivate de la celule cu capacitate sintetic ridicat. n acest mod s-a reuit de pild producerea unor cantiti ridicate de ajmalicin, folosit ca medicament antihipertensiv, din culturi celulare de Chatarantus 23

roseus, ca i cultivarea la scar comercial a celulelor de Lithospermum erythrorhizon, pentru producerea pigmentului rou ca aciune antiinflamatoare shikonin, obinndu-se o cretere a productivitii de la 0,4 la 23% substan uscat. Tot n acest scop s-a experimentat suplimentarea mediului de cultur ca anumii precursori (compui intermediari ai procesului biosintetic), fapt ce are ca rezultat n final producerea metabolitului secundar specific, n situaia n care cultura celular posed competena bioconversiei intermediarului respectiv i deci reactivarea activitii biosintetice. Pe de alt parte nc din anul 1974 COSTABEL i colab. au sesizat c sinteza i acumularea metaboliilor secundari sunt dependente de unele procese biochimice i structurale care se petrec la nivelul esuturilor cultivate "in vitro". Este bine cunoscut faptul c o serie de compui secundari se acumuleaz n anumite esuturi i organe specializate, cum sunt rdcini, fructe, lstari, saci glandulari, canale pentru uleiuri eterice, etc. De exemplu nicotina i alcaloizii nrudii sunt sintetizai n sistemul radicular al plantelor de tutun, dar sunt transportai i se pot acumula predominant n prile aeriene ale plantei. Capsaicina este sintetizat i se acumuleaz ntr-o anumit faz a dezvoltrii fructelor de Capsicum frutescens, enzima-cheie fiind activ numai n esutul placentar. Uleiul eteric al mentei se acumuleaz n celulele glandulare din frunze, iar cel de mueel n capitule. La Datura ferox hiosciamina este sintetizat n rdcini de unde este transportat n frunze. Pe traseul parcurs spre situsul de depozitare hiosciamina este apoi oxidat n scopolamin. Este deci evident c n multe cazuri biosinteza i biotransformarea metaboliilor secundari sunt corelate cu diferenierea morfologic i c aceste fenomene sunt nscrise n genomul speciilor. S-a constatat c i n cazul culturilor de esuturi i celule de la unele specii, biosinteza metaboliilor specifici este n mod obligatoriu corelat cu un anumit nivel al diferenierii celulare i tisulare (H. A. COLLIN i M. WAT'I'S, 1984). Se cunosc numeroase exemple cnd celulele aglomerate n agregate sintetizeaz produsul caracteristic speciei n timp ce suspensiile celulare fine nu realizeaz sinteza. n alte sisteme de culturi celulare organizarea multicelular sub form de embrioni somatici, lstari sau rdcini, favorizeaz sinteza i acumularea metaboliilor secundari, probabil datorit limitelor impuse diviziunilor celulare de condiia multicelular, n care exist gradieni ai nutrienilor, oxigenului i presiunii mecanice. Din aceast categorie fac parte de pild speciile la care n condiii naturale acumularea metaboliilor secundari se realizeaz n rdcini, ntre care i Rubia tinctorum. 0 tehnic apreciat ca avnd un potenial superior pentru producerea anumitor metabolii secundari "in vitro", bazat pe corelaia dintre organizarea structural i acumularea produilor secundari utilizeaz sistemul de transformare cu Agrobacterium rhizogenes. Rspunsul fenotipic determinat de inseria ADN-T al plasmidei Ri n genomul plantei const n proliferarea rapid de rdcini la situsul de infecie, care pot fi detaate i cultivate pe perioade nelimitate, n scopul producerii metaboliilor specifici. Aceste rdcini pstreaz caracteristicile biosintetice ale plantei de origine, la care metaboliii secundari se sintetizeaz i se acumuleaz n rdcini. n figura 3 sunt prezentate diferite modaliti de obinere a metaboliilor secundari, dar ele trebuie s in cont de: aprovizionarea cu plante, n vederea unei eventuale extracii; facilitatea sintezei sau a hemisintezei chimice; capacitatea microorganismelor de a produce compuii de interes.

24

Extracie, Sintez, Hemisintez Teste aprofundate

Cercetarea noilor produi Biotransformare

Sue morfogenetice Rdcini transformate Elicitare Conservare gene Producie de enzime Clonare de

-celule libere -celule imobilizateFigura 3. Posibiliti de producere a metaboliilor secundari (dup G. Freyssinet, M.Lebrun, B. Pelissier i T. Hardy, 1993).

Dac nici una dintre aceste ci nu este posibil sau dac ele sunt limitate, se va putea realiza producia substanelor cercetate de ctre culturile celulare vegetale in vitro, evitnduse concepia conform creia acest procedeu poate fi lung i riscant. Numeroasele avantaje ale aplicaiilor culturilor celulare vegetale in vitro contrazic aceast concepie: Prin valorificarea potenialului de biosintez sau de biotransformare se pot obine produi noi (domeniul farnaceutic); Eticheta produs natural permite cucerirea unei pri rentabile de pia, fa de produii de sintez.

5. Manipularea genomului prin aplicarea tehnologiei ADN recombinat25

Perfecionarea tehnicilor moleculare fac posibil modificarea genomului celulelor vegetale i n scopul dirijrii anumitor procese metabolice responsabile de sinteza unor metabolii secundari de interes. n acest context, manipulrile genetice vizeaz trei aspecte: reglarea aciunii genelor codificatoare pentru enzime-cheie pe parcursul procesului dezvoltrii; introducerea de gene noi; reglarea aciunii unor gene specifice prin utilizarea tehnologiei ARN antisens. Este cunoscut faptul c metabolismul secundar este puternic influenat de factori ai mediului, precum lumina, elicitorii sau rnirea mecanic. Totodat s-a demonstrat c muli metabolii secundari prezint specificitate de organ, de esut sau chiar pentru un anumit tip de celul, care poate constitui situsul sintezei sau al depozitrii compusului respectiv. Identificarea unei gene reglatoare specifice creeaz posibilitatea activrii acesteia pentru a realiza sinteza unui metabolit care nu este produs n condiii normale n populaia celular n cauz. Fezabilitatea acestei abordri a fost demonstrat n 1995 de ctre Facchini i de Luca, n urma cercetrilor ntreprinse pentru studiul corelaiei dintre dezvoltarea plantelor de Papaver, diferenierea celular, expresia genelor pentru biosinteza de alcaloizi i acumularea alcaloizilor specifici. S-a demonstrat astfel c expresia difereniat a genelor TYDC (tirozin/dopa decarboxilaz) i acumularea de alcaloizi cu specificitate de organ sugereaz o reglare coordonat a genelor care controleaz biosinteza alcaloizilor n concordan cu procesele dezvoltrii, fapt ce reliefeaz posibilitatea reglrii metabolismului secundar prin intermediul enzimelor cheie. Introducerea unor noi gene sau utilizarea unui promotor puternic pentru supra-expresia genelor care controleaz producerea unor enzime de tip slbatic reprezint o alt modalitate de manipulare a metabolismului secundar. Aceast idee a fost dezvoltat de ctre Meyer i colaboratorii (1987) pentru a studia biosinteza antocianilor, prin introducerea n celulele de Petunia hybrida a unei gene de la porumb, codificatoare pentru DQR (dihidroquercitin-4reductaza), o enzim care nu este n mod normal implicat n biosinteza flavonoizilor la Petunia. Aceast enzim a utilizat metabolitul endogen dihidrokaempferol ntr-un proces biosintetic nou care a avut ca rezultat producerea de leucopelargonidin. Acesta a fost la rndul lui convertit n pigmentul rou pelargonidin, care nu se acumuleaz n condiii normale n Petunia. Supra-expresia unor activiti enzimatice poate conduce la un flux crescut de precursori i n consecin la acumularea n cantiti sporite a unor compui. Aceast ipotez a fost verificat de ctre Napoli i colaboratorii (1990), prin introducerea n Petunia a unor extracopii ale genelor codificatoare pentru CHS (chalcon-sintaz) i DFR (dihidroflavonol-4reductaz), sub controlul transcripional al unui promotor puternic CaMV35S. n mod surprinztor, au constatat c un numr crescut al copiilor genelor nu a condus la accentuarea pigmentaiei, ci dimpotriv la reducerea acesteia, datorit unui nivel redus al transcrierii att al genelor strine ct i al celor native (chs i dfr). Studii similare au ntreprins i Eikind i colaboratorii (1990), ncercnd s induc supraexpresia unei gene PAL de la fasole ntr-o plant transgenic de tutun, spernd c n acest fel acestea vor acumula un coninut crescut n lignin. n realitate, s-a constatat ns o reducere a cantitii de lignin i de fenoli solubili, i n consecin a devenit evident faptul c sunt necesare mai nti cercetri aprofundate n domeniul reglrilor metabolice pentru ca aceast abordare s poat fi utilizat cu succes pentru a stimula acumularea unor compui secundari n culturile de celule vegetale. 26

Prima ncercare de a manipula metabolismul secundar prin utilizarea tehnologiei ARNantisens pentru reglarea activitii unor gene specifice aparine lui Krol i colaboratorii (1988) care au experimentat manipularea genetic a culorii la Petunia hybrida. n acest caz, pigmenii aparin grupului flavonoizilor, i un numr de gene codificatoare ale enzimelor implicate n biosinteza flavonoizilor au fost izolate i caracterizate. n mod special, CHS (chalcon-sintaz), prima enzim a cii fenilpropanoidice care conduce la biosinteza autocianilor, a fost identificat ca o int pentru manipulri genetice. Prin transformarea plantelor de Petunia cu gene antisens chs (menit s blocheze expresia complet a genei) s-a constatat c pigmentaia de tip slbatic a fost perturbat i a rezultat o gam de transformani cu diferite niveluri i tipuri de pigmentaie, fapt ce demonstreaz potenialul important al acestei abordri. Progresele nregistrate n ultimii ani n domeniul tehnicilor moleculare i ingineriei biochimice dau garania obinerii unor succese remarcabile n producerea de compui utili n culturi de celule vegetale, cu att mai mult cu ct identificarea unor compui deosebii de valoroi (cum este de exemplu Taxolul), care pot fi produi la parametrii optimi numai n culturi celulare, a dat un nou impuls reconsiderrii importanei culturilor celulare vegatale, ca surse eficiente de compui de interes practic deosebit.

Concluziin secolul urmtor, caracterizat drept era biotehnologiilor , strategiile biotehnologice vor determina schimbri ample, prin noi dimensiuni ale eficienei i productivitii n numeroase domenii economice. n cadrul noilor biotehnologii, tehnicile moderne de culturi de celule i esuturi vegetale ofer poteniale relevante de aplicabilitate n unele domenii biotehnologice competitive, viznd obinerea unor medicamente, produse alimentare, pigmeni naturali alimentari sau industriali, arome alimentare sau cosmetice etc. Interesul pentru obinerea metaboliilor secundari prin metode neconvenionale este stimulat de pronunata descretere a resurselor vegetale consacrate, ca urmare a perturbrii echilibrului mediului natural, a exploatrii nelimitate a acestor resurse, a creterii costului forei de munc i dificultilor tehnice i economice n cultivarea plantelor din flora spontan. Ca impact socio-economic, nmulirea prin culturi in vitro permite adaptarea rapid la cerinele pieii, aplicarea biotehnologiei respective oferind posibilitatea nceperii unei activiti profitabile prin obinerea unor venituri substaniale n urma aclimatizrii i certificrii materialului sditor propus n condiii aseptice, n timp scurt, pe suprafee de teren restrnse. Cercetrile ntreprinse au adus un plus substanial de informaie tiinific privind valorificarea pe ci neconvenionale a potenialului regenerativ al celulei vegetale, ca expresie a totipotenei morfogenetice i biochimice. Acestea s-au concretizat n tehnologii reproductibile i eficiente de regenerare in vitro de la diferite explante somatice att n scopul microclonrii unor genotipuri, ct i n scopul stabilirii de culturi celulare productoare de metabolii secundari de interes industrial. Obinerea unor rezultate pozitive reprezint primul pas n elaborarea unor metode aplicabile la scar industrial, necesare n industria alimentar, farmaceutic, textil sau cosmetic.

Bibliografie selectiv27

1. Alfermann A. W., Bergmann W., Figur C., Helmbold U., Schwantag D., Schuller I., Reinhard E., 1983. Bitransformation of O-methyldigitoxin to p-methyldigoxin by cell cultures of Digitalis lanata. In: Mantell SH, Smith H., eds. Plant Biotechnology. Cambridge University Press, p. 67-74. 2. Alfermann A. W., Reinhard E., 1980. Biotransformation by plant tissue cultures. Bull. Soc. Chim. Fr., 2, p. 35-45. 3. Balandrin M. F., Klocke J. A., 1988. Medicinal, Aromatic, and Industrial Materials from Plants. In Biotechnology in Agriculture and Forestry 4, Medicinal and Aromatic Plants I, Ed. by Y. P. S. Bajaj, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, p. 191-199. 4. Berlin J., Slag S., Strack D., Bokem M., Harms H., 1986. Production of betalains by suspension cultures of Chenopodium rubrum L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 5, p. 163-174. 5. Bohlmann J., Eilert U., 1994. Elicitor induced secondary metabolism in Ruta graveolens L. Role of chorismate utilising enzymes. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 38, p. 189198. 6. Boulter M.E., Croy E., Simpson P., Schields R., Croyand R.R.D., Shirsat A.H., 1990. Transformation of Brassica napus L. (oilseed rape) using Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes a comparison. Plant Sci., 70, p. 91-99. 7. Boyd M. G., 1991. Studies on carotenoid production in cultures of Bixa orellana. Ph. D. thesis, University of Edinburgh, UK. 8. Buitelaar R. M., Tramper J., 1992. Strategies to improve the production of secondary metabolites with plant cell cultures: a literature review. Journal of Biotechnology 23, p. 111-141. 9. Constantin Toma, Mihaela Ni, 1995. Celula vegetal. Editura Universitii Al. I. Cuza, Iai, p. 39. 10. Croes A. F., Jacobs J. JMR, Arroo RRJ, Wullems GJ., 1994. Thiophene biosynthesis in Tagetes roots: molecular versus metabolic regulation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 38, p. 159-165. 11. Dekeyser R., Inze D., Van Montagu M., 1990. Transgenic plants. In: Gene manipulation in plant improvement II. Ed. P. Gustafson. Plenum Press, New-York, p. 237-250. 12. Dore C., 1990. Cinquantenaire de la culture in vitro chez les vgtaux. Les Colloques de lINRA, 51. INRA PARIS. 13. Emil Pop, St. Peterfi, N. Slgeanu, H. Chirilei, 1960. Manual de fiziologia plantelor. Editura de Stat Didactic i Pedagogic, Bucureti, vol. II, p. 54. 14. Fleurentin J. R., Pelt J. M., 1990. Les plantes mdicinales. La Recherche, 21, p. 811-818. 15. Gavril Neamu, 1983. Biochimie ecologic. Editura Dacia, Cluj-Napoca, p. 13-54. 16. Gavril Neamu, Cmpeanu Gheorghe, Enache Aurelia, 1989. Dicionar de Biochimie vegetal. Editura Ceres, Bucureti, p. 46-246. 17. Gavril Neamu, Ionela Popescu, t. Lazr, I. Burnea, I. Brad, Gh. Cmpeanu, T. Galben, 1983. Chimie i biochimie vegetal. Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, p. 260282. 18. Hamill J. D., Parr A. J., Rhodes M. J. C., Robins R. J., Walton N. J., 1987. New routes to plant secondary products. Bio/Technology, 5, p. 800-804. 19. Meyer P., Heidmann I., Forkmann G., Saedler H., 1987. A new petunia flower colour generated by transformation of a mutant with a maize gene. Nature, 330, p. 677-678. 20. Richard A. Dixon, Christopher J. Lamb, 1990. Regulation of secondary metabolism at the biochemical and genetic levels. In Secondary Products from Plant Tissue Culture, Ed. by Barry V. Charlwood and M. J. C. Rhodes. 28

21. Schmauder H. P., Doerel P., 1990. Plant cell cultivation as a biotechnological method. Acta Biotechnol., 6, p. 501-516. 22. Wink M., 1986. Production of plant secondary metabolites by plant cell culture in relation to the site and mechanism of their accumulation. In: Plant vacuoles: their importance in solute compartmentation in cells and their applications in plant biotechnology. Ed. Marin B. Plenum Press, NATO ASI serie, vol. 134, p. 477-484. 23. Wink M., 1988. Plant breeding: importance of plant secondary metabolites for protection against pathogens and herbivores. Theor. Appl. Genet., 75, p. 225-233. 24. Yeoman M. M., Yeoman C. L., 1996. Manipulating secondary metabolism in cultured plant cells. In Phytol., 134, p. 553-569. 25. Zryd J. P., 1988. Cultures in vitro et production de