Upload
dangmien
View
220
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Dr. Gintaras Valinčius
Vilniaus universitetas, Biochemijos institutas
Seminaras 2012-03-28/29 Kaunas/Vilnius
1
2007–2013 m. Žmogiškųjų išteklių plėtros veiksmų programos 3 prioriteto „Tyrėjų gebėjimų stiprinimas“ VP1-3.1-ŠMM-05-K priemonės „MTTP tematinių tinklų, asociacijų veiklos stiprinimas“ projektas „Lietuvos Biochemikų draugijos
potencialo kurti žinių visuomenę didinimas“ (Nr. VP1-3.1-ŠMM-05-K-01-022)
Biologinių membranų modeliai
2
Paviršiaus biofuncionalizavimas. Molekulinis membranų inkaras: dvi koncepcijos
+ + + + +
I. Pasinaudoti elektrostatine sąveika
II. Pasinaudoti hidrofobine/kovalentine sąveikomis
3
Kokios molekulės galėtų būti molekuliniais inkarėliais?
Hidrofobinė dalis, pavyzdžiui dimiristoilas
Hidrofilinė dalis, pvz. oligoetileno oksidas
Prijungimo prie paviršiaus grupė, pvz., tiolas (-SH)
4
Šiandien turime šiuos sintetinius tiolipidus: Dimiristoil , WC14 (EO6) Dioleoil, HC18 (EO6), DC18 (EO9) Dipalmitoil, FC16 (EO9) Palmiloil/oleoil FayC (EO6)
Naujos kartos tiolipido inkaras turės dvi „kojeles“:
5
ethanol
Step 2: Perkeliamas lipidas (RSE metodas)
Step 1: Formuojamas mišrus monosluoksnis
buffer
Ng 2008 SURF talk
Au Au
Bisluoksnis jungiamas prie paviršiaus
ethanol
6
Inkaro monosluoksnio formavimą galime stebėti:
Kontaktinio kampo pokyčiai
0
20
40
60
80
100
120
140
0 50 100
Co
nta
ct a
ng
le, d
eg
WC14, mol %
McGillivray, D.J.; Valincius, G.; Vanderah, et al. Biointerphases. 2, 21-32 (2007).
7
Inkaro monosluoksnio formavimą galime stebėti elipsometriškai:
0
1
2
3
4
0 50 100Ell
ipso
me
tric
th
icn
ess
, n
m
WC14, mol %
3.3 nm
8
McGillivray, D.J.; Valincius, G.; Vanderah, et al. Biointerphases. 2, 21-32 (2007).
IR spektroskopija rodo spiralinės ir netvarkios struktūros -C-C-O- fragmentus
9 Dimiristoil- Diloleoil-
Realiu laiku molekulinio inkaro formavimąsi galime stebėti paviršiaus plazmonų rezonanso pagalba: daugeliu atveju biofunkcionalizavimas baigiasi < 1 val.
10
Kaip galime įrodyti fosfolipidinės membranos susiformavimą?
11
Laidininkas
Laidininkas
Dielektrikas
Elektrinė dielektriko talpa: 𝐶 =𝜀𝜀0
𝑑
Si/Au
Elektrocheminio impedanso spektroskopija (EIS)
12
-3,50
-3,00
-2,50
-2,00
-1,50
-1,00
-0,50
0,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00
Im C
, m
F/c
m2
Re C, mF/cm2
0.1 Hz
0.1 Hz
Inkaras
Membrana
Elektrinės talpos sumažėjimas signalizuoja apie bisluoksnės membranos susidarymą
HC18/DOPC
Periferiniai įrenginiai EIS matavimams
13
Neutronų reflektometrija leidžia nustatyti detalesnę biologiškai funkcionalizuoto paviršiaus architektūra
14
Raudonas – krentantis ir atspindėtas n spinduliai; Oranžinis – prasiskverbęs n spindulys; Žali – išbarstyti nelygumų n atspindžiai.
NR matuojamas atspindėtų (k2) ir krentančių (k1) neutronų skaičiaus santykis
Neutronų atspindžio intensyvumas jautrus sluoksninei paviršiaus struktūrai su maždaug 1 Å rezoliucija
15
Atspindžio intensyvumas
Qz, Å-1
Qz
Sluoksniai sukuria interferenciniuss maksimums/minimumus NR kreivėse, todėl jų analizė leidžia (teoriškai) atkurti sluoksninę struktūrą
16
AND/R at NIST Center for Neutron Research, Gaithersburg, MD
17
ISIS Pulsed Neutron Facility, Rutherford-Appleton Laboratory, Oxfordshire, UK
18
2012-03-09
Biologinės membranos ypač tinka NR. Lengvieji atomai pasižymi intensyvia neutronų sklaida, todėl yra gerai matomi „neutronų šviesoje“, kurios bangos ilgis nuo maždaug 2 iki 10 Å
19
Struktūriniams tyrimams padeda neutronų sklaidos parametrų kontrastas tarp H ir D.
PI- fosfolipidų membranos pasižymi raiškiais spektrais
20
WC14 (dimiristoyl)/diphytanoyl bilayer
21 McGillivray et al. Biointerphases. 2 (2007) 21-33
NR uždavinys yra – nustatyti paviršiaus struktūrą, generuojančią stebimą neutronų atspindžio krievę. Mūsų sukonstruotų pi-FLM atveju pavyksta patikimai identifikuoti prognozuojamą molekulinę architektūrą.
WC14(dimiristoyl)/ Diphytanoyl tBLM
Lateralinis pi-FLM homogeniškumas
22
AFM WC14/DPhyPC
Membranų sudėties pokyčiai: fosfolipidų sudėties variacija
23
Fluorescencinė mikroskopija
24
Vezikulės su FŽ (LR-DOPE ) pažymėtu DOPC
Vezikulės su FŽ (Chol-NDB) pažymėtu Chol
Elektrocheminiai matavaimai rodo, kad Chol pernašą į pi-FLM lydima ryškiu el.talpos sumažėjimu
25
Chol pernaša iš vezikulių turi tokį patį efektą elektrinei talpai
26
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Ele
ktr
inė
ta
lpa
, m
F/c
m2
Chol pernaša turi poveikį baltymų (toksinų) funkciniam aktyvumui
27
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Me
mb
ran
e c
on
du
cta
nce
, m
S
NR matavimai patvirtina, jog sąveika su vezikulėmis gali generuoti asimetriškas pi-FLM
A – dvisluoksnis suformuotas iš d54DMPC prieš sąveiką su vezikulėmis, B –
dvisluoksnis po sąveikos su hDMPC vezikulėmis.
D2O
H2O
D2O
H2O
Fosfolipidinė membrana
Aukso sluoksnis
Aukso sluoksnis
Tarpinės išvados
29
Sukurta technologija leidžia suformuoti įvairių sudėčių, tame tarpe ir iš biologinių fosfolipidų mišinių, membranų modelius, Atomine skyros fiziniai metodai verifikuoja pi-FLB struktūrą, pi-FLB sudėtį galime varijuoti sąveikos su vezikulėmis keliu. Galimas asimetrinių membranų modelių surfomavimas.
1. Membranas ardančių baltymų tyrimai
2. Poras formuojančių toksinų detekcija ir struktūriniai tyrimai
3. Membranos dielektrinę pažaidą sukeliančių baltymų oligomerų tyrimai.
30
31
Monitoring phospholipase activity with WC14-based tBLMs
PLA2
PL C
PL D
Ca2+ co-factor
Scooting mode
Elektrinė dielektriko talpa: 𝐶 =𝜀𝜀0
𝑑
EIS spektroskopija detektuoja membranos ardymą
32 Valincius, G.; et al. J.Phys. Chem. B.; 110 10213-10216 (2006).
+2 mM PLA2
NR atskleidžia struktūrinius ardomos membranos ypatumus
33
nS
DL
, Å-2
Išorinis membranos sluoksnis, ~33% vandens
-hemolizinas iš S.aureus
34
Song, L., Hobaugh, M., Shustak, C., Cheley, S., Bayley, H., Gouaux, J.E. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science v274 pp.1859-1866 , 1996
Ryškūs EIS pokyčiai iki pat ~10 nM koncentracijos ribos
35
Duncan J. McGillivray, Gintaras Valincius, Frank Heinrich, et al. J, 96 (4) 1547 - 1553, (2009).
NR leidžia identifikuoti baltymo lokalizaciją membranoje
36
Duncan J. McGillivray, Gintaras Valincius, Frank Heinrich, et al. J, 96 (4) 1547 - 1553, (2009).
Įterptas į pi-FLM baltymas - funkcionalus
37
pi-FLM tinkamos nuo cholesterolio priklausomų citolizinų detekcijai. Cholesterolis pastebimai amplifikuoja toksino poveikį membranoms
38
Su Alzheimerio liga siejami -amiloidų oligomerai
39
In vitro galima gauti įvairių dydžių A(1-42) oligomerus
40
Protocol I (1-2 nm) Protocol II (5-10 nm) Protocol III (fibrils)
-amiloidų toksiškumas priklauso nuo oligomerų dydžio
41
Dideli (5-10 nm) A1-42 oligomerai neįtakoja pi-FLM EIS spektrų: nekinta nei pi-FLM talpa, nei laidis
42
0 2.5e-7 5.0e-7 7.5e-7
-7.5e-7
-5.0e-7
-2.5e-7
0
E'
E''
346_DOPC_101.txt346_DOPC_1.6uM Ab_big_102.txt
Maži (1-2) A1-42 oligomerai didina pi-FLM talpą ir laidį, taigi pažeidžią dielektrinį membranų barjerą.
43
WC14/DOPC
Gintaras Valincius, Frank Heinrich, Rima Budvytyte, et al. Biophys. J. 95 4845-4861, (2008).
Papildantys spektroskopiniai (SDG) metodai leistų tiksliau įdentifikuoti toksinius A varianatus
44 44
Fibrils Non-toxic (5-10 nm) oligomers
Toxic (~2 nm) oligomers
pi-FLM taikymas: chromatografiniai detektoriai
45 45
Human sample Primary
purification Separation &
Concentration
Amyloid- fractions
Chromatography UV D1 D2
Detectors
Total amyloid-
Necrotic-active
Apoptotic-active
Išvados
46
• Paviršiuje imobilizuotosios fosfolipidų membranos sudaro biologiškai tikrovišką terpę funkcionalių baltymų įterpimui. • Membranų modeliai yra stabilūs ir leidžia taikyti platų šiuolaikinių fizinių metodų spektrą jų charakterizavimui bei struktūriniams tyrimams. • Vystoma eksperimentinė pi-FLM platforma gali būti pritaikoma membranų integralumą pažeidžiančių baltymų detektavimui, pvz., biosensoriuose, chromatografiniuose detektoriuose, taip pat membranų pažaidos bei membraninių baltymų mechanizmo ir funkcijos tyrimams.
Padėka
47
Rima Budvytytė , Mindaugas Mickevicius, Tadas Ragaliauskas VU BChI Dr. David Vanderah, NIST Gaithersburg, MD, USA Dr. Vilmantė Borutaitė, Ramune Morkūnienė, Paulius Čižas – LSMU, NI. Dr. Aurelija Žvirblienė – VU BTI Habl. dr. Gediminas Niaura Center of Physical Sciences and TechnologyVilnius, Prof. Mathias Losche, Carnegie Mellon Univ. Pittsburgh, PA Frank Heinrich, NIST Gaithersburg, MD. Dalis pristatytų rezultatų yra gauti, vykdant LMT remiamą projektą „Paviršiuje imobilizuoti dirbtiniai fosfolipidų bisluoksniai funkciniam baltymų įterpimu (ImfaBITE)“ (paramos sutartis MIP-096/2011).