26

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode penelitian deskriptif eksploratif dan

eksperimental. Penelitian deskriptif eksploratif meliputi isolasi kitin, transformasi

kitin menjadi kitosan, identifikasi kitin dan kitosan, sedangkan penelitian

eksperimental yaitu uji kitosan untuk menurunkan kadar kolesterol darah pada

tikus Sprague dawley. Penelitian eksperimental bertujuan untuk mengetahui

hubungan sebab akibat (cause and effect relationship), dengan cara mengekspos

satu atau lebih kelompok eksperimental dan satu atau lebih kondisi eksperimen.

Hasilnya dibandingkan dengan satu atau lebih kelompok kontrol yang tidak

diberikan perlakuan. Adapun tahapan dari penelitian ini yaitu: persiapan bahan,

isolasi kitin, transformasi kitin menjadi kitosan, identifikasi kitin dan kitosan,

serta memberikan perlakuan pada tikus percobaan.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian telah dilakukan pada bulan November 2014-Februari 2015 di

Laboratorium Kimia FPMIPA IKIP Mataram (proses isolasi kitin dan

transformasi kitin menjadi kitosan), Laboratorium bersama FMIPA Universitas

Udayana (identifikasi kitosan dengan Spektrofotometer FTIR), Laboratorium

Biomedik Rumah Sakit Hewan Universitas Udayana (uji kitosan pada tikus

Sprague dawley untuk menurunkan kolesterol darah), UPT Balai Laboratorium

Kesehatan Provinsi Bali (analisis kolesterol darah), dan Laboratorium FTP

Universitas Udayana (analisis kadar lemak pada feses).

27

4.3 Bahan dan Alat Penelitian

4.3.1 Bahan penelitian

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit udang yang

diperoleh dari pasar Kebun Roek Ampenan, kota Mataram. Hewan uji yang

digunakan adalah tikus Sprague dawley berumur 2 bulan dengan bobot badan

rata-rata ±150-200 g .

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya: HCl

p.a, NaOH p.a, CH3COOH p.a, ninhidrine, AgNO3, indikator phenolphtalein,

simvastatin, dan aquades.

4.3.2 Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: seperangkat alat

penggerus, pengaduk magnetik, oven memmert UNB-400, desikator, timbangan

analitik ohaus, stop watch, statif dan klem, pH universal, termometer, alat

sentrifugasi, corong, ayakan ukuran 100 mesh, kit analisis kolesterol, kandang

pemeliharaan tikus individu yang dibuat dari besi, pipet volume, labu ukur, gelas

beker, dan alat-alat kimia lainnya yang biasa digunakan di laboratorium. Peralatan

instrument yang digunakan adalah spektrofotometer fourier transform inframerah

(FTIR ZHIMADZU).

4.4 Ruang Lingkup Penelitian

Ruang lingkup penelitian ini adalah penurunan kadar kolesterol dalam

darah tikus percobaan yang sebelumnya diberikan asupan makanan yang

mengandungan lemak tinggi untuk meningkatkan kadar kolesterol darah. Setelah

kadar kolesterol meningkat tikus percobaan diberikan kitosan dengan variasi

konsentrasi 0,5%, 1%, dan 2% serta dibandingkan dengan obat standar yaitu

28

simvastatin. Pengukuran kadar total kolesterol dengan menggunakan metode

presipitasi secara spektrofotometri.

4.5 Rancangan Penelitian

Rancangan dasar yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL)

yang terdiri dari lima perlakuan dengan dua kali pengulangan. Analisis data

dilakukan dengan ANOVA satu arah. Jika perlakuan memberikan pengaruh yang

nyata, maka pengujian dilanjutkan dengan uji beda Duncan pada taraf 5% (Steel

dan Torrie, 1993) untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.

4.6 Prosedur Penelitian

4.6.1 Pembuatan tepung kulit udang

Limbah kulit udang sebanyak 3 kg direbus selama 15 menit, kemudian

dicuci dengan air sampai bersih, dikeringkan dalam oven pada suhu 110-120oC

selama kurang lebih satu jam, kemudian dimasukkan dalam desikator, dan

ditimbang. Sampel dihaluskan dan diayak dengan ayakan berukuran 100 mesh.

Hasil yang lewat dari ayakan ini digunakan untuk memperoleh kitin dan sebelum

digunakan terlebih dahulu ditetapkan kadar airnya.

4.6.2 Isolasi kitin dari tepung kulit udang

4.6.2.1 Proses demineralisasi

Serbuk kulit udang yang sudah dihaluskan hingga berukuran 100 mesh

sebanyak 200 g ditambahi larutan HCl 1,5 M dengan perbandingan 1:15 (b/v).

Serbuk kulit udang dan larutan HCl 1,5 M dicampur dalam gelas kimia kemudian

dipanaskan pada suhu 60-70oC selama 4 jam sambil dilakukan pengadukan

dengan kecepatan 50 rpm, larutan disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan

2000 rpm. Padatan yang diperoleh dicuci dengan aquades beberapa kali sampai

29

pH netral. Untuk mengetahui HCl yang digunakan telah habis tercuci dilakukan

uji terhadap air hasil cucian dengan memakai larutan AgNO3, sampai tidak

diperoleh endapan putih AgCl. Padatan dikeringkan dalam oven pada temperature

80oC selama 24 jam, serbuk kulit udang yang diperoleh tanpa mineral kemudian

didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang.

4.6.2.2 Proses deproteinasi

Serbuk kulit udang hasil demineralisasi ditambahi larutan NaOH 3,5%

dengan perbandingan 1:10 (b/v) antara pelarut dengan sampel. Campuran

dimasukkan ke dalam gelas kimia, dipanaskan pada suhu 60-70oC selama 4 jam

sambil dilakukan pengadukan dengan kecepatan 50 rpm. Campuran disentrifugasi

selama 15 menit pada kecepatan 2000 rpm. Padatan yang diperoleh dicuci dengan

aquades beberapa kali sampai pH netral. Air hasil cucian diuji dengan indikator

PP, bila tidak terjadi perubahan warna merah muda (pink) maka sisa ion OH- yang

terkandung sudah hilang. Padatan yang diperoleh dikeringkan dalam oven pada

suhu 80oC selama 24 jam kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang.

Padatan yang diperoleh diidentifikasi baik secara kualitatif dan kuantitatif apakah

benar mengandung kitin. Secara kualitatif adanya kitin dapat dideteksi dengan

reaksi warna Van Wesslink. Pada cara ini, kitin direaksikan dengan I2 dalam KI

yang memberikan warna coklat, kemudian jika ditambahkan asam sulfat berubah

warnanya menjadi violet. Perubahan warna dari coklat menjadi violet

menunjukkan reaksi positif adanya kitin. Secara kuantitatif untuk

mengidentifikasi suatu senyawa kitin dilakukan dengan analisis FTIR.

30

4.6.3 Pembuatan kitosan

Hasil yang diperoleh dari proses deproteinasi (kitin) dilanjutkan dengan

proses deasetilasi dengan menambahkan NaOH 60% dengan perbandingan 1:20

(b/v). Campuran diaduk dan dipanaskan pada suhu 100-110oC selama 4 jam

dengan kecepatan pengadukan 50 rpm kemudian dilakukan sentrifugasi selama 15

menit pada kecepatan 2000 rpm. Padatan yang diperoleh dicuci dengan aquades

beberapa kali sampai pH netral. Padatan kemudian dikeringkan dalam oven pada

suhu 80oC selama 24 jam kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang

sampai berat konstan. Kitosan yang diperoleh kemudian dikarakterisasi baik

secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif untuk menguji adanya kitosan

dengan menggunakan larutan ninhidrine sedangkan secara kuantitatif kitosan yang

diperoleh dikarakterisasi dengan menggunakan FTIR.

Untuk mengetahui derajat deasetilasinya (DD) digunakan metode base line

yang diusulkan oleh Domszy dan Rovert (Khan et al, 2002), seperti yang

ditunjukan dalam persamaan 1:

DD= 100-[{(A1588/A3410)×100}/1,33].......................(1)

dengan:

A = log (Po/P) = absorbansi

A1588 = Absorbansi pada panjang gelombang 1588cm- untuk serapan

gugus amida/asetamida

A3410 = Absorbansi pada panjang gelombang 3410cm- untuk serapan

gugus hidroksil (OH-)

31

4.6.4 Karakterisasi kitosan

Karakterisasi kitosan yang dilakukan meliputi: tekstur, rendemen

transformasi kitin menjadi kitosan, kadar air, kelarutan kitosan serta uji dengan

larutan ninhidrine.

1) Rendemen

Rendemen transformasi kitin menjadi kitosan ditentukan berdasarkan

persentase berat kitosan yang dihasilkan terhadap berat kitin yang digunakan

dalam proses transformasi kitin menjadi kitosan (Zahiruddin et al., 2008).

% Rendemen transformasi kitin menjadi kitosan

= ����� ������� ���� ����������

����� �����× 100%

2) Kadar air

Kadar air merupakan salah satu parameter yang sangat penting untuk

menentukan mutu kitosan. Protan Biopolimer menetapkan standar mutu untuk

kadar air kitosan adalah ≤10% (Bastaman, 1989). Pengujian kadar air dapat

dilakukan dengan metode AOAC (Association of Analytical Communities) cara

pemanasan (Sudarmadji et al., 1994) sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak

0,5 g dalam cawan porselin atau gelas arloji yang telah diketahui beratnya.

Sampel dipanaskan dalam oven pada suhu 100-105 oC selama 1-2 jam (tergantung

bahannya). Kemudian didinginkan dalam desikator selama kurang lebih 30 menit

dan ditimbang. Dipanaskan lagi dalam oven, lalu didinginkan dalam desikator dan

diulangi hingga berat konstan.

Perhitungan kadar air dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut:

% kadar air = ���

�× 100%

32

Keterangan: a : Berat wadah + sampel basah (g) b : Berat wadah + sampel kering (g) c : Berat sampel basah (g)

3) Kelarutan kitosan

Kelarutan kitosan merupakan salah satu parameter yang dapat dijadikan

sebagai standar penilaian mutu kitosan. Semakin tinggi kelarutan kitosan berarti

mutu kitosan yang dihasilkan semakin baik. Kitosan dilarutkan dalam asam asetat

dengan konsentrasi 2% dengan perbandingan 1:100 (g/ml).

4) Uji ninhidrine

Seberat 0,1 gram kitosan yang diperoleh dari penelitian ditempatkan dalam

suatu wadah dan disemprotkan dengan larutan ninhidrine kemudian didiamkan

selama 5 menit. Diamati perubahan yang terjadi, jika sampel berubah warna

menjadi ungu maka benar adanya gugus amina bebas dalam sampel.

4.6.5 Uji penurunan kadar kolesterol darah

Langkah awal dari prosedur ini adalah pembuatan larutan kitosan dengan

kadar 0,5%; 1%; dan 2 % yaitu dengan cara melarutkan kitosan sebanyak 0,5 g, 1

g, dan 2 g masing-masing ke dalam 100 ml larutan asam asetat 1% kemudian

campuran diaduk lalu disaring. Larutan kitosan ini siap diberikan pada hewan

percobaan yang sebelumnya telah dibuat hiperkolesterolemia. Hewan uji yang

digunakan adalah tikus Sprague dawley berumur dua bulan dengan bobot badan

±150-200 g. Tikus percobaan setiap hari diberikan makanan yang tinggi

kolesterol, pakan tikus percobaan yang diberikan ada dua macam yaitu yang

pertama berbentuk pelet dengan komposisi bahan terdiri dari otak sapi dan lemak

sedangkan pakan yang kedua yaitu kuning telur dan minyak yang diberikan pada

33

tikus percobaan dengan cara sonde. Makanan tersebut menginduksi peningkatan

kadar kolesterol secara eksogen.

Pemberian makanan tinggi kolesterol diberikan selama satu bulan sebelum

perlakuan dengan kitosan dimulai. Untuk memastikan hewan uji telah

hiperkolesterolemia maka diambil serum dari semua tikus percobaan untuk

diperiksa kadar kolesterolnya setelah pemberian makanan yang mengandung

kolesterol tinggi selama satu bulan. Kadar kolesterol normal pada tikus berkisar

10-54 mg/dL (Harini, 2009), sedangkan parameter terjadinya hiperkolesterolemia

ditandai dengan kadar total kolesterol mencapai > 130 mg/dL (Martati dan

Lestari, 2008).

Hewan uji tikus jantan yang telah hiperkolesterolemia disiapkan 20 ekor

dibagi kedalam lima kelompok perlakuan dengan dua kali pengulangan,

diadaptasi dalam kandang individu selama satu hari dengan memberi ransum

standar dan air secara ad libitum kemudian dilanjutkan dengan pemberian kitosan

dan simvastatin selama lima minggu. Kelompok A sebagai kelompok kontrol

positif, yaitu tikus yang dibuat hiperkolesterolemia tanpa pemberian kitosan

maupun simvastatin hanya diberikan plasebo berupa asam asetat 1%. Kelompok B

sebagai kelompok perlakuan tikus yang dibuat hiperkolesterolemia dan diberikan

obat standar penurunan kolesterol darah yaitu simvastatin. Dosis simvastatin yang

biasa digunakan oleh manusia berkisar 5-80 mg/hari, namun pemberian

simvastatin sebaiknya dimulai dengan dosis kecil melihat efek samping dari obat

ini. Jadi dosis pemakaian simvastatin untuk tikus percobaan dapat dihitung

dengan mengalikan dosis pemakaian pada manusia dengan faktor konversi

manusia ke tikus percobaan adalah 0,018 sehingga dosis pemakaian untuk tikus

34

percobaan dengan berat badan ±150-200 g adalah 0,6 mg/BB. Kelompok C

sebagai kelompok perlakuan tikus yang dibuat hiperkolesterolemia dan diberikan

bahan uji yaitu kitosan 0,5% b/v. Kelompok D sebagai kelompok perlakuan tikus

yang dibuat hiperkolesterolemia dan diberikan bahan uji yaitu kitosan 1% b/v.

Kelompok E sebagai kelompok perlakuan tikus yang dibuat hiperkolesterolemia

dan diberikan bahan uji yaitu kitosan 2% b/v.

Pemeriksaan kadar total kolesterol, penimbangan serta analisis kadar

lemak pada feses dilakukan pada minggu ke 0, III dan V. Sebelum dilakukan

pemeriksaan kadar kolesterol semua tikus percobaan dipuasakan dan hanya

diberikan air minum secara ad libitum selama 12 jam. Pengambilan darah tikus

dari pleksus retroorbitalis, darah yang didapatkan didiamkan selama satu hari di

refrigator kemudian disentrifugasi untuk mendapatkan serum sehingga dapat

diukur kadar total kolesterol dengan metode presipitasi secara spektrofotometri.

Pembedahan selanjutnya dilakukan untuk mengetahui fungsi organ tikus

percobaan selama penelitian. Data kadar total kolesterol darah yang diperoleh

dianalisis dengan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika perlakuan memberikan

pengaruh yang nyata, maka pengujian dilanjutkan dengan uji beda Duncan pada

taraf 5% (Steel dan Torrie, 1993) untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.