OPTIMASI PRODUKSI DAN KARAKTERISTIK BIOKIMIA

POLIFENOL OKSIDASE DARI ISOLAT TERPILIH FUNGI

ENDOFIT KULIT BUAH KAKAO (Theobroma cacao L.)

OPTIMIZATION OF PRODUCTION AND BIOCHEMICAL

CHARACTERISTIC OF POLYPHENOL OXIDASE FROM SELECTED

ENDOPHYTIC FUNGI IN POD HUSK OF CACAO

(Theobroma cacao L.)

S A R T I N I

P0700306002

PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2011

OPTIMASI PRODUKSI DAN KARAKTERISTIK BIOKIMIA POLIFENOL

OKSIDASE DARI ISOLAT TERPILIH FUNGI ENDOFIT KULIT BUAH

KAKAO (Theobroma cacao L.)

Disertasi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Doktor

Program Studi

Ilmu Kimia

Disusun dan Diajukan oleh

SARTINI

Kepada

PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2011

PERNYATAAN KEASLIAN DISERTASI

Yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : S a r t i n i

No.Pokok : P0700306002

Program Studi : Ilmu Kimia

Menyatakan bahwa disertasi yang saya tulis ini benar merupakan hasil karya

saya sendiri, bukan merupakan pengambilalihan tulisan atau pemikiran

orang lain. Apabila di kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa

sebagian atau keseluruhan disertasi ini hasil karya orang lain, maka saya

bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Makassar, Oktober 2011

Yang menyatakan,

Sartini

PRAKATA

Bismillahi rahmanirrahim

Puji syukur ke hadirat Allah Subhana Wataala dipanjatkan atas

segala rakhmat dan hidayah Nya sehingga disertasi ini dapat diselesaikan.

Banyak kendala yang dihadapi oleh penulis, baik dalam pelaksanaan

penelitian maupun dalam penyusunan disertasi ini, namun berkat bantuan

berbagai pihak, maka kendala-kendala tersebut dapat diatasi.

Pertama-tama penulis khaturkan terima kasih dan penghargaan

kepada bapak Prof.Dr. H. Abd.Rauf Patong sebagai promotor, bapak

Prof.Dr.Ir.Tjodi Harlim dan bapak Dr.Pirman, MS sebagai ko promotor yang

dengan ikhlas telah meluangkan waktunya untuk membimbing penulis dari

awal penelitian hingga penyusunan disertasi ini, melalui beliau-beliau

penulis banyak belajar mengenai teknologi dan biokimia enzim.

Penulis juga tak lupa mengucapkan terimakasih yang sebesar-

besarnya kepada :

1. Rektor dan Wakil Rektor bidang akademik Universitas Hasanuddin yang

telah memberikan kesempatan untuk mengikuti pendidikan S3 di Program

Pascasarjana Universitas Hasanuddin.

2. Ditjen Dikti Kementerian Pendidikan Nasional atas bantuan beasiswa

BPPS untuk pendidikan dan dana penelitian dari program riset untuk

mahasiswa S3.

3. Direktur dan Wakil Direktur Pascasarjana, Dekan FMIPA, Ketua dan

Sekrertaris Program S3 Ilmu Kimia FMIPA UNHAS, beserta seluruh staf

yang telah memberikan fasilitas studi dan berbagai kemudahan dalam

pelayanan administrasi selama penulis mengikuti pendidikan

4. Dekan Fakultas Farmasi UNHAS, Prof.Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. yang

telah memberikan izin kepada penulis untuk mengikuti pendidikan S3.

5. Bapak Prof.Dr. H. M. Noor Jalaluddin, Prof.Dr. H. Syahrul, M.Agr. dan ibu

Prof.Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. selaku penilai internal, serta Dr.rer.nat.

Muharram, MSc selaku penilai eksternal, terima kasih atas segala saran

perbaikan sejak seminar proposal hingga selesainya disertasi ini.

6. Teman-teman sejawat di Fakultas Farmasi UNHAS dan teman-teman S3

Kimia UNHAS angkatan 2006 yang telah memberikan dorongan moril,

sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan S3 ini

7. Kamaluddin Djafar, SSi., Apt., Ika Malikha, SPt., Hasliah, SSi., Dewi,

Mahdalia,SSi., Bety, dan Lukman, SSi., terima kasih atas bantuannya

dalam pelaksanaan penelitian penulis.

Kepada suami dan anak-anak tercinta: Prof.Dr.H.M.Natsir Djide, MS, Apt.,

Nina Pratiwi,SKM., Nana Juniarti, Nani Apriani, dan Nano Gustavo terima

kasih yang tak terhingga atas pengertian, dukungan dan doanya sehingga

penulis dapat menyelesaikan pendidikan S3 ini. Demikian pula buat Ibunda

tercinta, Hj. St. Aisjah Djohansjah atas segala kasih sayang dan doanya dan

untuk ayahanda Djohansjah (almarhum) terkirim doa semoga segala

curahan kasih sayang dan nasehatnya semasa hidup mendapat balasan

pahala dari Allah SWT.

Akhirnya, penulis menyadari bahwa disertasi ini jauh dari

sempurna, tetapi semoga dapat memberikan manfaat bagi pengembangan

ilmu pengetahuan. Amin

Makassar, Oktober 2011

Sartini

ABSTRAK

SARTINI. Optimasi Produksi dan Karakteristik Biokimia Polifenol Oksidase dari Isolat Terpilih Fungi Endofit Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L.) (dibimbing oleh Abd. Rauf Patong, Tjodi Harlim, dan Pirman) Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mengetahui bahwa di antara fungi endofit dari kulit buah kakao yang diisolasi ada yang mampu menghasilkan polifenol oksidase, (2) menentukan komposisi media fermentasi yang optimum memproduksi polifenol oksidase dari fungi endofit terpilih, (3) menentukan karakteristik biokimia dari polifenol oksidase yang dihasilkan dari fungi endofit terpilih

Tahap-tahap penelitian meliputi: (1) isolasi fungi endofit dari kulit buah kakao, (2) seleksi fungi endofit penghasil polifenol oksidase, (3) optimasi produksi polifenol oksidase melalui variasi konsentrasi ekstrak khamir, dekstrosa, asam gallat, dan tembaga sulfat dalam media fermentasi, (4) pemurnian enzim melalui fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, kromatografi filtrasi gel, analisis elektroforesis SDS-PAGE, dan (5) uji karakeristik biokimia polifenol oksidase yang dihasilkan.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa: (1) fungi endofit dari kulit buah kakao yang mampu menghasilkan polifenol oksidase adalah Tricothecium sp., (2) Optimasi produksi polifenol oksidase diperoleh pada komposisi media fermentasi: ekstrak khamir 1 %, KH2PO4 0,1 %, MgSO4.7H2O 0,05 %, CuSO4.5H20 0,1 mM, asam gallat 2 mM dengan aktivitas spesifik 3725,1 U/mg, (3) karakteristik biokimia polifenol oksidase yang diperoleh termasuk kategori tirosinase dan lakkase. Aktivitas enzim dihambat oleh asam askorbat, natrium metabisulfit, dan dinatrium EDTA . Suhu optimum 30 oC dan pH optimum 7. Nilai Km dan Vmax terhadap substrat katekol 0,625 mM dan Vmax 2083 U/mL.

ABSTRACT

SARTINI. Optimization of Production and Biochemical Characteristic of Polyphenol Oxidase from Selected Endophytic fungi in Pod Husk of Cacao (Theobroma cacao L.) (supervised by Abd. Rauf Patong, Tjodi Harlim, and Pirman) The research aimed to: (1) know that among the endophytic fungi of cacao pod husk isolated, some were able to produce polyphenol oxidase, (2) determine the optimum fermentation medium composition to produce polyphenol oxidase from selected endophytic fungus, (3) to determine biochemical characteristic of the polyphenol oxidase.

The research stages include.: (1) isolation and identification of endophytic fungi from cacao pod husk, (2) selection of polyphenol oxidase producing endophytic fungi, (3) production optimization of polyphenol oxidase through concentration variation of yeast extract, dextrose, cupri sulphate, and gallic acid in the fermentation medium, (4) enzyme purification through fractionation with ammonium sulphate, dialysis, gel filtration chromatography, SDS-PAGE electrophoresis analysis, and (5) biochemical characteristic test

The result of the research reveals that: (1) Endophytic fungi of the cacao pod husk can produce the polyphenol oxidase is Trichothecium sp. (2) Fermentation medium compositions which optimally produce polyphenol oxidase are: 1 % yeast extract, 0.1 % KH2PO4, 0.05 % MgSO4.7H2O, 0.1 mM CuSO4.5H2O, 2 mM gallic acid with specific activity 3725.1 U/mg. (3) Biochemical characteristics of the polyphenol oxidase are laccase and tyrosinase category. Optimum temperature and pH are 30 oC and 7.0. The enzymes was inhibited by ascorbic acid, sodium metabisulphite, and disodium EDTA. Value of Km and Vmax against catechol as substrate are 0.625 mM and 2083 U/mL.

DAFTAR ISI

Halaman

PRAKATA iv ABSTRAK vii ABSTRACT viii DAFTAR ISI ix DAFTAR TABEL xii DAFTAR GAMBAR xiii DAFTAR LAMPIRAN xv I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang 1

B. Rumusan Masalah 4

C. Tujuan Penelitian 4

D. Manfaat Penelitian 5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) 6

1. Uraian umum 6

2. Buah kakao 7

3. Kandungan bioaktif tanama n kakao 8

B. Fungi Endoft

1. Uraian umum 11

2. Metabolit yang dihasilkan oleh fungi endofit 13

3. Teknik isolasi fungi endofit 16

C. Polifenol Oksidase

1. Uraian umum 17

2. Sumber-sumber polifenol oksidase 21

3. Aplikasi polifenol oksidase 25

4. Mekanisme katalitik polifenol oksidase 26

5. Metode pengujian aktivitas polifenol oksidase 28

6. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas polifenol oksidase 30

7. Metode skrining polifenol oksidase dari mikroba 31

8. Metode produksi polifenol oksidase dari mikroba 33

9. Metode purifikasi polifenol oksidase 35

10. Karakteristik biokimia polifenol oksidase dari mikroba 38 D. Kerangka Pikir 40

E. Hipotesis 44

F. Definisi Operasional 44

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Lokasi Penelitian 45

B. Bahan dan Alat . 45

C. Prosedur Kerja 46

1. Isolasi fungi endofit dari buah kakao 46

2. Identifikasi fungi endofit kulit buah kakao 47

3. Seleksi fungi endofit penghasil enzim polifenol oksidase 47

4. Optimasi produksi polifenol oksidase melalui variasi 47

konsentrasi ekstrak khamir, Dekstrosa, CuSO4.5H2O,

Asam gallat

5. Ekstraksi enzim kasar 49

6. Uji Aktivitas Polifenol Oksidase 50

7. Pemurnian polifenol oksidase 51

8. Karakteristik Biokimia dari Polifenol oksidase 53

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi Fungi Endofit dari Kulit Buah Kakao 56

B. Identifikasi Fungi Endofit Kulit Buah Kakao 57

C. Seleksi Fungi Endofit Penghasil Polifenol Oksidase 59

D. Produksi Polifenol Oksidase dari Isolat Fungi Endofit Terpilih

1. Penentuan waktu fermentasi produksi polifenol oksidase 61

2. Efek ekstrak khamir terhadap produksi polifenol oksidase 62

3. Efek asam gallat terhadap produksi polifenol oksidase 64

4. Efek dekstrosa terhadap produksi polifenol oksidase.. . 65

5. Efek CuSO4 terhadap produksi polifenol oksidase 67

E. Pemurnian Polifenol Oksidase

1. Fraksinasi dengan amonium sulfat 70

2. Dialisis 72

3. Fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel 73

4. Analisis elektroforesis 75

F. Karakteristik Biokimia Polifenol Oksidase dari Isolat

Fungi endofit Kakao Terpilih

1. Kespesifikan substrat 77

2. Analisis kinetika polifenol oksidase 78

3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas polifenol oksidase 80

4. Pengaruh pH terhadap aktivitas polifenol oksidase 81

5. Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas polifenol oksidase 82

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 85

B. Saran-saran 86

DAFTAR PUSTAKA 87

LAMPIRAN 94

DAFTAR TABEL

Nomor halaman

1. Beberapa karakteristik biokimia enzim polifenol oksidase dari Beberapa tanaman. …………………………………….. 24

2. Karakteristik polifenol oksidase dari beberapa fungi ……….. 39

3. Pengaruh waktu fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase 62

4. Pengaruh ekstrak khamir dalam media fermentasi terhadap Aktivitas polifenol oksidase …………………………………… 63 5. Pengaruh konsentrasi asam gallat dalam media fermentasi Terhadap aktivitas polifenol oksidase ………………………. 65 6. Pengaruh konsentrasi dekstrosa dalam media fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase ………………………… 67 7. Pengaruh konsentrasi CuSO4 dalam media fermentasi Terhadap aktivitas polifenol oksidase ……………………….. 68

8. Aktivitas enzim dan kadar protein dari hasil pemekatan enzim polifenol oksidase dengan berbagai tingkat kejenuhan amonium sulfat ………………………………. 70 9. Hasil fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan Matriks sephadex G-100, eluen dapar fosfat 50 mM pH 6,5 , kecepatan elusi 2,5 mL/30 menit ………………... 73 10. Pola tingkat kemurnian polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp ………………………… …… . 75

11. Kespesifikan substrat dari polifenol oksidase fungi endofit Tricothecium sp …………………………………………. 77

12. Data hasil perhitungan aktivitas polifenol oksidase pada Konsentrasi substrat katekol yang berbeda …………………. 79 13. Aktivitas polifenol oksidase pada berbagai suhu ………… 80 14. . Aktivitas polifenol oksidase pada berbagai pH …………….. 82 15. Pengaruh penambahan inhibitor terhadap aktivitas polifenol oksidase ……………………………………………………. 83

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman 1. Penampang membujur buah kakao ………………………….. 8 2. Beberapa senyawa polifenol dari Theobroma cacao L. …….. 9

3. Beberapa struktur metabolit sekunder yang dihasilkan dari fungi endofit ……………………………………………………… 15 4. Skema kedudukan Cu pada laccase dari fungi …………………. 17 5. Sruktur x-ray bentuk teroksidasi kateol oksidase dari Ipomea batatas .................................................................... 18 6. Beberapa substrat untuk tirosinase …………………………… 19

7. Beberapa substrat untuk Lakkase …………………………….. 20

8. Perbedaan reaksi yang dikatalisis katekolase dan Lakkase… 21

9. Mekanisme katekol oksidase dari Ipomea batatas yang diusulkan berdasarkan data spektroskopik dan data biokimia ………… 27 10. Diagram alir kerangka pikir ………………………………………… 43

11. Fungi endofit yang tumbuh di sekitar potongan kulit buah kakao setelah masa Inkubasi 5 hari pada media PDA................... 56 12. Bentuk makroskopik dan mikroskopik isolat fungi endofit dari kulit buah kakao .......................................................... 58 13. Hasil uji kualitatif adanya polifenol oksidase yang diproduksi Oleh isolat fungi endofit kulit buah kakao ................................ 60 14. Pengaruh waktu fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase ................................................................ 61 15. Pengaruh konsentrasi ekstrak khamir dalam media fermentasi terhadap aktivitas polifenol oksidase ................................. 63

16. Pengaruh konsentrasi asam gallat terhadap produksi polifenol oksidase ....................................................................... 65 17. Pengaruh konsentrasi dekstrosa terhadap aktivitas polifenol oksidase ........................................................................ 66 18. Pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap aktivitas polifenol Oksidase .................................................................... 68 19. Pengaruh tingkat kejenuhan amonium sulfat (0 s/d 80 %) terhadap aktivitas polifenol oksidase dan kadar protein 71 20. Pengaruh tingkat kejenuhan amonium sulfat (0 s/d 90 %) terhadap aktivitas polifenol oksidase dan kadar protein 71 21. Profil elusi polifenol oksidase dari isolat fungi endofit 74

Trichothecium sp) kulit buah kakao pada sephadex G-100 eluen dapar fosfat 50 mM pH 6,5, kecepatan elusi 2,5 mL/30 menit

22. Profil hasil elektroforesis SDS-PAGE polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp……………… 76 23. Aktivitas polifenol oksidase dari isolat fungi endofit Trichothecium sp dengan berbagai substrat fenolik….. 78 24. Aktivitas polifenol oksidase dari fungi endofit pada berbagai suhu ……………………………………………………….. 80 26. Aktivitas polifenol oksidase dari fungi endofit pada berbagai pH 81 27. Efek inhibitor terhadap aktivitas polifenol oksidase yang

diperoleh dari fungi endofit kulit buah kakao ……… 83

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor halaman

1. Skema isolasi fungi endofit dari kulit buah kakao 94

2. Skema seleksi fungi endofit penghasil polifenol oksidase 95 3. Skema Penentuan waktu fermentasi untuk produksi polifenol 96 oksidase 4. Skema optimalisasi produksi enzim melalui variasi konsentrasi 97 ekstrak khamir, asam gallat, dekstrosa, CuSO4

5. Skema purifikasi dan karakteristik biokimia polifenol oksidase 98 6. Hasil Identifikasi dari Isolat fungi endofit dari kulit buah kakao 99 7. Contoh perhitungan aktivitas polifenol oksidase dengan 100 metode kronometri (spekrofotometri tidak langsung) 8. Perhitungan kadar protein dari polifenol oksidase 102 menggunakan metode Lowry dengan standar Bovine Serum Albumin (BSA) 9. Tabel kejenuhan amonium sulfat pada suhu 4 OC 104 (Bollag and Edelstein, 1991) 10. Komposisi gel pemisah dan gel penahan dengan 105 SDS-PAGE yang digunakan 11. Komposisi pengecatan perak (silver staining) 106 12. Perhitungan bobot molekul polifenol oksidase dari fungi 107 endofit kulit buah kakao.