PELACAKAN AKTIVITAS ANTIKANKER TERHADAP .METODOLOGI PAKTI Alat: bak pemeliharaan hewan coba, gavage, seperangkat alat bedah, seperangkat alat gelas (labu takar, pipet tetes, mikro

  • View
    225

  • Download
    4

Embed Size (px)

Text of PELACAKAN AKTIVITAS ANTIKANKER TERHADAP .METODOLOGI PAKTI Alat: bak pemeliharaan hewan coba, gavage,...

  • PELACAKAN AKTIVITAS ANTIKANKER TERHADAP TIGA SENYAWA SANTON TERPRENILASI DARI SPESIES GARCINIA

    Oleh:

    Dwi Oktaviani Jamil

    (1406 100 062)

    Dosen Pembimbing:

    Prof.Dr.Taslim Ersam,MS.

    Jurusan Kimia

    Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

    ITS Surabaya 2010PAKTI

  • LATAR BELAKANG

    PAKTI

    KANKER

    Sel kanker

    Sel kanker

    Pengobatan

    Kemoterapi

    Bahan bioaktif sintetis

    Bahan bioaktif dari Isolasi Bahan Alam

    TUMBUHAN

    Hutan Tropika Indonesia

    Senyawa Metabolit Sekunder

    SantonANTIKANKER

    Garcinia sp.

    O

    O

    B A

  • PERMASALAHAN

    TUJUAN

    Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas senyawa-senyawa santon terprenilasi yang diisolasi dari spesies Garcinia sebagai antikanker baru.

    Santon Terprenilasi

    ANTIKANKER

    PAKTI

    ?

  • METODOLOGI

    PAKTI

    Alat:bak pemeliharaan hewan coba, gavage, seperangkat alat bedah, seperangkat alat gelas (labutakar, pipet tetes, mikro pipet, gelas ukur, gelas beaker, gelas arloji, tabung reaksi, corong gelas),mortar, mikropipet, rak tabung reaksi, penangas air, stirrer, botol semprot, waterbath, tabungmikro (Ependorf), lemari pendingin, digital pH meter (Inolab-WTW), neraca analitik (Sartoriusbasic P-160), tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi (Denley tipe BR 401), inkubator (memmert),spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), mikroskop cahaya (Nicon), hot plate, dan autoklaf(Gnatus).

    Bahan:Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa terapi (1), senyawa terapi (2),senyawa terapi (3), tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar, PBS (Phospat BufferSaline), balok es, NaCl 0,9%, larutan stok MDA (malondialdehid), aquades, TCA 5%, HCl 1N, Na-tiobarbiturat, benzopiren, formaldehid 10%, etanol (80%, 90%, 95%, dan absolut), larutan xilol,parafin cair, antibodi primer anti-Rat-PCNA, p53 wild-type, dan Ras, antibodi sekunder Anti-Rabbit IgG Biotin labeled, kromogen DAB (diamino benzidine), H2O2, serum 2% BSA, pelarut SA-HRP (Strep Avidin-Horseradish Peroxidase), dan aquades steril.

  • METODOLOGI

    Isolasi Senyawa*

    -dikeringkan

    -ekstraksi

    -fraksinasi

    -pemisahan/Pemurniaan

    -penentuan struktur

    *telah dilakukan pada penelitian sebelumnya

    G. Tetranda & G. dulcis

    Santon terprenilasi

    PAKTI

  • Dibedah dan diambil organ paru

    Dikonfirmasi jumlah radikal bebas (MDA)

    Ekspresi PCNA, Ras, dan p53

    -diadaptasi selama 7 hari-dikelompokkan menjadi 5 kelompok

    Uji In vivoTikus Wistar

    (berat badan 200-250 g)

    K0 K2 K3 K4 K1

    -Diinjeksi 4x (berselang sehari) secara intraperitorial dengan larutan benzopirendosis 200mg/kg BB) dan diinkubasi selama 30 hari

    Kelompok tikus kanker B

    Kelompok tikus kanker C

    Kelompok tikus kanker D

    Kelompok tikus kanker A

    -Diobati 7x dengan senyawa (1)(dosis 100mg/kgBB)-Diinkubasi 7

    hari.

    -Diobati 7x dengan senyawa (2)(dosis 100mg/kgBB)-Diinkubasi 7 hari.

    -Diobati 7x dengan senyawa (3)(dosis 100mg/kgBB)- Diinkubasi 7 hari.

    PAKTI

  • - diperfusi dengan PBS pH 7,4- diambil, dipotong kecil-kecil, direndam dalam PBS pH 7,4- ditimbang 0,45 g- digerus dalam mortal yang diletakkan diatas balok es

    1. Uji Malon dialdehida (MDA)a. Pembuatan homogenate paru

    Tikus

    - dibedah, diambil parunya

    Paru

    Homogenat

    - ditambah 0,5 mL 0,9% NaCl dingin- dimasukkan dalam ependorf 1,5 mL- disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit

    Supernatan

    Uji MDA

    PAKTI

  • - diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit- dibiarkan dalam suhu ruangan- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)

    - dimasukkan dalam tabung reaksi kecil- ditambah 550 L aquades-ditambah 100 L 20% TCA- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N- dihomogenkan- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat- dihomogenkan- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit

    b. Pembuatan kurva standar MDA

    100 L larutan stok MDA dengankonsentrasi 0,1,2,3,4,5,6,7, dan 8 g/mL

    Supernatan

    Absorbansi larutan standart + kurva standart MDA

    PAKTI

  • - diinkubasi pada water bath 100oC selama 30 menit- dibiarkan dalam suhu ruangan- diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (maks = 533 nm)

    - dimasukkan dalam tabung reaksi kecil- ditambah 550 L aquades-ditambah 100 L 20% TCA- dihomogenkan ditambah 250 L HCl 1N- dihomogenkan- ditambah 100 L 1% Na-tiobarbiturat- dihomogenkan- disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit

    c. Preparasi sampel untuk pengukuran MDA

    100 L supernatan paru

    Supernatan

    Absorbansi Sampel

    PAKTI

  • -dimasukkan dalam larutan silol selama 20 menit, sebanyak 2 kali pada suhu ruang

    -dimasukkan dalam larutan silol selama 30 menit pada suhu 60-63C-dicelupkan dalam parafin cair-embedding blok parafin-didinginkan pada suhu 4C

    -diambil dan direndam dalam etanol 70% selama 24 jam-dimasukkan dalam etanol 80% selama 2 jam-dimasukkan dalam etanol 90% selama 20 menit-dimasukkan dalam etanol 95% selama 20 menit-dimasukkan dalam etanol absolut selama 20 menit dan diulangi sebanyak 3 kali

    2.Pembuatan Gambaran Histologi Parua.Embedding Paru

    Paru dalam formaldehid 10%

    Paru hasil dehidrasi dengan etanol

    Paru dalam blok parafin

    PAKTI

  • - diiris dengan ukuran 5 m-didinginkan pada suhu ruang (dimasukkan air) -dimasukkan dalam air hangat dengan suhu 38-40C-diambil dengan objek glass-dikeringkan di atas hot plate dengan suhu 38-40C sampai kering-diinkubasi pada suhu 38-40C selama 24 jam

    b. Pembuatan Preparat Paru

    Paru dalam blok parafin

    Preparat paru disimpan pada suhu ruang

    PAKTI

  • -dicelupkan dalam larutan silol 2x5 menit-dicelupkan dalam etanol bertingkat dimulai dari absolut, 95%, 90%, 80% dan 70% masing-masing 5 menit.-dicuci dengan aquades-dicuci dengan PBS pH 7,4-diaplikasi dengan 3% H2O2 selama 10 menit- dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-dibloking menggunakan serum 2% BSA selama 60 menit-diinkubasi dengan antibodi primer anti-Rat-p53; anti-Rat-PCNA; dan Ras semalam pada 4C-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditetesi dengan antibodi sekunder berlabel biotin-diinkubasi selama 1 jam-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditambah dengan SA-HRP selama 40 menit-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-ditambah kromogen DAB -dibilas dengan aquades-dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit-dilakukan counterstaining dengan Mayer hematoxilen selama 10 menit-dicuci dengan air kran-dikering anginkan-diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x

    c. Imunohistokimia Preparat Paru

    Preparat paru

    Aktivitas proliferasi sel ( skor p53; PCNA; dan Ras)

    PAKTI

  • Hasil dan Pembahasan Senyawa santon terprenilsai diisolasi dari dua tumbuhan Garcinia, yaitu G.

    tetranda dan G.dulcis.

    Tiga senyawa santon terprenilasi terbagi menjadi 3 golongan yaitu:

    santon monoprenilasi, santon diprenilasi, dan santon triprenilasi.

    PAKTI

  • 1,3,6-trihidroksi-7-metoksi-8-(prenil)-4-(geranil) santon (3)

    Struktur tiga senyawa santon terprenilasi

    O

    OH OH

    OH

    HO

    O

    HO OH

    OHO

    O

    MeO

    1,4,5,7-tetrahidroksi-2(1,1 dimetil alil) santon (1)

    -mangostin (2)

    OHHO O

    OHO

    MeO

    PAKTI

  • Hewan uji diinjeksi dengan senyawa terapi, kemudian dibedah

    dan diambill organ parunya.

    PAKTI

    Persiapan Hewan Uji

    Gambar.1 Proses Pembedahan Hewan Coba

  • Uji MDA (malondialdehid) MDA dihasilkan akibat adanya stress oksidatif sel. Stress oksidasi sel sendiri

    merupakan ketidak seimbangan antara antioksidan dengan radikal bebas yang ada dalam tubuh.

    Pengukuran kadar MDA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode tes thiobarbituric acid (TBA) yang dikembangkan oleh Alvarez dan Storey (1995).

    hv+ H

    PAKTI

    Gambar.2 Reaksi Pembentukan Radikal benzopiren

  • Kromogen MDA-TBA

    Pengukuran MDA dilakukan dengan mengukur absorbansi supernatan paru menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada = 533 nm

    PAKTI

    Gambar.3 Reaksi Pembentukan Kromogen MDA-TBA (merah muda)

  • konsentrasi

    MDA

    ( g/mL) Absorbansi

    0 0

    1 0.168

    2 0.224

    3 0.278

    4 0.382

    5 0.445

    6 0.533

    7 0.642

    8 0.711

    Gambar. 4 Kurva Standar MDA

    y = 0.084x + 0.039R = 0.992

    0

    0.1

    0.2

    0.3

    0.4

    0.5

    0.6

    0.7

    0.8

    0 2 4 6 8 10

    ab

    sorb

    an

    si

    konsentrasi (g/mL)

    Tabel.1 Data Absorbansi MDA Kurva standar

    PAKTI

    Pada penelitian ini digunakan kurva standar MDA untuk mengukur konsentrasi MDA pada hewan uji.

  • Tabel .2 Data absorbansi MDA hewan uji yang telah diobati dengan senyawa terapi

    Kode

    Kelompok

    Kode

    Senyawa

    Terapi

    Absorbansi [MDA]Rerata

    [MDA]1 2 3 1 2 3

    Biru 1 10,27 0,3 0,3 2,75 2,51 2,75 2,67

    merah 1 10,27 0,3 0,3 2,75 2,87 2,99 2,87

    merah biru 1 10,29 0,3 0,3 2,99 2,63 2,75 2,79

    Biru 2 20,38 0,4 0,4 4,06 3,70 3,94 3,90

    merah 2 20,36 0,4 0,4 3,82 3,82 3,70 3,78

    merah biru 2 20,35 0,4 0,4 3,70 3,94 4,06 3,90

    Biru 3 30,41 0,4 0,4 4,42 4,77 4,54 4,58

    merah 3 30,45 0,5 0,5 4,89 5,25 5,01 5,05

    merah biru 3 30,45 0,5 0,4 4,89 5,01 4,77 4,89

    Kontrol negatif0,2 0,2 0,2 1,92 2,04 2,27 2,08

    Kontrol positif0,52 0,5 0,6 5,73 5,85 6,20 5,92

    Keterangan

    Kontrol negatif : Tikus sehat

    Kontrol positif : Tikus sakit

    Uji MDA (malondialdehid)

    2,78

    3,86

Recommended

View more >