View
1.010
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
CONTENTS
1. Apa itu metode PCR?
2. Komponen-komponen PCR
3. Prinsip PCR
4. Varian-Varian metode PCR
5. Aplikasi PCR dalam diagnosis &
Apa itu metode
PCR? PCR = Polymerase Chain Reaction
Merupakan teknik amplifikasi DNA in vitro
Ditemukan oleh Karl Mullis pada tahun
1983 → Nobel Prize in Chemistry
1989 = majalah Science menobatkan PCR
sebagai “major scientific development”
1993 = Taq polymerase, enzim esensial
dalam PCR, dinobatkan sebagai “molecule
of the year”
Publikasi yang menggunakan metode PCR
s/d Juli 2012 = 3.240.000
1. Simple
2. Powerful
A. sensitive – sensitivity
B. specific – specificity
C. reliable – reliability; fidelity
3. fast
Kelebihan
metode PCR
Komponen-
Komponen PCR Template (DNA
cetakan)
Primer
DNA polimerase
dNTPs
Larutan buffer (+
Nuclease-free water)
DNA-dye atau Probe
(khusus Real Time
Mesin Thermal
Cycler
Mesin Thermal Cycler Generasi I
Mesin Thermal Cycler Generasi Terbaru
Mesin Real Time PCR
Consumables
Prinsip PCR
Merupakan teknik amplifikasi fragmen
DNA secara enzimatik dan bersifat in vitro
Pada setiap n siklus PCR sempurna akan
diperoleh 2n DNA target
Mis: DNA target (template) awal = 1
molekul, maka setelah 30 siklus, DNA
target akan berjumlah 230 molekul =
1.073.741.824 molekul
Pada umumnya terdiri atas TIGA tahap
utama yaitu
1. Tahap denaturasi DNA (denaturation)
2. Tahap penempelan primer (Annealing)
Sumber: Viljoen et al. 2005, Molecular Diagnostics PCR Handbook, Springer, p.22
DNA Replication
Komponen-Komponen Penting dalam
Replikasi DNA
Komponen-Komponen Penting dalam
Replikasi DNA
a. DNA cetakan : molekul DNA yang akan
direplikasi
b. Molekul deoksi-ribonukleotida: dATP,
dTTP, dCTP, dan dGTP
c. DNA Polymerase: enzim yang mengkatalisis
proses polimerisasi nukleotida menjadi untaian
DNA
d. DNA primase: enzim yang mengkatalisis
sintesis primer untuk memulai replikasi DNA
e. DNA helikase dan DNA girase: enzim yang
membuka ikatan untaian DNA induk &
berperan dalam mencegah aktivitas
supercoiling
f. Single strand binding protein (SSB): molekul
protein yang menstabilkan untaian DNA yang
sudah terbuka
g. DNA ligase: enzim yang menyambung
fragmen-fragmen DNAdATP = Deoxyadenosine triphosphate
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAReplication.html
The Reaction
THERMOCYCLERPCR tube
Denature (heat to
95oC)
Lower temperature to 56oC
Anneal with primers
Increase temperature to
72oC DNA polymerase +
dNTPs
Varian-Varian
PCR Basic PCR
Nested PCR
Multiplex
PCR
Real Time
PCR
RT-PCR
Inverse
PCR
PCR & Gel
Electrophoresi
s
PCR Gel Electrophoresis
Real Time PCR
HRM Analysis
High Resolution Melting Analysis
20
Homoduplexes C or T
Homozygotes represented by a single base change aredifferentiated by a difference in Tm melt.
T
A
C
G
Copyright © 2004 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings
Struktur DNA
Gula Pentosa
Basa
Purin/Pirimidin
Fosfat
Ikatan Fosfodiester
Susunan DNA: Double helix, Antiparalel
Ikatan Hidrogen
Chargaff’s Rule: DNA from any cell of all organisms should have a 1:1 ratio (base Pair Rule)of pyrimidine and purine bases and, more specifically, that the amount of guanine is equal to cytosine andthe amount of adenine is equal to thymine
Applications of PCR
Basic Research Applied Research
• Genetic matching
• Detection of pathogens
• Pre-natal diagnosis
• DNA fingerprinting
• Gene therapy
• Mutation screening
• Drug discovery
• Classification of organisms
• Genotyping
• Molecular Archaeology
• Molecular Epidemiology
• Molecular Ecology
• Bioinformatics
• Genomic cloning
• Site-directed mutagenesis
• Gene expression studies
Aplikasi Dalam
Dunia Farmasi
Farmakogenetik
Farmakogenomik
Resistensi Mikroba
Terhadap Obat
Disease Susceptibility
Penyakit Infeksi
Tropis di Indonesia
Demam berdarah
dengue
Malaria
TBC
Demam tifoid
Melioidosis
Dll
Aplikasi PCR dalam
Diagnosis
Penentuan genotipe virus Dengue: DEN
1-4
Penentuan spesies Plasmodium
dalam kasus infeksi malaria
Identifikasi gen Mycobacteriumtuberculosis yang bertanggung
jawab dalam patogenesis
Genotyping Salmonella entericaserovar Typhi sebagai penyebab
demam tifoid
Sumber: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166093405001564
Sumber: http://jcm.asm.org/content/43/5/2435.full.pdf+html
Aplikasi PCR dalam
Pengobatan
Penentuan profil mutasi gen mikroba.
Mis: mutasi gen GyrA menyebabkan
penurunan sensitivitas terhadap
fluorokuinolon
Penentuan aktivitas ekspresi gen yang
bertanggung jawab dalam imunitas
tubuh (mis: gen IL dan MHC) sebagai
gambaran tingkat imunitas seseorang
Identifikasi fragmen DNA tertentu pada
individu sebagai hasil integrasi DNA
virus pada DNA host (Mis: DNA HIV
Sumber: http://aac.asm.org/content/early/2012/02/22/AAC.06414-11.abstract
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576912001488
Suggested Readings