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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
PERFIL IMUNOLÓGICO DOS INDIVÍDUOS COM A COINFECÇÃO
HIV/LEISHMANIA INFANTUM
MANOELLA DO MONTE ALVES
NATAL/RN
2017
MANOELLA DO MONTE ALVES
PERFIL IMUNOLÓGICO DOS INDIVÍDUOS COM A COINFECÇÃO HIV/LEISHMANIA INFANTUM
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
com requisito para a obtenção do título de
Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Selma Maria Bezerra
Jerônimo
Co-orientadora: Profa. Eliana Lúcia Tomaz do
Nascimento.
NATAL/RN
2017
Alves, Manoella do Monte. Perfil imunológico dos indivíduos com a coinfecçãoHIV/Leishmania infantum / Manoella do Monte Alves. - Natal,2017. 63f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação emCiências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. Orientadora: Selma Maria Bezerra Jerônimo. Coorientadora: Eliana Lúcia Tomaz do Nascimento.
1. Síndrome de Imunodeficiência Adquirida - Dissertação. 2.HIV - Dissertação. 3. Leishmaniose - Dissertação. 4. Ativaçãoimune - Dissertação. I. Jerônimo, Selma Maria Bezerra. II.Nascimento, Eliana Lúcia Tomaz do. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.98:578.828
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde
Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
iv
MANOELLA DO MONTE ALVES
PERFIL IMUNOLÓGICO DOS INDIVÍDUOS COM A COINFECÇÃO HIV/LEISHMANIA INFANTUM
Aprovada em 17/03/2017
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Prof. Selma Maria Bezerra Jerônimo
Membros da Banca: Lara de Melo Barbosa Andrade e Lucas Pedreira de Carvalho
v
DEDICATÓRIA
A todos os Severinos do Brasil, que permanecem longe dos olhos e dos interesses
dos governantes deste país.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos pacientes que convivem com o HIV, que mesmo na sua busca constante pelo
anonimato, me emprestaram um pouco de seu tempo e aceitaram fazer parte do
estudo.
A todos que fazem o Instituto de Medicina Tropical do Rio Grande do Norte, pelas
portas sempre abertas e que sem eles, este estudo não aconteceria.
E em especial a:
Carol Aguiar, pela paciência, parceria e ajuda inestimável no aperto das horas.
Amanda Albuquerque, por ter sido meus pés e mãos neste estudo.
Glória Monteiro, pelo otimismo, disponibilidade e carinho.
Professora Eliana Tomaz pela oportunidade que me abriu ao falar do IMT e por ter
me convidado para iniciar este mestrado.
Este estudo recebeu suporte do National Institutes of Health (NIH-AI-30639) e
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.
E por fim, agradeço à Professora Selma, que segurando o leme do IMT nesses
mares pouco favoráveis, é capaz de nos levar a horizontes melhores.
vii
“Vivendo, se aprende; mas o que se aprende mais, é só a fazer outras maiores
perguntas” (Guimarães Rosa em Grande Sertão: Veredas)
viii
RESUMO
A Leishmania infantum é um patógeno de comportamento oportunista. O risco de
pessoas com infecção assintomática por L. infantum desenvolverem leishmaniose
visceral (LV) é maior naquelas coinfectadas com HIV (vírus da imunodeficiência
humana) do que em imunocompetentes. A hipótese do presente estudo é que ativação
persistente de células T em pessoas coinfectadas com HIV (HIV+) e L. infantum
aumenta o risco de progressão para LV. Para testar essa hipótese, foi realizado um
estudo, entre maio de 2014 a agosto de 2016, em uma área endêmica para LV no
estado do Rio Grande do Norte, Brasil, com objetivo de determinar a frequência de
coinfecção assintomática HIV/L. infantum e avaliar a resposta imune em pessoas com
coinfecção Leishmania-HIV. Em estudo transversal, um total de 1.134 pessoas HIV+
foram avaliadas quanto a frequência de infecção por L. infantum, usando-se como
marcador anticorpo anti-Leishmania. Um subgrupo de coinfectados HIV/L. infantum
foi seguido e determinados os níveis de ativação, senescência, anergia, exaustão e
regulação de células T e a evolução clínica, comparando-os com pessoas HIV+,
AIDS/LV, LV e saudáveis. A taxa de infecção assintomática por L. infantum em
pessoas HIV+ foi de 23,6% (n=268), destas 2 desenvolveram LV dentro de 1 ano e
foram a óbito. Pessoas dos grupos HIV/L. infantum, AIDS/LV e LV apresentaram maior
expressão de CD38HLA-DR e PD1 em linfócitos T CD8 do que pessoas com HIV. Em
todos os grupos houve expressão aumentada de CD57 nos linfócitos T CD8. O grupo
HIV/L. infantum apresentou maior expressão de CD25FoxP3 nos linfócitos T CD8.
Pessoas infectadas por L. infantum apresentaram uma maior ativação de linfócitos T
CD8. Essa ativação persistente em pessoas com HIV/L. infantum pode levar a déficits
imunológicos que aumentaria o risco de progressão para LV. Esses resultados
sinalizam para a necessidade de avaliação de profilaxia com drogas leishmanicidas
como medida para reduzir o risco de desenvolver LV sintomática.
Palavras-chave: HIV, AIDS, leishmaniose, coinfecção, ativação imune.
ix
ABSTRACT
The risk to develop visceral leishmaniasis (VL) in subjects with HIV+ (Human
immunodeficiency virus) is greater than for immunocompetent people with
asymptomatic Leishmania infantum. The hypothesis of this study was that persistent
T cell activation in HIV co-infected persons and asymptomatic Leishmania infection
increases the risk of progression to VL and to relapse. To test this hypothesis, a cross-
sectional study of subjects HIV+ was carried out between May 2014 and August 2016
in an endemic area for LV, in the state of Rio Grande do Norte, northeast Brazil, with
the goal to determine the rate of asymptomatic L. infantum infection in HIV-infected
persons (HIV +) and the immunological status of this co-infection. A total of 1,134 HIV+
subjects was recruited. A subgroup of HIV/L. infantum was followed to determine the
level of T cell activation, senescence, anergy, exhaustion and regulation and clinical
follow up and compared to a HIV+, AIDS/VL, VL alone and healthy individuals. The
rate of L. infantum asymptomatic infection was 23.6%. Of the 268 HIV/L. Infantum, 2
developed VL and died. Subjects with HIV/L. infantum, AIDS/VL and VL group
presented higher expression of CD38HLA-DR and PD1 in CD8 cells than subjects with
only HIV. For all groups, there was an increased expression of CD57 in T CD8
lymphocytes. HIV/L. infantum group presented the higher CD25FoxP3 expression in T
CD8 lymphocytes. People infected with L. infantum had a greater activation of CD8 T
lymphocytes. This persistent activation may lead to possible immunologic deficits that
in individuals with immunosuppressive diseases would increase the risk to develop VL.
Therefore, prophylaxis with leishmanicidal drugs should be considered.
Keywords: HIV, Aids, leishmaniasis, co-infection, immune activation.
x
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
Aids Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida
APCs Célula Apresentadora de Antígeno
CCR5 Receptor de quimiocina Tipo 5
CD cluster de diferenciação
CD3 Linfócito T CD3
CD4 Linfócito T CD4
CD8 Linfócito T CD8
CTLA4 Antígeno de Linfócito Citotóxico Tipo 4
CXR4 Receptor CXC de quimiocina Tipo 4
DO Densidade óptica
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA Ensaio Imunoenzimático
FoxP3 Fator de Transcrição da Família “forkhead”
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA Antígeno Leucocitário Humano
HLADR Antígeno Leucocitário Humano - antigen D Related
IFI Imunofluorescência Indireta
IFN Interferon
IFNγ Interferon Gama
IL Interleucina
LV Leishmaniose Visceral
xi
MDMs Macrófago derivado de monócito
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
MIF Fator Inibidor de Migração de Macrófagos
MIP-1β Proteína Inflamatória de Macrófago 1β
NFkB Fator de Transcrição Nuclear kappa B
NK Células Natural Killers
PBMC Célula Mononuclear do Sangue Periférico
PCR Reação em cadeia da polimerase
PD1 Morte programada - 1
qPCR Reação em Cadeia da Polimerase quantitativo
rK39 Proteína Recombinante Cinesina 39
sCD14 Fração solúvel do receptor CD14
SLA Antígeno solúvel de Leishmania
TARV Terapia Antirretroviral
TGF- Fator de Transformação do Crescimento β
Th1 Células T auxiliares do tipo 1
Th17 Células T auxiliares do tipo 17
Th2 Células T auxiliares do tipo 2
TLR Receptores Toll-like
TNF Fator de Necrose Tumoral
TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa
Treg Células T reguladoras
xii
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Figura 1 - Fluxograma do arrolamento dos participantes do estudo.. ....................... 28
Figura 2 - Distribuição de IgG anti-rK39 por grupos. ................................................. 33
Figura 3 - Distribuição de IgG anti-SLA por grupos. .................................................. 34
Figura 4 – Valores de CD4 por grupo. ....................................................................... 36
Figura 5 - Valores de CD8 por grupo. ....................................................................... 36
Figura 6- Relação T CD4/CD8 por grupo.. ................................................................ 38
Figura 7 - Expressão de CD38HLA-DR em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B).
.................................................................................................................................. 41
Figura 8 - Expressão de CTLA4 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). .......... 42
Figura 9 - Expressão de PD1 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). .............. 43
Figura 10 - Expressão de CD57 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). .......... 43
Figura 11 - Expressão de CD25FoxP3 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). 44
Gráfico 1 - Taxa de coinfecção assintomática HIV/L. infantum. ................................ 32
xiii
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 1 – Características demográficas dos grupos ............................................... 32
Tabela 2 – Avaliação da infecção por L. infantum por presença de anticorpo anti-
Leishmania, anti-SLA e anti-rK39 .............................................................................. 33
Tabela 3 – Contagem de linfócitos e carga viral do HIV ............................................ 35
Tabela 4 - Teste de comparação múltipla entre os grupos para linfócitos T CD4 e T
CD8 ........................................................................................................................... 35
Tabela 5 – Características demográficos e laboratoriais dos grupos ........................ 40
Tabela 6 – Dados de ativação, exaustão, anergia, senescência e regulação dos
linfócitos T CD4 e T CD8 ........................................................................................... 45
Quadro 1 - Painel de anticorpos para determinar ativação, anergia, exaustão,
senescência e regulação linfocítica ........................................................................... 30
Quadro 2 - Grupos x Estrato CD4 ............................................................................ 37
Quadro 3 - Grupo x Estrato Carga Viral (CV) do HIV ............................................... 37
Quadro 4 – Correlação entre os linfócitos CD4 e CD8 dos indivíduos ..................... 38
xiv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15
2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 18 2.1 Leishmaniose visceral e AIDS: Epidemiologia e Clínica ....................................... 18 2.2 Resposta imune a Leishmania infantum e HIV ...................................................... 22
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 27 3.1 Geral: ........................................................................................................................ 27 3.2 Específicos: .............................................................................................................. 27
4. MÉTODOS .......................................................................................................... 28 4.1 Tipo de estudo e população estudada ................................................................... 28 4.2 Definição dos grupos: ............................................................................................. 28 4.3 Coleta de dados ....................................................................................................... 29 4.4 Determinação de anticorpos anti-Leishmania pelo teste ELISA .......................... 29 4.5 Determinação da ativação, exaustão, anergia, senescência e regulação de linfócitos T CD4 e CD8 ................................................................................................... 29 4.6 Análise estatística .................................................................................................... 30 4.7 Considerações éticas .............................................................................................. 31
5. RESULTADOS ................................................................................................... 32 5.1 Caracterização da população estudada ................................................................. 32 5.1.1 Frequência da coinfecção assintomática HIV/L. infantum ................................. 32 5.2 Perfil imunológico dos grupos estudados ............................................................. 39 5.2.1 Características demográficas e laboratoriais ..................................................... 39 5.2.2 Avaliação dos marcadores de ativação, exaustão, anergia, senescência e regulação de linfócitos T CD4 e CD8 ............................................................................ 41
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 46
7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 49
8. REFERÊNCIAS: ................................................................................................. 50
15
1. INTRODUÇÃO
O surgimento da pandemia HIV/AIDS modificou o espectro das Leishmanioses.
Foi no grupo de pessoas com leishmaniose visceral, LV/AIDS, que a Leishmania foi
primeiro reconhecida como patógeno de comportamento oportunista. Desde a
primeira publicação da coinfecção, em meados da década de 80, o número de casos
LV/AIDS tem aumentado, em todas as áreas endêmicas para LV no mundo, e passa
a ser um problema importante, pela frequência de recaída da LV (1, 2).
Estudos conduzidos no nordeste do Brasil indicam que a maioria das pessoas
infectadas com L. infantum são capazes de montar uma respostar celular efetiva, sem
que haja o desenvolvimento LV (3, 4). A infecção assintomática por L. infantum no
estado do Rio Grande do Norte, tem variado ao longo dos anos. Jeronimo et cols. (5),
no ano de 2004, observaram uma prevalência de 35% em área endêmica na região
periurbana de Natal e Lima et cols., no ano de 2012, observaram uma prevalência de
24,6%. Vários fatores ambientais estão envolvidos com essa variação na taxa de
infecção por L. infantum e desenvolvimento de LV (6).
Garrote et cols., em um estudo transversal com 4.825 pessoas, observaram
uma soroprevalência de 64% para L. infantum entre as 217 pessoas HIV+ versus 4,9%
na população geral (7). Carranza-Tamayo et cols., observaram uma prevalência
cumulativa de infecção por Leishmania em 16% de 163 pessoas HIV+ em Brasília,
Brasil (8). Em 2012, Orsini et cols., observaram 20,2% de positividade em área
metropolitana endêmica para LV do Sudeste do Brasil (9), enquanto outro estudo na
região Norte do país mostrou prevalência de 3,4% (10).
A infecção pelo HIV aumenta o risco de desenvolvimento de LV (11) e acredita-
se que mais de 90% destes casos sejam recaídas e não, reinfecções (12). O que não
é uma surpresa já que na infecção pelo HIV, existe disfunção de células CD4. É sabido
que pessoas infectadas pelo HIV apresentam ativação imune persistente em níveis
maiores que controles saudáveis, vista na expressão de HLA-DR e CD25 nos
linfócitos T CD4 e T CD8 (13). Além disso, viremia residual do HIV, translocação
bacteriana e presença de coinfecções, como a citomegalovirose, tem sido claramente
relacionados à ativação imune, por meio da ativação de sinalizações intercelulares,
expressão de moléculas de adesão e por fim, elevada expressão de citocinas (14-16).
Sabe-se também que o parasitismo no tecido linfoide intestinal pelas formas
amastigotas da leishmania acelera o dano na mucosa associado à infecção pelo HIV,
16
aumentando translocação bacteriana e favorecendo a ativação linfocitária (17, 18).
Leishmaniose visceral e HIV são endêmicas no Brasil (19), país que reporta a
maioria das coinfecções nas Américas. A incidência de AIDS no país cresceu de 0,8
casos por 100.000 habitantes em 1986 para 20,1 casos por 100.000 habitantes em
2009 (20). No Brasil, as novas infecções por HIV aumentaram 11% entre 2005 e 2013.
Em 2014, o país registrou 47% de todos os novos casos contabilizados na América
Latina (21). No período de 2000 a 2013, foram registrados 4.185 casos de AIDS em
adultos no estado do Rio Grande do Norte (22). Além disso, em 2014, o Brasil foi
responsável por 90% dos casos de LV na América Latina, sendo o Nordeste
responsável por 58% destes casos. Nos últimos 10 anos, a incidência de LV no país
foi de 2 casos para cada 100.000 habitantes (23).
É bem conhecido que a chegada da terapia antirretroviral (TARV) altamente
efetiva modificou a história natural do HIV e das doenças oportunistas associadas a
AIDS, incluindo a LV (24). Porém, estudos mostraram que entre 38 a 70% dos
coinfectados HIV/L. infantum que já tiveram LV, recebendo TARV, apresentavam
recidiva da LV, mesmo após tratamento efetivo para esta infecção, havendo uma
resposta diminuída ao tratamento antiparasitário (25, 26). Isso pode ser explicado pela
fisiopatologia de ambas as infecções, já que leishmania infecta e se multiplica dentro
de macrófagos e o HIV também pode invadir e se replicar nesta população celular (27,
28). Ambas as infecções mudam a resposta celular do padrão Th1 para o padrão Th2,
através de complexos mecanismos mediados por citocinas (29). Além disso, essa
dificuldade na recuperação imune tem sido parcialmente explicada pela depleção de
precursores celulares na medula óssea promovida pela leishmania, levando à
deficiência de liberação de novos linfócitos na periferia (26).
Casado et cols., demonstraram recentemente que LV pregressa em indivíduos
infectados pelo HIV é uma causa independente de níveis persistentemente elevados
de ativação imune, imunosenescência, inflamação e translocação microbiana
comparado com outros pacientes HIV+ , a despeito de uma TARV efetiva e carga viral
indetectável por no mínimo 1 ano (13). Santos-Oliveira et cols. (30) demonstraram que
indivíduos coinfectados HIV/L. infantum, com LV já tratada e baixas cargas virais, por
no mínimo 6 meses, ainda apresentavam níveis de lipopolissacarídeos e sCD14
(ambos associados a translocação bacteriana e ativação imune, respectivamente),
interleucina 1β, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 17, fator inibitório de
17
migração de macrófagos (MIF), proteína 1β de inflamação de macrófagos (MIP-1) e
fator de necrose tumoral (TNF) elevados e similares aos vistos em pacientes
coinfectados com LV ativa (31).
Ainda hoje existem lacunas de conhecimento e de estudos clínicos e
imunológicos relacionados a coinfecção HIV/L. infantum. Sendo assim, um melhor
entendimento se faz necessário, principalmente devido ao grande número de pessoas
com infecção pelo HIV em áreas endêmicas para leishmaniose, como é o caso do
estado do Rio Grande do Norte e diversas localidades no Brasil (6). Na verdade, todos
os estados da federação brasileira já notificaram casos autóctones de LV. Além disso,
existe um número cada vez maior de pessoas recebendo terapias imunossupressoras,
associadas a doenças autoimunes, neoplasias e transplantes, resultando em
imunidade celular suprimida. Dessa maneira, um melhor entendimento do mecanismo
imunológico da coinfecção Leishmania-HIV poderia auxiliar a estabelecer estratégias
quanto ao tratamento que permitiria diminuir a morbidade e mortalidade nesta
população (32). Este estudo teve como objetivo determinar a frequência de infecção
por L. infantum num centro de referência para HIV no Rio Grande do Norte, estado
endêmico para LV, e avaliar o perfil imunológico dos indivíduos com a coinfecção
assintomática HIV/L. infantum.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Leishmaniose visceral e AIDS: Epidemiologia e Clínica Ainda hoje as doenças infecciosas e parasitárias são consideradas as maiores
responsáveis pela mortalidade mundial e por ¼ da carga global de doenças (33). Os
recursos são limitados, onde menos de 10% do gasto mundial em saúde é dirigido às
doenças tropicais e 90% destes gastos são dirigidos a doenças que afetam apenas
10% da população do mundo (34).
Dentre as doenças negligenciadas, as leishmanioses se encontram na nona
posição quanto ao seu impacto em mortalidade, morbidade e custos, refletidos nos
Anos de Vida Perdidos Ajustados por Incapacidade. Trezentos e cinquenta milhões
de pessoas vivem em áreas de risco para infecção por alguma espécie de Leishmania.
Um total de 12 milhões estão atualmente infectadas em 98 países e 2 milhões de
novos casos de leishmanioses (cutânea, mucosa e visceral) são estimados para
ocorrer anualmente. No mundo, LV é responsável por cerca de 500.000 casos por ano
(35) e é a segunda causa de morte por doença parasitária (36).
Previamente descrita como uma doença rural, a LV tornou-se endêmica e
epidêmica em várias cidades brasileiras desde a década de 80. Em 2012, o Brasil foi
responsável por 96,5% das pessoas com diagnóstico de LV nas Américas (37) e
ocupa a terceira posição em prevalência mundial (38), onde as taxas de mortalidade
tem variado de 4,2% a 10,2% (39).
A LV na América Latina e Europa é uma zoonose causada pelo protozoário do
gênero Leishmania infantum (sin. L. chagasi, na América Latina), enquanto na Índia é
uma antroponose, tendo como agente etiológico Leishmania donovani. Esses
microrganismos pertencem a ordem Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae (40).
A primeira descrição da L. donovani foi realizada por William Leishman, em 1903, em
um soldado irlandês morto da conhecida febre Dum-Dum na Índia. Leishman
acreditava que os parasitas visualizados fossem tripanossomos que tivessem sofrido
alterações post-mortem (41).
Leishmanias são parasitas dimórficos, com duas formas em seu ciclo de vida:
promastigota (que se multiplica no intestino do inseto vetor) e amastigota (forma
intracelular obrigatória, encontrada em macrófagos de hospedeiros vertebrados) (42).
Leishmania é transmitida aos vertebrados através da picada da fêmea do
flebotomínio. L. longipalpis é a principal espécie vetora de L. infantum nas Américas.
19
Outras vias ocasionais de transmissão incluem o uso de seringas contaminadas,
transfusão de hemoderivados, a via transplacentária e contaminação em laboratório
(ocupacional) (43). A via de transmissão transplacentária é difícil de estimar sua
importância, na manutenção da endemia, uma vez que nas áreas endêmicas para LV
há vetores competentes para transmitirem Leishmania. O cão (Canis familiaris) é o
principal reservatório da doença nas áreas urbanas no Brasil (44), sendo a raposa
(Lycalopex vetulus e Cerdocyon thous) e o gambá (Didelphis albiventris) reservatórios
silvestres (45).
A LV caracteriza-se clinicamente como uma síndrome consumptiva febril de
caráter crônico, onde o exame clínico mostra uma hepatoesplenomegalia febril e o
hemograma, uma bicitopenia ou pancitopenia. A LV resulta, na maioria dos casos, em
morte se não tratada, mas mesmo com tratamento, a mortalidade pode alcançar 20%
(35). Nas Américas, o impacto da LV não é exatamente conhecido, já que ainda
existem falhas nos sistemas de notificação (38), apesar de melhora substancial no
sistema de notificação no Brasil, que é responsável por mais de 90% dos casos de LV
nas Américas.
Para o diagnóstico da LV são comumente usados testes com visualização
direta do parasita e presença de sinais clínicos. No entanto, em áreas endêmicas, a
maioria das pessoas apresenta infecção assintomática, sendo confirmada por meio
de positividade ao teste intradérmico a antígenos de leishmania (Montenegro) e/ou
aos testes sorológicos (3, 46). Esse último grupo não recebe tratamento e se não
apresentarem alguma imunossupressão permanecem saudáveis.
No Brasil, o método padrão ouro para diagnóstico da forma sintomática da LV,
continua sendo a observação direta do parasita em aspirado de medula óssea ou a
cultura deste, originado de amostras teciduais, requerendo procedimentos invasivos,
com maior risco de eventos adversos (47). Nos últimos 20 anos, foram desenvolvidos
vários ensaios sorológicos para diagnóstico de infecção por Leishmania, e estes têm
facilitado a confirmação do diagnóstico de doença quando da presença de sinais e
sintomas característicos de LV.
A base do tratamento da LV era feita com antimoniatos por via intravenosa ou
intramuscular, durante 28 dias (48). No entanto, resistência tem sido relatada no Brasil
e em outras localidades, com demonstração de presença de alelos de resistência na
Leishmania (49). A maioria dos casos de LV na Índia é resistente a antimoniais, sendo
20
a anfotericina e suas formulações lipídicas as mais utilizadas para tratamento. No
Brasil, há resposta aos antimoniatos, mas anfotericina lipossomal está direcionada ao
pacientes com maiores morbidades, devido a uma maior ocorrência de eventos
adversos com o uso dos antimoniatos (50).
A prevalência da infecção por Leishmania infantum em pessoas convivendo
com o HIV pode variar, dependendo da região estudada (9, 47, 51), porém os dados
ainda são bastante escassos. Ao longo dos anos, houve a interiorização do HIV e a
urbanização da L. infantum, no Brasil, permitindo o aumento do número de casos de
LV em pacientes Aids (32).
A Aids teve suas primeiras descrições em 1981, quando homens americanos
previamente saudáveis e que praticavam sexo com outros homens passaram a
apresentar quadros infecciosos por agentes oportunistas. O vírus da Imunodeficiência
Humana (HIV), reconhecido em 1983, é um vírus de RNA, identificado como um
Lentivirus da família Retroviridae, se distribuindo mundialmente nos últimos 35 anos
(52).
Em 2015 existiam 37,6 milhões de pessoas vivendo com HIV no mundo, 2,1
milhões de novas infecções e 1,1 milhão de óbitos (53). De 2007 até junho de 2016,
foram notificados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação, (Sinan),
sistema de notificação do Ministério da Saúde do Brasil, 136.945 casos de infecção
pelo HIV no Brasil, ressaltando que a notificação compulsória da infecção pelo HIV é
muito recente no país, o que impede uma completa análise epidemiológica dos casos
(54).
A transmissão do HIV se dá por via sexual na grande maioria dos casos, porém
pode ocorrer através de transfusão sanguínea, compartilhamento de seringas e de
forma vertical na gestação. Após entrada no organismo humano, o vírus se replica na
mucosa, submucosa e segue para tecido linfonodal (55). A célula alvo principal do HIV
é o linfócito T CD4, que após replicação viral, é destruído. A resposta inicial ao vírus
se faz por produção de anticorpos não neutralizantes, não impedindo o escape viral
(56); e pela população linfocitária T CD8. Esta que controlará parcialmente a infecção
por atuar na parte viral mutante, permitindo lentificação e queda da replicação viral,
tanto na fase inicial aguda quanto na fase crônica da infecção (57, 58). Enquanto a
maioria dos linfócitos morrem após ativação e atividade citotóxica, uma população de
linfócitos T CD8 de memória permanece. Caso essa população se torne senescente,
21
isto é, caracterizada pelo marcador CD57, haverá aumento de susceptibilidade a
infecções e autoimunidade. A infecção pelo HIV tem sido associada a expansão de
linfócitos T CD8+CD57+ (59).
Certos pacientes com HLA-B57 e HLA-B27 apresentam uma resposta T CD8
mais efetiva, culminando em maior destruição viral, consequentemente, com queda
mais lentificada dos níveis de linfócitos T CD4 (60). Durante toda a fase de infecção
crônica por HIV, há ativação persistente de células T CD4 e células T CD8 e elevados
níveis de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-, IL-6 e IL-1 (61).
A maioria dos indivíduos HIV+ progridem para a Aids na ausência de TARV,
culminando com a ocorrência de doenças oportunistas, incluindo a LV. No Brasil, o
tratamento antirretroviral é oferecido gratuitamente a todos os indivíduos que
convivem com o HIV, sendo atualmente o esquema inicial composto por 2 inibidores
da transcriptase reversa e um inibidor da integrase viral. Estudos recentes, no entanto,
mostram que a sobrevida de pessoas convivendo com HIV pode ser semelhante a
pessoas imunocompetentes (62).
O diagnóstico clínico e laboratorial da coinfecção sintomática Aids e LV muitas
vezes tem sido difícil, pois características associadas à LV, como febre prolongada,
hepatoesplenomegalia, perda de peso e pancitopenia nem sempre estão presentes,
além disso, apresentações atípicas podem aparecer, como pneumonites ou formas
intestinais. A presença de outras doenças oportunistas também pode dificultar o
diagnóstico (9).
Somado a isso, a depleção de células T CD4 promovida pela presença do HIV,
implica em não reconhecimento dos antígenos de leishmania e consequente não
estimulação de linfócitos B, o que de certa maneira explica sorologias negativas
nestes coinfectados (63). O HIV também provoca uma inibição na resposta do
hospedeiro frente à leishmania, favorecendo a disseminação do parasita em sítios
atípicos e promovendo alta parasitemia (64).
O uso da PCR tem sido estudado para o diagnóstico de LV, tanto em sangue
periférico quanto em medula óssea, com sensibilidades variando de 73% a 100% e
especificidade próximo a 100% para o diagnóstico da infecção, principalmente em
pacientes HIV+ (65-69), sendo menor, a sensibilidade por métodos sorológicos (63).
Além disso, métodos usando PCR tem revelado até 30% da coinfecção em pacientes
22
HIV+ assintomáticos (70).
Existem vários fatores que determinam a expressão clínica da leishmaniose em
pacientes com HIV, como: sistema imune do hospedeiro, fatores de virulência do
parasita e outros relacionados ao vírus (26, 71). Molina et cols. (47), em estudo
recente, observou que independente de todos estes fatores citados acima, ao avaliar
a carga parasitária por qPCR (PCR quantitativo) em pacientes HIV+ que foram
tratados para LV, mostrou que esta era preditiva da recorrência da LV.
2.2. Resposta imune a Leishmania infantum e HIV
A resposta imune do hospedeiro é crucial em determinar o quadro clínico na
infecção por L. infantum e outras espécies de Leishmania em pessoas
imunocompetentes. Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia, avaliado pelo teste
de Montenegro (72) e resposta linfocitária, no passado, no Brasil, indicavam que 1 em
cada 5 -10 crianças infectadas por L. infantum desenvolviam LV (73). No entanto, na
Europa, o risco de desenvolver LV é menor. Tanto a imunidade inata quanto a
adaptativa participam na resposta à leishmania. Uma vez que as formas
promastigotas penetram a derme, ocorre ativação do sistema complemento,
resultando na destruição de mais de 90% dos parasitas inoculados (74). Dessa forma,
apenas uma pequena quantidade do parasita parece ser responsável pelo
estabelecimento da infecção. O início da interação parasito-hospedeiro envolve
reconhecimento do parasita através de receptores Toll-like (TLRs) expressos em
várias populações de leucócitos, incluindo células dendríticas, macrófagos e linfócitos
T (75).
Em modelos murinos, Interleucina(IL)-12, produzida pelas células dendríticas,
dirige ao final, a resposta imune Th1, com ativação das células NK (natural killers),
estas que são a fonte inicial de interferon gamma (IFN-γ), e são responsáveis por
limitar a reprodução do parasita, até que ocorra uma resposta T celular específica
(40, 76). Sabe-se que neste processo ocorre um aumento na produção das espécies
reativas de oxigênio, como superóxido e peróxido de hidrogênio, que são essenciais
para a destruição do parasita (77). Células mononucleares periféricas de sangue
periférico (PBMCs) de pessoas com infecção assintomática ou subclínica respondem
ao antígeno de leishmania com proliferação e produção de IL-2, IFN-γ e IL-12 (78).
Em contraste, PBMCs de pacientes com LV, na fase sintomática, não respondem a
antígenos específicos de Leishmania e não produzem IFN-γ (79, 80). Na fase
23
sintomática da LV, a resposta imune preponderante é do tipo Th2 através de um
subgrupo de linfócitos T CD4 com expressão de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e TGF-. Essa
imunossupressão Leishmania específica é temporária e revertida após o tratamento
bem sucedido (81).
Pacientes com LV possuem altos níveis de anticorpos IgE, IgM e IgG anti-
leishmania (82). O aumento na produção de anticorpos parece não proporcionar
proteção, pois ao opsonizar o patógeno, permitem que macrófagos o fagocite,
estimulando IL-10 e TGF-, diminuindo a capacidade microbicida desta célula, (83).
Além disso, IL-10 aumenta a sobrevida de linfócitos B e estudos mostram que
camundongos depletados de células B são menos susceptíveis à infecção por L.
donovani (84). IL-10 também tem sido fortemente implicado como fator
imunossupressor na infecção por leishmania. Estudos com pacientes sudaneses
mostram que na LV, existe produção simultânea de IL-10 e IFN-γ nos linfonodos e na
medula óssea. Os níveis de IL-10 diminuem após resolução da doença (85, 86).
Presume-se que esta citocina tenha caráter regulatório, participando de uma rede
homeostática de proteção aos tecidos, evitando danos colaterais causados por uma
excessiva inflamação (82).
TNF-α tem papel fundamental na eliminação do parasita a nível hepático e
esplênico, já que esta citocina é essencial na formação do granuloma, com
consequente controle na proliferação da leishmania. Porém, o excesso de TNF-α pode
ser responsável por dano celular progressivo e disfunção imunológica, visto, por
exemplo, na infecção por Leishmania braziliensis (87, 88). Dessa forma, a resposta
do hospedeiro à infecção não apenas se deve à expressão de determinadas citocinas,
como também, na regulação fina destas (89).
IL-6 é uma citocina liberada em resposta a uma ampla gama de estímulos
inflamatórios, incluindo infecção intracelular, sendo considerado um fator pro-
inflamatório (90). Entretanto, em certos modelos, IL-6 tem sido reportado como
supressor de mecanismos inflamatórios, diminuindo a ativação macrofágica e tendo
efeitos antimicrobianos (91). Resultados in-vitro e in-vivo indicam que IL-6 pode
promover, suprimir ou deixar inalterada a resposta anti-leishmania intracelular do
hospedeiro infectado(92).
Receptores Toll-like (TLRs), cruciais na resposta imune inata, também são
reportados como participantes na resposta à infecção por este parasita (77), como já
24
dito anteriormente. Vários estudos tem confirmado sua importância no início da
infecção e na susceptibilidade e resistência do hospedeiro a Leishmania (93, 94), já
que evidências atuais demonstram que esses receptores podem regular o balanço
Th1/Th2 (77). Um exemplo disto é o TLR2 mediando a expressão de IL-10,
aumentando ou diminuindo a destruição intracelular da leishmania (95). Pois acredita-
se que seja a atuação dos TLRs que irá determinar a atuação das células
apresentadoras de antígenos (APCs) como também a habilidade de células T em
expressar a resposta Th1 ou Th17 na presença dos antígenos de leishmania (96).
Pouco se tem estudado sobre a resposta Th17 na LV e na coinfecção Aids/LV,
porém é sabido que esta resposta apresenta um importante papel na interação
hospedeiro-patógeno na superfície de mucosa (97) e sabe-se que a presença de
poucas células Th17 em mucosa está associada a translocação bacteriana no epitélio
intestinal. Como dito anteriormente, IL-27 produzida por macrófagos, bloqueia a
resposta Th17 na LV (82). Estudos em pacientes com LV mostraram elevados níveis
séricos de IL-27 e aumento na expressão de fatores de transcrição relacionados a
esta interleucina em aspirado esplênico (98).
Estudos relacionados à função das células Treg (caracterizadas pela
expressão do marcador FoxP3) na leishmaniose em humanos são limitados (99).
Vallejo et al., ao estudar indivíduos positivos para o HIV, observou níveis mais baixos
de células T naive no grupo que teve leishmaniose, assim como maior número de
células Treg.
Expressão elevada de CTLA4 (Antígeno de Linfócito Citotóxico Tipo 4) foi
encontrada em pessoas com LV sintomática, sendo esta expressão diminuída após
a cura clínica (Rodrigues-Neto, 2017 aceito). Além disso, níveis diminuídos de células
T naive também foram observados em pacientes assintomáticos infectados por L.
infantum, sem evidência de infiltração medular (99). O CTLA-4 é uma molécula de
superfície que é expressa em linfócitos T CD4 e T CD8, apesar de já ter sido reportada
sua expressão em células B. Sua expressão se dá após ativação de células T,
atuando como uma molécula contra-regulatória, impedindo proliferação desordenada
do linfócito T, sendo um marcador de anergia (100). Anergia é observada na fase
sintomática da LV.
A leishmania aumenta a replicação do HIV, tanto em culturas in-vitro como em
pessoas coinfectadas (28), em parte, devido a ativação crônica do sistema imune
25
(101), com a indução de produção de TNF-α e IL-1 (102) e consequente amplificação
de genes de replicação do HIV (103), e aumento da expressão de co-receptores virais
(CCR5 e CXR4), favorecendo a entrada, integração, formação e liberação de
partículas virais (104). Sabe-se que a expressão de CCR5 se correlaciona
positivamente com a carga viral do HIV e negativamente com a contagem de CD4,
mostrando uma relação direta com progressão da doença (105). Isso promove um
aumento na secreção de TNF-α, IL-2, IL 4, IL 6 e IL-10, com progressão da
imunodeficiência e diminuição na sobrevida destes pacientes (106). IL-6 tem sido
implicada na estimulação da replicação viral em macrófagos via NF-kB (107). Uma
produção aumentada desta interleucina tem sido detectada em macrófagos infectados
com leishmania (108, 109). Foi visto que CCR5 tem expressão precoce e aumentada
em macrófagos infectados in vitro por leishmania (110-112). Por outro lado, o HIV
aumenta a fagocitose e a replicação da leishmania dentro de monócitos derivados de
macrófagos (MDMs) (102), dado contraditório, pois sabe-se que a infecção pelo HIV
inibe atividade fagocitária (113).
Além disso, Barreto de Souza et cols. mostraram que o HIV aumenta a
replicação da leishmania em população de macrófagos coinfectados por meio da
expressão da ciclooxigenase-2, síntese de prostaglandina E2 e o fator de crescimento
β (TGF-β), por transativação da proteína Tat (114). Vallejo et cols. (99) demonstraram
que pacientes coinfectados HIV/L. infantum com passado de LV tinham uma depleção
importante de células T naive comparados a pacientes considerados mau
respondedores imunológicos (CD4 < 250 células/mm3) ambos em uso de TARV por
mais de 1 ano e carga viral indetectável, demonstrando uma pior recuperação imune.
Foram observadas maiores densidades de CCR5 nas células T CD8+ dos pacientes
que tinham tido LV previamente (99). Somado a isso, exaustão de linfócitos T tem sido
proposta como um mecanismo insatisfatório de recuperação imune (115) através da
observação da expressão de PD1 (morte programada-1) em linfócitos de pacientes
HIV+ (116, 117). A molécula PD-1 e seus ligantes são amplamente expressas e
exercem uma diversidade de funções imunoregulatórias na ativação e tolerância de
células T, protegendo os tecidos de agressões autoimunes. Pode ser expressa em
células T CD4, T CD8, monócitos, células natural killers e células dendríticas. Por
permitir tolerância de células T, esta molécula facilita a persistência de infecções
crônicas, como a infecção pelo HIV, sendo um marcador de anergia e com função
crítica na proliferação de células T regulatórias (118).
26
Por fim, Jiménez et col. observaram que indivíduos HIV+ mesmo em uso de
TARV e carga viral indetectável por pelo menos 1 ano apresentavam telômeros mais
curtos do que os indivíduos controles saudáveis (119). Durante o envelhecimento, se
é observado o encurtamento dos telômeros em células do sistema imune, e isto é
mais evidente durante estados de inflamação crônica e em indivíduos HIV+ sem
tratamento (120). Evidenciando assim um estado de proliferação celular constante
(121) e ativação imune nestes indivíduos.
Dessa maneira, em pacientes coinfectados, acredita-se que o HIV usa parte da
rede de citocinas mediada pela leishmania para sua replicação (122). Sendo assim,
HIV/L. infantum surge como uma importante comorbidade, onde ambos os patógenos
agem sinergicamente (64). Ainda é bastante debatido se a perda da competência
imunológica dos indivíduos coinfectados é devido a ativação imune persistente,
supressão da proliferação linfocitária ou por ambos os fenômenos (123).
Todos estes dados se tornam relevantes na medida em que se tem atualmente
um grupo de pacientes com a coinfecção, que nunca apresentaram LV. O
conhecimento de que a ocorrência da LV, imprime nestes pacientes uma resposta
imunológica desfavorável, tornando-os susceptíveis a recaídas e piorando seu
prognóstico imunológico (124), sugere uma preocupação crescente no grupo do
coinfectados assintomáticos. Sendo assim, o presente estudo buscou avaliar o perfil
imunológico destes indivíduos por meio da análise da ativação, anergia, exaustão,
senescência e regulação dos linfócitos T CD4 e T CD8.
27
3. OBJETIVOS
3.1 Geral: Avaliar o perfil de ativação imune das pessoas com a coinfecção
assintomática HIV/L. infantum.
3.2 Específicos:
3.2.1 Determinar a frequência da infecção assintomática por L. infantum em
pessoas com infecção pelo HIV e residentes em área endêmica para
Leishmaniose Visceral.
3.2.2 Avaliar o perfil de ativação imune das pessoas com AIDS e leishmaniose
visceral; pessoas com HIV sem infecção por L. infantum e; pessoas com
leishmaniose visceral sem infecção pelo HIV.
28
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipo de estudo e população estudada Um estudo transversal foi realizado entre maio de 2014 a agosto de 2016, onde
1.134 indivíduos HIV+, residindo no Rio Grande do Norte, área endêmica para LV
(125), foram testados para a infecção por L. infantum (126). Um subgrupo destes
pacientes com a coinfecção assintomática HIV/L. infantum foi seguido para avaliação
da resposta imune. Outros 4 grupos foram recrutados, incluindo AIDS e LV; HIV; LV;
e saudáveis (S) e tiveram amostras sanguíneas coletadas para o estudo imunológico
(Figura 1). As amostras de sangue da população HIV foram obtidas no Laboratório
Central do Rio Grande do Norte (LACEN-RN), onde são
coletados e processados os exames de contagem de carga viral, contagem de
linfócitos T CD4 e linfócitos T CD8; enquanto as demais populações foram recrutadas
no Hospital Giselda Trigueiro, hospital de referência em doenças infectocontagiosas
do estado do Rio Grande do Norte.
4.2 Definição dos grupos: 1. Indivíduos com sorologia positiva para o HIV e para Leishmania infantum sem
diagnóstico de leishmaniose visceral (HIV/L. infantum). 2. Indivíduos positivos para o HIV e com sorologia negativa para L. infantum (HIV).
3. Indivíduos com AIDS e leishmaniose visceral (AIDS/LV): pessoas que
apresentaram sorologia positiva para HIV e tiveram diagnóstico de leishmaniose
A B
Figura 1 – Fluxograma do arrolamento dos participantes do estudo. A. Estudo
transversal para determinação da frequência infecção por L. infantum. B. subgrupo
arrolado para o estudo imunológico.
HIV+ n=1.134
HIV/L. infantum
n=268
HIV/L. infantum
n=10
HIV+ n=845
AIDS/LV n=21
HIV+ n=16
AIDS/LV n=14
LV n=8
Saudáveis n=6
29
visceral. O diagnóstico de LV foi confirmado por achado do parasito no aspirado de
medula óssea ou pela presença de anticorpos anti-leishmania. 4. Indivíduos com leishmaniose visceral e negativos para o HIV (LV).
5. Indivíduos com sorologia negativa para o HIV e para Leishmania infantum (S).
4.3 Coleta de dados
Dados demográficos e laboratoriais (sexo, idade, endereço, contagem de
linfócitos T CD4 e CD8 e carga viral do HIV) foram obtidos na base de dados do
Ministério da Saúde. Pessoas positivas para o HIV tiveram, em geral, a contagem de
linfócitos T CD4 e CD8 e carga viral do HIV medidas, 2 vezes por ano, de acordo com
protocolo nacional. Dados demográficos, clínicos e laboratoriais dos indivíduos dos
subgrupos foram obtidos por entrevista ou via prontuário.
4.4 Determinação de anticorpos anti-Leishmania pelo teste ELISA
A detecção de anticorpos IgG anti-leishmania no soro foi realizada por ELISA,
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizando a fração solúvel de antígenos de
promastigotas (SLA) obtido de um isolado de medula óssea de um paciente oriundo
de Natal (Cepa IOC 341) (5, 127) e/ou proteína recombinante (rK39) (128), usando
um protocolo previamente publicado.
4.5 Determinação da ativação, exaustão, anergia, senescência e regulação de linfócitos T CD4 e CD8
Os linfócitos foram analisados em amostra ex-vivo. Foram coletados 4 ml de
sangue de cada participante em tubos contendo heparina como anticoagulante. O
sangue foi dividido em 2 partes de 2mL cada, e para cada parte foi adicionado 6mL
de tampão de lise de células vermelhas. O sangue foi incubado por 20 min a 4oC e
centrifugado a 2851 x g por 15min a 10oC. A lise de células vermelhas foi realizada
duas vezes para a obtenção das células brancas. O pool de células brancas foi lavado
com 10mL de PBS-Azida 0,1% centrifugado a 754 x g por 10 min a 4oC. O pellet de
células brancas foi ressuspenso em 400uL de PBS-BSA (0,5%). A suspensão celular
foi dividida em 100μl por tubo cônico de polipropileno de 5 ml (BD) e incubado com
anticorpos monoclonais segundo desenho experimental (quadro 1). Após a incubação
30
por 30 minutos a 4oC, as células foram lavadas em PBS por centrifugação (754 xg, 10
minutos a 4oC) e ressuspensas em PBS contendo 1% de formaldeído (Sigma). As
células então foram fixadas por 15 minutos em temperatura ambiente, e após a
fixação, as células foram lavadas em PBS por centrifugação (754 x g, 10 minutos a
4oC). Por fim, o pellet contendo as células marcadas e fixadas foram ressuspensas
em 200ul de PBS e armazenadas a 4oC até o momento da aquisição em citômetro de
fluxo BD canto II (BD).
O tubo para o painel de regulação, após a última fixação e lavagem, foi incubado
com solução permeabilizadora (PBS-0,5% Saponina- 0,5% BSA) por 10 min em
temperatura ambiente, no escuro. Ao final desse tempo, o tubo foi centrifugado (754
x g, 10 minutos a 4oC), as células ressuspensas em PBS e incubadas com o anticorpo
por 30 min à temperatura ambiente. Após a incubação, as células foram lavadas
com solução permeabilizadora e foram centrifugadas. Por último, as células foram
lavadas em PBS por centrifugação como as etapas anteriores, após a marcação
intracelular, e os tipos celulares e marcadores quantificados no citômetro.
Quadro 1 - Painel de anticorpos para determinar ativação, anergia, exaustão, senescência e regulação linfocítica Painéis Marcadores
FITC PE PE-Cy5 PE-Cy7 APC APC-Cy7
1 -Ativação CD38 HLA-DR CD4 CD3 CD8
2-Senescência,
anergia e exaustão CD57 CTLA4 PD1 CD4 CD3 CD8
3- Regulação FoxP3 CD25 CD4 CD3 CD8
FITC = Isocianato de fluoresceína; PE = Ficoeritrina; APC = Aloficocianina.
4.6 Análise estatística
O teste qui-quadrado foi usado para avaliar a associação entre as variáveis
categóricas e o teste de Kruskal-Wallis foi usado para avaliar se havia diferença entre
os grupos. O teste de Pearson foi usado para avaliar a correlação entre as variáveis
quantitativas. O software usado foi o STATISTICA 7.0 Statsoft.
Na avaliação dos valores de densidade óptica e marcadores imunológicos, o
teste de Kruskal-Wallis foi usado para a comparação entre os grupos e o teste de
comparação múltipla de Dunn foi feito na avaliação grupo a grupo. O software usado
31
foi o GraphPad Prism versão 6.01. Foi adotado o nível de significância de 5%.
4.7 Considerações éticas Este protocolo e o consentimento informado foram avaliados e aprovados pelo
Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP- UFRN) e pelo
Comitê de Ética Nacional Brasileira (CONEP). O certificado de aprovação ética (CAAE
12584513.1.0000.5537).
32
5. RESULTADOS
5.1 Caracterização da população estudada
5.1.1 Frequência da coinfecção assintomática HIV/L. infantum Um total de 1.134 indivíduos HIV+, residentes no estado do Rio Grande do Norte,
foram avaliados quanto a infecção por L. infantum. Desses, 268 (23,6%) tiveram
sorologia positiva para L. infantum; e 21 (1,9%) tinham AIDS/LV (gráfico 1). Dos 268
HIV/L. infantum, 2 desenvolveram LV dentro de 1 ano após a testagem sorológica e
ambos foram a óbito. Desses, 736 eram do sexo masculino (64,9%), sem diferença
entre os grupos (p=0,723). A mediana da idade foi de 40 anos sem diferença entre os
grupos (p=0,259) (Tabela 1).
Gráfico 1 - Taxa de coinfecção assintomática HIV/L. infantum.
Tabela 1 – Características demográficas dos grupos
Grupos Parâmetros
Idade, anos. p = 0,259
Sexo masculino/feminino, p=0,723
HIV 40 (2-78) 544/301 HIV/L. infantum 38,5 (4-82) 177/91 AIDS/LV 40 (20-55) 15/6
Nota: os dados estão descritos nos valores de mediana (mínimo-máximo), exceto para sexo. Qui-
quadrado foi usado para comparar sexo e Kruskal-Wallys para comparar a idade entre os grupos.
O grupo LV teve a maior mediana quanto aos níveis de anticorpos, tanto para
anti-rK39 quanto para anti-SLA (Tabela 2). O grupo HIV/L. infantum teve mediana de
HIV+74.5%
HIV/L. infantum23.6%
AIDS/LV1.9%
Taxa de coinfecção assintomática HIV/L. infantum
33
densidade óptica menor do que o grupo LV e sem diferença em relação ao grupo
AIDS/LV, tanto para rK39 quanto para SLA (p = 0,002 e p < 0,0001, respectivamente)
(Tabela 2 e Figuras 2 e 3).
Tabela 2 – Avaliação da infecção por L. infantum por presença de anticorpo anti-Leishmania, anti-SLA e anti-rK39
Grupos Antígenos
SLA, p<0,0001 rK39, p<0,0001
HIV (n=845) 0,40 (0,08-0,99) 0,34 (0,06-0,99)
HIV/L. infantum (n=268) 1,15 (0,11-11,51) 1,06 (0,08-9,94)
AIDS/LV (n = 20) 0,65 (0,08-10,37) 0,78 (0,10-9,37)
LV (n = 6) 6,29 (3,05-10,47) 7,62 (1,02-9,47) n = número. Nota: os dados estão descritos nos valores de mediana (mínimo-máximo). Kruskal-
Wallys foi usado para comparação dos parâmetros.
Figura 2 - Distribuição de IgG anti-rK39 por grupos. A figura mostra os valores de
IgG anti-rK39 para cada grupo. A parte superior da barra representa a mediana e os
quadrados e triângulos os valores extremos. A linha tracejada representa o cut-off do
teste.
RelativeOpticalDensity
Anti-rK39IgG
HIV
HIV/L.infantum
AIDS/LV LV
0
2
4
6
8
10
12 p<0.0001
p=0.0059 p=0.003
p=0.002
p<0.0001
34
Figura 3 - Distribuição de IgG anti-SLA por grupos. A figura mostra os valores de
IgG anti- SLA para cada grupo. A parte superior da barra representa a mediana e os
quadrados e triângulos os valores extremos. A linha tracejada representa o cut-off do
teste.
Quanto a contagem de linfócitos T CD4 e CD8 e carga viral, houve diferença
entre os três grupos (HIV, HIV/L. infantum e AIDS/LV), (p <0,0001) (Tabela 3 e Figuras
4 e 5), não foi determinada a contagem total destas células para o grupo LV.
Observou-se que a quantidade de CD4 diminuiu em presença da infecção por
Leishmania. No entanto, a contagem de T CD8 não apresentou diferença entre o
grupo HIV e HIV/L. infantum (p = 0,111) (Tabela 4).
RelativeOpticalDensity
Anti-SLAIgG
HIV
HIV/L.infantum
AIDS/LV LV
0
2
4
6
8
10
12p<0.0001
p=0.0273
p<0.0001
p<0.0001
p=0.004
35
Tabela 3 – Contagem de linfócitos e carga viral do HIV
Parâmetros
Grupo Células T CD4
(céls/mm3) p<0,0001
Células T CD8, (céls/mm3)
p<0,0001
Carga do HIV (cópias/mL)
p<0,0001
HIV n = 843;
567 (2-3.272)
n = 843;
979 (52-6.241)
n = 821;
<40 (<40-6.656.651)
HIV/L. infantum
n = 267;
488 (4-1.703)
n = 267;
1.090 (110-6.172)
n = 262;
<40 (<40-5.477.781)
AIDS/LV n = 19;
115 (11-857)
n = 19;
430 (132-1.648)
n = 21;
122.926 (<40-2.353.459)
n = número. Nota: os dados estão descritos nos valores de mediana (mínimo-máximo). Kruskal-Wallys
foi usado para comparação dos parâmetros.
Tabela 4 - Teste de comparação múltipla entre os grupos para linfócitos T CD4 e T CD8
Tipo de linfócito
Teste de comparação múltipla, valor p (n=1.129) HIV
HIV/L. infantum
AIDS/LV
CD4
HIV 0,0021 0,000 HIV/L. infantum 0,0021 0,00029 AIDS/LV 0,000 0,00029 CD8
HIV 0,111 0,000 HIV/L. infantum 0,111 0,000 AIDS/LV 0,000 0,000
• Teste Kruskal-Wallis, anova não paramétrica
36
Figura 4 – Valores de CD4 por grupo. Box-plots mostram a mediana de CD4 para
cada grupo. Os círculos e as estrelas representam valores atípicos (>1,5x amplitude
interquartílica e >3x amplitude interquartílica, respectivamente).
Figura 5 - Valores de CD8 por grupo. Box-plots mostram a mediana de CD8 para
cada grupo. Os círculos e as estrelas representam valores atípicos (>1,5x amplitude
interquartílica e >3x amplitude interquartílica, respectivamente).
Os indivíduos com AIDS/LV apresentaram menor contagem de CD4 e maior
carga viral (p<0,0001). Nesse mesmo grupo, a contagem de células T CD4 estava
37
abaixo de 100 células/mm3 em 42,1% dos indivíduos, e em 26,3%, estava acima de
250 células/mm3. A carga viral < 1.000 cópias/ml foi mais presente nos grupos HIV e
HIV/L. infantum, e cargas virais mais altas estavam presentes no grupo AIDS/LV (p
<0,0001) (quadros 2 e 3).
Quadro 2 - Grupos x Estrato CD4
Estrato CD4 (céls/mm3)
Total <= 100
100 a
250 > 250
Grupo HIV n 51 62 730 843
% 6,0% 7,4% 86,6% 100,0%
HIV/L.
infantum
n 23 36 208 267
% 8,6% 13,5% 77,9% 100,0%
AIDS/LV n 8 6 5 19
% 42,1% 31,6% 26,3% 100,0%
Total n 82 104 943 1129
% 7,3% 9,2% 83,5% 100,0%
n = número. Χ2 = 62,31 4 g.l. p<0,0001
Quadro 3 - Grupo x Estrato Carga Viral (CV) do HIV
Estrato CV
(cópias/ml)
Total
<=
1000 > 1000
Grupos HIV n 631 190 821
% 76,9% 23,% 100,0%
HIV/L.
infantum
n 177 85 262
% 67,6% 32,4% 100,0%
AIDS/LV n 5 16 21
% 23,8% 76,2% 100,0%
Total n 813 291 1104
% 73,6% 26,4% 100,0%
n = número. Χ2 = 36,24 2 g.l. p<0,0001
38
Os valores de T CD4 e T CD8 correlacionaram-se positivamente (p <0,001)
(quadro 4) e a razão CD4/CD8 foi menor no grupo AIDS/LV (p <0,0001) (Figura 7).
Quadro 4 – Correlação entre os linfócitos CD4 e CD8 dos indivíduos
CD4 CD8 CD4 Correlação de Pearson
Sig. (bicaudal)
N
1
1.129
.216**
.000
1.129 CD8 Correlação de Pearson
Sig. (bicaudal)
N
.216**
.000
1.129
1
1.129 **. A correlação é significante ao nível de 0,01 (bicaudal).
Figura 6- Relação T CD4/CD8 por grupo. Box-plots mostram a mediana da razão
CD4/CD8 para cada grupo. Os círculos e as estrelas representam valores atípicos
(>1,5x amplitude interquartil e >3x amplitude interquartil, respectivamente). A relação
CD4/CD8 foi menor no grupo AIDS/VL (p <0,0001).
39
5.2 Perfil imunológico dos grupos estudados
5.2.1 Características demográficas e laboratoriais Um total de 54 indivíduos foram avaliados quanto a ativação, anergia,
exaustão, senescência e regulação de células T CD4 e CD8. Desses, 6 eram do grupo
de indivíduos saudáveis, 16 eram do grupo HIV, 10 do grupo HIV/ L. infantum, 14 do
grupo AIDS/LV e 8 do grupo LV. Não houve diferença significativa quanto a idade
(p=0,56) entre os grupos e a maioria dos indivíduos era do sexo masculino, tanto HIV
quanto LV incidem mais frequentemente na população adulta. Não houve diferença
quanto a contagem de linfócitos T CD8 entre os grupos (p=0,23), porém houve
diferença quanto a contagem de linfócitos T CD4 (p<0,0001) e carga viral (p<0,0001)
(tabela 5). Três pessoas do grupo AIDS/LV apresentaram outras infecções
oportunistas concomitante ao quadro de LV, que foram: neurotoxoplasmose;
tuberculose pulmonar; e tuberculose miliar e pneumocistose.
40
Tabela 5 – Características demográficos e laboratoriais dos grupos
Grupo
Parâmetros
Idade, anos. p = 0,08
Sexo masculino, n, (%)
Células T CD4 (céls/mm3) a
p = 0,003
Células T CD8 (céls/mm3) b
p = 0,33
Carga do HIV (cópias/mL) c
p = 0,0006
Saudáveis (n=6) 35 (31-43) 3 (50) não mensurado não mensurado não mensurado*
HIV (n = 16) 42 (21-54) 7 (43,8) 512 (64-1153) 817 (284-3.226) <40 (<40-9452)
HIV/L. infantum (n = 10) 41 (29-62) 7 (70) 414 (105-747) 1.002 (316-3.992) <40 (<40-35.462)
AIDS/LV (n = 14) 40 (18-53) 12 (85,8) 85 (8-161) 737 (218-1.194) 193.021(<40-
7.000.000)
LV (n = 8) 30 (16-51) 7 (87,5) não mensurado não mensurado não mensurado*
n = número. Nota: dados estão demonstrados em mediana e valores mínimos e máximos; a = HIV x HIV/L. infantum (p>0.9); HIV x AIDS/LV (p < 0.0001); HIV/L.
infantum x AIDS/LV (p = 0.005); b = HIV x HIV/L. infantum (p >0.9); HIV x AIDS/LV (p = 0.71); HIV/L. infantum x AIDS/LV (p = 0.3); c = HIV x HIV/L. infantum (p >0,9);
HIV x AIDS/LV (p < 0.0001); HIV/L. infantum x AIDS/VL (p = 0.01); * teste rápido para HIV negativo
41
5.2.2 Avaliação dos marcadores de ativação, exaustão, anergia, senescência e regulação de linfócitos T CD4 e CD8
Pessoas do grupo AIDS/LV e do grupo LV tiveram uma maior expressão do
CD38HLA-DR nas células T CD4 (p=0,03), Figura 7A. Quanto aos linfócitos T CD8,
indivíduos dos grupos HIV/L. infantum, AIDS/LV e LV apresentaram uma maior
expressão de CD38HLA-DR do que os indivíduos do grupo HIV (p = 0,04 e p < 0,0001,
respectivamente), Figura 7B.
Figura 7 - Expressão de CD38HLA-DR em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). HIV/LI se refere ao grupo HIV/L. infantum. S corresponde ao grupo de indivíduos
saudáveis. Cada ponto representa um paciente e a barra representa a mediana dos
valores.
0
20
40
60
80
100
%CD3CD4CD38HLADR
HIV/LI AIDS/LVHIV LV
0.030.0010.002
S0
20
40
60
80
100
%CD3CD8CD38HLADR
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
0.00010.0002
< 0.00010.040.04
A B
42
Para avaliar se havia anergia dos linfócitos T CD4 e CD8 (Figura 8A e 8B,
respectivamente), a porcentagem de células expressando CTLA4 foi analisada e,
porém não há diferença entre os grupos.
Figura 8 - Expressão de CTLA4 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). HIV/LI
se refere ao grupo HIV/L. infantum. S corresponde ao grupo de indivíduos saudáveis.
Cada ponto representa um paciente e a barra representa a mediana dos valores.
Para avaliar a existência de exaustão, os linfócitos T CD4 e CD8 foram
marcados com anticorpos anti-PD1. Pessoas com AIDS-LV apresentaram maior
exaustão de linfócitos T CD4, havendo diferença significativa apenas com o grupo
saudável (Figura 9 A). Para a subpopulação de células TCD8, a maior expressão de
PD1 foi no grupo HIV/LI, e essa expressão foi diferente significativamente do
observado no grupo HIV (figura 9B).
%CD3CD4CTLA4
0
20
40
60
80
100
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
%CD3CD8CTLA4
0
10
20
30
40
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
A B
43
Figura 9 - Expressão de PD1 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). HIV/LI se
refere ao grupo HIV/L. infantum. S corresponde ao grupo de indivíduos saudáveis.
Cada ponto representa um paciente e a barra representa a mediana dos valores.
Na avaliação da senescência dos linfócitos T CD4 e CD8 (figure 10A e 10B,
respectivamente), os linfócitos foram marcados com anticorpo anti-CD57.
Observamos que não houve diferença entre os grupos para os linfócitos TCD4. Para
os linfócitos TCD8, foi observada uma maior expressão deste marcador em relação
aos linfócitos T CD4, além de que o grupo HIV/LI expressou níveis mais altos em
relação aos outros grupos e significativamente diferente do grupo HIV.
Figura 10 - Expressão de CD57 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). HIV/LI
se refere ao grupo HIV/L. infantum. S corresponde ao grupo de indivíduos saudáveis.
Cada ponto representa um paciente e a barra representa a mediana dos valores.
%CD3CD4PD1
0
10
20
30
40
50
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
0.01
%CD3CD8PD1
0
20
40
60
80
100
0.0090.00010.002
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
A B
%CD3CD4CD57
0
20
40
60
80
100
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
%CD3CD8CD57
0
20
40
60
80
100
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
0.01A B
44
Finalmente, para avaliar a regulação dos linfócitos T CD4 e CD8 (figura 11A e
11B, respectivamente), os linfócitos foram marcados com anticorpos anti-CD25 e anti-
FoxP3. Não observamos diferença entre os grupos quanto aos linfócitos T CD4, mas
houve uma expressão aumentada deste marcador nos linfócitos T CD8 do grupo
HIV/L. infantum, quando comparado com os outros grupos.
Figura 11 - Expressão de CD25FoxP3 em linfócitos T CD3CD4 (A) e CD3CD8 (B). HIV/LI se refere ao grupo HIV/L. infantum. S corresponde ao grupo de indivíduos
saudáveis. Cada ponto representa um paciente e a barra representa a mediana dos
valores.
A tabela abaixo (tabela 6) descreve os valores de mediana, mínimo e máximo
dos marcadores imunológicos já descritos.
%CD3CD4CD25FOXP3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS%CD3CD8CD25FOXP3
0
5
10
15 0.00070.020.002
HIV/LI AIDS/LVHIV LVS
BA
45
Tabela 6 – Dados de ativação, exaustão, anergia, senescência e regulação dos linfócitos T CD4 e T CD8
Parâmetros
Grupos
Saudável n=6
HIV n = 16
HIV/L. infantum n = 10
AIDS/LV n = 14
LV n = 8
p
%CD3CD4CD38HLADR 2,0 (0,8-13,7) 2,5 (0,8-17,7) 6,9 (3,3-15,8) 18,0 (0,7-86,2) 14,2 (0,85-31,7) <0,0001
%CD3CD8CD38HLADR 2,8 (0,54-3,58) 4,1 (2,1-25,1) 24,6 (6,7-50,4) 36,9 (14,7-96,9) 54,0 (2,0-65,0) <0,0001
%CD3CD4CTLA4 6,9 (0,26-62,1) 1,0 (0,03-92,0) 0,7 (0,2-17,9) 1,5 (0,04-37,3) 6,4 (0,7-42,8) 0,41
%CD3CD8CTLA4 0,7 (0-5,8) 0,3 (0,04-14,4) 0,7 (0,2-15,9) 0,4 (0,1-28,8) 3,4 (0,17-25,0) 0,27
%CD3CD4PD1 8,6 (3,9-12,9) 5,0 (0,2-15,4) 5,4 (1,3-21,4) 18,0 (0,4-40,2) 11,8 (0,73-45,9) 0,03
%CD3CD8PD1 0,04 (0-0,5) 2,5 (0,01-58,0) 42,6 (15,7-80,1) 21,4 (6,2-57,0) 15,1 (4,3-55,7) <0,0001
%CD3CD4CD57 12,8 (1,2-37) 4,0 (0,7-52,2) 15,7 (2,6-66,7) 10,8 (0,2-40,0) 5,8 (1,2-28,7) 0,17
%CD3CD8CD57 39,4(15,9-60,1) 39,1 (17,1-69,6) 62,8 (42,6-88,0) 54,6 (21,3-72,4) 49,7(11,1-59,1) 0,02
%CD3CD4CD25FoxP3 0,07 (0,01-1,4) 0,42 (0,03-0,65) 0,1 (0,04-1,5) 0,09 (0-1,0) 0,09(0-0,62) 0,38
%CD3CD8CD25FoxP3 0,10 (0-0,8) 0,25 (0,04-9,9) 4,0 (1,6 – 12,4) 0,12 (0 – 3,9) 0,11 (0,02-0,39) 0,0002
n = número de pacientes avaliados. Nota: os dados estão em valores de mediana e valores mínimo e máximo
46
6. DISCUSSÃO
Infecção assintomática por L. infantum é comum em áreas endêmicas para LV
e a maioria das pessoas infectadas são capazes de controlar a infecção e não
desenvolver LV (5, 6, 129). Entretanto, lacunas existem quanto a condução dos casos
assintomáticos, quando há a presença de comorbidades imunossupressoras, como é
a infecção por HIV. Neste estudo foi observado que 23,6% (n=268) das pessoas HIV+
apresentavam infecção por Leishmania, mensurada pela presença de anticorpos anti-
leishmania. Essa frequência foi maior do que a observada para pessoas sem HIV,
residentes na mesma área endêmica, que apresentaram uma infecção por
Leishmania de 14,8% (Coutinho et al, 2016, dados não publicados). É conhecido que
a prevalência de infecção por Leishmania pode variar, de ano para ano, dependendo
de vários outros fatores, incluindo ambientais. Em uma área endêmica para LV, como
o estado do Rio Grande do Norte (32), a soroprevalência desta infecção varia ao longo
dos anos de 3-8%. Onde a incidência cumulativa da infecção assintomática medida
pelo teste de Montenegro pode ser tão alta quanto 49.4% (5, 6).
Dos 268 indivíduos HIV+ infectados por L. infantum, 2 evoluíram para o status
AIDS/LV e ambos morreram desta doença. Observamos também uma taxa de óbito
de 28% no grupo AIDS/LV neste mesmo período (dados não mostrados). Apesar da
introdução da TARV altamente efetiva ter levado ao aumento da sobrevida dos
pacientes infectados pelo HIV, estudos tem mostrado uma recuperação apenas
parcial do status imunológico destas pessoas (130, 131) e por conseguinte, isto
poderia resultar em desenvolvimento de LV. Neste estudo, tanto indivíduos com
AIDS/LV quanto indivíduos coinfectados assintomáticos HIV/L. infantum
apresentaram níveis de anticorpos consideravelmente mais baixos do que indivíduos
com LV, alguns sem produção alguma de anticorpos, demonstrando o déficit
imunológico provocado pela simples presença do HIV.
Sabe-se que a ativação imune de linfócitos T medida pela expressão de HLA-
DR e CD38 permanece alta entre os indivíduos positivos para o HIV mesmo após 1
ano de TARV (132). Como já mencionado, Casado et col. (13), demonstrou que LV
prévia em indivíduos infectados pelo HIV é uma causa independente de níveis
persistentemente altos de ativação imune, imunosenescência, inflamação e
translocação microbiana comparado com outros indivíduos positivos para o HIV,
apesar de uma TARV efetiva e cargas virais indetectáveis por no mínimo 1 ano. Por
conseguinte, para analisar se a infecção por L. infantum poderia alterar a resposta
47
imune, nós comparamos a expressão de CD38HLA-DR em linfócitos T CD4 e CD8 de
pessoas com LV, HIV, AIDS/LV, coinfecção assintomática por HIV/L. Infantum e
indivíduos saudáveis. Conforme já conhecido, indivíduos HIV+ exibiram ativação de
linfócitos T, e pacientes AIDS/LV e LV apresentaram uma ativação ainda maior.
Surpreendentemente, indivíduos com a coinfecção assintomática HIV/L. infantum
tiveram a ativação de linfócitos T similar ao grupo AIDS/LV e LV. Então, apesar da
contagem de linfócitos T CD8 não diferir entre o grupo HIV e HIV/L. infantum, o status
imunológico do indivíduo coinfectado assintomático é similar aos dos indivíduos com
LV.
Um estudo de Hunt et col. em pacientes HIV+ mostrou que mesmo com
supressão da carga viral pela TARV, a frequência de células T CD8 ativadas
(CD38HLADR) predisse um aumento de mortalidade (133). E um estudo recente feito
por Cannizzo et col. mostrou que pacientes positivos para o HIV sem receber TARV
apresentavam uma maior ativação de células T CD8 (CD8CD38) e que em indivíduos
em uso de TARV, esta ativação estava reduzida mas níveis altos ainda eram vistos
em comparação com controles saudáveis (134). Nossa população de coinfectados,
mesmo sem expressão de LV, se comportou, em parte, em termos da resposta imune
como pacientes AIDS/LV e LV.
Indivíduos com LV apresentam uma imunossupressão induzida pela
leishmania e que é revertida dentro de meses após o sucesso do tratamento (135,
136). Esta anergia na LV pode ser devida em parte à expressão de CLTA4 (Rodrigues-
Neto, 2017 aceito), em resposta a exposição de Leishmania. Neste presente estudo,
não foi observado aumento da expressão de CTLA4, possivelmente, devido as células
não terem sido estimuladas com antígenos de Leishmania.
O marcador PD1 tem sido previamente identificado na superfície de linfócitos
T CD8 em exaustão. Um estudo de Day et col. (137), quando avaliando um grupo de
71 indivíduos HIV+, mostrou que a expressão de PD1 em linfócitos T CD8 se
correlacionou positivamente com valores de carga viral. Confirmando que altos níveis
de antígenos virais na infecção crônica pelo HIV estão associadas com expressão
aumentada de PD1 em linfócitos T CD8. Nosso estudo mostrou que em relação aos
parâmetros avaliados, a expressão deste marcador é alta. Tem sido visto que ativação
imune desencadeada pelo HIV leva a um aumento de expressão de células Treg com
ativação de vias contra-regulatórias, incluindo produção aumentada de IL-10 e
aumento na expressão de PD1 nos linfócitos T (138, 139). Entretanto, L. infantum
48
isoladamente pode induzir aumento da expressão de PD1 na LV (140).
Quando avaliamos a senescência de linfócitos T CD4 e CD8, observamos que
não houve diferença entre os grupos, mas uma expressão aumentada deste marcador
foi vista nos linfócitos T CD8. CD57 é um marcador de maturação de células T CD8
em indivíduos HIV+ (141) e uma forte correlação tem sido vista entre a expressão
deste marcador e supressão da replicação viral mediada por linfócitos T CD8 (142).
Somado a isso, Casado et col. observou uma maior expressão deste marcador em
indivíduos com passado de LV, TARV por 1 ano e carga viral indetectável,
comparados com indivíduos com CD4 abaixo de 200 células/mm3 , TARV por um ano
e carga viral indetectável porém sem passado de LV (13). Então, mesmo com 50%
do grupo HIV/L. infantum ter carga viral indetectável, existiu expressão de CD57 nos
linfócitos T CD8. Como o grupo LV também apresentou uma alta expressão de CD57,
é possível que a leishmania atue como um estimulador desta via.
Por fim, ao avaliar a expressão de CD25FoxP3, observamos expressão em
linfócitos T CD4 sem diferença entre os grupos, justificada pela presença do HIV e da
L. infantum nos grupos, estimulando a resposta T regulatória (143, 144). Porém uma
expressão aumentada deste marcador foi vista nos linfócitos T CD8 do grupo HIV/L.
infantum. Em humanos, as células Treg (CD4+) suprimem respostas direcionadas a
patógenos, incluindo o próprio HIV. Não se sabe ainda ao certo qual a importância da
expressão de FoxP3 em células T CD8. Estudos tem mostrado um aumento na
expressão deste marcador nos linfócitos T CD8 em indivíduos HIV+ com doença
avançada e em indivíduos progressores rápidos, caracterizados por uma resposta T
CD8 pobre em relação ao HIV (145). Pacientes imunodeprimidos mostram uma
marcada redistribuição na expressão deste marcador, com uma diminuição nos
linfócitos T CD4 e aumento nos linfócitos T CD8 (143). Observamos uma maior
marcação de T CD8 apenas no grupo HIV/L. infantum. Uma possível justificativa para
tal achado, seria o fato de que a presença da infecção pelo L. infantum desencadearia
uma resposta inflamatória, estimulando a produção de uma resposta contra-
regulatória. O mesmo não sendo observado no grupo AIDS/LV e LV devido a uma
intensa imunossupressão, potencialmente devido a uma perda das células
progenitoras, resultando em perda do repertório linfocitário. Uma outra hipótese para
o nosso achado seria a de que progressores rápidos se relacionam com o nosso grupo
HIV/L. infantum pela presença de um patógeno circulante. Naquele grupo seria alta
carga viral e neste grupo seria a presença da leishmania.
49
7. CONCLUSÕES
1. A frequência de infecção assintomática pelo L. infantum em pessoas HIV+ em
área endêmica para leishmaniose é alta.
2. Pessoas HIV+ com infecção assintomática por L. infantum apresentam uma
baixa expressão de anticorpos anti-Leishmania, similar ao grupo AIDS/LV e
inferior ao grupo LV, demonstrando assim um déficit imunológico já instalado.
3. Pessoas infectados pela L. infantum, mesmo sem passado de LV, mostram
uma maior ativação de linfócitos T CD8.
4. O padrão de anergia e exaustão de linfócitos T CD4 e CD8 em pessoas com a
coinfecção AIDS/LV pode justificar as várias recaídas vistas nestes pacientes.
5. O padrão de ativação, exaustão, senescência e expressão de FoxP3 em
linfócitos TCD8 do grupo HIV/L. Infantum aponta para a necessidade de um
olhar clínico diferenciado neste grupo de indivíduos.
50
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![Celulas do sistema imunológico[1]](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/559f6f211a28ab21068b4699/celulas-do-sistema-imunologico1-55a145c606691.jpg)
