PERMcABlLlTi MEMBRANAIRE ET R&ISTA CE AUX ANTIBIOTIQUES CHEZ LE BACTiRlES A GRAM NiGATIF

Jean-Marie Pages a,*, Eric Garnotel b

RBsum6

Un des facteurs cl&s intervenant dans I’activit6 antibactkienne des

antibiotiques est la concentration intracellulaire atteinte sur la cible.

Chez les batteries g Gram nbgatif, I’enveloppe comprend la mem-

brane externe et la membrane cytoplasmique ; la permkabilit6 de

ces deux structures joue un r6le majeur dans la sensibilitk Elle

peut en effet moduler la diffusion (passive) de I’antibiotique lors de

son entree, et reguler son expulsion (active). Les porines sit&es

dans la membrane externe et les pompes d’efflux qui forment Ides

complexes protkiques intra- et intermembranaires sont parmi les

voies principales de ce transport. Les Bv6nements gknetiques et

biochimiques qui conkBlent I’expression fonctionnelle de ces divers

canaux membranaires sont des questions importantes de la physio-

logie bactbrienne ; plusieurs de ces mecanismes cellulaires sont

impliquk en clinique, dans la manifestation et le niveau de r&is-

tance aux antibiotiques.

Bact&ie Gram nhgatif - rksistance aux antibiotiques -

porines - pompe tl’offlux.

Summary

Intracellular concentration of active antibiotic molecules reaching the

target is a key factor for the expression of antimicrobial activity. The

envelope of gra,m-negative bacteria includes the outer membrane

and the cytoplasmic (inner) membrane ; the permeability of both

structures plays a major role in bacterial susceptibility to antibiotics.

The permeabili(v can modulate antibiotic entry by regulating passive

diffusion process and can also control active transport (expulsion)

of the antibiotic. The outer membrane porins and the effux pumps

that form intra- and intermembrane complexes are the main mecha-

nisms involved in drug transport. Genetic and biochemical events

that control the functional expression of these various membrane

channels have large consequences on the bacterial physiology ; in clinical practice, many of these cellular mechanisms are involved

in the expression and /evei of antibiotic resistance.

Gram-negative bacteria - antibiotic resistance - porins -

efflux pump.

a EA2197-Enveloppe bact&ienne, perm&abiiit& et antibiotiques Facult6 de m6decine 27, bd Jean-Moulin 13385 Marseille cedex 05

b Service de biologie HBpital d’lnstruction des Armees Laveran 13998 Marseille Armkes

??Correspondance Jean-Marie.Pages@medecine.univ-mrs.fr

article recu et accept6 se 26 mars 2003.

0 Elsevier, Paris.

Revue Francake des Laboratoires. aw 2003, N” 352

1, --~

C hez les bactkies B Gram nbgatif, i’enveloppe comprend deux membranes, la membrane externe et la membrane cytoplasmique

ou interne (figure 7). Elles constituent a la fois une barri&e de pro- tection contre les agents toxiques presents dans le milieu, et une struc- ture complexe qui contient divers mkanismes protbiques assurant le transport d’&ments indispensables B la survie et & la croissance bac- t&ienne. Cactivitb des diverses familles d’antibiotiques est fortement dependante de ces mkanismes de transport membranaire, puisqu’ils interviennent en modulant la concentration intracellulaire de la molk- cule antibactkienne. Avec l’emergence d’une rksistance croissante aux antibiotiques [19] et la disskmination de souches MDR (muitidrug resistance, resistantes a plusieurs types d’antibiotiques), la connais- sance des mkcanismes qui sont impliqu6.s dans la physiologie mem- branaire est devenue un enjeu crucial. La caractkisation des bases mokulaires, gknktiques, biochimiques et structurales des systbmes de transport membranaire associk B ces mkcanismes de ksistance est maintenant indispensable. Ces connaissances permettront : - d’blaborer de nouvelles m&hodes de diagnostic et d’identification des mkcanismes de resistance ; - d’entreprendre la recherche d’alternatives thkapeutiques face aux r&istances.

2,’ L Vembrane exterre et ~3c~‘i-w

La membrane externe des bactkies & Gram nkgatif (figure 1) est constitu6e de phospholipides, de lipopolysaccharide (LPS) et de pro- t6ines [33]. Elle protege la bacterie contre des agressions physiques telles qu’un choc mkanique ou une variation de tempkrature, chi- miques comme les sels biliaires, les acides ou les antibiotiques, et bio- logiques telles que les dbfensines, les bactkiocines ou les anticorps. La membrane externe, avec le LPS et les phospholipides, est ainsi le premier obstacle aux mokules hydrophiles chargbes devant pi?&- trer la bact&ie pour la d&ruire. De la mBme mankre, la densit des sucres et des chaines latitrales du LPS organise un filtre efficace pour les autres mokules. Plusieurs revues documentees dkrivent le rBle

de ces structures membranaires [l, 12, 31, 341.

Chez les bactkies B Gram nkgatif, une classe de protbines mem- branaires particuli&es, les porines, organise des canaux membranaires capables d’assurer la p&&ration des nutriments. Ces systkmes de transport passif (qui ne nkessite pas une source d’bnergie) consti- tuent une grande famille de protbines de la membrane externe : OmpF.

OmpC, OmpD, PhoE, LamB, OmpA, OmpK36 et Omp36, dkrites chez Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes.

Salmonella typhimurium [I 2, 17,34,42, 431. Cette superfamille des porines prbsente une certaine conservation dans leur sequence pro-

tbique, et notamment pour les regions intramembranaires I> 5, 441.

57

Rksistance aux antibiotiques : aspects techniques

MILIEU EXTRACELLULAIRE

ME

PE

Ml

CYTOPLASME

MI : membrane interne ; PE : espace pkplasmique ; ME : membrane externe ; ipp : lipoprot&x ; LPS : lipcpolysaccharide ; PL : phospholipides ; PG : peptldoglycane ; OmpF : porine OmpF ; OmpA : protkine OmpA ; P : proteines ; PLP : prot6ines de liaison aux p6nicillines. MBcanisme d’efflux : pompe, AcrB ; fusion, AcrA ; canal, TolC.

Les parametres physicochimiques et electrophysiologiques des divers canaux ont ete determines par differentes methodes : gonflement des

liposomes, mesures d’accumulation d’un sub&rat radiomarque ou fluo- rescent, bicouches lipidiques (membrane artificielle), ou plus recem-

ment patch clamp des liposomes [91.

Les travaux realises par differentes equipes utilisant ces diverses

approches sur les porines purifiees ont permis de definir trois types de canaux localises dans la membrane externe : - des porines non specifiques, avec OmpF comme representant et

comprenant OmpC, OmpF, OmpD, 0mpK36 et Omp36 ; - des porines plus selectives, impliquees dans la diffusion de sucres

ou de metaux, comme LamB pour le saccharose, ScrY ou FhuA ; - des proteines qui forment des canaux pour I’entree ou la sortie de

diverses molecules, telles que TolC pour I’hemolysine ou les antibio- tiques, OmpA.

Dans le cas des porines non specifiques telles que OmpF ou OmpC, on peut iilustrer la topologie de la proteine a partir des donnees structurales (figufe 2). Le tonneau en feuillets /3 antiparalleles est for-

tement ins&e dans la membrane externe et menage un canal hydrophile avec une region de restriction sit&e a mi-hauteur. Cette constriction organise un champ electrostatique avec deux

croissants, l’un de charge negative (venant de la boucle 3) et I’autre de charge positive (venant des acides amines de la paroi) ; cette structure du canal definit la selectivite et la conductance (cc porosite )>)

de la porine.

En clinique, les etudes extensives realisees sur divers isolats des genres

Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas ou Serratia, ont ainsi

montre que la chute d’expression des porines, associee a la produc-

tion d’enzymes, est un element cle dans la resistance aux p-lactamines.

D’un autre c&e, le role des porines dans la sensibilite aux fluoroqui-

nolones a Bte etabli ; par exemple, chez Enterobacter cloacae, le type

de porine produit, F, est associe au niveau de sensibilite a cette classe

d’antibiotiques [4].

Chez Pseudomonas aeruginosa, les etudes realisees sur la poke D

ont clairement montre le lien entre la sensibilite a l’imipeneme et I’ex-

pression de cette proteine [36,46]. Par ailleurs, les dipeptides, substrat

nature1 de ce canal, sont capables de modifier le niveau de sensibilite

a ce carbapeneme [47]. Cexistence de porines qui seraient directement

associees a la penetration d’une classe particuliere d’antibiotiques nest

pas demontree chez les enterobacteries. II semble que les capacites

de permeabilite membranaire, plus elevees chez E. co/i, K. ,oneumoniae

et E. aerogenes, et les parametres physicochimiques des pokes pro-

duites chez les batteries n’aient pas amene I’intervention d’une porine

speciale pour le transport de molecules de p-lactamines particulieres,

a I’oppose de ce qui se produit chez F1 aeruginosa.

Ces donnees sont a rapprocher des resultats acquis dans le domaine

de la permeabilite membranaire comparee chez E. co/i, P. aeruginosa

et les mycobacteries [20].

Revue Franqaw des Laboraroires, avril 2003 No 352

II est admis que la diminution de synthese des porines joue un role dans la resistance [12, 31 I ; la mise en place de la barriere enzyma- tique vient completer efficacement cette impermeabilite, comme cela est rapporte dans de nombreux cas. La principale question demeure le mecanisme de controle responsable de la disparition des porines. Recemment, la regulation rapide et efficace de I’expression de la porine d’f. aerogenes a ete mantree chez un patient colonise soumis a un traitement par I’imipenbme ; la prescription du carbapeneme amene la disparition de la porine et une resistance par impermeabilite, alors que I’arret du traitement cause sa @apparition chez la bacterie rede- venue sensible [:2]. Chez plusieurs batteries, la regulation negative fait intervenir I’operon mar qwi via micf destabilise I’acide ribonucleique messager (ARNm) de la porine [22], et ce conjointement a I’expres- sion des pornpets d’efflux [l, 61. De meme, le systeme ompR-envZqui module la synthese des porines OmpC-OmpF chez E. co/i [28, 291, pourrait aussi jouer un role chez des isolats resistants. Par ailleurs, la production de la protelne OmpX est associee a une chute d’expres- sion des porines chez E. co/i, E. aerogenes, E. c/oacae et K pneu- moniae par un mecanisme inconnu ace jour. D’autres processus fai- sant intervenir des cascades de regulation genetique (via so,&, ramA, IHF) sont aussi associes a la diminution de la synthese des porines. A tote de ces mecanismes lies a la regulation genetique, I’influence de facteurs structuraux associes, comme le role du LPS dans I’as- semblage membranaire, les chaperons, le transport et I’insertion, peu- vent avoir un effet determinant sur la quantite de porines presente dans la membrane. Les facteurs externes (pH, osmolarite, source de car- bone, concentration en 0,) peuvent aussi intervenir en fonction du site de colonisation ou du traitement, et ainsi moduler la synthese de represseurs inhibant I’expression de la porine.

Plusieurs equipes ont decrit des souches cliniques d’enterobacte- ries qui presentent un profil similaire a celui d’un phenotype d’im- permeabilite avec une synthese normale de porines. La premiere ana- lyse d’un isolat d’E. aerogenes de ce type en 1998 1231 a permis de caracteriser les bases moleculaires de ce mecanisme de resis- tance original : l’s remplacement d’un residu de glycine par un aspar- tique dans la boucle 3 irlduit le retrecissement du canal et I’altera- tion du champ electrostatique [8]. Chez Neisseria gonorrhoeae, des cas similaires ont ete decrits avec des mutations identiques dans l’equivalent de la boucle 3 des porines ; la participation d’un sys- teme d’efflux appara’it necessaire dans ce cas afin de completer la resistance aux fl-lactamines [48]. Par ailleurs, il est interessant de mentionner I’existence d’un residu Tyr supplementaire dans la region interne du canal de 0mpK37 de K pneumoniae : ce residu tree une restriction de la taille du canal via sa chaine laterale, qui, rejetee dans le lumen, ralentit la penetration des p-lactamines [lo]. Ainsi, la bac- terie pourrait exprimer une porine naturellement inefficace pour la diffusion de certains antibiotiques. Ces observations posent le pro- bleme de la selection possible de souches produisant des porines modifiees sous I’effet d’une pression antibiotique, ceci a c&e de bac- teries depourwes de porines.

Avec la resoluti~on de la structure 3D du canal de certaines porines et I’identification d’acldes amines impliques dans le canal [161, de nouvelles notions (champ electrostatique, interaction electrostatique), ont emerge afin d’elucider les facteurs impliques dans la diffusion de la molecule clans le canal. La localisation des charges sur la mole- cule d’antibiotique devient aussi un parametre cle du dialogue entre les deux partenaires. Nestorovich et al. [30] font ainsi intervenir les residus de la zone de constriction de la porine OmpF (Glu, Arg) et les charges de i’ampicilline lors du transit dans le canal. Les etudes

realisees par les memes auteurs ont montre que la presence d’un antibiotique genere des modifications des caracteristiques physi-

cochimiques du pore QmpF.

Revue Fran&e de!; Laboratoires, av7il 2003, N” 352

MILIEU EXTERIENR

domaines exposds k la surface

domaine membranairc (membrane externe)

r&ion p6riplasmique

ESPACE PERIPLASMIQUE

Les dimensions des diffkrentes r&gions du canal, embouchure, restriction, et

d6bouch6 dans le p&iplasme sent identiques sur le dessin ; en partie droite sont illustrks la topologie et les divers domaines de la poke, expos&s B la surface, ink% gr&s dans la membrane, CJU du c&k pkriplasmique.

La description de souches cliniques produisant des porines modifiees

donne un nouvel eclairage sur le role des charges portees par I’anti- biotique et celles appartenant au acides amines situ& dans le pore.

Ces observations et les resultats r&cents etablissent les bases mole-

culaires du transport des antibiotiques, et par la ouvrent des pers- pectives sur le design des nouvelles molecules.

3:‘. Ef3ux et rf5sistance

Les systemes d’efflux actifs (dependants de l’energie) son: des meca-

nismes de transport membranaire presents dans toutes les cellules euca- ryotes ou procaryotes. La fonction essentielle de ces systemes est iden-

tique malgre leur diversite structurale et leur source d’energie ; ils s’opposent a I’accumulation intracellulaire de divers substrats : metaux lourds, antibiotiques, composes aromatiques, detergents, etc. [37].

Canalyse des genomes a montre la large redondance des genes codant pour des systemes d’efflux potentiels ; chez E. co/i, il existe 37 pompes distinctes [35]. Toutefois, il semble qu’un petit nombre seu- lement de ces systemes soit actif, ou que les conditions de leur expres-

sion ne soient pas connues a ce jour. A partir de I’analyse des sequences et de I’activite de ces pompes, cinq grandes familles ont ete constituees [38, 401 : - ABC (AT? binding cassette) transporteurs ; - RND (resistance nodulation celi division) ;

- MFS (ma,ior facilitator superfamily) ;

- SMR (small multidrug resistance) ;

- MATE (multiantimicrobial extrusion).

59

Rksistance aux antibiotiques : aspects techniques

EFFLUX IMPERMiABILiTE

Dans la cascade de rkgulation, I’activation est pr&ente en noir avec f, la kpres- sion est symtjoli&e en grise avec -. Cactivation de la pompe se traduit par I’ex- puision des antibiotiques, et la repression de la synthese des porines am&ne le phenotype impermeable (pour les p-lactamines, par exemple).

Un transport (antiport) de proton a BtB decrit pour RND, MFS et SMR, d’ion Na+ pour MATE, et une hydrolyse de I’ATP pour ABC ; ces el& ments fournissent I’(?nergie au systi3me.

Ce processus, qui induit une modification de la sensibilite aux anti- biotiques, fait intervenir au moins deux criteres : - la mobiiisation d’une pompe et I’organisation d’un canal trans- membranaire qui expulse l’agent toxique ;

- le niveau d’expression (constitutif, inductible) des complexes d’ef- flux.

Chez les bactbries & Gram nbgatif qui possedent une enveloppe com- plexe, on rencontre un systbme tripartite comprenant : - une protbine ins&&e dans la membrane cytoplasmique qui fournit I’t?nergie au transport ; - une lipoprot&ne p&iplasmique qui assume la liaison/fusion avec

- ie canal protbique dans la membrane externe lib&ant la mol&ule dans le milieu (figure 7).

Ce systbme B trois composants prothiques, comme par exemple MexABlOprM de /? aeruginosa ou AcrABlTolC d’E. co/i, montre une organisation complexe 1381. Dans le cas de la pompe AcrAB/TolC 118, 291, les riicentes analyses de structure 3D par cristallographie indi- quent une organisation en trim&e de la pompe AcrAB associ&e B un homotrim&e TolC generant le canal externe (figure I). Cassociation fonctionneile des composants se produit par des domaines sp&i- fiques, tels que les boucles p&iplasmiques chez AcrAB ; la fixation du substrat transport6 sur des sites donn&s induirait un changement de conformation qui libererait I’antibiotique a I’extbrieur en empruntant ie canal TolC.

Fe transporteur AcrB ou MexB est une proteine de 100-l 30 kDa avec une douzaine d’hblices a qui assurent I’insertion dans la membrane cytoplasmique. La proteine de liaison intermembranaire AcrA ou MexA, une lipoproteine d’enviror; 40 kDa, traverse le p&iplasme et couple

le transfert 8. une proteine de la membrane externe qui lib&e la drogue & I’ext&ieur. Le dernier composant, TolC ou OprM, d’une taille d’en- viron 50 kDa, constitue le canal externe ; la structure montre une orga- nisation en feuillets p organisant un tonneau p homotrim&ique conte- nant un seul canal pour le transport des solut8s. La figure 7 est une illustration de la pompe AcrABITolC chez f. co/i.

Un tel mecanisme d’efflux est identifib chez de nombreux isolats cli- niques et prend en charge des classes d’antibiotiques ayant une structure aussi diverse que celles des t&acyclines, des quinolones, des ph&icol&s ; certaines P-lactamines pourraient stre prises en charge a la surface de la membrane cytoplasmique en fonction de leur degr& d’hydrophobie [32, 341. Un m&me mbcanisme (parfois la m&me pompe) assure aussi la resistance B I’egard des polymyxines, des macrolides et des peptides antimicrobiens. II est ainsi plus facile de parler des diffbrents transporteurs plutBt que de reelles specifici- t&s pour le substrat. Diffbrents inhibiteurs sont d&rits [5, 21, 24 1 : carbonylcyanide m-chloroph&ylhydrazone (CCCP), ph6nylala- nine-arginine-P-naphtylamide, pyridoquinolines. II est interessant de noter que I’effet de ces inhibiteurs est pl&iotropique, et qu’il restaure une activitb pour diffbrentes familles d’antibiotiques. Certains d’entre eux peuvent ainsi inhiber I’activite de differentes pompes d’efflux, comme cela a Bti! montrb avec le ph&ylalanine-arginine-p- naphtylamide chez P. aeruginosa [21]. Toutefois, leur utilisation est contraignante et difficile & mettre en ceuvre en clinique, Btant donnb leur toxicit et les contre-indications, leur durbe de vie et les faibles informations disponibles actuellement sur leur activitb (site et affinitb).

La regulation du processus est plus ou moins bien d&rite suivant le systeme d’efflux impliqu& ; le mieux document6 actuellement est le rbgulon mar BtudiB intensivement par diverses Bquipes [l , 6, 71. Corganisation gitnique (figure 3) du locus montre trois genes trans- crits dans le m&me sens (marR, A, B) et un de sens oppose (marCI. Le rbpresseur, code par marR, reprime de mani&re constitutive I’ex- pression de I’op&on en se fixant sur le site opbrateur 0 et bloque la transcription. Plusieurs mutations dans le gene marR induisent son inactivation et amenent I’expression de I’op&on et de la resistance, par exemple dans le cas des isolats d’E. co/i resistants aux quino- lones [25]. Certains inducteurs tels que le salicylate peuvent dbpla- cer la proteine MarR et ainsi libitrer I’op&on du blocage [7, 261. Une fois la lecture engagee, MarA est synth&is& Ce regulateur (marA) est I’activateur du systeme ; il possede le motif h&ice-boucle-hblice (helix-turn-helix), caracteristique des protbines affines pour I’acide d&soxyribonucl&ique (ADN). II induit la transcription de I’op&on mar ainsi que d’autres loci dans lesquels des sites mar (mar box) ont Bt& decrits ; on trouve ainsi les genes de pompes d’efflux (acrAB) ou de rbponse au stress (fpr). II faut mentionner qu’il existe une conservation Blevee entre divers rbgulateurs decrivant une famille des homologues MarA distribues parmi les batteries [l 1, 271.

De tr&s fortes homologies ont &t8 d&rites entre les protbines MarA d’E. co/i, de S. typhimurium et de K pneumoniae, ce qui reflbte une stra- tbgie conservbe dans le contr6le de I’efflux. Une d’entre elles coordonne, via marA, I’expulsion des drogues et inhibe la synthese des porines [I]. Chez E. co/i et E. aerogenes, on observe deux effets de MarA : - activation du mbcanisme d’efflux via AcrAB/TolC ; - diminution de la synthese des porines via la production de micF et OmpX.

Cette cascade g&&ique assure une protection par impermBabilit6 (blactamines ou certaines quinolones) et par expulsion @tracyclines, quinolones). Cefficaciti! des m&anismes mis en jeu explique la des- cription d’isolats cliniques ayant un large spectre de rbsistance, conci- liant I’imperm&abilit8, I’efflux ou la presence d’une &phalosporiqase

66 Revue Fran~a~se des iaboratwes, av:i! 2003. N” 352

’ E. co/i Porine +

E. coii Porine -

i E. aerogenes Porine +

’ f. aerogenes Porine -

K. pneumoniae Porine +

0,06 0,03 0x1

1 1 0,25/0,5

1 1 0,5/l

32164 16164 41%

0,l 0,25 0,l IO,25

K. pneumoniae Poke - 8 >4 0,511

Mesures de la CMI de quelques p-lactamines chez diverses ent&obact&ries synth&isant ou non les porines.

/ 6% aerogenes 256 512 16 I ’ E. aerogenes + 64 64 075

E. aerogenes / efflux - - 16 32 < 0,25

16 32 512

Mesures de la CMI de divers antibiotiques en pr&sence d’inhibiteurs d’efflux ou dans une souche d’fnterobacteer

aerogenes dGt6e des composants du syst&me d’efflux (AU-TOI).

d&prim8e. En suppkment B ces facteurs, la bactkrie peut p&en- ter des mutations dans les cibles ou, par acquisition de cassettes d’&- ments mobiles, synthbtiser diverses enzymes de detoxification (a&- tylase, transfkrase).

II est intkressant de noter que ia modification de la permbabilitk mem- branaire reprbsente uln Bvknement important dans la rksistance bac- tkrienne aux antibiotiques [13, 31 j. Cimpact, soit de la disparition des porines, soit de I’expression d’un mkcanisme d’efflux, se traduit par une augmentation notable des CMI mesurees chez des isolats cliniques (tableaux I, II). Si B cette modification vient s’ajouter un autre m&a- nisme, production d’enzyme ou si?lection de mutations, une multi& sistance A des niveaux Blew% est rapidement atteinte.

Le tableau / montre que l’activit8 des fi-lactamines est modifike par la disparition des porines chez les ent&obact&ies BtudiBes. Cefficacitb de p&+tration de I’antibiotique est fortement alt&r&e, d’oti une reduction de 10 k 15 fois de la vitesse d’augmentation de la concentration de I’antibiotique dans la bacterie dbpourvue de porines (figure 4). La quantitb rbduite de P-lactamines internalisbe peut i%re dkgra.dke par les enzymes pitriplasmiques, mais aussi induire une synthese de c&phalosporinase inductible [231. Par ailleurs, la biodlsponibilit& de l’antibiotique sur le site infectieux, associke A des dkfauts de p&&ration, peut favoriser I’acquisition

bacth-ie d6pourvue de porine __*.._.4--* _Is-e--

I I I 1 50 100 150 200

Temps (secondes)

Cinetique de p&&ration d’une p-lactamine dans une ent6robactkrie synthbti-

sant la porine majoritaire (trait plein) OL! d&pourvue de porine (trait pointilk).

Revue Francaise des Laboratows. avrii 2003. N” 352 61

RBsistance aux antibiotiques : aspects techniques

bad&rie sensible

/F

/ e , + inhibiteur

/

* I

J I I ___-m-m- ._.__I--*-.--

_.-e.- _*_____------- _,I- bact&rie expritnant

_.-- un q&me d’efflux I I I

300 400

Temps (secondes)

600

lnhibiteur et concentration intracellulaire de i’antibiotique. Les concentrations intra- cellulairesd’un antibiotique correspondent a lasituation obtenue avec une bac- tene sensible (trait fin), une bactke exprimant le systeme d’efflux (trait pointill4, et la m&e bacterie en pr&ence d’un inhibiteur additionnb au temps indique par la flG.che (trait pointilk? Bpais).

de mecanismes de resistance par transfert genetique (plasmides, transposons).

Une etude portant sur 45 souches d’Enterobacter aerogenes pos- sedant une resistance elevee aux cephalosporines a montre qu’envi- ron 40 % d’entre elles presentaient un defaut de porine (disparition ou chute significative de I’expression) associe a la barriere enzyma- tique 133.

Le probleme cl& est la rapidite d’adaptation de la bacterie en presence de I’antibiotique. Apres quelques jours de culture en presence d’imi- pet&me, des batteries avec une production tres reduite de porines sont selection&es [2]. Si le stimulus disparait de I’environnement, la porine est a nouveau synthetisee. Dans ce cas, la regulation ferait inter- venir micFet peut-etre des regulateurs de type ompR-envZou I’ope- ron mar, voire des elements inconnus ace jour. Cette adaptabilite nest pas reservee a Enterobacter et, &ant donne la conservation au niveau genetique des cascades de regulation, les enterobacteries ont cer- tainement la capacite d’apporter le meme type de reponse sous la m&me pression d’antibiotique [22]. La mise au point de sondes gene- tiques permettra d’evaluer I’existence de represseurs/activateurs dans ces batteries, et ainsi de suivre I’evolution des isolats en situation cli- nique sous la pression antibiotique.

Un autre point concerne la production de molecules qui peuvent induire un encombrement des porines a I’origine d’une impermeabilite. Un exemple recent est la protection apportee par les polyamines. A pH acide, E colisecrete la cadaverine qui, en obstruant la porine OmpC, protege

la bacterie contre le choc de pH [41]. Les polyamines peuvent aussi blo- quer la penetration des antibiotiques [41]. La synthese de ce type d’agents bloquants peut aussi intervenir in vivo dans un site de coloni- sation et conferer une resistance efficace, sans alterer les caracteris- tiques genetiques et biochimiques de la bacterie isolee.

En ce qui concerne I’efflux, son role dans la resistance multiple peut etre mis en evidence, soit en inactivant les genes codant pour les differents composes, soit en utilisant des inhibiteurs de la pompe. Le tableau II

indique les resultats concernant differents isolats cliniques. Les diffe- rences obtenues entre les CMI sont fortement significatives, et montrent I’impact des pompes d’efflux dans la resistance concernant des mole- cules structuralement differentes, comme les fluoroquinolones, le chlo- ramphenicol et la tetracycline. II faut toutefois mentionner que, dans les deux cas, destruction ou inhibition des pompes, on ne restaure pas com- pletement la sensibilite, car les mecanismes additionnels, impermeabi- lite, enzymes ou mutation, demeurent actifs.

La f;gure 5 illustre la concentration intracellulaire d’un antibiotique pris en charge par les pompes d’efflux selon que la bacterie exprime ou non le mecanisme, ou en presence d’un inhibiteur. La concentration intra- bacterienne d’antibiotique est regulee par la pompe. Les variations de la concentration en antibiotique en absence ou en presence d’un inhi- biteur refletent I’activite intrinseque de la pompe, et indiquent I’efficacite de ce systeme de transport. Nous avons montre que 80 % a 90 Vo des molecules ayant pen&e sont susceptibles d’etre expulses par ce meca- nisme [23].

II est interessant de noter que ce mecanisme d’efflux est implique dans la resistance aux sels biliaires [45] ; ce resultat laisse penser que la flore residente de I’appareil digestif exprime ces pompes a un niveau significatif, et possede deja une resistance de base pour des mole- cules susceptibles d’etre effluees.

La resistance naturelle peut provenir de la juxtaposition de ces modi- fications touchant la permeabilite membranaire. En effet, I’expression de porines a diffusion reduite ou la synthese de faibles quantites de porines [3, 141, associee a la presence d’un efflux actif [13, 20, 311 peut induire une baisse de la sensibilite a certains antibiotiques tels que les p-lactamines ou les fluoroquinolones ; ce mecanisme peut, a terme, favoriser l’emergence ou l’acquisition d’autres types de resis- tance complementaire par la bacterie.

II est egalement important d’identifier I’impact d’autres elements tels que les analgesiques (salicylate) ou les antiseptiques (ammonium qua- ternaire), les transferts genetiques entre batteries partageant la meme niche ecologique, les modifications du LPS ou les sites de colonisa- tion, sur I’acquisition et la modulation de la resistance associee a la permeabilite de I’enveloppe.

Par ailleurs, la gestion de la permeabilite membranaire intervient aussi dans la colonisation in situ (secretions de toxines, d’enzymes ou d’ad- hesines). II est ainsi necessaire d’analyser ce grand processus de la physiologie bacterienne, afin d’apprehender son influence dans la colo- nisation et la resistance.

Remerciements Nous remercions A. Favard pour son aide pendant la redaction du manuscrit.

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