Pharmacocin~tique des medicaments anfi-infectieux

PHARMACOLOGIE ET DOSAGE DES INHIBITEURS NUCLI OSIDIQUES DE LA TRANSCRIPTASE INVERSE DU VlH

Stanislas Grassin Delyle a, Christophe Bazin a, Clotilde Le Tiec ~, Anne-Marie Taburet a,,

Rdsume

Les dosages plasmatiques des inhibiteurs nucleosidiques de la

transcriptase inverse du VIH sont realises par des methodes de

chromatographie liquide haute performance avec detection dans

I'uitraviolet. Les methodes permettant le dosage des metabolites

intracellulaires triphosphoryles actifs ont et6 developpees dans des laboratoires specialises et disposant de ohromatographe liquide

couple A un spectrometre de masse en tandem. Elles restent du

domaine de la recherche. Le suivi therapeutique des inhibiteurs

nucleosidiques de la transcriptase inverse n'est pas & I'heure

actuelle recommande, puisque seuls les metabolites triphosphory-

les dans la cellule sont actifs ; pour la majorite des nucleosides,

aucune relation entre concentration plasmatique et concentrations

intracellulaires du derive triphosphate n'a ete mise en evidence.

Chromatographie liquide haute performance - analogues

nucl~osidiques - inhibiteurs de la transcriptase inverse -VIH.

Summary : Pharmacology and assay of nucleoside

analogs, inhibitors of reverse transcriptase of HIV-I

High performance liquid chromatographic methods with UV detec- tion were developped to assay nucleoside analogs inhibitors of HIV- 1 reverse transcriptase in plasma. Intracellular concentration of nucleoside triphosphate, the active metabolite, can be measured by specific and sensitive assays such as liquid chromatography connected to tandem mass spectrometer. Such difficult assays were developped in a few research laboratories. There is poor relationship between plasma concentrations and intracellular concentrations of the triphosphate derivative. Therapeutic drug monitoring of nucleo- side analogs are not recommanded in clinical practice.

High performance liquid chromatographic methods -

nucleoside analogs - reverse transcriptase inhibitors - HIV.

a Service de pharmacie Hepita] de Bicetre, Assistance Publique - Hepitaux de Paris 78, rue du GeneraI-Leclerc 94270 Le Kremlin-Bic~tre

* Correspondance anne-marie.taburet@bct.ap-hop-paris.fr

article re~u et accepte le 7 juillet 2004.

© Elsevier SAS.

1, Introduction

L es medicaments antiretroviraux actuellement commercialises sont regroupes en quatre classes en fonction de leur mode d'ac-

tion :les inhibiteurs nucleosidiques et nucleotidiques de la transcriptase inverse (INT0, les inhibiteurs non nucleosidiques (INNTI), les inhibi- teurs de la protease (IP) et les inhibiteurs de fusion. La prise en charge de I'infection par le VlH repose en premiere intention sur des trithe- rapies associant 2 INTI et un INNTI ou un IP. Les inhibiteurs nucleo- sidiques de la transcriptase inverse sont la premiere classe d'antire- troviraux apparue sur le marche, au milieu des annees 1980, avec la raise & disposition de la zidovudine.

Ces composes sont constitues de derives dideoxynucleosidiques transformes, apres trois etapes de phosphorylation intracellulaire, en substances actives capables de bloquer la transcriptase inverse virale par competition avec les nucleosides naturels. IIs agissent en bloquant la traduction de I'ARN en ADN par la transcriptase inverse (figure 1). Cette classe constitue la base incontournable pour le developpement d'associations antiretrovirales. Apres avoir rappele les proprietes phar- macologiques de ces medicaments, nous presenterons les differentes methodes de dosages de ces molecules dans les liquides biologiques, puis nous evoquerons I'interet de ces dosages pour le suivi thera- peutique pharmacologique des patients ou en recherche clinique.

2. Les medicaments

Le suivi therapeutique s'applique aux medicaments & marge thera- peutique etroite pour lesquels des relations effet-concentration ont pu etre etablies et qui presentent une importante variabilit¢ inter-indivi- duelle de leurs concentrations circulantes apres administration de posologies standards. II faut egalement que les contraintes techniques relatives & la determination des concentrations de ces medicaments nesoient pas trop importantes. Actuellement, tousles antiretroviraux

ne repondent pas & ces criteres.

2.1. Molecules d isponib les [7, 8, 9, 17, 18, 19, 24]

II existe #. I'heure actuelle sept inhibiteurs nucleosidiques de la trans- criptase inverse commercialises en France, ainsi qu'un inhibiteur nucleotidique (tenofovir). Les inhibiteurs nucleosidiques necessitent pour 6tre actifs trois phosphorylations successives par des kinases cellulaires, alors que le tenofovir n'en a besoin que de deux (figure 2). Les molecules disponibles sur le marche et leurs differentes presen- tations sont resumees clans le tableau I.

2.2. Posologie et modal i tes de prise [8, 18, 24]

Les posologies des differentes molecules et leurs modalites de prise sont resumees dans le tableau IL

Revue Frangaise des Laboratoires, septembre 2004, N ° 365 59

Pharmacocin~tique des medicaments anti-infectieux

3. Pharmacologic des medicarnents antir6troviraux analogues nucleosidiques ou nucieotidiques de la transcriptase inverse du VIii

3.1. Proprietes pharmacocinet iques et pharmacodynamiques [1,3, 5, 7, 17, lg, 22, 24]

Les caracteristiques pharmacocinetiques sont resumees dans le tableau IlL Uabsorption et la biodisponibilite des medicaments de cette classe sont en general bonnes, et peu influencees par la prise de nourriture ; les deux exceptions sont la didanosine, qui se degrade en milieu acide et qui dolt etre ingeree & distance des repas, et le tenofovir dont la biodisponibilite est augmentee d'environ 40 % en presence d'un repas.

La fixation aux proteines plasmatiques est faible. Uelimination est importante par vole renale sous forme inchangee pour la stavudine, la lamivudine, la zalcitabine et le tenofovir. Les metabolites de la zidovudine (environ 60 % de la dose), de la didanosine (environ 50 % de la dose) et de I'abacavir (95 % de la dose) n'impliquent pas les cytochromes P450 hepatiques.

3.2. Interact ions me, d icamenteuses [7, 8, 18, 24]

Ce sont des interactions de type pharmacodynamiques, rarement pharmacocinetiques. Les associations entre deux analogues nucleosi- diques phosphoryles par les memes kinases est deconseillee : zidovudine et stavudine ou lamivudine et zalcitabine. Par ailleurs, I'utilisation concomitante de stavudine et de didanosine, ou de didanosine et de zalcitabine n'est pas recommandee, car elle augmente le risque d'effet indesirable de type neuropathie. II a ete montre recemment que le tenofovir entratne une augmentation des concentrations de didanosine, justifiant la diminution de la posologie de didanosine.

3.3. Pathologies interferentes [17, 19, 24]

La posologie des inhibiteurs nucleosidiques elimines par vole renale (stavudine, lamivudine, didanosine, zalcitabine, tenofovir) dolt etre diminuee chez les patients atteints d'insuffisance renale selon les recommandations des monographies. Le tenofovir ayant une toxicite renale, il est contre-indique chez les patients presentant une alteration de cette vole d'elimination. Chez les patients atteints d'insuffieance hepatique, il est a priori inutile de modifier la posologie des inhibiteurs nucleosidiques de la transcriptase inverse, sauf apparition de signes d'intolerance. En I'absence d'etude, la plupart de ces molecules sont contre-indiquees ou deconseillees en cas d'insuffisance hepatique severe.

3.4. Relation concentrat ion-ef fet

Les mutations de la transcriptase inverse entratnent une resistance, parfois croisee a. plusieurs inhibiteurs nucleosidiques. C'est pourquoi les bi- ou tritherapies & base d'inhibiteurs nucleosidiques de la transcriptase inverse ont une puissance antivirale insuffisante. Le suivi therapeutique des antiretroviraux est en general limite au dosage des inhibiteurs de la protease, et dans une moindre mesure, des inhibiteurs non nucleosidiques de la transcriptase inverse, car ces deux classes impliquent le cytochrome P450 entrafnant une forte variabilite inter- individuelle et des interactions medicamenteuses. Les indications de ces dosages sont limitees, & I'heure actuelle, & I'analyse precoce d'un echec therapeutique pour eliminer un sous-dosage, a la recherche d'un surdosage en cas d'effets indesirables ou & des adaptations posologiques en cas d'interactions medicamenteuses et/ou d'etats

physiopathologiques particuliers (grossesse, poids faible, insuffisance hepatique...).

Les analogues nucleosidiques sont des prodrogues, qui necessitent une triphosphorylation par des kinases intracellulaires aboutissant b. des derives 5' triphosphates actifs. La concentration plasmatique de la molecule mere est rarement correlee #. I'effet pharmacologique, et les variations inter-individuelles du metabolisme des molecules de cette classe ne permettent pas d'etablir un lien entre la concentration plasmatique, concentration intracellulaire du metabolite triphosphoryle actif et I'inhibition virale.

Le dosage plasmatique des inhibiteurs nucleosidiques de la transcriptase inverse ne permet donc pas d'etudier I'efficacite du traitement, mais peut permettre d'explorer un surdosage. Le tenofovir augmente les concentrations plasmatiques de ddl, justifiant une diminution de posologie. Ces techniques ne sont effectuees que dans des laboratoires specialises, et de nombreux travaux sont effectues sur les dosages intracellulaires, afin de mettre en evidence une correlation entre les concentrations intracellulaires des metabolites actifs et I'activite antivirale. Cependant, ces dosages intracellulaires necessitent un equipement specifique (LC-MS/MS) en raison des faibles concentrations mesurees et I'interpretation des dosages est complexe (absence de standardisation des recueils et de la conser- vation des cellules, interferences des nucleotides endogenes...).

4. ToUerance

4.1. Contre- indicat ions [7, 24]

II existe peu de contre-indications formelles & la prescription des inhibiteurs nucleosidiques de la transcriptase inverse, si ce n'est la reintroduction d'un traitement par I'abacavir s'il a ete precedemment arrete du fait de I'apparition d'un syndrome d'hypersensibilite (fievre, eruption cutanee) et ce en raison du risque de deces. Uhypersensibilite connue b. Fun des medicaments contre-indique toujours sa poursuite ou sa reintroduction.

4.2. Effets secondaires [8, 14, 18, 24]

Les effets indesirables des antiretroviraux sont nombreux, mais de gravite variable. Certains sont d'apparition rapide (toxidermie due & I'abacavir), d'autres retardes (neuropathies peripheriques et lipodystrophies). Un bilan biologique (NFS, enzymes hepatiques) est necessaire pour mettre en evidence I'apparition d'une toxicite hematologique ou hepatique. Enfin, rappelons que les bi- ou tritherapies rendent I'imputabilite d'un effet indesirable a tel ou tel compose parfois difficile, comme par exemple les anomalies metaboliques qui surviennent chez plus de 50 % des patients traites par antiretroviraux. Les effets indesirables et la surveillance que necessitent les inhibiteurs nucl6osidiques de la transcriptase inverse sont resumes dans les monographies des medicaments. Notons qu'ils ont souvent pour origine la toxicite mitochondriale, qui peut expliquer un certain nombre des effets indesirables observes avec cette classe, tels que les neuropathies, les pancreatites ou les myopathies. La manifestation biologique de cette toxicite est I'apparition d'une acidose lactique.

5. Methodes de dosage

5.1. General i tes [3, 5]

Les dosages plasmatiques sont le plus souvent realises par chro- matographie liquide haute performance avec detection dans I'ultra- violet, alors que la chromatographie liquide couplee #. la spectrometrie

60 Revue Frangaise des Laboratoires, septembre 2004, N ° 365

Pharmacocin@tique des m6dicaments antHnfectieux

Zidovudine

Stavudine

Didanos ne !

Zalcitabine

LamivUdine

A caVJ

Em~riciiabine i

Tenof0vir i

AZT

D4T

DDI

R6trovir ®

Z6rit ®

Videx ®

• G@lules 100 et 250 mg

/ d

3

A

F

Zidovudine

R~trovir ®

Stavudine

Z6rit ®

Didanosine

Videx ®

Zalcitabine

Hivid ®

Lamivudine

Epivir ®

Emtricitabine

Abacavir

Ziagen ~

~idovudine

~- lamivudine

Combivir ~

Zidovudine + lamivudine

÷ abacavir

Trizivir ®

T6nofovir

Viread ®

500 & 600 mg~

60 A 80 mg/jour

200 ~ 400 mg~

2,25 mg/j

300 mg/j

200 mg8

600 mg/j

Zidovudine 600 mg/j

Lamivudine 300 mg/j

Zidovudine 600 mg/j

Lamivudine 300 mg/j

Abacavir 600 mg/j

En 2 ou 3 prises/j

1 gel b. 250 mg 2 fois/j ou ' cp. & 300 mg 2 fois/j ou 2 gel & 1 O0 mg 3 fois/j

En 2 prises/j - Poids < 60 kg : 60 mg/j soJt 1 gel & 30 mg 2 fois/j

- Poids _> 60 kg : 80 mg/j soit 1 gel & 40 mg 2 fois/j

En 1 prise/j - Poids _> 60 kg : 400 mg/j

- Poids < 60 kg : 250 mg/j

En 3 prises/j

1 cp, ~t 0,750 mg 3 fois/j

En 2 prises/j ou 1 prise/j

] cp, & t50 mg 2 fois/j ou 1 cp. & 300 mg 1 fois/j

! cp. 1 fois/j

En 2 prises/j

1 cp. & 300 mg 2 fois/j

En 2 prises/j ] cp. 2 fois/j

En 2 prises/j

1 co, 2 fois/j

245 mg/j 1 cp. I fois/j

Revue Fran(;aise des Laboratoires, septembre 2004, N o 365 61

Pharmacocin~tique des m~dicaments anti-infectieux

=(%) 63_+10 I 82_+,~

Effet de I'alimentation sur F _ - 24 % tnchan~c

Tm~ (h) 0,5-0,8 0,5-1 ,(

C~a ~ (ng/mL) - 30

Fixation Drot6iaue (%) -- < 5

Vd (L/kg) 1,2 - 1,7

R LCR/Dlasma 0,15 - 0,8 - - ' , _

R foeto-matemel 0.5 - 1

T1/2 pl. (h)

CI (mL/min) 1 000-1 200

T1/2 ntracellulaire (h) 3 & 5

M~tabolisme Glucurono- ND conjugaison

15-25 40-5O i Fe (% dose) T 1/2 : demi vie ; pl : plasmatique Fe : fraction excret6e dans les urines, sous formes inchangee.

1 5 & 2 0

Di-d~oxyribose

62 Revue Franoaise des Laboratoires, septembre 2004, N ° 365

Pharmacocin~tique des m#dicaments anti-infectieux

Thymldlne ZDV analogs Thyrnidine kinee, e

I and2 d4T

ZDV M P Thymtdytate

kinase d 4 T M P - - ~

Z D V DP - - ~ 5"NDPK

d4T DP - - ~

ZDV TP

d4T TP

Cytidine ddC analogs FTC

3TC dCK

ddC MP FTC MP ~MPK

= 3TC MP

ddC DP ---4,- FTC DP 5~oPK 3TO DP

ddC TP FTC TP 3TC TP

Adenosine ddi analogs

Guanosine analogs

5"NT AMPD

-.~ ddl MP ~ ddA MP

TDF ~ PMPA Ceflular

esfet~,~t

ABV 4.- ABV MP-~ CBV MP - - ~

APT AMPD gK

ddA DP A MPK 5;IVDPK

PMPA MP

CBV DP - - ~

5~DPK

ddA TP

PMPA DP

CBV TP

TDF : tenofovir ; ABC : abacavir ; CBV : cavibovir ; PMPA : t6nofovir diphosphate ; ddA : did6oxyadenosine. MP : monophosphate ; DP : diphosphate ; TP : triphosphate.

de masse en tandem s'impose pour les dosages intracellulaires, encore reserv6s & un hombre restreint de laboratoires.

5.2. Moda l i tes de pr616vement

Pour le dosage plasmatique, le pr~levement doit se faire juste avant la prise du medicament, sur tube heparine sans gelose, afin d'estimer la concentration residuelle. Un prelevement au pic peut aussi ~tre rea- lise, effectue 1 h apr¢s la prise. II s'impose pour la didanosine, car cette molecule & demi-vie courte etant administr6e une seule fois par jour, tes concentrations r6siduelles sont souvent en-dessous de la limite de quantification.

5.3. Techn iques de d o s a g e

5.3.1. Plasmatiques Plusieurs m6thodes de dosage plasmatique des inhibiteurs nucl6osi- diques ont 6te developp6es, permettant soit le dosage specifique d'une mol6cule, soit le dosage d'un groupe de mol6cules. Ce sont le plus sou- vent des techniques de chromatographie liquide haute performance, mais d'autres types de methodes ont aussi 6t6s developpes.

5.3.1.1. Techniques chromatographiques Les differentes techniques publiees sont resum6es dans le tableau IV [2, 4, 10, 13, 16, 21,23], et consistent en une extraction solide-liquide suivie d'une separation par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse, avec une d6tection dans I'UV. L'extraction prealable est de type solide-liquide car les analogues nucleosidiques sont des molecules trop hydrophiles pour 6tre extraites par les solvants

organiques classiques utilis6s dans les extractions liquide-liquide. Des am61iorations ont pu 6tre apportees gr&ce & I'utilisation de paires d'ions [2, 10] (formation de complexes entre la paire d'ions-acide octane sul- fonique OSA et les molecules & separer), une lecture & differentes Ion- gueurs d'ondes [21 ], ou I'utilisation de colonnes & polarite particuliere [21 ] qui permettent de retenir les formes cationiques de la lamivudine et la zalcitabine. Toutes ces techniques ont des limites de quantification compatibles avec les concentrations retrouv6es dans le plasma aux posologies recommand6es. D'autres auteurs d6crivent le dosage de certaines de ces m6mes mole- cules en utilisant une d6tection par spectrometrie de masse en tan- dem [15, 20, 25] permettant d'abaisser significativement la limite de quantification et le volume de la prise d'essai.

5.3.1.2. Autres techniques

Radioimmunoanalyse Des techniques immunologiques sont d6velopp6es pour le dosage des inhibiteurs nucl6osidiques, ayant pour objectif de diminuer la limite de quantification obtenue en chromatographie [6].

Chrom~tographie (Hectrocinetique micellaire Elle utilise le m~me principe que la CLHP classique, avec ufllisation d'un champ electrique pendant la s6paration [1 1].

5.3.2. M~tabolites phosphoryl~s intracellulaires [3]

Actuellement, seules quelques molecules de la classe des inhibiteurs nucleesidiques de la transcriptase inverse peuvent ~tre dos6es dans le milieu intracellulaire. II s'agit de la zidovudine, la stavudine, la lami-

Revue Fran~aise des Laboratoires, septembre 2004, N ° 365 63

Pharmacocin~tique des m~dicaments anti-infectieux

Prise dVessai 1 mL

Solide-liquide Extraction ~ > 70 %

2' 3'-0 Etalon interne isopropylidene uridine

Gradient Ac~tonitrile Tampon

Phase mobile KH2PO 4 pH 4.2

OSA

ClS Symmetry Colonne (250 x 4,6 mm)

D(~tection UV 260 nm

Temps d l a n a l y s e L 40 min

Limite de ~ - D I D4T AZT : 10 quantification I 3TC ABC : 20 (ng'mL'l) _ ~

2 R~f6rence

Waters Polarity dC. i : x ! F̧

o~> 92 °/0 i

ik

Uv uv 285

10 I 20

vudine et la didanosine. I~tant donne les tres faibles concentrations mesurees (en fmol/10 e cellules), les methodes de dosage doivent etre tres sensibles et specifiques. La difficulte de la mise au point d'une tech- nique de dosage des metabolites intracellulaires est due #. la difficulte de fabriquer des echantillons d'etalonnage et des contreles qualite qui utilisent la meme matrice. Apres une premiere etape d'isolement des cellules, on peut proceder soit & un dosage direct des nucleotides intra- cellulaires phosphoryles (LC/MS/MS), soit & un dosage indirect, neces- sitant une dephosphorylation des nucleotides.

5.3.2.1. Recueil et lavage des cellules

Cette etape dolt etre realisee avec precaution, car elle conditionne route la suite du dosage. Sa qualite est primordiale pour I'interpreta- tion des resultats. Des tubes OPT (ceil preparation tube) sent utili- ses pour le recueil des echantillons sanguins et permettent I'etablis- sement d'un gradient de densite pendant la centfifugation. Les CMSP (cellules mononucleees du sang peripherique) ferment alors un anneau, qui doit ensuite ~tre recupere et lave rapidement & 4 °C avec du serum physiologique dans un autre tube, afin d'eviter la degradation des nucleosides triphosphates. La numeration des cellules est realisee par mesure de ]'ADN, dont la concentration est correlee au nombre de CMSP dans I'echantillon.

5.3.2.2. Aspect analytique

Techniques indirectes

Les metabolites mono-, di-, ou triphosphoryles sont extraits des cel- lules, separes par chromatographie ionique ou par chromatographie de paire d'ions, puis dephosphoryles en nucleosides par une phos- phatase. Apres purification, la quantification s'effectue par methode radio-immunologique (RIA) ou en CLHP avec detection UV ou par spectrometrie de masse.

Ces techniques ont I'inconvenient d'etre Iongues (temps d'incubation avec la phosphatase), de necessiter un volume de sang important (10- 50 mL), et d'avoir une variabilite accrue par I'absence d'etalon interne.

Technique directe

Une m6thode par chromatographie liquide/spectrometrie de masse en tandem (LC/MS/MS) a ere developp6e. Elle permet la mesure simul- tanee des metabolites triphesphoryles des inhibiteurs nucleosidiques de la transcriptase inverse et des nucleotides endogenes competiteurs sur la transcriptase inverse. Un des inter6ts est de pouvoir calculer le ratio entre les metabolites triphosphoryies et le nucleotide endogene, qui entrent tousles deux en competition pour la liaison & la trans- criptase inverse ; I'utilisation de ce rapport en terme d'index d'activite reste & evaluer. La quantification du nucl6otide endogene est un indi- cateur indirect d'assurance qualite de la preparation des cellules. Analytiquement, ces dosages font appel & la chromatographie de paire d'ions, qui separe les nucleotides en fonction du nombre de groupements phosphate sur la molecule. La sensibilite est amelioree par I'utilisation d'une colonne de tres faible diametre interne (Cle, 150 x 0,32 ram) ; et le choix d'un spectrometre de masse de type quadripele.

La technologie employee et la difficulte d'interpretation des resultats font que ce type de dosage est pour I'instant reserve & des laboratoires specialises et ne peut ~tre realise en routine.

6. ConcJusion

A lors que les analogues nucleosidiques de la transcriptase inverse ont 6re les premiers medicaments antiretroviraux mis sur

le marche, leur mecanisme d'action et leurs caracteristiques phar- macologiques n'ont pas et6 completement elucides. Les techniques de dosage actuellement disponibles permettent de mesurer la concentration plasmatique de ces analogues nucleosidiques par methode CLHP classique. Cependant, en I'absence de relation demontree entre ces concentrations et I'efficacite virologique, un suivi therapeutique pharmacologique ne peut 6tre recommande. Les dosages intracellulaires des metabolites actifs triphosphoryles res- tent du domaine de la recherche.

64 Revue Frangaise des Laboratoires, septembre 2004, N ° 365

Pharmacocin6tique des m#dicaments anti-infectieux

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