Penentuan Kadar Protein Dengan Spektrofotometri

  • View
    4.409

  • Download
    45

Embed Size (px)

Text of Penentuan Kadar Protein Dengan Spektrofotometri

Laporan Praktikum Laboratorium Biokimia

Hari, Tanggal : Jumat, 16 Maret 2012 Kelompok :8 PJP : Prof. Dr. Maggy T. Suhartono Yanti, Ph.D. Asisten : Bernadetta Meika Dysa Irina Elissa Tjahjono Fidelia Isabel Yuliani Wijaya Katharina Jessica Matheus Alvin Prawira Sabar Budiman Stephanus Aditya Listian Stevanny Wong Steven Clement Wendy Andryan

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN SPEKTROFOTOMETRI Debora Jessen Vania Gavrila Wikasa Melinda Ika Sari Michael Edbert Suryanto 2011-080-020 2011-080-026 2011-080-052 2011-080-089 2011-080-101

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI UNIVERSITAS KATOLIK INDONESIA ATMA JAYA 2012

PENDAHULUAN Protein merupakan senyawa biomolekul yang penting, karena perannya dalam berbagai proses di dalam tubuh. Protein terdapat dalam jumlah yang banyak di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme ([UAD] 2011). Untuk memenuhi kebutuhan protein dalam tubuh, seseorang harus mengonsumsi makanan yang mengandung protein. Banyak makanan yang merupakan sumber protein bagi tubuh, namun kadar protein di dalam setiap makanan berbedabeda. Oleh karena itu, pada percobaan ini akan dilakuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan menggunakan metode spektrofotometri. Selain itu, percobaan ini juga dilakukan untuk menentukan efektivitas metode yang digunakan (metode Lowry dan metode Bradford), serta untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford. Pengukuran kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode spektrofotometri merupakan metode yang menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya dalam mengukur konsentrasi suatu senyawa (Lestari 2010). Dasar penggunaan metode spektrofotometri adalah dengan menggunakan metode Lowry dan Bradford. Prinsip metode Lowry adalah terbentuknya warna biru akibat penambahan pereaksi Folin Ciocalteau dan Biuret. Terbentuknya warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi ion Cu2+ dengan ikatan peptida dalam larutan alkalis pada saat penambahan pereaksi biuret serta terjadinya reaksi reduksi pereaksi Folin Ciocalteau dengan asam amino dalam protein (Kolakowski 2012). Sedangkan, prinsip metode Bradford adalah adanya ikatan antara protein dengan CBB-G250 (Coomassie Brilliant Blue-G250) dalam keadaan asam. CBB yang awalnya berwarna merah akan berubah warna menjadi biru pada saat berikatan dengan protein sehingga terjadi perubahan panjang gelombang pewarna dari 465 nm menjadi 595 nm (Walker 2002).

BAHAN DAN METODE Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer VIS, kuvet plastik, rak tabung reaksi, tabung reaksi, pompa bulp, vorteks, pipet mikro, tip, magnetic stirrer, gelas piala, labu takar, gelas ukur, dan kertas saring. Bahan yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) 1 mg/ml, NaOH 0,1 M, CuSO4.5H2O 1%, Na K-tartarat 2%, Na2CO3 2%, Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95%, Asam fosfat 85%, pereaksi Folin-Ciocalteau, pereaksi Biuret, pereaksi Bradford, alumunium foil dan sampel protein (putih telur 5%v/v, putih telur 5% v/v 2 kali pengenceran, tepung cacing 2 % b/v, tepung cacing 2% b/v 2 kali pengenceran, susu 2% b/v, susu 2% b/v 2 kali pengenceran). Metode yang digunakan dalam praktikum ini terbagi menjadi 2 bagian, yaitu metode Lowry dan metode Bradford. Untuk masing-masing metode dilakukan pembuatan kurva standard dan pengukuran kuantitatif larutan protein. Prosedur kerja pada metode Lowry adalah sebagai berikut. Perrtama, 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,25 Volume akuades (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,25

Kemudian, 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya. Selanjutnya, kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6), sampel (tabung 7), dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut.

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8

Volume protein (ml) Standar: 1,2 Standar: 1,2 Standar: 1,2 Standar: 1,2 Standar: 1,2 Standar: 1,2 Sampel protein: 1,2 Akuades: 1,2

Volume pereaksi Biuret (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6

Langkah selanjutnya, larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen, lalu didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu, ditambahkan 0,3 ml pereaksi Folin Ciocalteau, divorteks, dan dibiarkan selama 30 menit dalam suhu ruang. Hal tersebut bertujuan agar reaksi dapat berjalan optimal. Bila waktu pembiaran lebih dari waktu tersebut, maka larutan akan menjadi jenuh sehingga hasil yang diperoleh tidak maksimal. Setelah reaksi terjadi, absorbansi larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 650 nm. Langkah terakhir, kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis. Selain itu, juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml). Sedangkan, pada metode Bradford, prosedur kerjanya sebagai berikut. Perrtama, 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 0,8 0,7 0,5 0,3 0,2 0,1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2,0 1,75 1,25 0,75 0,5 0,25 Volume akuades (ml) 0,5 0,75 1,25 1,75 2,0 2,25

Kemudian, 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya. Selanjutnya, kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6), sampel (tabung 7), dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut.

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8

Volume protein (ml) Standar: 0,4 Standar: 0,4 Standar: 0,4 Standar: 0,4 Standar: 0,4 Standar: 0,4 Sampel protein: 0,4 Akuades: 0,4

Volume pereaksi Bradford (ml) 8 8 8 8 8 8 8 8

Langkah selanjutnya, larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen, lalu didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang sehingga reaksi dapat berlangsung optimal Setelah itu, larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. Langkah terakhir, kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis. Selain itu, juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml).

HASIL Tabel 1 Kurva standar Lowry [BSA] (M) 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0.45 0.4 0.35 absorbansi 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6 [protein] Gambar 1 Kurva standar metode Lowry. Tabel 2 Kurva standar Bradford [BSA] (M) 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Absorbansi (A) 0 0,171 0,286 0,433 0,743 0,889 0,919 0.8 1 1.2 Absorbansi (A) 0 0,016 0,077 0,123 0,255 0,318 0,373 y = 0.396x - 0.009 R = 0.984

1.2 1 absorbansi 0.8 0.6 0.4 y = 1.181x + 0.052 R = 0.975

0.20 0 0.2 0.4 0.6 [protein] Gambar 2 Kurva standar metode Bradford Tabel 3 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Lowry Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1,102 0,546 0,574 0,712 0,778 0,772 0,535 0,590 1,656 1,996 1,227 1,844 Abs2 (A) 1,199 0,467 0,547 0,714 0,770 0,929 0,571 0,693 1,794 2,078 1,605 1,800 Abs ratarata (A) 1,1905 0,5065 0,5855 0,7130 0,7740 0,8505 0,5530 0,6415 1,7250 2,0370 1,4160 1,8220 [Protein] 3,0290 1,3018 1,5013 1,8232 1,9773 2,1704 1,4192 1,6427 4,3788 5,1667 3,5985 4,6237 0.8 1

Tabel 4 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Bradford Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1,003 0,979 1,116 0,908 1,072 0,970 0,734 0,919 1,513 2,593 2,925 1,198 Abs2 (A) 1,029 1,002 1,100 0,907 1,051 1,001 0,716 0,934 1,512 2,579 2,179 1,183 Abs ratarata (A) 1,0160 0,9905 1,1080 0,9075 1,0615 0,9855 0,7250 0,9265 1,5125 2,5860 2,5520 1,1905 [Protein] (M) 0,8163 0,7947 0,8942 0,7244 0,8548 0,7904 0,5699 0,7710 1.2367 2,1456 2,1168 0,9640

Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Lowry y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a,b = konstanta dari grafik standar 1. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 1,1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1,1905 = 0,396x 0,009 1,1905 + 0,009 = 0,396x 1,1995 = 0,396x x = 3,0290 M 2. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 0.396x - 0.009

y = 0,5065 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,5065 = 0,396x 0,009 0,5065 + 0,009 = 0,396x 0,5155 = 0,396x x = 1,3018 M 3. Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 0,5855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,5855 = 0,396x 0,009 0,5855 + 0,009 = 0,396x 0,5945 = 0,396x x = 1,5013 M 4. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 0,7130 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,7130 = 0,396x 0,009 0,7130 + 0,009 = 0,396x 0,722 = 0,396x x = 1,8232 M 5. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui: y = 0.396x - 0.009

y = 0,7740 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,7740 = 0,396x 0,009 0,7740 + 0,009 = 0,396x 0,783 = 0,396x x = 1,9773 M 6. Sampel C (Kelompok 6) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 0,8505 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,8505 = 0,396x 0,009 0,8505 + 0,009 = 0,396x 0,8595 = 0,396x x = 2,1704 M 7. Sampel D (Kelompok 7) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 0,5530 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,5530 = 0,396x 0,009 0,5530 + 0,009 = 0,396x 0,562 = 0,396x x = 1,4192 M 8. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui: y = 0.396x - 0.009

y = 0,6415 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0,6415 = 0,396x 0,009 0,6415 + 0,009 = 0,396x 0,6505 = 0,396x x = 1,6427 M 9. Sampel E (Kelompok 9) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 1,7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1,7250 = 0,396x 0,009 1,7250 + 0,009 = 0,396x 1,734 = 0,396x x = 4,3788 M 10. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui: y = 0.396x - 0.009 y = 2,0370 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2,0370 = 0,396x 0,009 2,0370 + 0,009 = 0,396x 2,046 = 0,396x x = 5,1667 M 11. Sampel F (Kelompok 11) Diketahui: y = 0.396x - 0.009

y = 1,4160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1,4160 = 0,396x 0,009 1,4160 + 0,009 = 0,396x 1,425 = 0,396x x = 3,59