JOURNAL READINGAminoglycoside ototoxicity and hair cell ablation in the adult gerbil:A simple model to study hair cell loss and regenerationDisusun untuk Memenuhi Syarat Mengikuti Ujian Kepaniteraan Klinik di Bagian THTRumah Sakit Umum Daerah AmbarawaDiajukan Kepada:Pembimbing: dr. M. Setiadi, Sp. THT-KL, Msi MedDisusun Oleh:Alifia Assyifa H2A010002

Kepaniteraan Klinik Departemen THTFAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANGRumah Sakit Umum Daerah Ambarawa

LEMBAR PENGESAHANKOORDINATOR KEPANITERAAN THTJournal Reading dengan Judul:Aminoglycoside ototoxicity and hair cell ablation in the adult gerbil:A simple model to study hair cell loss and regenerationDisusun untuk Memenuhi Syarat Mengikuti Ujian Kepaniteraan Klinik di Bagian THTRumah Sakit Umum Daerah AmbarawaDisusun Oleh:Alifia Assyifa H2A010002Telah disetujui dan disahkan oleh Pembimbing:Tanggal:.Nama Pembimbing: dr. M. Setiadi, Sp. THT-KL, Msi MedTanda tangan:..

Ototoksisitas aminoglikosida dan ablasi sel rambut pada gerbil dewasa: Studi sederhana mempelajari hilangnya sel rambut dan regenerasinyaAbstrakPada gerbil Mongolia, Meriones unguiculatus, telah banyak digunakan sebagai model dari studi yang berhubungan dengan telinga bagian dalam. Meskipun telah digunakan untuk penelitian tentang pendengaran, belum ada protokol yang kuat untuk ototoksik yang menginduksi kerusakan pada sel rambut pada spesies ini. Pada tulisan ini, dijelaskan pengembangan aminoglikosida yang menginduksi kerusakan sel rambut, menggunakan kanamisin potensial dengan loop diuretic furosemid. Menariknya, Gerbil menunjukkan relative tidak sensitif terhadap gentamisin yang dibandingkan dengan kanamisin, dan pada bumetanide secara potensial tidak efektif menimbulkan ototoksik.Peneliti juga menguji patologi dari neuron ganglion spiral setelah kerusakan sel rambut dalam jangka panjang. Baiknya, hanya ada sedikit atau tidak ada kerusakan neuron meskipun pada 8 bulan setelah kerusakan sel rambut. Hal ini mirip dengan kondisi yang sering dijumpai pada manusia, dimana fungsi neuron dapat bertahan bahkan puluhan tahun setelah kerusakan sel rambut, degenerasi sekunder yang ditemukan pada tikus, marmot atau mamalia kecil lainnya. Tujuan peneliti adalah mengombinasi faktor-faktor berikut yang membuat gerbil merupakan model yang baik untuk ototoksik yang menginduksi kerusakan sel rambut.

1. PengantarSejak tahun 1940, antibiotik aminoglikosida telah diakui klinis berefek ototoksik. Ketika digunakan dalam terapi kombinasi dengan loop diuretic seperti asam ethacrynic, sering menyebabkan ketulian reversibel menggunakan antibiotik tunggal yang secara cepat menginduksi dan permanen (Brown et al.,1974; Mathog et al., 1969). Sebagian kerusakan dikarenakan kematian sel sensoris khususnya epitel organ Corti yang terletak di dalam tempurung tulang koklea. Destruksi dari tiga baris luar sel rambut dan satu baris sel dalam rambut menyebabkan menurunnya fungsi sel pendukung sekitar dan penggantian sel organ dengan epitel yang mendatar flatenned yang merupakan bagian dari jaringan parut dan dapat disertai ketulian pada pasien. Akan tetapi, bidang pengobatan berkembang maju, pada epitel yang rusak tersebut dapat menjadi target potensial untuk terapi intervensi, dimana menjadi gagasan untuk memperbaiki organ Corti, atau studi implantasi koklear.Kerusakan organ Corti sering disertai menurunnya fungsi neuron ganglion spiral (SGNs) yang menginervasi sel rambut. Menurunnya fungsi neuron ini terjadi dengan variasi yang cepat pada spesies yang berbeda. Pada babi guinea, substansi SGNs diobservasi selama 7 hari setelah terapi aminoglikosida (Kong et al., 2010), dimana pada manusia, sisa SGNs ditemukan beberapa tahun setelah kerusakan sel rambut. (Ghorayer et al., 1980).Gerbil adalah subjek yang baik untuk penelitian sistem pendengaran yang merupakan bagian dari fisiologi pendengaran (Otto and Jrgen, 2012). Pada perhitungan etiologi secara kasar, hewan mempunyai jangkauan frekuensi pendengaran yang luas frekuensi rendah digunakan sebagai alarm; dan pada spektrum pendengaran, bunyi hewan masing-masing lebih dari sekitar level 25 kHz. Hal ini membuat gerbil adalah subjek yang lebih relevan untuk mengetahui tingkat penurunan pendengan dibanding yang memiliki jangkauan frekuensi tinggi seperti pada tikus atau marmot. Selain itu, spesies ini merupakan hewan dengan pembedahan yang kuat, dengan koklea yang besar dapat dengan mudah dilalui tulang yang kecil dari bulla pendengaran yang merupakan bagian yang baik untuk uji coba pengetahuan strategi terapetik.Ketika protokol telah berkembang untuk kerusakan neuropati ganglion spiral (Lang et al., 2005; Schmiedt et al., 2002), metode yang sederhana dan kuat untuk menginduksi lesi ototoksik dari sel rambut tidak ada dalam spesies ini. Protokol sekarang yang mengandung aplikasi topikal dari aminoglikosida menggunakan gel yang dilepaskan perlahan atau aplikasi berulang aminoglikosida dari injeksi transtimpani (Polgar et al., 2001; Wanamaker et al., 1999). Keduanya adalah metode invasive dan terbukti tidak dapat sebagai acuan.Data menunjukkan bahwa gerbil dapat digunakan sebagai subjek dalam penggunaan aminoglikosida yang secara cepat dan permanen menginduksi penurunan pendengaran menggunakan one-shoot, dosis tunggal kanamisin diikuti satu dosis loop diuretic furosemid. Dimana penelitian ini merupakan uji coba perbaikan yang telah dilakukan pada spesies lain, diulang dan sering menimbulkan toksik dan telah dilakukan regimen dosis.2. Alat dan bahan2.1. HewanGerbil Mongolia dari peternakan koloni (berasal dari Charles river, Germany), umur antara 3 hingga 5 bulan yang dimulai dari awal protokol-tidak ada efek dari umur yang dicatat dari awal pengukuran pendengaran, menggunakan jantan dan betina-tidak ada perbedaan antara jenis kelamin terhadap kemampuan. Semua uji coba telah mendapat ijin dari Sheffield University Ethical Review Committee dan di bawah pengawasan Home Office Project Licence authority, sesuai dengan legislasi UK dan EU.

2.2. Model OtotoksisitasPada uji sistemik, hewan mendapat injeksi subkutaneus dengan larutan gentamisin sulfat atau kanamisin sulfat dalam normal saline (400-500mg/kg; Sigma, Gillingham, UK) diikuti 20-30 menit selanjutnya injeksi intraperitoneal bumetanida (50mg/kg; Sigma) atau larutan furosemid (100mg/kg; Sigma). Aplikasi topikal untuk koklea, diinduksi anestesi dari isoflurane, bulla auditori dicapai melalui insisi retroauricula menggunakan scalpel, aminoglikosida dan larutan diuretic diaplikasikan secara langsung disekitarnya, Pada kasus yang sama, hewan ini diimplantasi dengan gelatin sponge (Cutanplast, Sheffield, U.K.). Bulla ditutup menggunakan fascia plug yang ditempatkan dengan perekat vetbond (3 M, Bracknell, U.K.). Lapisan otot dan luka ditutup dengan bahan Vicryl yang absorbable (Ethicon, Norderstedt, Germany). Dan hewan tersebut mengalami perbaikan.2.3 Pengukuran pendengaranHewan tersedasi dengan ketamine/xylazine campuran dan ditempatkan di tikar panas untuk mengatur suhu tubuh. Menggunakan 3 paket proses signal digital perangkat keras dan lunak (Tucker DaviesTechnologies (TDT), Florida) digunakan untuk menunjukkan rangsang jangkauan dari 110 dB hingga 20 dB pada peringkat ke 20s-1 lalu diturunkan 10 dB. Rangsangan bunyi merupakan bunyi murni 5 ms pada 80 dB. Pada frekuensi antara 6 kHz hingga 38 kHz, pada 4 kHz atau 2 kHz, 4 kHz, 8 kHz, 16 kHz dan 32 kHz pada intensitas dari 20 dB hingga 90 dB. Suara yang ditujukan pada hewan melalui metode bidang bertutup dengan diameter 3 mm, tabung berukuran 10 cm terdiri dari speaker yang disisipkan ke meatus auditori hingga ujung mendekati membran timpani. Pengukuran respon batang otak auditori direkam menggunakan 27G elektroda jarum subdermal yang ditempatkan di vertex tengkorak (electrode perekam) dan proses mastoid ipsilateral (elektroda rujukan), dengan elektroda pokok ditempatkan di belakang dekat ekor. Tegangan yang menginduksi rangsangan suara juga direkam. Masing-masing stimulus ditampilkan 500 kali, demikian gelombang yang dihasilkan merespon lebih dari rata-rata. Untuk masing-masing intensitas, amplitudo dari respon antara gelombang ii positif peak puncak (P2) dan gelombang ii negative puncak (N3), menunjukkan aktivitas neural dalam nukleus koklear dan kompleks olivary superior, telah diukur dan menunjukkan aktivitas auditori sentral (Burkard et al., 1993; Boettcher et al., 2006). Ambang respon batang otak auditori dihitung sebagai tingkat suara yang dibutuhkan untuk menghasilkan respon tegangan 2 standard deviasi yang mana rata-rata tingkat bising masing-masing rekaman (May et al., 2002). Semua uji coba memiliki bukti suara. (AGS Noise Control Ltd, Melton Mowbray, U.K.).2.4. ImunohistokimiaTulang temporal diberi imersi 4% paraformaldehyde (PFA; PH 7,4) untuk 24-48 jam pada suhu 4oC dan dekalsifikasi pada 5 M EDTA PH 8 dalam satu minggu pada suhu 4oC. Sampel diambil/PBS series (7,5%, 15%, 22,5%, 30; beberapa jam/per malam). Menanamkan Cryo-M-Bed medium (VWR, Lutterworth,U.K.), bagian 12 mm diambil pada Bright cryostat atas gelatin/chrome alum-dilapisi kaca geser. Bagian jaringan dicairkan, direhidrasi, secara singkat diberi 4% PFA, 0,1% Triton/PBS dan dihambat dalam 5% serum donkey/1% B.S.A. sebelum diinkubasi pada malam harinya pada suhu 4oC dengan antibodi berikut: anti-aTubulin (1:150, mouse monoclonal; Sigma), anti-III-Tubulin (1:150, mouse monoclonal; Sigma), anti-espin (1:100, rabbit polyclonal; Sigma), anti-myelin basic protein (MBP; 1:75, mouse monoclonal; Millipore), anti-MyoVIIA (1:100, rabbit polyclonal; kind gift, C. Petit), anti-OCP2 (1:100, rabbit polyclonal, kind gift R. Thalmann), anti-Neurofilament 200 (NF-200; 1:200, rabbit polyclonal; Sigma), anti-Na, K-ATPase 3 subunit (NKAa3; Santa Cruz, Insight Biotechnology,Wembley, U.K.), anti-CtBP2 (BD Biosciences, Oxford,U.K.). Deteksi diperoleh dari inkubasi dalam waktu 2 jam pada suhu ruangan dengan anti-mouse Alexa 488 dan anti-rabbit Alexa 568 (Life Technologies, Paisley, U.K.) dan jaringan diberi pewarna dengan 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma) sebelum pemasangan Vectashield (Vector Laboratories, Peterborough, U.K.). Gambar diambil dengan Zeiss Axiophot microscope dengan perangkat lunak Axiovision menggunakan Adobe Photoshop 7.0. Seluruh pewarnaan koklea intak telah dijelaskan di Mac Donald and Rubel (2008). Koklea didekalsifikasi seperti di atas, diinkubasi dengan antibodi primer (anti-III-Tubulin and anti-MYOVIIA) untuk beberapa hari dalam 4oC dengan anti-mouse Alexa 488 dan anti-rabbit Alexa 568 dalam 3-5 hari. Setelah dicuci, sampel didehidrasi dengan gradient ethanol yang ditingkatkan dan dibersihkan melalui MSBB, dengan rasio 5:3 metil salisilat dan benzyl benzoate (Sigma) dalam 2 hari. Gambar dianalisis dengan FIJI dan dimasukkan dalam photoshop.2.5 Pewarnaan PhalloidinTulang temporal didekalsifikasi seperti yang sudah dijelaskan. Epitel koklea dicuci dalam 0,1% Triton/PBS dan diinkubasi semalam dalam Alexa Fluor 568 phalloidin (2 unit/ml; Life Technologies). Sampel yang digandakan dicuci dalam 0,1% Triton/PBS, serta sampel dipasang di Vectashield.2.6. Perhitungan kepadatan/densitas ganglion spiralSGNs di kanal Rosenthal diwarnai dengan III-Tubulin dan dihitung dari gambar yang diambil pada Zeiss Axiophot microscope seperti sebelumnya. Apikal, mild dan basal bergantian dihitung dari minimal 5, bagian pertengahan modiolar per koklea. Bagian yang dihitung setidaknya 36 m untuk mencegah penghitungan yang berlebih. Densitas sel dihitung dengan mengukur daerah kanal Rosenthal menggunakan FIJI (Http://fiji.sc/Fiji) dan menghitung jumlah sel per mm2. Menggunakan uji ANOVA satu arah dan t-tes tidak berpasangan untuk signifikansi dan dilakukan di Prism (GraphPad Software, San Diego, Amerika Serikat).3. Hasil3.1. Aplikasi gentamisin topikal tidak menyebabkan hilangnya sel rambut kokleaInvestigasi pertama kali difokuskan pada aplikasi topikal dari aminoglikosida untuk koklea. Bulla pendengaran yang fenestrated dan 400 g gentamisin sulfat dalam larutan diaplikasikan ke membrane round window (RWM), baik secara langsung (n=3); atau pada sepotong spons gelatin sebelum direndam untuk efek slow release (N=1). Namun, bertentangan dengan hasil yang terlihat pada babi guinea (Yanget al., 2010) dan sebelumnya didapatkan gerbil yang (Sheppard et al., 2004) menunjukkan tidak ada kerusakan yang jelas dari sel-sel rambut (Gbr. 1). Imunofluoresensi dilakukan pada jaringan koklea penanda untuk IHCS dan OHCS, MYO7A dan ESPIN menunjukkan ekspresi yang normal pada telinga yang diobati vs telinga kontralateral yang tidak diobati di seluruh luasnya koklea (Gbr. 1A-D vs E-H dan I-L vs M-P), menunjukkan bahwa tidak ada kerusakan pada pengobatan ini. Wakil bagian dari basal (A-H) dan mild (I-P) ditunjukkan pada Gambar. 1; hasil yang sama diamati pada ketiga tingkat aksial untuk kedua pengobatan. Persarafan dari organ Corti diuji dengan saraf marker -III tubulin (Hallworth dan Luduena, 2000) dan tidak ada kerusakan nyata dari persarafan ke sel-sel rambut bagian dalam setelah pengobatan gentamisin (lihat panah putih, Gambar. 1). Hasil ini dikonfirmasi pada tingkat fungsional (Gbr. 1Q, R). ambang ABR di 20 dB (data tidak ditunjukkan), menunjukkan ada pergeseran di ambang batas awal diukur dan sejenis profil respon yang diamati hingga 80 dB, dengan hewan yang diuji pada interval pasca-perawatan rutin. Dalam kasus akut ditampilkan (Gambar. 1Q), prosedur dihentikan pada 3 minggu pasca-aplikasi, sedangkan aplikasi kronis dijalankan selama 11 minggu supaya berdegenarasi, akan tetapi jelas tidak terjadi, dengan respon amplitude tetap konsisten. Tidak ada indikasi fenotipe perilaku toksisitas vestibular, seperti berputar-putar atau kepala mengangguk pada hewan-hewan ini. Meskipun melibatkan kohort hewan kecil, disarankan bahwa penggunaan gentamisin tidak menjadi pilihan sebagai agen ototoksik dan akibatnya gentamisin tidak dianjurkan lebih jauh.3.2. Aplikasi gabungan dari kanamisin dan bumetanide hanya menginduksi kerusakan ringan. Kanamisin juga telah banyak digunakan sebagai sarana menginduksi ototoksisitas koklea pada model binatang lain, seperti tikus (Astbury dan Baca, 1982) atau babi guinea (Aran et al, 1975.;Poirrier et al., 2010). Namun, penelitian telah menunjukkan bahwa efek yang sangat potensial bila digunakan bersama dengan loop diuretik, seperti asam ethacrynic (Brummett, 1981) atau bumetanide (Taylor et al., 2008). Dalam sebuah percobaan percontohan, kedua obat diberikan dalam pengobatan sistemik dengan dosis tunggal kanamisin selama empat puluh menit kemudian diikuti dosis tunggal bumetanide, yang jelas menyebabkan diuresis (n=1). Atau, obat yang diterapkan bersama-sama pada gelatin sponge topikal ke RWM seperti di atas (Section 3.1) (n=1). Namun, regimen juga tidak menghasilkan kerusakan yang jelas dari sel-sel rambut koklea seperti yang ditunjukkan oleh ekspresi normal ESPIN dan MYO7A di rambut bagian dalam dan luar sel di seluruh koklea. Secara bergantian ditunjukkan pada Gambar. 2A-H. Pengobatan sistemik tidak mengakibatkan hilangnya pendengaran (Gambar. 2I) respon yang kuat ke 20 dB dipertahankan selama durasi sembilan minggu dari protokol. Namun, penurunan kecil dalam pendengaran diamati secara topikal, paradigma pengobatan gelatin sponge (Gambar. 2J-L). Ambang pendengaran dibangkitkan dari 20 dB hingga 27 dB (Gambar. 2K) selama percobaan dan analisis dari tanggapan terhadap frekuensi nada murni menunjukkan bahwa kerusakan ini terjadi terutama di kisaran pertengahan frekuensi, dengan 18-34 kHz yang paling berpengaruh (Gambar. 2L). Meskipun signifikan, kerusakan ini terlalu bijak untuk menginduksi gangguan pendengaran yang cepat dan substansial, lagipula rejimen dosis ini tidak dianjurkan lebih lanjut.3.3. Pengobatan dengan kanamisin dan furosemide menunjukkan hilangnya sel rambut substansial Loop diuretik furosemide juga telah banyak digunakan untuk memperkuat efek ototoksik dari aminoglikosida contoh dalam (Alam et al, 1998;. Brummett et al, 1975;.. Hirose et al, 2011) dan referensi di dalamnya. Pada gerbil diobati dengan dosis tunggal kanamisin saja, tidak ada bukti hilangnya sel rambut yang diamati (data tidak ditunjukkan). Namun, ketika dosis tunggal, dosis kanamisin sistemik yang difollow up tak lama dan setelah itu mendapat suntikan furosemide, ada kerusakan yang cepat dan besar baik rambut dalam dan luar sel (Gambar. 3). Imunofluoresensi untuk protein ESPIN menunjukkan hilangnya immunoreactivity lengkap satu minggu setelah pengobatan (Gambar. 3A-D), menyiratkan hilangnya fungsi ketika sel rambut dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati, tidak adanya pewarnaan di barisan tunggal sel-sel rambut bagian dalam dan semua tiga baris rambut luar sel. Hasil setara ditemukan ketika sampel yang diwarnai untuk adanya ekspresi MYO7A (data tidak ditampilkan). Pencitraan fase kontras ditambah dengan imunofluoresensi untuk protein yang mengikat kalsium PARVALBUMIN pada satu minggu pasca perawatan menegaskan hasil ini (Gambar. S1), sehingga sel-sel rambut bagian dalam PARVALBUMIN-positif sel rambut bagian dalam hilang di semua tingkat koklea, meninggalkan serat aferen PARVALBUMIN-positif memproyeksikan ke organ yang rusak Corti. Sementara itu, bagaimanapun terowongan Corti masih ada dan bangunan organ pendengaran masih relatif intak ('t'; Gambar. 3A, D.). Seperti yang diharapkan pada spesies mamalia lain meskipun kerusakan ini permanen, pada titik waktu kemudian, misalnya pada 16 minggu dan 34 minggu pasca perawatan, ada sedikit atau tidak ada immunoreactivity untuk ESPIN dan organ Corti telah berdegenerasi, dengan kolapsnya terowongan Corti dan diduga mendatarnya sel pendukung yang tersisa (Gambar. 3E-L). Namun, adanya proses aferen sepanjang neuron ganglion spiral tetap utuh (panah putih, A, E, I), bahkan 8 bulan setelah ototoksik akut dan hilangnya sel rambut (lihat Section 3.4 untuk lebih lanjut). Respon batang otak pendengaran (ABR) diukur pada 15 hewan, baik sebelum dan pada interval berikutnya (Gambar. 3M, N). Seperti disinggung pada Section 3.1, ABR membangkitkan dengan satu spektrum luas mulai dari 20 dB sampai 110 dB yang direkam sebelum dosis obat, satu minggu kemudian (Gbr. 3M) dan pada interval dilakukan sering sampai akhir prosedur (data tidak ditampilkan). Ambang pendengaran dibesarkan rata-rata hampir 69 dB setelah 1 minggu (n=15, 24 telinga;. Gambar 3M) dengan kenaikan pada hewan individu mulai 36-97 dB.

Gambar 1. Aplikasi topical gentamisin tidak mempengaruhi organ pendengaran. Solusion gentamisin sulfat diaplikasikan langsung ke membrane window yang akut (E-H, Q) atau sebagai paradigma 'slow release' pada spons gelatin (M-P, R). Imunofluoresensi -III TUBULIN dan penanda sel rambut MYO7A (B, D, F, H) dan ESPIN (J, L, N, P) menunjukkan bahwa tidak ada efek pada organ Corti baik pada kondisi telinga yang diobati atau yang dibandingkan dengan telinga kontralateral tidak diobati (A-D; I-L) menunjukkan tidak ada perbedaan yang jelas dalam struktur atau integritas sel-sel rambut bagian dalam dan luar. Bagian yang diwarna dengan DAPI untuk menggambarkan inti sel. Tidak ada gangguan persarafan dari IHCS oleh neuron ganglion spiral (Panah, A, E, I, M). Pengukuran ABR diambil pada interval pasca pengobatan, perbedaan respon ditemukan pada 20 dB dalam pengobatan rejimen (Q, R). Panah menunjuk ke sel-sel rambut bagian dalam, kurung menggambarkan tiga baris sel rambut luar. Skala 50 m.Pada akhir prosedur terdapat kenaikan rata-rata di ambang pendengaran 64 dB (n=4, data tidak ditunjukkan). Hal ini tidak berbeda secara signifikan dengan hilangnya rambut yang terlihat setelah 1 minggu, dengan ambang batas rata-rata diukur menjadi 94 dB dan 93 dB masing-masing menyiratkan bahwa mayoritas kerusakan terlihat terjadi sebagai respon akut terhadap ototoksik. Tidak ada perbedaan dalam respon antara telinga kiri dan kanan, dengan rata-rata kenaikan ambang di 1 minggu pasca ototoksik pada 72 dB dan 67 dB masing-masing (Gambar. 3M). Tanggapan untuk frekuensi pips individu dari 2 kHz sampai 32 kHz pada kisaran intensitas 20 dB dB-90 juga diukur (n=6 hewan; 12 telinga diukur; Gambar. 3N). Kenaikan yang sangat signifikan dalam ambang diamati di seluruh spektrum frekuensi yang diukur (Lihat Tabel 1), menyiratkan bahwa sel-sel rambut sama-sama sensitif terhadap pengobatan sepanjang koklea.3.4. Sel rambut dihitung setelah satu minggu pengobatan kanamisin / furosemide Kerusakan baik sel-sel rambut dalam dan luar substansial. Untuk mengukur tingkat hilangnya sel rambut diamati kohort hewan diobati dengan kanamisin dan furosemide, dan koklea yang diperiksa satu minggu kemudian menggunakan immunofluorescence yang meningkat secara keseluruhan (MacDonald et al., 2008), suatu teknik yang memungkinkan koklea individu yang akan dicitrakan bergantian dalam konteks 'in situ' (Gbr. 4). Penghitungan analisis pewarnaan untuk MYO7A immunoreactivity dan sel berikutnya (Tabel 2) menunjukkan kerusakan besar baik dalam dan sel-sel rambut luar, ditunjukkan oleh hilangnya pewarnaan MYO7A di semua tingkat koklea (Gambar. 4B, E, H, K, N, Q). Sejumlah IHCS tetap dalam kondisi perlakuan pergantian basal (Gambar. 4Q), tetapi jelas dismorfik dibandingkan dengan yang tidak dilakukan perlakuan (Gambar. 4N) dan belum dapat mewakili populasi mati. Posisi organ Corti ditentukan oleh posisi yang mendasari pewarnaan -III TUBULIN (Gambar. 4A, D, G, J, M, P).3.5. Sel non-sensorik mempertahankan identitas mereka Terdapat laporan dalam literatur bahwa hilangnya identitas sel pendukung sebagai konsekuensi sekunder dari hilangnya Sel sensorik pendukung sel rambut-sel pendukung menjadi mendatar dan kuboid dan tampilan epitel (Hellier et al, 2002;. Hirose et al,. 2011; Huizing et al., 1987; Taylor et al., 2012).

Gambar. 2. Aplikasi kanamisin dan bumetanide memiliki efek kecil pada pendengaran. Pendekatan kombinasi menggunakan kanamisin dan bumetanide tidak berpengaruh pada penggunaan dosis sistemik (AED, I), dan hanya memberikan kerusakan sedang pada pendengaran ketika diberikan pegobatan topikal, aplikasi kronis (E-H, J-L). Imunofluoresensi untuk ESPIN menunjukkan bahwa dalam kedua kasus organ Corti utuh (panah dan kurung B, F, dibandingkan dengan kontrol tidak diobati, Gambar. 1J, L) and pewarnaan -III tubulin menunjukkan bahwa persarafan ke sel-sel rambut normal (panah, A, E). Bagian yang diwarnai dengan DAPI untuk menggambarkan inti sel. Bagian khas dari masing-masing sampel adalah apikal (AED), basal (E-H). Respon ABR dipertahankan pada 20 dB dalam pengobatan sistemik (I). Ada peningkatan kecil di ambang pendengaran dalam kasus topikal 6minggu setelah pengobatan (J, K), dan penurunan fungsional ini dinyatakan dalam rentang pertengahan frekuensi dari 18-30 kHz (L). Panah menunjuk ke sel-sel rambut bagian dalam, kurung menggambarkan tiga baris sel rambut luar. Skala 50 m. Untuk menguji dalam kanamisin / furosemide dilakukan pada gerbil, bagian dari koklea diambil pada berbagai waktu yang diperiksa untuk mendapat ekspresi dari OCP2, komponen dari kompleks SCF ubiquitin ligase (Henzl et al., 2004), yang terdapat dalam sel koklea non-sensorik, dari sel interdental spiral limbus ke sel-sel akar ligamen spiral; dan asetat TUBULIN, penanda untuk sel Deiter dan sel pilar dalam dan luar (Saha et al, 2000;. Tannenbaum et al., 1997). Tingkat ekspresi OCP2 tetap sebanding dengan kondisi yang tidak diobati sama sekali tahap pasca-perlakuan, dari 1 minggu ke 34 minggu (Gambar. 5A-L). Demikian pula, tingkat TUBULIN asetat tetap setara pada yang tidak diobati vs diobati (Gambar. 5M-X), dalam sel pilar dan sel Deiter. Meskipun belum membentuk analisis kuantitatif tanda ekspresi tersebut untuk mengkonfirmasi tetap tidak dirubah, visualisasi kualitatif akan menunjukkan bahwa sel-sel pendukung mampu bertahan untuk waktu yang lama tanpa adanya sel-sel rambut pada gerbil tersebut. Terowongan Corti tetap terbuka dan utuh untuk cukup waktu pasca-kerusakan (16 minggu, data tidak ditunjukkan;. 22 minggu, Gambar 5G-I) dan sel pendukung morfologi klasik difollow up, mirip dengan yang dibandingkan dengan yang tidak diobati (Gambar. 5A-C) dan awal lesi hewan (1 minggu, Gambar. 5D-F). Namun, setelah kerusakan jangka panjang, perubahan morfologi sel dalam sampel klinis di minggu ke 34 ditunukkan kerusakan terowongan Corti (panah, Gambar. 5J-L) dan mendatarnya sel pilar.3.6. Proses saraf perifer ke organ Corti yang rusak yang tetap utuhSel-sel rambut dalam dan luar berdegenerasi dalam respon ototoksik (Gambar. 3 dan 4, S1, S2). Namun, muncul persarafan substansial yang dipertahankan dalam organ Corti (Gambar. 3, 4, 6 dan 7, S1, S2 (Stankovic dkk, 2004;.. Sugawara et al, 2005;. Zilberstein et al, 2012) bahwa spiral neuron ganglion masih dapat menerima dukungan trofik dari sel pendukung dalam organ Corti mungkin memang terjadi, tapi menariknya 'simpul' dari distal, prosesnya dipertahankan bahkan dalam kasus, tampaknya organ telah digantikan oleh epithelium yang berkarakteristik 'damage (Gambar. 3I, L).

Gambar 3. Aplikasi kanamisin dan furosemide sistemik menghancurkan sel-sel rambut dalam dan luar. Aplikasi kanamisin dan furosemide sistemik memberikan kerusakan kedua sel rambut dalam dan luar yang cepat dan komprehensif. Imunofluoresensi untuk penanda bundle rambut ESPIN menunjukkan kerusakan kompleks immunoreactivity 1 minggu setelah pemberian obat, menyiratkan hilangnya fungsi sel rambut (bandingkan panah dan kurung di B dengan situasi kontrol pada Gambar. 1J). Terowongan Corti ditampilkan pada tahap ini (t, A, D). Hilangnya bundle rambut permanen baik pada minggu ke 16 dan 34 pasca perawatan, tidak ada pemulihan bundle rambut (panah dan kurung, F, J) dan organ Corti telah berdegenerasi di F, H mengarahkan ke area kecil dari ekspresi ESPIN anomali yang bukan merupakan sel rambut yang berfungsi dan mungkin merupakan sel rambut dalam proses kerusakan. Namun, adanya proses neuron ganglion spiral tetap utuh (panah, A, E, I.) DAPI digunakan sebagai pewarnaan seperti sebelumnya. Rata-rata ambang ABR meningkat jauh setelah pengobatan (M), dari sekitar 27 dB, awalnya untuk sekitar 97 dB setelah tujuh hari. Tidak ada perbedaan terlihat antara respon dari telinga kiri dan kanan (n=9 telinga kiri; **** P