34

Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis
Page 2: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

CONTENTS

1. Apa itu metode PCR?

2. Komponen-komponen PCR

3. Prinsip PCR

4. Varian-Varian metode PCR

5. Aplikasi PCR dalam diagnosis &

Page 3: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Apa itu metode

PCR? PCR = Polymerase Chain Reaction

Merupakan teknik amplifikasi DNA in vitro

Ditemukan oleh Karl Mullis pada tahun

1983 → Nobel Prize in Chemistry

1989 = majalah Science menobatkan PCR

sebagai “major scientific development”

1993 = Taq polymerase, enzim esensial

dalam PCR, dinobatkan sebagai “molecule

of the year”

Publikasi yang menggunakan metode PCR

s/d Juli 2012 = 3.240.000

Page 4: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

1. Simple

2. Powerful

A. sensitive – sensitivity

B. specific – specificity

C. reliable – reliability; fidelity

3. fast

Kelebihan

metode PCR

Page 5: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Komponen-

Komponen PCR Template (DNA

cetakan)

Primer

DNA polimerase

dNTPs

Larutan buffer (+

Nuclease-free water)

DNA-dye atau Probe

(khusus Real Time

Page 6: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Mesin Thermal

Cycler

Mesin Thermal Cycler Generasi I

Mesin Thermal Cycler Generasi Terbaru

Mesin Real Time PCR

Page 7: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Consumables

Page 8: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Prinsip PCR

Merupakan teknik amplifikasi fragmen

DNA secara enzimatik dan bersifat in vitro

Pada setiap n siklus PCR sempurna akan

diperoleh 2n DNA target

Mis: DNA target (template) awal = 1

molekul, maka setelah 30 siklus, DNA

target akan berjumlah 230 molekul =

1.073.741.824 molekul

Pada umumnya terdiri atas TIGA tahap

utama yaitu

1. Tahap denaturasi DNA (denaturation)

2. Tahap penempelan primer (Annealing)

Page 9: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Sumber: Viljoen et al. 2005, Molecular Diagnostics PCR Handbook, Springer, p.22

Page 10: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

DNA Replication

Page 11: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Komponen-Komponen Penting dalam

Replikasi DNA

Page 12: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Komponen-Komponen Penting dalam

Replikasi DNA

a. DNA cetakan : molekul DNA yang akan

direplikasi

b. Molekul deoksi-ribonukleotida: dATP,

dTTP, dCTP, dan dGTP

c. DNA Polymerase: enzim yang mengkatalisis

proses polimerisasi nukleotida menjadi untaian

DNA

d. DNA primase: enzim yang mengkatalisis

sintesis primer untuk memulai replikasi DNA

e. DNA helikase dan DNA girase: enzim yang

membuka ikatan untaian DNA induk &

berperan dalam mencegah aktivitas

supercoiling

f. Single strand binding protein (SSB): molekul

protein yang menstabilkan untaian DNA yang

sudah terbuka

g. DNA ligase: enzim yang menyambung

fragmen-fragmen DNAdATP = Deoxyadenosine triphosphate

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAReplication.html

Page 13: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

The Reaction

THERMOCYCLERPCR tube

Page 14: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Denature (heat to

95oC)

Lower temperature to 56oC

Anneal with primers

Increase temperature to

72oC DNA polymerase +

dNTPs

Page 15: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis
Page 16: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Varian-Varian

PCR Basic PCR

Nested PCR

Multiplex

PCR

Real Time

PCR

RT-PCR

Inverse

PCR

Page 17: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

PCR & Gel

Electrophoresi

s

PCR Gel Electrophoresis

Page 18: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Real Time PCR

Page 19: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

HRM Analysis

High Resolution Melting Analysis

Page 20: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

20

Homoduplexes C or T

Homozygotes represented by a single base change aredifferentiated by a difference in Tm melt.

T

A

C

G

Page 21: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Copyright © 2004 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

Struktur DNA

Gula Pentosa

Basa

Purin/Pirimidin

Fosfat

Ikatan Fosfodiester

Susunan DNA: Double helix, Antiparalel

Ikatan Hidrogen

Chargaff’s Rule: DNA from any cell of all organisms should have a 1:1 ratio (base Pair Rule)of pyrimidine and purine bases and, more specifically, that the amount of guanine is equal to cytosine andthe amount of adenine is equal to thymine

Page 22: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Applications of PCR

Basic Research Applied Research

• Genetic matching

• Detection of pathogens

• Pre-natal diagnosis

• DNA fingerprinting

• Gene therapy

• Mutation screening

• Drug discovery

• Classification of organisms

• Genotyping

• Molecular Archaeology

• Molecular Epidemiology

• Molecular Ecology

• Bioinformatics

• Genomic cloning

• Site-directed mutagenesis

• Gene expression studies

Page 23: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Aplikasi Dalam

Dunia Farmasi

Farmakogenetik

Farmakogenomik

Resistensi Mikroba

Terhadap Obat

Disease Susceptibility

Page 24: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Penyakit Infeksi

Tropis di Indonesia

Demam berdarah

dengue

Malaria

TBC

Demam tifoid

Melioidosis

Dll

Page 25: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Aplikasi PCR dalam

Diagnosis

Penentuan genotipe virus Dengue: DEN

1-4

Penentuan spesies Plasmodium

dalam kasus infeksi malaria

Identifikasi gen Mycobacteriumtuberculosis yang bertanggung

jawab dalam patogenesis

Genotyping Salmonella entericaserovar Typhi sebagai penyebab

demam tifoid

Page 26: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Sumber: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166093405001564

Sumber: http://jcm.asm.org/content/43/5/2435.full.pdf+html

Page 27: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Aplikasi PCR dalam

Pengobatan

Penentuan profil mutasi gen mikroba.

Mis: mutasi gen GyrA menyebabkan

penurunan sensitivitas terhadap

fluorokuinolon

Penentuan aktivitas ekspresi gen yang

bertanggung jawab dalam imunitas

tubuh (mis: gen IL dan MHC) sebagai

gambaran tingkat imunitas seseorang

Identifikasi fragmen DNA tertentu pada

individu sebagai hasil integrasi DNA

virus pada DNA host (Mis: DNA HIV

Page 28: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Sumber: http://aac.asm.org/content/early/2012/02/22/AAC.06414-11.abstract

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576912001488

Page 29: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis
Page 30: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis
Page 31: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis
Page 32: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis

Suggested Readings

Page 33: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis
Page 34: Pemanfaatan pcr dalam diagnosis