15

Optimasi Efisiensi_2014cy

Embed Size (px)

DESCRIPTION

biotek

Citation preview

i

‘’ SEMINAR NASIONAL BIOTEKNOLOGI 2014’’

Biotechnological Approaches to Blue Economy

Implementation

Diselenggarakan oleh:

Program Studi Biologi - Fakultas Teknobiologi

Universitas Surabaya

Perpustakaan Lantai 5 Universitas Surabaya

Surabaya-Indonesia

27 - 28 Febuari 2014

ii

‘’ SEMINAR NASIONAL BIOTEKNOLOGI 2014’’

Biotechnological Approaches to Blue Economy

Implementation

PROSIDING

Ketua:

Theresia Desy Askitosari, S.Si., M.Biotech

Editor:

Dr.rer.nat. Maria Goretti M. Purwanto

Dr. Tjandra Pantjajani

Theresia Desy Askitosari, S.Si., M.Biotech

Ruth Chrisnasari, S.TP., M.P.

Nurul Azizah, S.Si.

Diselenggarakan oleh:

Program Studi Biologi - Fakultas Teknobiologi

Universitas Surabaya

27 - 28 Febuari 2014

iii

‘’ SEMINAR NASIONAL BIOTEKNOLOGI 2014’’

Biotechnological Approaches to Blue Economy

Implementation

PROSIDING

ISBN : 978-602-14714-2-5

Editor : Dr.rer.nat. Maria Goretti M. Purwanto

Dr. Tjandra Pantjajani

Theresia Desy Askitosari, S.Si., M.Biotech

Ruth Chrisnasari, S.TP., M.P.

Nurul Azizah, S.Si.

Diterbitkan oleh : UBAYA Press

iv

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kami haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat yang telah

diberikan sehingga Prosiding Seminar Nasional Bioteknologi (SNB) Universitas

Surabaya (UBAYA) 2014 dapat diselesaikan. SNB UBAYA 2014 merupakan

seminar nasional pertama yang diselenggarakan oleh Fakultas Teknobiologi,

Universitas Surabaya, sekaligus mengawali rangkaian kegiatan peringatan lustrum

pertama Fakultas Teknobiologi, Universitas Surabaya yang jatuh pada tanggal 1

Februari 2015. Tema seminar nasional ini adalah ‘Biotechnological Approaches to

Blue Economy Implementation’ yang diadakan pada tanggal 27-28 Februari 2014,

bertempat di Gedung Perpustakaan lantai V, Universitas Surabaya, serta dihadiri

oleh enam pembicara utama yang pakar di bidang Industri dan Bisnis, Kesehatan

dan Forensik, serta Pangan dan Pertanian. Peserta yang berpartisipasi dalam

presentasi oral maupun poster berasal dari berbagai perguruan tinggi negeri

maupun swasta di Indonesia serta instansi pemerintah maupun industri.

Prosiding ini dibuat dengan tujuan memberikan pengetahuan bagi masyarakat luas

terkait dengan penelitian di bidang bioteknologi untuk mendukung implementasi

Blue economy di Indonesia . Prosiding SNB UBAYA 2014 ini berisi makalah dan

hasil penelitian dari para pembicara utama maupun peserta presentasi oral.

Adanya sesi diskusi pada sesi oral yang dibagi menjadi 4 kelas paralel, yaitu kelas

Bioteknologi Kesehatan dan Forensik, Bioteknologi Pangan, Bioteknologi

Tanaman, dan Bioteknologi Lingkungan, maupun sesi poster diharapkan dapat

menjadi motivasi bagi pemakalah untuk terus berkarya di bidang bioteknologi

untuk mendukung implementasi Blue economy di Indonesia.

Kami menyadari bahwa Prosiding ini tentu saja tidak luput dari kekurangan, untuk

itu segala saran dan kritik kami harapkan demi perbaikan Prosiding pada terbitan

tahun yang akan datang. Kami berharap Prosiding ini dapat bermanfaat bagi kita

semua.

Hormat saya,

Theresia Desy Askitosari

v

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR iv Keynote Speaker Blue Economy sebagai Pilar Kedaulatan Ekonomi Indonesia 3 Jaya Suprana Aplikasi Teknologi DNA sebagai Metode Identifikasi di Bidang Forensik 4 Agung Sosiawan Solusi Saintifik terhadap Berbagai Permasalahan dalam Industri Bioproses 5 (Lingkungan) yang Menunjang Implementasi Blue Economy

Lieke Riadi

Aplikasi Bioteknologi Pangan dan Pertanian untuk Menunjang Implementasi 6 Blue Economy

Anton Apriyantono

Technology Development of Microscope from Cell Biology to Nano Biology 8 Sutiman B. Sumitro Solusi Saintifik terhadap Berbagai Permasalahan dalam Bioteknologi Tanaman 9 yang Menunjang Implementasi Blue Economy Xavier Daniel Bidang Bioteknologi Kesehatan dan Forensik Deteksi Transovarial Virus Dengue pada Nyamuk Vektor Demam Berdarah 13 Kasus KLB di Kabupaten Merauke Provinsi Papua : Sebuah Pendekatan Molekular

Hana Krismawati*1), Hanna Kawulur1), Antonius Oktavian1), Neville Raymon M2), Arif 2), John Master Saragih3), Jan Lewier1)

Deteksi Mutasi Fragmen DNA Integrase HIV-1 pada Subyek Odha di Jayapura 17

Hotma Hutapea1, Arie Ardiansyah2

Karakterisasi DNA Escherichia coli C600 Lisogenik Menggunakan Teknik 22 Hibridisasi Dot Blotting dan Southern Blotting

Aline Puspita Kusumadjaja Optimasi dan Aplikasi Multiplex Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi 32 Salmonella sp., Vibrio cholerae, dan Pseudomonas aeruginosa pada Air Minum Kemasan sebagai Pengganti Metode Deteksi Konvensional

Vicky Chu*, Maria Goretti M. Purwanto, Xavier Daniel

viii

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Indigen Penghasil Biosurfaktan dari Sampel 188 Endapan Lilin pada Pipa Transmisi Minyak Mentah

Any Juliani1)*, Andik Yulianto1), Mutia Anneu Sutani2) Isolasi dan Identifikasi Bakteri Resisten Logam Berat Kadmium 195

Johnsen Tanjaya*, Tjandra Pantjajani, Mangihot Tua Goeltom

Kloning Gen Pengkode Enzim Endo-1,4-Beta-Glucanase (ysdC) dan 201 Endo-BETA-1,3-1,4 Glucanase (BSUW23_10175) dari Bacillus subtilis dalam Sel Escherichia coli Origami

Mariana Wahjudi*, Olivia Maria Angelina, Xavier Daniel, Lisa Gunawan, Yusnita Liasari

Kajian Jenis Tempat Perindukan, Kepadatan Larva Aedes sp., dan Perilaku 3M 210 Masyarakat Kecamatan Cilacap Utara Kabupaten Cilacap – Jawa Tengah

Imam Apriyana1)*, Haris B. Widodo2), Agatha Sih Piranti3)

Ekstraksi Eksotoksin Bakteri Simbion Nematoda Patogen Serangga 216 Hasil Isolasi Sampel Tanah Trawas, Mojokerto

Theresia Desy Askitosari

Karakteristik Bakterial Agarase Isolat GC 2.1. dari Perairan Sancang Garut 223

Santi R. Anggraeni1)*, Emma Rochima2), M. Untung Kurnia Agung1)

Isolasi dan Identifikasi Mikroorganisme Penghasil Enzim Kitinase Termofil 228 pada Permandian Air Panas Prataan, Tuban

Steven Yasaputera, Tjandra Pantjajani, Ruth Chrisnasari* Bidang Bioteknologi Tanaman/Pertanian Seleksi Ketahanan 10 Genotipe Gandum (Triticum aestivum L.) dengan Proline 237 sebagai Penanda terhadap Cekaman Suhu Tinggi dan Kekeringan Theresa Dwi Kurnia1)*, Djoko Murdono2), Nugraheni Widyawati2),

Sony Heru Priyanto3) Ekspresi Gen Doda pada Bunga Celosia di Jawa Timur 242

Mastuti R*, Harijati N, Fatinah AA Optimasi Efisiensi Transformasi Transien dan Regenerasi Transforman 249 Stabil Tembakau Sindoro (Nicotiana tabacum)

Jaka Angkasa Saputra, Tjie Kok1), Xavier Daniel2) Populasi dan Aktivitas Mikroba Tanah pada Budidaya Wortel Organik 256 dan Konvensional

Sarmah1)*, Khamdanah1), Edi Husen2)

ix

Pengaruh Biodekomposer Bc 1 dan Bc 2 terhadap Percepatan Pengomposan 261 dan Kualitas Kompos Tandan Kosong Kelapa Sawit

Khamdanah*, Elsanti, Sarmah, Edi Santosa, Surono

Pengaruh Katalis Berbasis CoMo pada Reaksi Hydrocracking Minyak 268 Nyamplung Menjadi Biofuel

Adrianto Prihartantyo*, Achmad Roesyadi, Mahfud, Rismawati Rasyid

Hidrocracking Minyak Biji Kapuk dengan Katalis Padat NiCoMo/γ-Al2O3 275

Eni Setya Rini*, Achmad Roesyadi Senyawa Penyusun Ekstrak N-Heksana dari Daun Pisang Batu, Kepok dan 283 Ambon Hasil Distilasi Air

Titri Siratantri Mastuti*, Ratna Handayani1 Perombakan Herbisida 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid (2,4-D) 288 oleh Isolat Bakteri Tanah Vulkanik Gunung Merapi, Yogyakarta

Seftavi Widya Sari UCAPAN TERIMA KASIH 293 HALAMAN SPONSOR 294

249

Optimasi Efisiensi Transformasi Transien dan Regenerasi Transforman Stabil

Tembakau Sindoro (Nicotiana tabacum)

Jaka Angkasa Saputra, Tjie Kok1)

, Xavier Daniel2)

Program Studi Biologi, Fakultas Teknobiologi, Universitas Surabaya

Jalan Raya Kalirungkut, Surabaya 60293, Indonesia Telp/fax: 031-2981399/ 031-2981278 1),2)

Email: [email protected]; [email protected]

ABSTRAK

Agrobacterium tumefaciens telah digunakan secara luas pada penelitian molekuler tanaman dan

pemuliaan tanaman sejak tahun 1983 untuk kepentingan rekayasa genetika. Umumnya A.tumefaciens diinfeksi

pada diskus daun sedangkan menginjeksi A.tumefaciens ke jaringan daun dapat dijadikan alternatif, metode ini

disebut Agroinfiltrasi. Agroinfiltrasi lebih cepat dan mudah dibandingkan teknis diskus daun karena dapat

mengukur ekspresi transgene sejak 2-4 hari setelah infiltrasi. Sedangkan metode diskus daun memerlukan

waktu 2-4 bulan untuk analisa ekspresi transgene. Pada penelitian ini, Agroinfiltrasi daun dilakukan pada

Sindoro salah satu jenis tembakau Temanggung. Variabel agroinfiltrasi adalah densitas inokulum A.tumefaciens

C58C1(pMp90, pEGAD) dan waktu ko-kultivasi setelah infiltrasi. Kuantifikasi Green Fluorescent Protein

(GFP) ekstrak daun Sindoro dibandingkan kontrol negatif dapat mencapai 123% pada OD600=0.06 saat 24 jam

setelah infiltrasi. Sebagian agroinfiltrasi daun Sindoro juga diregenerasi pada media Murashige dan Skoog (MS)

mengandung BASTA 5 ppm sebagai agen seleksi. Tunas transforman muncul pada hari ke-47 setelah inokulasi

di media MS seleksi transforman.

Kata kunci: agroinfiltrasi, A.tumefaciens, GFP, tembakau sindoro

Pendahuluan

Agrobacterium tumefacienstelah digunakan secara luas pada penelitian molekuler tanaman

dan pemuliaan tanaman sejak tahun 1983 untuk kepentingan rekayasa genetika. Keberhasilan metode

ini telah diaplikasikan pada kedelai, kapas, beras, jagung, tebu dan gandum (Ko dan Korban, 2004;

Lopez et al., 2004). A.tumefaciens umumnya digunakan sebagai alat transformasi terhadap diskus

daun dilanjutkan regenerasi transforman dari diskus in vitro yang dikenal sebagai teknik transformasi

stabil. Alternatif lain untuk mentransformasi tanaman dapat dengan cara menginjeksi A.tumefaciens

ke organ tanaman secara in-planta atau Agroinfiltrasi. Teknik agroinfiltrasi merupakan transformasi

transien artinya hanya sebagian jaringan yang tertransformasi, bukan suatu organisme utuh.

Agroinfiltrasi memungkinkan pemantauan ekspresi protein, lokalisasi protein dan interaksi antar

protein (Sparkes et al., 2006), penentuan fungsi gen (Bendahmane et al., 2000; Van der Hoorn et al.,

2000; Johansen dan Carrington, 2001; Shao et al., 2003; Wroblewski et al., 2005), analisis promoter

(Hellens et al., 2005), dan studi inducible genes (Lee dan Yang, 2006).

Pada penelitian ini, Agroinfiltrasi dilakukan pada daun tembakau Temanggung jenis Sindoro

menggunakan A.tumefaciens C58C1(pMp90, pEGAD). Daun yang diinfiltrasi akan mengandung sel-

sel tansforman mengekspresikan GFP. Selanjutnya protein GFP diekstraksi sebagai indikator efisiensi

transformasi. Keberhasilan transformasi menggunakan A.tumefaciens dipengaruhi oleh beberapa

faktor seperti densitas inokulum bakteri (OD600), lama inkubasi, surfaktan, dan kerentanan tanaman

host (Cheng et al., 1997; Mondal et al., 2001; Lopez et al., 2004). Pada penelitian ini digunakan

variabel densitas inokulum A.tumefaciens C58C1(pMp90, pEGAD) dan lama inkubasi. Selain itu,

juga dilakukan regenerasi transforman stabil melalui teknik kultur jaringan pada media seleksi in vitro

mengandung BASTA.

Metodologi

Bahan

Tanaman yang digunakan sebagai objek penelitian adalahTembakau (Nicotiana tabacum)

Temanggung jenis Sindoro. Tanaman tembakau ditumbuhkan dari persemaian biji tembakau di

Greenhouse Fakultas Teknobiologi Universitas Surabaya.Strain A.tumefaciens, yang digunakan

adalah C58C1(pMp90,pEGAD) dari koleksi Laboratorium Fakultas Teknobiologi Universitas

Surabaya. A.tumefaciens strain C58C1 telah resisten terhadap rifampisin. pMp90 memberikan

resistensi gentamisin serta meningkatkan efektivitas transformasi. Plasmid pEGAD memberikan

resisten terhadap kanamisin, serta membawa coding sequence GFP dan gen Bar.

Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight
Toshiba
Highlight

250

Bahan kimia yang digunakan sebagai berikut: Luria-Bertani (LB) Broth, LB Agar, Gentamisin,

Kanamisin, Rifampisin, asam borat pH 8, NaCl, kafein, asam askorbat, Triton X-100, DTT, PMSF,

NaOCl, Tween-20, media Murashige dan Skoog (MS), BASTA, cefotaxime, NAA, dan BAP. Media

infiltrasi (50 ml) dengan komposisi 250 mg D-glucose, 5 ml larutan stok MES (Phytolab), dan 5 ul

1M larutan stok Acetosyringone (Phytolab) kemudian ditambahkan akuades hingga 50 ml. Larutan

stok MES 500 mM dibuat dengan 4.88 gram bubuk MES dilarutkan dalam 50 ml akuades dan pH

diatur hingga 5.5, dan larutan disimpan di suhu 4°C. Larutan stok Acetosyringone 1M dibuat dengan

0.196 gram bubuk Acetosyringone dalam 1 ml DMSO, kemudian dialikuot dan disimpan pada suhu -

20°C

Alat

Alat-alat yang digunakan: mikrosentrifus dingin, spektrofotometer, sonikator, Geldoc, fluorimeter

FLUOstar Omega, syringe, alat diseksi, dan Laminar Air Flow (LAF).

Prosedur

Persiapan Kultur A.tumefaciens. Stok gliserol A.tumefaciens C58C1(pMp90, pEGAD) diinokulasi

dalam LB agar mengandung antibiotik (50 µg/ml Kanamisin, 25 µg/ml Rifampisin dan 20 µg/ml

Gentamisin). Koloni tunggal A.tumefaciens C58C1(pMp90, pEGAD) diinokulasi dalam 15 ml LB

Broth mengandung antibiotik (50 µg/ml Kanamisin, 25 µg/ml Rifampisin dan 20 µg/ml Gentamisin)

dan diinkubasi pada suhu 28°C dengan kecepatan 120 rpm hingga OD600 = 0.5-0.8. Kultur

disentrifugasi 3.000 rpm selama 10 menit, dan supernatan dibuang. Sebanyak 5 ml media infiltrasi

ditambahkan sebelum disentrifugasi 3.000 rpm selama 10 menit, dan supernatan dibuang. Media

infiltrasi ditambahkan hingga mendapatkan OD600 akhir = 0.10; 0.06 dan 0.02. Kultur A.tumefaciens

C58C1(pMp90, pEGAD) siap diinfiltrasi ke daun tembakau.

Agroinfiltrasi daun tembakau. Daun berukuran ±10 cm dipilih dari tanaman berumur 1-2 bulan. Air

berlebih diberikan ke pot saat malam sebelum infiltrasi. A.tumefaciens C58C1(pMp90, pEGAD)

diresuspensi dalam media infiltrasi dengan syringe tanpa jarum. Sebanyak 1 ml kultur A.tumefaciens

diinfiltrasi dengan syringe tanpa jarum ke sisi bawah daun. Area infiltrasi ditandai dengan marker

hitam. Tanaman terinfiltrasi dikembalikan ke Greenhouse dan dibiarkan selama 24 jam, 48 jam, dan

72 jam. Saat waktu inkubasi berakhir, daun dipanen atau disimpan pada suhu -80°C jika akan

dianalisa pada waktu yang cukup lama.

Ekstraksi GFP. Daun terinfiltrasi dipanen dan ditimbang seberat 100 mg kemudian ditambahkan 200

µl Extraction Buffer (0.25 M asam borat, pH 8, 0.25 M NaCl, 1% kafein, 1% asam askorbat, 0.1%

Triton X-100, 1mM DTT, dan 1 mM PMSF). Daun dihancurkan dengan mortar dingin dan ekstrak

kasar disonikasi selama 30 menit. Ekstrak disentrifugasi selama 30 menit pada suhu 4°C, sebanyak

165 µl supernatan di tambahkan 71 µl larutan campuran Ammonium Sulfat (AS) 4 M dan 50 mM tris

pH (30% volum final (v/v)). Prespitasi dibiarkan selama 15 menit sebelum disentrifugasi 8.000g

selama 30 menit pada suhu 4°C. 120 µl supernatan siap divisualisasi dan dikuantifikasi. Teknik

ekstraksi ini dimodifikasi dari teknik Peckham et al. (2006).

Visualisasi dan Kuantifikasi GFP. Sebanyak 120 µl ekstrak kasar dalam Eppendorf dimasukkan ke

Geldoc untuk visualisasi. Kuantifikasi dilakukan terhadap 100 µl ekstrak kasar menggunakan

mikroplate hitam. Intensitas GFP diukur pada panjang gelombang eksitasi 390 nm dan emisi 520 nm

menggunakan FLUOstar Omega dengan mikroplate BMG Labtech 96.

Regenerasi transforman stabil. Daun terinfiltrasi direndam dalam akuades selama 20-30 menit

kemudian dicuci dengan deterjen dan dibilas hingga bersih. Perendaman dengan fungisida 10 ml/L

dilakukan selama 2 jam kemudian dilanjutkan perendaman NaOCl 2.6% selama 5 menit dan NaOCl

2.1% selama 15 menit, masing-masing perendaman dibilas tiga kali dengan akuades steril. Daun

dipotong dan ditanam dalam media MS inisiasi tunas mengandung 0.8 BAP, 0.2 NAA, agen selektif

BASTA 5 ppm dan cefotaxime 500 ppm. Kontrol wild-type yaitu daun yang hanya diinfiltrasi media

infiltrasi tanpa kultur, ditanam pada media mengandung BASTA dan tanpa BASTA. Cahaya ruang

inkubasi diatur 24 jam cahaya.

251

Hasil dan Pembahasan

Visualisasi dan Kuantifikasi GFP.

Visualisasi intensitas fluoresensi GFP dari ekstrak kasar dalam Geldoc ditunjukkan pada

Gambar 1. Secara kasat mata dapat diperkirakan OD600=0.06 dan 0.10 saat 24 jsi memberikan

pendaran GFP lebih terang dibandingkan kombinasi variabel lainnya. Data intensitas GFP hasil

ekstraksi dikonversi menjadi persentase relatif terhadap kontrol negatif (kontrol negatif bernilai

100%) dapat dlihat pada Gambar 2. Intensitas GFP secara relatif menunjukkan nilai tinggi pada

OD600= 0.06 pada semua waktu inkubasi dan OD600=0.10 saat 48 jsi dan 72 jsi. Berdasarkan efisiensi

waktu dan nilai intensitas GFP, maka OD600=0.06 saat 24 jsi dipilih untuk tahap selanjutnya.

Gambar 1. Pendaran ekstrak kasar GFP daun Sindoro. Variabel yang digunakan adalah tiga variasi densitas

inokulum A.tumefaciens (OD600=0.02, 0.06, 0.10) dan tiga variasi waktu inkubasi (24, 48, 72 jam setelah

infiltrasi (jsi)). Kontrol negatif adalah daun yang diinfiltrasi media infiltrasi saja. Sebanyak 120 µl ekstrak kasar

diamati pendarannya pada masing-masing Eppendorf di dalam Geldoc.

Secara umum, tingkat ekspresi GFP menunjukkan peningkatan pada OD lebih rendah dan terus

meningkat hingga batas tertentu kemudian tingkat ekspresi menurun. Demikian pula hal yang sama

terjadi pada waktu inkubasi. Hal ini dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada transformasi menggunakan

A.tumefaciens,kecocokan pengenalan dan kolonisasi A.tumefaciens terhadap sel tanaman bukan hal

yang utama dalam menentukan keberhasilan transformasi. Tetapi respons tanaman host terhadap

A.tumefaciens selama proses infeksi juga memegang peranan penting (Zambryski, 1988; Binns,

1990). Sel tanaman diketahui memiliki kemampuan mengenali patogen dan mengaktifkan sinyal

pertahanan yang selanjutnya menyebabkan respons nekrosis (Lamb et al., 1989; Mehdy, 1994; Dangl

et al.,1996; Hammond-Kosack dan Jones, 1996; Blumwald et al., 1998; Somssich dan Hahlbrock,

1998; Richter dan Ronald, 2000). Sinyal pertahanan tanaman antara lain berujung pada hypersensitive

OD 600

0.02

OD 600

0.06

OD 600

0.10

24 jsi

48 jsi

72 jsi

kontrol negatif

252

reaction (HR). HR pada tanaman berakhir pada nekrosis lokal di sekitar area infeksi (Hammond-

Kosack dan Jones, 1996; Richter dan Ronald, 2000). Nekrosis dilaporkan salah satu alasan utama

yang menurunkan efisiensi transformasi dengan A.tumefaciens (Gustavo et al.,1998). Proses ini dapat

berlangsung setelah 24-36 jam setelah co-cultivation dan secara signifikan menurunkan efisiensi

transformasi menggunakan A.tumefaciens baik secara stabil maupun transien (Perl et al.,1996). Reaksi

nekrosis dipengaruhi oleh beberapa parameter transformasi seperti: umur eksplan, preculture period,

densitas inokulum bakteri, dan lama waktu infeksi (Das et al., 2002). Beberapa gen yang

diekspresikan tanaman selama 48 jam sebagai bentuk pertahanan antara lain: RNAse, peroksidase dan

gen PR (pathogenesis related) terdeteksi melalui RT-PCR (Ditt et al., 2005). Salah satu solusi untuk

menghindari oksidasi yang disebabkan HR adalah dengan menambahkan antioksidan seperti asam

askorbat, sistein, asam sitrat, PVPP, PVP, DTT, dan cyclitols (myo-inositol).

Gambar 2. Grafik perbandingan intensitas GFP pada daun Sindoro relatif terhadap kontrol negatif. Sumbu Y

menunjukkan nilai intensitas relatif terhadap kontrol negatif (biru) dalam persentase pada kondisi OD600=0.02

(merah), OD600=0.06 (hijau), dan OD600=0.10 (ungu). Sumbu X menunjukkan variasi waktu 24 jsi, 48 jsi dan 72

jsi. Replikasi dilakukan sebanyak 6 kali.

Penurunan tingkat ekspresi selama transformasi transien dapat dikarenakan hilangnya protein

setelah degradasi T-DNA yang tidak terintegrasi di dalam sel (Chiera et al., 2008; Dhillon et al.,

2009). Proses infeksi A.tumefaciens ke sel tanaman merupakan sistem yang kompleks. Adanya

interupsi pada langkah tertentu akan signifikan pada langkah selanjutnya dan berdampak pada

efisiensi transformasi. Kerentanan host terhadap A.tumefaciens juga terkait erat dengan interaksi

polisakarida pada sel tanaman host dan sel A.tumefaciens (Sangwan et al., 1992). Beberapa kondisi

spesifik yang menyebabkan yield protein rekombinan bervariasi antara lain keadaan fisiologis dan

tahap perkembangan. Faktor yang dapat mempengaruhi adalah temperatur, intensitas cahaya, pupuk,

umur inokulasi tanaman, waktu inkubasi setelah infiltrasi daun dan ekspresi protein (Chen et al.,

2013). Tingkat ekspresi GFP juga berbeda bergantung pada umur daun. Ekspresi lebih tinggi

ditemukan pada daun yang lebih muda pada pucuk (Wydro et al., 2006).

253

Umur eksplan Wild-type Wild type + BASTA Daun setelah diinfiltrasi

+ BASTA

0 hari

15 hari

47 hari

Gambar 3. Regenerasi langsung transforman stabil Sindoro. Perkembangan eksplan yang ditanam pada

media inisiasi tunas: wild-type tanpa BASTA (A1-A3), wild-type pada BASTA 5 ppm (B1-B3) dan daun

terinfiltrasi A.tumefaciens C58C1 (pMp90,pEGAD) pada BASTA 5 ppm (C1-C3). Seluruh media mengandung

cefotaxime 500 ppm.

Regenerasi transforman stabil.

Infiltrasi A.tumefaciens C58C1 (pMp90,pEGAD) ke daun dilakukan 24 jsi sebelum ditanam

secara in vitro. Perkembangan eksplan dapat dilihat pada Gambar 3. Sebagai kontrol regenerasi, wild-

type pada media tanpa BASTA menunjukkan regenerasi in vitro berhasil dengan baik meski

cefotaxime 500 ppm juga terkandung dalam media (Gambar 3 A2-A3). Sedangkan kontrol negatif

dipresentasikan oleh eksplan wild-type pada BASTA 5 ppm. Kontrol negatif menunjukkan respons

nekrosis pada hari ke-15 dan tidak teramati adanya perkembangan pada hari selanjutnya (Gambar 3

B2-B3). Daun yang terinfiltrasi pada BASTA 5 ppm juga menunjukkan respons nekrosis pada hari ke-

15 (Gambar 3 C2). Tetapi pada hari ke-47, eksplan mengalami respons pembengkakan pada sebagian

jaringan bahkan calon tunas sudah dapat teramati pada tahap ini (Gambar 3 C3).Regenerasi

transforman in vitro lebih lama dibandingkan perkembangan wild-type tanpa BASTA dikarenakan

BASTA yang membunuh sel wild-type juga menghambat perkembangan transforman yang masih

beradaptasi. Pada seleksi transforman digunakan BASTA 5 ppm untuk mencapai selektivitas dimana

semua tunas yang tumbuh benar-benar adalah transforman (data optimasi konsentrasi BASTA tidak

ditunjukkan). Sel transforman harus memproduksi protein phosphinotricin acetyl transferase (PAT)

untuk mendetoksifikasi BASTA yang ada dalam media. Proses detoksifikasi dan biosintesis protein

PAT membutuhkan energi dan nutrisi sehingga perkembangan transforman terhambat. Disamping itu,

agroinfiltrasi mengakibatkan luka pada daun sehingga meningkatkan resiko stres lebih tinggi saat

tahap sterilisasi. Sel tanaman transgenik yang mengalami stres dan nekrosis akan menghambat

regenerasi klon transgenik (Potrykus, 1990). Perendaman dengan antioksidan seperti asam askorbat

atau DTT setelah sterilisasi, diharapkan dapat menetralisir radikal bebas pada jaringan.

A1 B1 C1

A2 B2 C2

A3 B3 C3

254

Kesimpulan

Teknik agroinfiltrasi dapat memantau ekspresi GFP pada Tembakau (Nicotiana tabacum)

jenis Sindoro dalam waktu 1-3 hari setelah infiltrasi. Agroinfiltrasi menggunakan A.tumefaciens

C58C1(pMp90, pEGAD) OD600=0.06 saat waktu tersingkat yaitu 24 jsi mendapatkan tingkat ekspresi

GFP yang cukup tinggi (123%) dibandingkan kontrol negatif. Selain itu, daun terinfiltrasi dapat

diregenerasi menjadi transforman stabil pada media seleksi. Tunas transforman muncul pada hari ke-

47 setelah inokulasi in vitro.

Ucapan Terima Kasih

Kami sangat berterimakasih kepada dosen, staf dan karyawan Fakultas Teknobiologi

Universitas Surabaya dan juga teman-teman yang turut membantu dalam penelitian ini. Terutama

kami berterimakasih kepada Dr. Dominique Roby dari LIPM, Perancis yang memberikan kultur

A.tumefaciens strain C58C1 (pMp90). Penelitian ini disponsori oleh Lembaga Penelitian dan

Pengabdian kepada Masyarakat Universitas Surabaya.

Daftar Pustaka

1. Bendahmane, A., et al. Agrobacterium transient expression system as a tool for the isolation of

disease resistance genes: application to the Rx2 locus in potato. Plant J, 2000; 21:73-81.

2. Blumwald, E., Aharon, G.S., dan Lam, B.C.H. Early signal transduction pathways in plant–

pathogen interactions. Trends in Plant Sci, 1998; 3:342-346.

3. Chen, Q., et al.Agroinfiltration as an Effective and Scalable Strategy of Gene Delivery for

Production of Pharmaceutical Proteins. Adv Tech Biol Med, 2013;1:103.

4. Cheng, M., et al. Genetic Transformation of Wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant

Physiol, 1997;115:971-980.

5. Chiera, J.M., Lindbo, J.A., dan Finner, J.J. Quantification and extension of transient GFP

expression by co-introduction of a suppressor of silencing. Transgenic Research, 2008; 17: 1143-

1154.

6. Dangl, J.L., Dietrich, R.A., dan Richberg, M.H. Death don't have no mercy: Cell death programs in

plant-microbe interactions. Plant Cell, 1996; 8:1793-1807.

7. Das, D.K., et al. An efficient leaf-disk culture method for the regeneration via somatic

embryogenesis and transformation of grape (Vitis vinifera L.). Plant cell Rep., 2002; 20:999-1005.

8. Dhillon, T. et al. Quantitative evaluation of six different viral suppressor of silencing using image

analysis of transient GFP expression. Plant Cell Reports, 2009; 28:639-647.

9. Ditt, R.F., Nester E.W., dan Comai, L. The plant cell defense and Agrobacterium

tumefaciens.FEMS Microbiology Letters, 2005; 247(2):207-213.

10. Gustavo, A.R., et al. Agrobacterium tumefaciens: A natural tool for plant transformation.

Electronic J. Biotechnol, 1998; 1:3.

11. Hammond-Kosack, K.E., dan Jones, J.D.G. Resistance gene-dependent plant defense responsses.

Plant Cell, 1996; 8:1773-1791.

12. Hellens, R.P., et al. Transient expression vectors for functional genomics, quantification of

promoter activity and RNA silencing in plants. BMC Plant Methods, 2005; 1:13.

13. Johansen, L.K., dan Carrington, J.C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA

silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiol, 2001;

126:930-938.

14. Ko, T., dan Korban, S. Enhancing the frequency of somatic embyogenesis following

Agrobacterium-mediated transformation of immature cotyledons of soybean (Glycine max (L.)

Merrill). In Vitro Cell Dev. Biol-Plant, 2004; 40:552-558.

15. Lamb, C.J., et al. Signals and transduction mechanisms for activation of plant defenses against

microbial attack. Cell, 1989; 56:215-224.

16. Lee, M.W., dan Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol

Biol, 2006; 323:225-229.

17. Lopez, S.J., et al. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation in tea (Camellia

sinensis L.O. Kuntze). Plant Mol. Biol. Rep., 2004; 22:201a-201j.

18. Mehdy, M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens. Plant Physiol, 1994;

105:467-472.

255

19. Mondal, T.K., et al. Transgenic tea (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze cv. Kangra Jat) plants

obtained by Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos. Plant Cell Rep, 2001;

20:712-720.

20. Peckham,G.D., Bugos, R.C., dan Su, W.W. Purification of GFP fusion proteins from transgenic

plant cell cultures. Protein Expression and Purification, 2006; 49: 183–189.

21. Perl, A., et al. Establishment of an Agrobacterium-mediated transformation system for grape (Vitis

vinifera L.): The role of antioxidants during grape-Agrobacterium interactions. Natur Biotechnol,

1996; 14:624-628.

22. Potrykus, I. Gene transfer to cereals: an assessment. BioTechnology, 1990; 8: 535-542.

23. Richter, T.E., dan Ronald, P.C. The evolution of disease resistance genes. Plant Mol. Biol, 2000;

42:195-204.

24. Sangwan, R.S., et al. Characterization of competent cells and early events of Agrobacterium-

mediated genetic transformation in Arabidopsis thaliana. Planta, 1992; 188: 439-456.

25. Shao, F., et al. Cleavage of Arabidopsis PBS1 by Bacterial Type III Effector. Science, 2003;

301:1230-1233.

26. Somssich, I.E., dan Hahlbrock, K. Pathogen defense in plants – a paradigm of biological

complexity. Trends in Plant Science, 1998; 3:86-90.

27. Sparkes, I., et al. Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and

generation of stably transformed plants. Nature Protocols, 2006; 1:4. Diakses dari

http://www.nature.com/natureprotocols tanggal 20 Desember 2013.

28. Van der Hoorn, J.A.L., et al. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative

analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Mol Plant-Microbe Interact, 2000;

13:439-446.

29. Wroblewski, T., Tomczak, A., dan Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated

transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotech J, 2005;

3:259-273.

30. Wydro, M., Kozubek, E, dan Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene

expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica, 2006; 53: 289–

298.

31. Zambryski, P. Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells.

Annu. Rev. Genet, 1988; 22:1-30.