VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS KATEDRA

Gintarė Milašiūtė

Pirminės ląstelių kultūros – informatyvus navikų tyrimų in vitro

eksperimentinis modelis

Magistro baigiamasis darbas

Biocheminės analizės studijų programa, valstybinis kodas 621C77001

Molekulinės biologijos, biofizikos ir biochemijos studijų kryptis

Vadovas (-ė) __________________ _________________ __________ (Moks.laipsnis, vardas, pavardė) (parašas) (data)

Apginta _____________ ________________ ________________ (Fakulteto dekanas) (parašas) (data)

Kaunas, 2016

2

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Leidimą išdavė Kauno regioninis biomedicininių tyrimų etikos komitetas. Ledimo nr. P2-

137/2006; išdavimo data: 2011m. gruodžio 8d.

Darbo autoriui interesų konflikto nekilo.

Magistro baigiamasis darbas atliktas LSMU Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų

laboratorijoje.

3

SANTRUMPOS

AMA – antimicinas A;

ATP – adenozintrifosfatas;

CD – diferenciacijos antigenai;

DAPI – 4,6-diamidino-2-fenilindiolo dihidrochloridas, nukleorūgščių dažas;

DMEM – Dulbeco modifikuota Eagle terpė;

MET – perėjimas iš mezenchiminio į epitelinį fenotipą (angl. mezenchymal-epythelial transition);

Er-α – estrogenų receptorius α;

F12 – maistinių medžiagų mišinys;

FAB – fibroblastų aktyvinimo baltymas;

FVS – fetalinis veršelio serumas;

KI67 – baltymas, koduojamas MKI67 geno (proliferacijos žymuo);

NADH – nikotinamidadenindinukleotidas;

NADPH – nikotinamidadenindinukleotido fosfatas (redukuota forma);

PBA – natrio fenilbutiratas;

PBS – (angl. Phosphate-buffered saline) fosfatinis buferis;

Sal – salinomicinas;

STAT3 – signalo daviklis ir transkripcijos 3 aktyvatorius (ang. signal transducer and activator of

transcription 3);

4

TURINYS

Santrauka................................................................................................................................. 6

Abstarct................................................................................................................................... 7

Įvadas...................................................................................................................................... 8

1. Literatūros analizė........................................................................................................... 10

1.1. Pirminės ląstelių kultūros...................................................................................... 10

1.2. Ląstelų heterogeniškumas navike......................................................................... 11

1.3. Naviko kamieninės ląstelės................................................................................... 13

1.4. Navikinių ląstelių žymenys................................................................................... 15

1.4.1. Diferenciacijos antigenai CD24 ir CD44................................................ 15

1.4.2. Proliferacijos žymuo Ki67....................................................................... 16

1.4.3. Fibroblastų aktyvinimo baltymas α (FAB).............................................. 16

1.5. Naviko slopikliai................................................................................................... 17

1.5.1. Salinomicinas.......................................................................................... 17

1.5.2. Antimicinas A.......................................................................................... 17

1.5.3. Natrio fenilbutiratas................................................................................. 18

1.6. Hipertermija.......................................................................................................... 18

2. Medžiagos ir metodai....................................................................................................... 21

2.1. Naudotos medžiagos............................................................................................. 21

2.2. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų išskyrimas iš piktybinio audinio.......... 21

2.3. Tyrimams naudotų navikinių ir naviko neformuojančių ląstelių auginimas........ 22

2.4. Ląstelių proliferacijos įvertinimas fluorescenciniu metodu, naudojant Hoechst

33342....................................................................................................................

22

2.5. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų žymenų (Ki67, CD24, CD44 ir FAB)

nustatymas imunocitocheminiu metodu.........................................

23

2.6. Kolonijų formavimo arba klonogeninė analizė.................................................... 23

2.7. Ląstelių invazyvumo tyrimas “žaizdos gijimo” metodu...................................... 23

2.8. Fluorescencinės mikroskopijos analizė................................................................ 24

2.9. Statistinė duomenų analizė................................................................................... 24

3. Rezultatai ir jų aptarimas................................................................................................. 25

3.1. Naviko žymenų raiška krūties naviko pirminių ląstelių kultūrose....................... 25

3.2. Krūties adenokarcinomos MDA-MB-231 ir pirminių naviko ląstelių kultūrų 27

5

(krūties naviko – BC1, BC2, BC4, BC5, BC6 ir gerklų karcinomos LSCC)

proliferacijos pokyčiai paveikus slopikliais, fluorescenciniu metodu, naudojant

Hoechst 33342......................................................................................................

3.3. Naviko neformuojančių ląstelių proliferacija, paveikus naviko slopikliais

fluorescenciniu metodu, naudojant Hoechst 33342..............................................

31

3.4. Krūties naviko ląstelių proliferacija, paveikus naviko slopikliais bei

hipertermija...........................................................................................................

32

3.5. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 gyvybingumo ir kamieniškumo įvertinimas pagal

kolonijų formavimo analizę, paveikus slopikliais................................................

33

3.6. Naviko slopiklių poveikis MDA-MB-231 ir pirminių krūties naviko ląstelių

kultūrų (BC2 ir BC5) judėjimui...........................................................................

37

3.7. Rezultatų apibendrinimas.................................................................................... 41

Išvados..................................................................................................................................... 45

Literatūra................................................................................................................................. 46

Dalyvavimas konferencijose.……………………………………………………………... 56

1 Priedas................................................................................................................................. 57

6

SANTRAUKA

Magistro darbo autorius: Gintarė Milašiūtė

Magistro darbo pavadinimas: Pirminės ląstelių kultūros – informatyvus navikų tyrimų in vitro

eksperimentinis modelis

Vadovas: Daktarė Ieva Antanavičiūtė

Darbas pristatytas: Vytauto Didžiojo Universiteto Gamtos mokslų fakultete, Kaunas, 2016 gegužė.

Puslapių skaičius: 57

Lentelių skaičius: 2

Paveikslų skaičius: 25

Priedų skaičius: 1

Dauguma naviko tyrimų atliekami naudojant jau sukurtas navikinių ląstelių linijas kaip in

vitro eksperimentinius modelius. Tačiau pirminės ląstelių kultūros turi pranašumų, lyginant jas su

ląstelių linijomis, kurios neatspindi heterogeniškumo ir vaistams atsparių navikų susiformavimo

priežasties. Pirminės naviko ląstelių kultūros tiriamos atlikus tik keletą persėjimų, todėl šios ląstelės

labiau atitinka naviko savybes ir gali būti panaudotos kaip ligos modelis.

Magistro baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti slopiklių (100 nM salinomicino (Sal),

10 µM antimicino A (AMA) ir 100 µM natrio fenilbutirato (PBA)) bei hipertermijos (5 val., 40 °C)

poveikį pirminėms naviko ląstelių kultūroms. Darbe tirta navikui būdingų žymenų (CD24, CD44,

Ki67 ir FAB) raiška imunocitocheminiu metodu, ląstelių proliferacija fluorescenciniu metodu,

naudojant Hoechst 33342, gyvybingumas pagal gebėjimą formuoti kolonijas ir invazyvumas

„žaizdos gijimo“ metodu. Tyrimai atlikti su pirminėmis ląstelių kultūromis – krūties naviko (BC1,

BC2, BC4, BC5, BC6) ir gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos (LSCC), krūties naviko ląstelių

linijomis (MDA-MB-231 ir MCF-7) bei naviko neformuojančiomis ląstelėmis (kvėpavimo takų

lygiųjų raumenų ląstelės, ASM; žmogaus plaučių diploidiniai fibroblastai, Wi38; triušio mioblastai,

RMB; kamieninės kaulų čiulpų ląstelės, MSC).

Įvertinus slopiklių poveikį pasirinktais metodais, nustatyta, kad didžiausią neigiamą

poveikį pirminėms naviko ląstelių kultūrų ir linijų proliferacijai, gyvybingumui ir judėjimui turi

antimicinas A. Įjautrinimo hipertermija naudojimas sukėlė BC2 ir MCF-7 ląstelių proliferacijos

didėjimą, o sumažėjusi proliferacija stebėta MDA-MB-231 ląstelėse. Tačiau įjautrinimas

hipertermija neturėjo įtakos slopiklių sukeltiems proliferacijos pokyčiams tirtose ląstelių linijose.

7

ABSTRACT

Author of Master Thesis: Gintarė Milašiūtė

Full title of Master Thesis: Primary cell lines - informative in vitro experimental model for cancer

research

Supervisor: Dr. Ieva Antanavičiūtė

Presented at: Faculty of Natural Sciences, Vytautas Magnus University, Kaunas, May 2016.

Number of pages: 57

Number of tables: 2

Number of pictures: 25

Number of appendices:1

Most of cancer studies are performed by using cell lines like in vitro models. Primary

cell cultures have more advantages, than cell lines, which do not properly represent heterogeneity

and cause of formation of drug-resistant tumors. Primary cell cultures are tested after few passages,

therefore, these cells are more in line with tumor properties and can be used as a tumor model.

The aim of this study was to evaluate the effect of different inhibitors (100 nM

salinomycin (Sal), 10 µM antimycin A (AMA) and 100 µM sodium phenylbutyrate (PBA)) and

hyperthermia (5 h, 40 °C) to primary cancer cell cultures. In this study we investigated the

expression of tumor-cell specific markers (CD24, CD44, KI67 and FAP) by imunocitochemistry,

also cell proliferation by Hoechst 33342 fluorimetric assay, cell viability by colony formation assay

and cell mobility by wound healing assay. Cells used in in this study: primary cell cultures – BC1,

BC2, BC4, BC5, BC6 and LSCC; human breast cancer cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7);

normal cell lines (airway smooth muscle cell, ASM; human diploid cell line, Wi38; rabbit myoblast,

RMB; bone marrow mesenchymal stem cell, MSC).

Our results showed that antimycin A caused decreased proliferation, viability and

mobility in primary cell cultures and cell lines. Pretreatment with hyperthermia increased the

proliferation in BC2 and MCF-7 cells and decreased proliferation in MDA-MB-231 cells. We did

not observed any alterations on the effect of inhibitors on cell proliferation after pretreatment with

hypertehermia.

8

ĮVADAS

Dauguma naviko tyrimų atliekami naudojant jau sukurtas naviko ląstelių linijas kaip in vitro

tyrimų modelius. Galima alternatyva šioms linijoms – pirminės ląstelių kultūros, išskirtos iš naviko

audinio (Turin ir kt., 2014). Iš nedidelio navikinio audinio kiekio galima išskirti ląsteles, kurios

neribotai dalinasi. Tokios ląstelės gali būti naudojamos įvertinti įvairių krūties naviko tipų atsaką į

skirtingus gydymo metodus, gerinant supratimą apie navikinėse ląstelėse įvykusius pakitimus (Ochs

ir kt., 2003).

Yra žinoma, kad daugumai navikų būdingos ląstelių subpopuliacijos, tai yra, ląstelės navike

nėra vieno tipo. Piktybinio darinio sudėtyje gali būti epitelinių ląstelių, su naviku susijusių

fibroblastų ar mezenchiminių (kamieninių) ląstelių. Pastarosios ląstelės yra atsparios chemoterapijai

ir daug agresyvesnės (Tveit ir kt., 1981; Shiavo ir kt., 2007). Pirminės naviko ląstelių kultūros

tiriamos atlikus keletą persėjimų. Jose randamos ląstelių subpopuliacijos, todėl šios ląstelės labiau

atitinka naviko savybes ir gali būti panaudotos kaip naviko mikroaplinkos modelis (Burdall ir kt.,

2003). Išvestos ląstelių linijos yra homogeniškos bei neatspindi tikrosios klinikinės situacijos.

Pirminės ląstelių kultūros turi ir trūkumų – ilgai kultivuojamos keičia fenotipą, o tai sukelia

sunkumų interpretuojant gautus tyrimų rezultatus, tačiau išvestos ląstelių linijos, naudojamos ilgą

laiką taip pat gali kisti (Hass ir kt., 2009; Bonner-Weir ir kt., 2000).

Nors krūties naviko pirminės ląstelių kultūros gali būti naudingos siekiant nuspėti atsaką į

gydymą, duomenų apie šių ląstelių fenotipą yra mažai. Dažniausiai tiriama naviko ląstelių CD24- ir

CD44+ žymenų raiška (Ricardo ir kt., 2011), taip pat Ki67 proliferacijos žymens raiška (Gerdes ir

kt., 1991), tačiau kitų ligos vystymuisi reikšmingų žymenų tyrimų atlikta nedaug.

Tiriamajame darbe naudojami naviko slopikliai salinomicinas, antimicinas A ir natrio

fenilbutaratas. Tai pat buvo vertinamas hipertermijos (40 °C) poveikis ląstelių proliferacijai atskirai

ir kartu su minėtais slopikliais. Šios strategijos neigiamai paveikti naviko ląsteles turi nevienodus

veikimo mechanizmus ir veikia skirtingus naviko ląstelių tipus, todėl atlikti tyrimai yra aktualūs,

nes tikrojoje naviko mikroaplinkoje ląstelės nebūna vieno tipo ir tai labiau atspindi klinikinę

situaciją bei gali būti pritaikoma personalizuotos medicinos vystymui (Lu ir kt., 2014).

9

Darbo tikslas:

Įvertinti naviko slopiklių ir hipertermijos poveikį krūties naviko pirminėms ląstelių

kultūroms.

Uždaviniai:

1. Ištirti CD24, CD44, Ki67 ir FAB raišką krūties naviko pirminėse ląstelių kultūrose

imunocitocheminiu metodu.

2. Nustatyti salinomicino, antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikį pirminių krūties naviko

ląstelių kultūrų (BC), gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos (LSCC), krūties adenokarcinomos

(MDA-MB-231) ir naviko neformuojančių ląstelių proliferacijai fluorescenciniu metodu, naudojant

Hoechst 33342.

3. Įvertinti įjautrinimo hipertermija bei salinomicino, antimicino A ir natrio fenilbutirato

poveikį krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų, MDA-MB-231 ir MCF-7 ląstelių proliferacijai.

4. Nustatyti salinomicino, antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikį pirminių ląstelių

kultūrų ir MDA-MB-231 ląstelių linijos gyvybingumui, atliekant kolonijų formavimo analizę.

5. Įvertinti BC2 ir MDA-MB-231 ląstelių invazyvumą „žaizdos gijimo“ metodu, paveikus

slopikliais.

10

1. LITERATŪROS ANALIZĖ

1.1. Pirminės ląstelių kultūros

Ląstelių kultūra – dirbtinėje aplinkoje auginamos ir tam tikriems tyrimams naudojamos

eukariotinės ląstelės. Ląstelės, ką tik išskirtos iš gyvų audinių, vadinamos pirmine kultūra. Paprastai

tai yra heterogeninė ląstelių masė, pasižyminti specifinėmis, tam tikram audiniui būdingomis

savybėmis (Abhisek ir kt., 2013).

Jau kelis dešimtmečius imortalizuotos navikinių ląstelių linijos yra pasiekiamas ir lengvai

naudojamas biologinis modelis naviko biologijos ir galimo antinavikinių vaistų veiksmingumo

tyrimams. Tačiau daug tyrimų parodė, kad šios ląstelių linijos prastai atstoja įvairovę,

heterogeniškumą ir vaistams atsparių navikų susiformavimo priežastį Michel ir kt., 2000). Išvedama

trumpalaikė kultūra iš pirminių ląstelių, išskirtų iš solidinio naviko, gali būti naudojama ir įgijo

didelę svarbą kaip modelis personalizuotoje medicinoje (Abhisek ir kt., 2013).

1.1 pav. Pirminio naviko mikroaplinka. Modifikuota pagal Upreti, Jyoti ir Sethi, 2013.

Pirminio naviko mikroaplinką sudaro naviko ląstelės, apsuptos normaliomis epitelinėmis

ląstelėmis, mezenchiminėmis kamieninėmis ląstelėmis, endotelinėmis kamieninėmis ląstelėmis ir

įvairiomis iš kaulų čiulpų kilusiomis ląstelėmis. Heterogeninių ląstelių buvimas, signalinės

11

molekulės, ekstraląstelinis užpildas ir mechaniniai ženklai, skatinantys neoplastines transformacijas

naviko mikroaplinkoje, palaiko naviko augimą ir invazyvumą (1.1 pav.) (Schwartz ir kt., 2012;

Liotta ir kt., 2001).

Dauguma krūties naviko tyrimų atliekami naudojant jau sukurtas krūties naviko ląstelių

linijas kaip in vitro modelius. Kaip alternatyvą šioms linijoms, galima naudoti pirmines ląstelių

kultūras, išskirtas iš krūties naviko audinio. Genetiškai pakeistos naviko ląstelių linijos in vitro

sąlygomis neatstoja tikrosios klinikinės situacijos. Be to, skirtingų pacientų atsakas į tuos pačius

vaistus prieš navikus, kurie genetiškai yra tapatūs, skiriasi [6]. Gali būti sunku suprasti genetinius ir

epigenetinius milijonų pacientų skirtumus iš kelių navikinių ląstelių linijų. Taigi, skirtingas

klinikinis atsakas į antinavikinius vaistus ir nuo pacientų priklausoma navikų įvairovė yra esminis

dalykas, vedantis į personalizuotą mediciną (Abhisek ir kt., 2013).

Tai skatina vystyti metodus pirminių navikinių ląstelių kultūrų išvedimui ir kultivavimui,

kad pasiektume didesnį efektyvumą naviko gydymo procese. Pirminio naviko ląstelių kultūrų

modelis turi keletą pranašumų - ląstelės yra izoliuojamos tiesiai iš naviko, be to, duomenys apie

patologiją leidžia palyginti kultūros ir pirminio naviko ląstelių charakteristiką (Tveit ir kt., 1981).

Pirminės ląstelių kultūros geriausiai atitinka in vivo situacijų eksperimentinius modelius, ir

jos gali išreikšti charakteristikas, kurių nematyti dirbtinai išaugintose ląstelių linijose (Abhisek ir

kt., 2013).

1.2. Ląstelių heterogeniškumas navike

Įvairios naviko ląstelės gali turėti skirtingą morfologiją ir fenotipą, įskaitant ir ląstelės

morfoflogiją, genų raišką, metabolizmą, judėjimą, proliferaciją ir metastazavimo potencialą

(Marusyk ir kt., 2009). Šį reiškinį galima matyti ne tik tarp skirtingų navikų ląstelių, bet ir tarp to

paties naviko ląstelių (Almendro ir kt., 2013). Toks naviko ląstelių heterogeniškumas sukelia

sunkumų ieškant veiksmingo gydymo metodo. Tyrimai, atliekiami ląstelių heterogeniškumo

supratimui ir apibūdinimui gali padėti suprasti ligos atsiradimo ir progresavimo priežastis

(Almendro ir kt., 2013). Naviko heterogeniškumas pastebėtas leukemijos (Campbell ir kt., 2008),

krūties (Shipitsin ir kt. 2007), prostatos (MacIntosh ir kt., 1998; Alvarado ir kt., 2005; Konishi ir

kt., 1995), smegenų (Heppner, 1984), galvos ir kaklo (Califano ir kt., 1996), šlapimo pūslės (Sauter

ir kt., 1995), storosios žarnos (Gonzalez-Garcia ir kt., 2002; Samowitz ir Slattery, 1999; Giaretti ir

kt., 1996), liposarkomos (Horvai ir kt., 2009) ir ginekologinių navikų (Fujii ir kt., 2000) ląstelėse.

Genetiniai ir epigenetiniai skirtumai tarp naviko ląstelių to paties naviko viduje gali

paaiškinti, kodėl kai kurios naviko ląstelės išlieka net baigus gydymą. Skirtingos klonų populiacijos

heterogeniškame navike gali turėti skirtingą jautrumą citotoksiniams vaistams. Tai yra siejama su

12

sąveika tarp klonų, ji gali slopinti arba keisti gydymo poveikį, o tai sukelia sunkumų heterogeniškų

navikų ir jų metastazių sėkmingam terapiniam gydymui. Tokiam navikui gydyti naudodami

citotoksinį vaistą nužudysime didžiąją populiaciją naviko ląstelių, tačiau kelios, atsparios

naudojamam vaistui išgyvens, kurios vėlau pradės daugintis ir užaugins naują naviką klonų

evoliucijos būdu. Toks naujas navikas yra heterogeniškas ir atsparus pirminiam vaistui bei gali būti

daug agresyvesnis (Zellmer ir Zhang, 2014). Dėl atsparumo vaistams yra atsakingos ir naviko

kamieninės ląstelės, kurioms reikia specifiškai kamienines ląsteles veikančio vaisto, nes įprasti

vaistai nužudo įprastas naviko ląsteles, o likusios kamieninės suformuoja naują naviką, kuris yra

heterogeniškas ir turi atsparumą ne tik pirminiam vaistui (1.2. pav.) (Markman ir kt., 2013).

1.2 pav. Du pagrindiniai naviko atsparumo vaistams mechanizmai: A paveikslėlyje parodyta kaip

populiacija 3 yra visiškai sunaikinama, o populiacija 4 yra dominuojanti navike, kuri atsinaujina; B paveikslėlyje pavaizduota heterogeninė naviko ląstelių populiacija su kamieninėmis ląstelėmis, po gydymo išlieka tik kamieninės ląstelės, kurios po tam tikro laiko sugeba sukurti buvusias ląstelių

populiacijas. Modifikuota pagal Markman ir kt., 2013.

Naviko heterogeniškumui paaiškinti yra remiamasi dviem modeliais – klonų evoliucijos ir

naviko kamieninių ląstelių (1.3. pav.) (Shackleton ir kt., 2009).

Klonų evoliucijos modelis pirmą kartą buvo pasiūlytas 1976 m. (Nowell ir kt., 1976). Pagal

šį modelį navikas susiformuoja iš vienos mutavusios ląstelės, kuri progresuodama kaupia

papildomas mutacijas. Šie pokyčiai duoda pradžią papildomų subpopuliacijų atsiradimui, kurios turi

gebėjimą toliau dalintis ir mutuoti. Toks heterogeniškumas gali padėti atsirasti subklonams, kurie

turi pranašumą prieš kitas navike esančias ląsteles ir šie subklonai bėgant laikui tampa

dominuojančiais naviko mikroaplinkoje (Swanton, 2012; Merlo ir kt., 2006). Šis modelis padeda

13

suprasti naviko augimą, nepasisekimą gydyme ir naviko agresyvumą, kuris atsiranda naviko

formavimosi procese (1.3 pav. A) (Swanton, 2012).

1.3 pav. Naviko ląstelių gebėjimas formuoti naviką pagal klonų evoliucijos (A) ir kamieninių ląstelių modelius (B). Modifikuota pagal Magee ir kt., 2012.

Naviko kamieninių ląstelių modelis teigia, kad naviko populiacijoje yra tik nedidelė grupė

ląstelių, kurios geba formuoti naviką. Jos vadinamos naviko kamieninėmis ląstelėmis ir pasižymi

gebėjimu atsinaujinti ir diferencijuotis į naviko neformuojančias ląsteles. Naviko ląstelių

heterogeniškumas tam pačiam navike yra aiškinamas skirtingų ląstelių susidarymu iš naviko

kamieninių ląstelių. Kamieninių ląstelių pakitimai dažnai sukelia epigenetinius pokyčius, tačiau taip

pat gali atsirasti ir dėl kamieninių ląstelių populiacijos klonų evoliucijos, kai genetinės mutacijos

kaupiasi kamieninėse ląstelėse ir jų palikuonyse (1.3 pav. B) (Shackleton ir kt., 2009).

1.3. Naviko kamieninės ląstelės

Naviko kamieninės ląstelės turi pagrindines atsinaujinimo, klonų inicijavimo savybes ir

ilgalaikį populiacijos atkūrimo potencialą. Naviko kamieninės ląstelės gyvena nišomis, kurios yra

14

anatomiškai skirtingi regionai naviko mikroaplinkoje. Šios nišos išlaiko pagrindines navikinių

kamieninių ląstelių savybes, išsaugo fenotipinį plastiškumą, apsaugoja nuo imuninės sistemos ir

palengvina metastazavimą (Plaks ir kt., 2015).

Kamieninės ląstelės padarė pagrindą daugybei klausimų apie vystymosi biologiją. Žmogus

vystosi pagal iš anksto nustatytą planą, kuris paverčia apvaisintą kiaušinėlį į sudėtingą daugialąstį

organizmą. Apvaisintas kiaušinėlis vystosi į totipotentinių ląstelių kamuolėlį, kurios vėliau vystosi į

tris gemalo sluoksnius: endodermą, ektodermą ir mezodermą. Šie trys primityvūs ląstelių tipai

vystosi į visus suaugusio kūno audinius. Audiniai, kuriuose atsiranda piktybiniai dariniai, tokie kaip

kraujas, smegenys, krūtys, oda ir kiti gyvybiniai organai turi ląstelių hierarchiją su maža audiniui

specifinių kamieninių ląstelių populiacija, atsakinga už vystymąsi ir audinių priežiūrą, kad žmogus

gyventų (Lobo ir kt., 2007).

Keli svarbūs tyrimai privedė prie hipotezės, kad naviko kamieninės ląstelės gali būti

atsakingos už naviko augimą ir išlikimą. Pirmiausia, daugybė navikų atsiranda iš vienos ląstelės, bet

ne visos ląstelės navike yra identiškos. Tai taip pat yra žinoma kaip naviko heterogeniškumas.

Navike yra daugybė skirtingų naviko ląstelių tipų, kai kurios iš jų yra navikinės, kai kurios

infiltruotos naviko neformuojančios ląstelės, kurios manoma padeda naviko ląstelėms augti. Beja,

navikai atsiranda iš vienos transformuotos ląstelės, o navikinės ląstelės navike gali rodyti skirtingus

fenotipus, kurie šiek tiek primena normalų audinį iš kurio yra kilusios (pvz.: įvairi morfologija,

specifinių baltymų raiška, kurie būdingi subrendusioms arba nesubrendusioms to organo ląstelėms)

bei turi besikeičiantį proliferacijos potencialą (Park ir kt., 1971).

1.4 pav. Naviko kamieninės ląstelės ir terapija. Modifikuota pagal

http://www.eurostemcell.org/factsheet/cancer-disease-stem-cells

15

Jei terapiniai vaistai nužudo didžiąją dalį naviko ląstelių, tačiau naviko kamieninės ląstelės

išlieka, jos pradeda dalintis ir tampa naviko atsinaujinimo priežastimi (1.4 pav.) (Magee ir kt.,

2012).

1.4. Navikinių ląstelių žymenys

Duomenų apie pirminių krūties naviko ląstelių fenotipą yra mažai. Dažniausiai tiriama

naviko ląstelių CD24- ir CD44+ žymenų raiška (Ricardo ir kt., 2011), taip pat KI67 proliferacijos

žymens raiška (Gerdes ir kt., 1991), tačiau kitų ligos vystymuisi reikšmingų žymenų tyrimų atlikta

nedaug.

1.4.1. CD24 ir CD44 diferenciacijos antigenai

Žmogaus krūties navikuose esti nedidelė dalis ląstelių populiacijos, kuri turi kamieninėms

ląstelėms būdingų požymių. Šios ląstelės, vadinamos kamieninėmis naviko ląstelėmis. Jos geba

diferencijuotis į skirtingų tipų ląsteles, atsinaujinti bei formuoti navikus ksenografiniame modelyje,

pvz.: pelės organizme (Al-Hajj ir kt., 2003). Šios ląstelės apibūdinamos kaip turinčios CD44

antigeno ir neturinčios CD24 antigeno arba turinčios jo nedaug (CD44+/CD24-) (Naor ir kt., 2008;

Ponta ir Herrlich, 2003).

CD24 – viengrandis transmembraninis glikoproteinas (Fang ir Tang, 2010). Jis veikia kaip

specifinis hialiurono rūgšties receptorius, skatinantis naviko neformuojančių ląstelių judėjimą

(Baumann ir kt., 2005). CD24 žymens raiška pasižymi hematopoetinės, nervinio audinio, epitelinės,

raumenų, kasos ir kitos ląstelės bei įvairių tipų naviko ląstelės. CD24 raiška siejama su

invazyvumu, mobilumu ir padidėjusia navikinių ląstelių proliferacija (Rostoker ir kt., 2015).

Svarbus žymuo krūties navikinėse ląstelėse yra ir transmembraninis glikoproteinas CD44

(Sneath ir Mangham, 1998). Šis baltymas yra susijęs su ląstelių proliferacija, judėjimu ir

diferenciacija bei dalyvauja daugelyje viduląstelinių signalų perdavimo pakopų, (Adamia ir kt.,

2005). Skirtingos CD44 formos randamos daugelyje normalių žmogaus organizmo ląstelių, ypač

epiteliniuose ir hematopoetiniuose audiniuose (Stamenkovic ir kt., 1991). Tiek in vitro tiek in vivo

tyrimai parodė, kad CD44 yra aktyvus krūties naviko ląstelėse, o naviko neformuojančiose krūties

audinio ląstelėse jis neaktyvus (Yang ir kt., 2015). Slopinant šį baltymą yra skatinama ląstelių

proliferacija, todėl amnoma, kad CD44 yra būdingas naviko kamieninėms ląstelėms (Pham ir kt.,

2011). CD44 žymuo taip pat reikalingas kamieninių naviko ląstelių įsitvirtinimui tolesniuose

audiniuose (Zoller, 2011).

16

1.4.2. Ki67 proliferacijos žymuo

KI67 – nehistoninis branduolio baltymas (Gerdes ir kt., 1991), kuris naudojamas kaip

ląstelių proliferacijos žymuo, nes šis baltymas aptinkamas visose ląstelės ciklo fazėse, išskyrus G0,

kai ląstelė nesidalija (Jonat ir Arnold, 2011). Dar nėra žinomos tikslio Ki67 baltymo funkcijos, bet

nustatyta, kad jis reikalingas ląstelės dalijimuisi (Ross ir Hall, 1995).

KI67 nustatomas atliekant imunohistocheminį naviko audinio arba imunocitocheminį

fiksuotų ląstelių tyrimą (van Dierendonck ir kt., 1989; Cuzick ir kt., 2011), o rezultatai vertinami

apskaičiuojant ląstelių, kurių branduolyje aptinkamas šis žymuo, procentą (Munzone ir kt., 2012;

Aleksandarany ir kt., 2011). Skirtingos ląstelės ciklo fazės pasižymi nevienoda KI67 raiška – šio

baltymo gali būti tiek branduoliuose bei branduolėliuose. Skiriasi ir dažymosi intensyvumas –

pastebimas skirtingas grūdelių ar dėmelių dydis bei kiekis (Stathopoulos ir kt., 2014).

Ki67 baltymo raiška normaliame krūties audinyje nėra didelė – siekia vos 3 % (Harper-

Wynne ir kt., 2002; Clarke ir kt., 1997). Įprastai krūties naviko ląstelės pasižymi ganėtinai aukšta

Ki67 raiška, šio žymens aptinkama nuo 20 iki 100 % ląstelių (Subik ir kt., 2010), o Ki67 raiška

daugumoje pirminių navikų yra mažesnė nei 15 % (Inwald ir kt., 2013). Didelė Ki67 raiška siejama

su prasta ligos prognoze bei geru atsaku į chemoterapiją (Urruticoechea ir kt., 2005).

1.4.3. Fibroblastų aktyvavimosi baltymas α (FAB)

Fibroblastų aktyvavimo baltymas α (FAB) – ląstelių paviršiaus glikoproteinas, priklausantis

serino proteazių šeimai ir pasižymintis peptidaziniu aktyvumu (Shi ir kt., 2012). Ištirta, kad FAB

yra svarbus naviko mikroaplinkai. FAB laikomas su naviku susijusių fibroblastų žymeniu

(Christiansen ir kt., 2013; Liu ir kt., 2015).

Šio baltymo sunku aptikti sveikuose suaugusio žmogaus audiniuose, tačiau didele jo raiška

pasižymi audinių persitvarkymo sritys: embrioniniai audiniai, navikai, kepenų ir plaučių fibrozės

bei kt. (Hamson ir kt., 2014). FAB gali būti aptinkamas ir pačiose navikinėse ląstelėse ir naviko

stromoje (Zhang ir kt., 2015; Shi ir kt., 2012). FAB nustatytas krūties naviko ląstelėse (Shi ir kt.,

2012) bei kasos navikinių ląstelių linijose (Fang ir kt., 2010; Baumann ir kt., 2005). Manoma, kad

didelė FAB raiška įvairių tipų navikuose gali būti susijusi su padidėjusia metastazių limfmazgiuose

formavimosi tikimybe bei prasta ligos prognoze (Jis ir kt., 2014).

Taip pat manoma, kad šį baltymą galima aptikti su naviku susijusiuose leukocituose (Peng ir

kt., 2013). Parodyta, kad FAB svarbus naviko augimui ir angiogenezei, be to, FAB raiškos

sumažinimas naviko ląstelėse skatina ląstelių apoptozę bei kolageno skaidulų kaupimąsi (Lai ir

Wang, 2012).

17

1.5. Naviko slopikliai

Viena iš didžiausių problemų klinikiniame antinavikinių vaistų pritaikyme yra navikinių

ląstelių gebėjimas tapti atsparioms daugybei vaistinių preparatų. Išmėginama nemažai naujų ir jau

žinomų antinavikinių vaistų ir jų derinių siekiant atrasti didžiausią poveikį įvairioms navikinėms

ląstelėms turintį būdą (Lu ir kt., 2015).

1.5.1. Salinomicinas

Salinomicinas – monokarboksirūgšties polieterio antibiotikas, išskirtas iš Streptomyces

albus, kurio pagrindinis taikinys navike – navikinės kamieninės ląstelės. Tačiau mechanizmas,

kuriuo jis veikia, dar nėra gerai apibūdintas (Verdoodt ir kt., 2012). Šio antibiotiko gebėjimas

specifiškai žudyti lėtai proliferuojančias navikines kamienines ląsteles daug efektyviau nei

diferencijuotas navikines ląsteles net ir mažomis koncentracijomis privedė prie tyrimų naudojant

dažniausiai sutinkamus chemoterapinius preparatus kartu su salinomicinu (Fuchs ir kt., 2009;

Florian ir kt., 2014). Salinomicinas ir jo dariniai pasižymi stipriu antiproliferaciniu poveikiu prieš

vaistams atsparias navikinių ląstelių linijas. Šis antibiotikas sukelia mitochondrijų disfunkciją,

ląstelinio ATP koncentracijos sumažėjimą ir autofagiją (Naujolat ir Steinhart, 2012; Florian ir kt.,

2014).

Buvo nustatyta, kad mažos salinomicino koncentracijos skatina krūties naviko kamienines

ląsteles keisti fenotipą į navikines epitelines ląsteles, o didelės šio preparato koncentracijos sukelia

ląstelių apoptozę (Gunasinghe ir kt., 2012). Ląstelių perėjimas iš mechenchiminių į epitelines

(MET, angl. mesenchymal-epithelial transition) yra paremtas mezenchiminių savybių praradimu ir

epitelinio fenotipo įgijimu. Šie procesai gali slopinti navikinių ląstelių progresiją ir invaziją į

supančią mikroaplinką. Tokie pokyčiai stabdo krūties naviko progresavimą ir metastazavimą, už

kurį būtent ir yra atsakingos navikinės kamieninės ląstelės (Dianbo ir kt., 2011; Hyunsook ir kt.,

2015).

Nustatyta, kad salinomicinas gali potencialiai efektyviausiai veikti nusitaikydamas į krūties

naviko kamienines ląsteles per STAT3 (signalo daviklis ir transkripcijos 3 aktyvatorius) geno

slopinimą (Koddapully ir kt., 2014; Peibin ir Turkson, 2009).

1.5.2. Antimicinas A

Antimicinas A (AMA) yra stiprus priešgrybelinis preparatas, randamas simbiotinėse

Streptomyces kitazawensis bakterijose. AMA tiesiogiai veikia ląstelių mitochondrijas. Jis yra

mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso slopiklis, slopina sukcinato ir NADH oksidazę.

Oksidaciniame fosfirilinime elektronų transporto grandinėje veikia kaip ubikvinolio oksidacijos ir

mitochondrijų elektronų transporto tarp citochromų b ir c slopiklis. Pagal AMA gebėjimą sutrikdyti

18

mitochondrijų funkciją, šis antibiotikas buvo išmėgintas kaip potencialus antinavikinis preparatas

(Yong ir kt., 2008; Mohamad ir kt., 2015). Neseniai buvo nustatyta, kad AMA gali stabdyti plaučių

naviko ląstelių proliferaciją, sukeldamas oksidacinį stresą. Įdomiausia tai, kad AMA buvo įvardytas

kaip vienas iš efektyviausių junginių kovoje prieš navikines kamienines ląsteles (Chi-Tai ir kt.,

2013)

1.5.3. Natrio fenilbutiratas

Natrio fenilbutiratas (PBA) – histono diacetilazės slopiklis (HDACI). Tai aromatinė riebalų

rūgštis, in vivo oksiduojama į fenilacetatą β-oksidacijos būdu. Žmoguje taip susidaręs fenilacetatas

yra pašalinamas konjugacija su glutaminu susidarant fenacetilglutaminui, kuris yra išskiriamas su

šlapimu (Seisuke ir kt., 2012).

Natrio fenilbutirato gebėjimas slopinti histono diacetilazę padaro jį efektyviu preparatu

kovojant prieš naviką, kuris gali sukelti ląstelių diferenciaciją per chromatino modifikacijas ir genų

raiškos reprogramavimą. Tyrimuose in vitro buvo nustatyta, kad PBA turi potencialų antinavikinį

efektą, slopina navikinių ląstelių augimą ir diferenciaciją įvairiose žmogaus naviko ląstelėse

(pavyzdžiui storosios žarnos karcinomoje, Burkito limfomoje, pirminėje ūminėje mieloidinėje

leukemijoje, retinoblastomoje, prostatos navike ir kt.) (Dyer ir kt., 2002). Rezultatai parodė, kad

PBA efektyviai veikia skirtingus naviko tipus: hormonams atsparų prostatos naviką, hematologinį

piktybinį naviką, aukšto laipsnio astrocitomą, krūties karcinomą ir t.t. (Reynolds ir kt., 2000).

1.6. Hipertermija

Hipertermija – nauja terapija, turinti didelį potencialą, kaip pagalbinė naviko gydymo

priemonė. Vokietijoje hipertermija dar vadinama „onkotermija“ bei dešimtmečius naudojama kartu

su chemoterapija ir radioterapija. Taikoma aukštesnė nei 39°C temperatūra sukelia svarbius

metabolinius pokyčius naviko ląstelėse bei padaro jas labiau pažeidžiamas įprastiniu gydymu (Noh

ir Myoung, 2014; Sugaharu ir Tsutomu, 2008; Bettaieb ir kt., 2013).

Kaip veikia hipertermija? Šilumos taikymas sukelia svarbius metabolinius pokyčius naviko

ląstelėse, įskaitant ir baltymų denatūraciją bei agregaciją, dėl to sukeliamas ląstelės areštas ir

baltymų sintezės inaktyvacija (1.5 pav.) (Lepock ir James, 2005). Šiluma taip pat sukelia ląstelės

membranos pralaidumo pokyčius ir pasireiškia sumažėjusiu ląstelinio ATP kiekiu (Richter ir kt.,

2010; Sonna ir Larry, 2002). Naviko ląstelių branduolių baltymai yra ypač jautrūs hipertermijai

(Sugaharu ir Tsutomu, 2008). Šiluma naviko ląstelėms sukelia nemažai streso ir įvykę metaboliniai

pokyčiai padaro jas labiau jautrias chemoterapijai bei radioterapijai (Bettaieb ir kt., 2013; Van Der

Zee, 2002; Van Der Zee, 2008).

Pagrindinis visų standartinių naviko gydymo terapijų tikslas yra kuo efektyviau pažeisti

19

navikines ląsteles. Yra žinoma, kad hipertermijos taikymas sukelia pakitusioms ląstelėms nemažai

streso. Streso, sukelto hipertermijos ir chemoterapijos ar radioterapijos, kombinacija naviko

ląstelėms yra neįveikiama. Hipertermija ir kitos terapijos kartu veikia sinergistiškai, todėl toks

gydymo taikymas pacientams su solidiniais navikais, kuriems jau taikoma chemoterapija arba

radioterapija turėtų būti potencialiai apsvarstytas.

Chemoterapijai naudojami vaistai dažnai būna toksiški ne tik naviko ląstelėms, bet ir

sveikoms. Naviko ląstelėms blogiau sekasi tvarkytis su aukštesne temperatūra, nes jos yra labai arti

viena kitos, o normalios ląstelės yra geriau išsidėsčiusios erdvėje, todėl jos geriau paskirsto šilumą.

Keletas tyrimų parodė, kad naviko ląstelės yra labiau pažeidžiamos šiluma, nei normalios ląstelės

(Babbs ir kt., 1980).

1.5 pav. Hipertermijos sukeliami procesai ląstelėje. Modifikuota pagal

http://yaletownnaturopathic.com/loco-regional-hyperthermia

Chemoterapijai naudojami vaistai dažnai būna toksiški ne tik naviko ląstelėms, bet ir

sveikoms. Naviko ląstelėms blogiau sekasi tvarkytis su aukštesne temperatūra, nes jos yra labai arti

viena kitos, o normalios ląstelės yra geriau išsidėsčiusios erdvėje, todėl jos geriau paskirsto šilumą.

Keletas tyrimų parodė, kad naviko ląstelės yra labiau pažeidžiamos šiluma, nei normalios ląstelės

(Sugaharu ir Tsutomu, 2008; Babbs ir kt., 1980). Hipertermija yra citotoksiška naviko ląstelėms ir

gali sinergistiškai citotoksiškai veikti kartu su chemoterapija.

20

Reaktyviosios deguonies formos (ROS) yra didelio reaktyvumo molekulės, kurios naikina

DNR ir kitus svarbius elementus naviko ląstelėse. Dauguma chemoterapinių vaistų veikia būtent

generuodami ROS, kurios ir naikina šias nesustabdomai augančias ląsteles. Aukšta temperatūra

padidina biocheminių reakcijų lygį, bendras efektas ląstelėms – pagreitėjęs ląstelių metabolizmas.

Tai aktualu pacientams, kuriems taikoma chemoterapija, nes pagreitėjęs ląstelių metabolizmas

sukelia svarbų ROS padidėjimą ir oksidacinį stresą (Moryyama-Gonda, 2000; Katschinski ir

Dorthe, 1999; Bettaieb ir kt., 2008). Hipertermijos taikymas padidina reaktyvių deguonies formų

generaciją, pvz.: vandenilio peroksidai, superoksidai. Aukšta temperatūra padaro šias molekules

netgi labiau reaktyvias (Lord-Fontaine ir kt., 1999). Bendras aukštesnės temepratūros efektas yra

svarbus ROS susidarymo ir aktyvumo padidėjimas naviko ląstelėse.

Vienas iš didžiausių iššūkių chemoterapijoje – efektyviai vaistu pasiekti naviką. Navikai

prastai aprūpinami krauju, nes ląstelės yra labai arti viena kitos. Dažnai tik mažas procentas

chemoterapijai naudojamų vaistų iš tiesų patenka į naviką (Drummond ir Daryl, 1999). Kai bet

kuris audinys žmogaus organizme yra šildomas, sukeliamas kraujagyslių išsiplėtimas. Šildant

naviką, padidinamas kraujo tiekimas į naviką, todėl vaistas daug efektyviau patenka į piktybinį

darinį. Tai ypač svarbu pacientams, kuriems išsivystę solidiniai navikai, nes hipertermija padidina

vaisto patekimo į naviką efektyvumą.

Chemoterapija dažnai susilpnina imuninę sistemą, o tai yra didelė problema, nes stipri

imuninė sistema būtina nugalėti navikui. Chemoterapija ar radioterapija nebus efektyvios, jei

imuninė sistema nebus pajėgi sutvarkyti metabolinę netvarką. Aukštos temperatūros taikymas

stimuliuoja įvairius imuninės sistemos elementus (Bogovic, 2001). Yra žinoma, kad aukšta

temperatūra pagreitina imuninių ląstelių migraciją prie taikinio ir padidina jų aktyvumą kovojant

prieš naviko ląsteles (Hiraga ir kt., 2011).

21

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1. Naudotos medžiagos

Ląstelių auginimui buvo naudota Dulbeco modifikuota Eagle terpė (DMEM), krūties naviko

ląstelių auginimui buvo naudota DMEM/Ham‘s F12 (1:1) terpė. Naudoti terpių priedai: fetalinis

veršelio serumas (FVS), penicilinas/streptomicinas (P/S). Prilipusių ląstelių monosluoksnio

suardymui buvo naudotas 0,025% tripsino EDTA tirpalas (Sigma Aldrich, Vokietija).

Ląstelių gyvybingumo įvertinimui naudotas tripano mėlis (Biochrom AG, Vokietija).

Tyrimuose naudoti fluorescenciniai dažai – bis Benzimide trihydrochloride HOECHST 33342

(Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Šveicarija).

Ląstelių išskyrimui iš biopsinės medžiagos buvo naudota III tipo kolagenazė (150 U/ml),

(Sigma-Aldrich, JAV).

Imunocitochemijai buvo naudoti pirminiai antikūnai Ki67, CD24, CD44 ir FAB ir antrinis

AlexaFluor 488 Green.

Tyrimuose naudoti slopikliai: salinomicinas (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Izraelis),

antimicinas A (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Izraelis) ir natrio fenilbutiratas (Sigma-Aldrich

Chemie Gmbh, Jungtinės Amerikos Valstijos). Ląstelės buvo auginamos vienkartiniuose auginimo induose ląstelių kultūroms ir Petri

lėkštelėse, imunocitocheminiams tyrimams ląstelės augintos 24 šulinėlių plokštelėse su

dengiamaisiais stikleliais, o kolonijų formavimo analizei ;ąste;ės augintos 12 šulinėlių plokštelėse.

Ląstelių gyvybingumui įvertinti fluorescenciniu metodu, jos buvo auginamos 96 šulinėlių

plokštelėse juodu dugnu (Greiner, Vokietija).

2.2. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų išskyrimas iš naviko

Krūties naviko pirminės ląstelių kultūros buvo paruoštos iš dalies navikinio audinio

biopsijos medžiagų, paimtų iš LSMU pacienčių.

Ląstelės buvo išskiriamos dviem būdais: 1) Navikinio audinio biopsijos pavyzdys ląstelėms

išskirti užpilamas 1 ml 0,025 % tripsino tirpalu ir perkeliamas į 15 ml mėgintuvėlį. Mėginiai 60 min

laikomi kratytuve (37 °C, 350 rpm), po to 5 min centrifuguojami (420 g). Supernatantas nupilamas,

o likusi medžiaga perkeliama į indelį ląstelių kultūroms auginti ir užpilama 4 ml auginimo terpės,

paruoštos iš DMEM, 10 % FVS ir 1 % P/S.

2) Navikinio audinio biopsijos pavyzdys ląstelėms išskirti buvo paveiktas 1 mg/ml

kolagenaze (tipas III) ir 0,025 % tripsino tirpalu. Mėginys susmulkinamas, padalinamas į du

22

mėgintuvėlius ir centrifuguojamas 5 min (420 g). Supernatantas nupilamas, o ant likusios

medžiagos užpilama 1 ml tripsino arba III tipo kolagenazės tirpalo. Mėginiai 60-čiai minučių

perkeliami į kratytuvą (37 °C, 350 rpm), po to 5 min centrifuguojami (420 g). Supernatantas

nupilamas, o likusi medžiaga užsėjama į indelius ląstelių kultūroms auginti su augimo terpe

(DMEM/Ham’s F12, 10 % FVS, 100 U/ml penicilino - 100µg/ml streptomicino) ir inkubuojama

37°C drėgnoje 5 % CO2 atmosferoje.

Po 24 val. visos negyvos ir neprilipusios ląstelės pašalinamos. Augimo terpė keičiama

kiekvieną dieną, kol prilipusios ląstelės pasiekia 90 % konfluenciją. Susiformavus ląstelių

monosluoksniui, ląstelių kultūros persėjamos 1–2 kartus per savaitę. Tyrimams naudojamos ne

didesnio nei 10 pasažo pirminės ląstelių kultūros.

2.3. Tyrimams naudotų navikinių ir naviko neformuojančių ląstelių auginimas

Navikinių ląstelių kultūros buvo auginamos DMEM/Ham‘s F12 terpėje (1:1), praturtintoje

10 % FVS ir antibiotikais (100 U/ml penicilino, 100 µg/ml streptomicino). Naviko neformuojančios

ląstelės auginamos DMEM terpėje, papildytoje tokiomis pačiomis koncentracijomis FVS ir

antibiotikais.

Ląstelės kultivuojamos persėjant jas esant 70 – 80 % konfluencijai.

2.4. Ląstelių proliferacijos įvertinimas fluorescenciniu metodu, naudojant

Hoechst 33342

Prieš dažant ląstelės vieną kartą nuplaunamos DMEM terpe. Ant nuplautų ląstelių

užpilama terpė be serumo, kurioje Hoechst 33342 koncentracija 4 µg/ml ir inkubuojama 37°C

drėgnoje 5 % CO2 atmosferoje 45 min. Po praėjusio laiko, ląstelės tris kartus plaunamos

fiziologiniu tirpalu. Hoechst 33342 dažo fiksuotas ir gyvas ląsteles. Fluorescencija nustatoma

fluorimetru Fluoroskan Ascent™ Microplate Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Jungtinės

Amerikos Valstijos). 96 šulinėlių plokštelėje juodu dugnu matavimai atliekami esant sužadinimo

355±10 nm ir emisijos - 460±10 nm bangos ilgiams (atliekami mažiausiai 3 kiekvieno pavyzdžio

matavimai 100 µl ląstelių suspensijos 3x104 ląst./ml). Matuojant fluorescenciją, įvertinamas PBS

buferio fonas.

23

2.5. Kolonijų formavimo arba klonogeninė analizė

Ląstelės sėjamos į 12 šulinėlių plokšteles po 100 ląstelių į šulinėlį, sekančią dieną ląstelės

veikiamos slopikliais, kurie keičiami kas trečią dieną, po 5-10 parų ląstelės fiksuojamos 15 min 4 %

paraformaldehido tirpalu ir dažomos kristalo violetu. Nudažytos ląstelės fotografuojamos ir

skaičiuojamas kolonijų kiekis ir plotas (tikra kolonija laikoma tokia, kuri susideda iš daugiau nei 50

ląstelių).

2.6. Navikinių ląstelių žymenų (CD24, CD44, KI67 ir FAB) nustatymas

imunocitocheminiu metodu

Ląstelių suspensijos išsėjamos į 24 šulinėlių ląstelių auginimo plokštelę su dengiamaisiais

stikliukais dugne augimo terpėje DMEM/Ham‘s F12 su 10 % FVS, 100 U/ml penicilino ir 100

µg/ml streptomicino. Po 24 h nupilama augimo terpė, ląstelės kartą plaunamos kambario

temperatūros PBS tirpalu, fiksuojamos 15 min 4 % paraformaldehidu, po to tris kartus plaunamos

PBS. Ląstelės permeabilizuojamos 15 min. 0,2 % Triton X-100/PBS ir blokuojamos 1 % JSA/PBS

tirpalu vieną valandą.

Pirminiai antikūnai paruošiami su 1 % JSA tirpalu tokiu santykiu 1:20 (triušio polikloninis

antikūnas prieš FAB) arba 1:30 (pelės monokloninis antikūnas CD24, triušio polikloninis antikūnas

CD44, pelės monokloninis antikūnas KI67). Ląstelės su antikūnais inkubuojamos 1 val. 37 °C

temperatūroje. Po pirminio antikūno veikimo mėginiai penkis kartus plaunami JSA/PBS tirpalu.

Antrinis ožkos polikloninis antikūnas prieš pelės imunoglobulinus ar asilo polikloninis antikūnas

prieš triušio imunoglobulinus, konjuguoti su Alexa Fluor 488 dažu veikia ląsteles santykiu 1:125 su

JSA/PBS tirpalu. Plokštelė įdedama į vandens vonelę ir inkubuojama 30 min 37 °C. Po inkubacijos

dengiamieji stikleliai tris kartus plaunami JSA/PBS tirpalu ir vieną kartą PBS tirpalu. Dengiamieji

stikleliai su paruoštomis ląstelėmis nusausinami ir ant objektinio stiklelio užlašinama tvirtinimo

terpės su DAPI („Vectashield“, JAV). Stikliukai klijuojami prie objektinio stiklelio. Pavyzdžiai

analizuojami motorizuotu invertuotu mikroskopu Olympus IX81 (Olympus, Japonija).

2.7. Ląstelių invazyvumo tyrimas „žaizdos gijimo“ metodu

Ląstelių invazyvumas buvo tiriamas “žaizdos gijimo” metodu. Ląstelės šiam metodui

auginamos iki 90 % konfluencijos ant plonadugnių lėkštelių, tada monosluoksnis perbraukiamas

steriliu 10 µl pipetės antgaliu. Ląstelės plaunamos šviežia terpe ląstelių nuolaužoms

pašalinti. Ląstelių gebėjimas užpidyti įbraižą įvertintas apskaičiuojant procentinę užpildytą ląstelių

24

dalį įbraižoje. Vaizdai laike fiksuojami 10 val. 37 °C temperatūroje drėgnoje 5 % CO2 atmosferoje,

naudojant inkubavimo sistemą INUBG2EONICS (Tokai Hit, Shizuoka-ken, Japonija) ant motorinio

Olympus IX81 mikroskopo (Olympus Europe holding Gmbh, Hamburg, Germany), įrengto su x20

DIC imersijos objektyvu prie kurio įmontuotas inkubatorius.

2.8. Fluorescencinės mikroskopijos analizė

Fluorescencinės mikroskopijos nuotraukos darytos invertuotu mikroskopu Olympus IX81

(Olympus Europe holding Gmbh, Hamburgas, Vokietija) su vaizdo analizės sistema Olympus

xcellence 2.0. Naudoti filtrai: žalias (sužadinimui naudotas 470 nm filtras, o emisijai registruoti –

525 nm filtras), mėlynas (sužadinimui naudotas 350 nm filtras, o emisijai registruoti – 470 nm

filtras).

2.9. Statistinė duomenų analizė

Kiekybiniai duomenys pateikiami kaip aritmetiniai vidurkiai ± standartinė paklaida (SE),

apskaičiuoti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų, jei nenurodyta kitaip. Eksperimentinių

duomenų analizė buvo atliekama naudojant SigmaPlot (v10.0) kompiuterinę programą. Duomenų

kitimo patikimumas įvertintas taikant neporinių eksperimentų, dviejų nuokrypių Stjudento t-testą.

Duomenys laikomi statistiškai patikimais, kai P yra mažesnis nei 0,05 (* - p < 0.05).

25

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Naviko žymenų raiška krūties naviko pirminių ląstelių kultūrose

Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų (BC1, BC2, BC4, BC5 ir BC6) būdingų žymenų

CD24, CD44, KI67 ir FAB raiška buvo vertinama darant fluorescencinės mikroskopijos nuotraukas

su invertuotu mikroskopu Olympus IX81 su vaizdo analizės sistema Olympus xcellence 2.0.

Nurodytos ląstelių kultūros buvo sėjamos į 24 šulinėlių plokšteles ant dengiamųjų stikliukų

po 2000 ląstelių į šulinėlį. Po 24 valandų ląstelės dažomos imunocitocheminiu metodu, kaip

nurodyta metodikoje.

3.1 pav. CD24 žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didinimas x20)

Visose tirtose krūties naviko pirminėse ląstelių kultūrose nustatyta CD24 žymens raiška (3.1

pav.), tačiau ląstelių, turinčių šį žymenį kiekis kultūrose skiriasi. BC1 ir BC4 ląstelių kultūrose yra

mažiau ląstelių, turinčių CD24 baltymo, nei BC2 ir BC5 ląstelių kultūrose. BC6 ląstelių kultūroje

CD24 žymuo pasiskirstęs visoje ląstelių citoplazmoje.

3.2 pav. CD44 žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didnimas x20)

BC1, BC5 ir BC6 kultūrose CD44 žymenį turinčių ląstelių yra daugiausia, šiose ląstelėse šis

žymuo pasiskirstęs po visą ląstelių citoplazmą. BC2 ląstelių kultūroje tokių ląstelių yra mažiau,

negu anksčiau minėtose kultūrose. Dauguma BC4 ląstelių šio žymens neturi, o jį turinčiose ląstelėse

šis baltymas susitelkęs prie branduolio (3.2 pav.). Gautus rezultatus sunku interpretuoti, nes ląstelės

turinčios CD44(+), bet neturinčios CD24(-) vadinamos turinčiomis navikinių kamieninių ląstelių

BC1 BC2 BC4 BC5 BC6

BC1 BC2 BC4 BC5 BC6

26

fenotipą, tačiau BC6 ląstelių kultūroje abiejų žymenų raiška yra gan didelė, todėl galime teigti, kad

ši ląstelių kultūra yra heterogeniška – ląstelės nėra vieno tipo.

3.3 pav. Ki67 žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didinimas x10)

Visos tirtos ląstelių kultūros pasižymi didele proliferacijos žymens Ki67 raiška. BC5

kultūroje, ląstelių turinčių šį žymenį yra daugiau, nei kitose ląstelių kultūrose (3.3 pav.). Kultūras

lyginant tarpusavyje, BC6 turi mažiausiai Ki67 proliferacijos žymens.

Krūties naviko pirminių ląstelių kultūros, kaip ir literatūroje aprašytos komercinės krūties

navikų ląstelių linijos, naudojamos eksperimentams, pasižymi didele Ki67 proliferacijos žymens

raiška.

3.4 pav. FAB žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didinimas x20)

Iš 3.4 pav. matyti, kad šios ląstelių kultūros yra heterogeniškos: yra tiek FAB raiška

pasižyminčių, tiek šio baltymo neturinčių ląstelių. Su naviku susijusiems fibroblastams būdingo

FAB turinčios ląstelės išsidėsčiusios grupėmis. Dalis BC1, BC2, BC4 ir BC5 ląstelių kultūrų

FAB(+) ląstelių šį baltymą turi tik branduolyje, o kitos ląstelės – ir branduolyje, ir citoplazmoje.

BC6 ląstelių kultūros FAB(+) ląstelėse šis baltymas nustatytas tik branduoliuose.

Visose tirtose ląstelių kultūrose nustatyta FAB turinčių ląstelių, tačiau jų kiekis nedidelis

(iki 10%). Šio baltymo raiška krūties naviko pirminėse ląstelių kultūrose literatūroje nėra aprašyta.

Siekiant tiksliau įvertinti skirtumus tarp BC ląstelių kultūrų, atliktas kiekybinis navikui

būdingų žymenų CD24, CD44, Ki67 ir FAB raiškos tyrimas. Gauti rezultatai (± standartinė

paklaida) pateikti 3.1 lentelėje:

BC1 BC2 BC4 BC5 BC6

BC1 BC2 BC4 BC5 BC6

27

3.1 lentelė. Navikui būdingų žymenų raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose kiekybiškai (%)

CD24 CD44 Ki67 FAB

BC1 24±1,1 64±1,8 89±1,9 7±0,5

BC2 63±2,3 32±1,2 82±7,7 4±1,4

BC4 21±1,7 15±0,8 83±1,1 6±1,2

BC5 59±3,1 73±2,7 98±1,3 2±0,2

BC6 84±4,0 71±1,9 77±5,6 4±0,8

Ištirta, kad BC ląstelių kultūros pasižymi aukšta Ki67 proliferacijos žymens raiška bei turi

navikinėms ląstelėms būdingus (stipriai išreikštus audinių persitvarkymo srityse) su fibroblastais

susijusius baltymus, todėl galima teigti, kad šios ląstelių kultūros yra navikinės.

3.2. Krūties adenokarcinomos MDA-MB-231 ir pirminių naviko ląstelių

kultūrų (krūties naviko – BC1, BC2, BC4, BC5, BC6 ir gerklų karcinomos

LSCC) proliferacijos pokyčiai paveikus slopikliais, fluorescenciniu metodu,

naudojant Hoechst 33342

Įvertintos fluorescencinio metodo, naudojant Hoechst 33342, jautrumo ribos ir atlikti MDA-

MB-231 ląstelių Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumo priklausomybės nuo ląstelių kiekio

tyrimai ląstelių kiekio matavimui (3.5 pav.).

3.5 pav. MDA-MB-231 ląstelių linijos Hoechst 33342 fluorescencijos priklausomybė nuo ląstelių

skaičiaus

y = 2.933x + 1.412R² = 0.967

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

Ląstelių skaičius, x103

28

Gauti rezultatai (3.5 pav.), kad Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumas patikimai

priklauso ląstelių kiekio esant ir mažai ir didelei ląstelių koncentracijai. Gautas koreliacijos

koeficientas 0,967 parodo, kad ląstelių skaičius patikimai atitinka Hoechst 33342 fluorescencijos

intensyvumą .

MDA-MB-231 ir krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų (BC1, BC2, BC4, BC5 ir BC6) bei

pirminių gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos LSCC ląstelių proliferacijos pokyčiai paveikus

slopikliais (100 nM salinomicinas, 10 µM antimicinas A ir 100 µM natrio fenilbutiratas) buvo

vertinami fluorescenciniu metodu, ląstelių branduolius dažant Hoechst 33342. Duomenų

išsibarstymą galima paaiškinti tuo, kad pirminės krūties naviko ląstelių kultūros tiriamos atlikus tik

keletą persėjimų, todėl šios ląstelės labiau atitinka naviko savybes, joms būdingos ląstelių

subpopuliacijos – piktybiniame darinyje gali būti su naviku susijusių fibroblastų ar mezenchiminių

(kamieninių) ląstelių, tai gali lemti svarbius ląstelių fenotipo pokyčius ir sukelti sunkumų

interpretuojant gautus tyrimų rezultatus.

Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 96 šulinėlių fluorescencijos matavimams skirtas

plokšteles, 3x103/100 µl koncentracija. Po 24 val. DMEM/Ham‘s F12 (MDA-MB-231 ir BC) arba

DMEM (LSCC) terpė keičiama į paruoštą terpę su atitinkama slopiklio koncentracija. Praėjus 48 ir

72 val., atliekami matavimai fluorimetru prie sužadinimo 355±10 nm ir emisijos - 460±10 nm

bangos ilgių.

3.6 pav. MDA-MB-231 ląstelių proliferacija pagal Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumą po

48 (A) ir 72 valandų (B) slopiklių poveikio (n=3)

Po 48 val. poveikio slopikliais, MDA-MB-231 kontrolinių ląstelių proliferacija buvo beveik

5 kartus didesnė, nei ląstelių, paveiktų salinomicinu, o antimicinas A ir natrio fenilbutiratas mažino

ląstelių proliferaciją 4 kartus.

Po 72 val. poveikio slopikliais, didžiausią neigiamą efektą MDA-MB-231 ląstelių

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

K Sal AMA PBA

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

A

***

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

K Sal AMA PBA

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

B

*

*

29

proliferacijai turėjo antimicinas A (~50 %), o salinomicinas ląstelių proliferaciją paskatino 40 %

(3.6 pav.).

3.7 pav. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, po

48 valandų slopiklių poveikio (n=3)

Praėjus 48 eksperimento valandoms buvo stebimas didelis rezultatų išsibarstymas. Atliktų

eksperimentų su BC1, BC2 ir BC4 ląstelių kultūromis rezultatus sunku įvertinti proliferacijos

sumažėjimą ar padidėjimą. BC5 ląstelių kultūros proliferaciją mažino visi slopikliai, didžiausias

neigiamas efektas pasiektas naudojant salinomiciną – proliferacija sumažėjo ~86 %. BC6 ląstelių

kultūros proliferaciją taip pat mažino visi naudoti slopikliai, natrio fenilbutiratas proliferaciją

sumažino net ~90 % (3.7 pav.).

3.8 pav. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, 72

val. po slopiklių poveikio (n=3)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

BC1 BC2 BC4 BC5 BC6

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

K

Sal

AMA

PBA

* * *

***

0

5

10

15

20

25

30

35

40

BC1 BC2 BC4 BC5 BC6

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

KSalAMAPBA

*

**

**

*

*

*

30

Praėjus 72 val. po poveikio slopikliais, didžiausias efektyvumas visų ląstelių kultūrų

proliferacijos sumažėjimui buvo pasiektas naudojant natrio fenilbutiratą, išskyrus BC1 ląstelių

kultūrą, kuriai patikimo proliferacijos mažinimo negalinme įvertinti dėl didelio rezultatų

išsibarstymo. Salinomicino poveikis BC2 ląstelių kultūros proliferaciją patikimai padidino.

Antimicinas A slopino BC4, BC5 ir BC6 ląstelių augimą (3.8 pav.).

Atlikus proliferacijos tyrim duomenų palyginimui tarp pirminių ląstelių kultūrų ir

komerciškai prieinamų išvestų ląstelių linijų, galima daryti išvadą, kad BC2 ląstelių kultūros atsakas

į naudotų slopiklių poveikį yra panašus į MDA-MB-231 atsaką – praėjus 48 eksperimento

valandoms, naudoti slopikliai šių ląstelių priliferaciją mažina, o po 72 eksperimento valandų,

salinomicinas jų proliferaciją skatina, o antimicinas A slopina.

3.9 pav. LSCC ląstelių proliferacija pagal Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumą po 48 (A) ir

72 val. (B) slopiklių poveikio (n=3)

Po 48 val. poveikio slopikliais, LSCC ląstelėms didelį poveikį ląstelių proliferacijos

sumažęjimui turėjo visi naudoti slopikliai (~80 %).

Praėjus 72 val., didžiausią poveikį ląstelių augimui turėjo natrio fenilbutirato poveikis –

proliferacija sumažėjo net ~84 %, paveikus antimicinu A - ~78 %, o salinomicinu - ~55 %

(3.79pav.).

Lyginant slopiklių poveikį priminių krūties ir gerklų navikų ląstelių proliferacijai, nustatyta,

kad jautresnės po 48 ir 72 valandų slopiklių poveikio, yra pirminės gerklų plokščiųjų ląstelių

karcinomos LSCC ląstelės.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

K Sal AMA PBA

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

* * *

A

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

K Sal AMA PBA

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

**

*

B

31

3.3. Naviko neformuojančių ląstelių linijų proliferacijos pokyčiai paveikus

slopikliais fluorescenciniu metodu, naudojant Hoechst 33342

Naviko neformuojančių ląstelių (ASM, WI38, RMB ir MSC) proliferacija paveikus

slopikliais (100 nM salinomicinas, 10 µM antimicinas A ir 100 µM natrio fenilbutiratas) buvo

vertinama fluorescenciniu metodu, ląstelių branduolius dažant Hoechst 33342.

Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 96 šulinėlių plokšteles juodu dugnu, 3x103/100

µl koncentracija. Po 24 valandų DMEM terpė keičiama į paruoštą terpę su atitinkama slopiklio

koncentracija. Praėjus 48 ir 72 val., atliekami matavimai fluorimetru prie sužadinimo 355±10 nm ir

emisijos - 460±10 nm bangos ilgių.

3.10 pav. Naviko neformuojančių ląstelių proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, veikiant

slopikliais 48 valandas (n=3)

Naviko neformuojančių ląstelių linijoms didžiausią poveikį po 48 val. poveikio slopikliais

turėjo antimicinas A – sumažino RMB ir ASM ląstelių proliferaciją, tačiau wi38 ir MSC ląstelių

proliferacijos šis slopiklis nemažino. RMB ląstelių proliferaciją salinomicinas mažino tik keliais

procentais, natrio fenilbutiratas patikimo poveikio šių ląstelių proliferacijai neturėjo. Paveikus MSC

ląsteles nurodytais slopikliais, nebuvo stebimas ląstelių proliferacijos slopinimas. ASM ląstelių

proliferaciją paveikė visi naudoti slopikliai – salinomicinas jų augimą sumažino ~20 %, natrio

fenilbutiratas apie ~34 %, o antimicinaas A net ~77 % (3.10 pav.).

05

10152025303540

wi38 RMB MSC ASM

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

KSalPBAAMA

*

*

**

*

*

*

**

*

32

3.11 pav. Naviko neformuojančių ląstelių proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, veikiant

slopikliais 72 valandas (n=3)

Praėjus 72 slopiklių poveikio valandoms, salinomicinas ir natrio fenilbutiratas reikšmingo

poveikio naviko neformuojančių ląstelių proliferacijai neturėjo, o antimicinas A RMB, MSC ir

ASM ląstelių proliferaciją mažino. Fibroblastų augimo naudoti slopikliai neveikė reikšmingu

pokyčiu (3.11 pav.).

3.4. Hipertermijos ir navikinių slopiklių poveikis krūties naviko ląstelių

proliferacijai

Pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų (BC2 ir BC5), krūties adenokarcinomos MDA-MB-

231 ir krūties duktalinė karcinomos MCF-7 ląstelių proliferacija, paveikus hipertermija bei naviko

slopikliais buvo vertinama fluorescenciniu metodu, ląstelių branduolius žymint Hoechst 33342.

Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 96 šulinėlių plokšteles, juodu dugnu, po 3000

ląstelių į šulinėlį. Po 24 val. plokštelė ląstelių įjautrinimui temperatūra įdedama 5 valandoms į

inkubatorių, kuriame temperatūra 40 °C, po 5 valandų DMEM/Ham‘s F12 terpė keičiama į paruoštą

terpę su atitinkama slopiklio koncentracija ir plokštelė dedama į normalią 37 °C temperatūrą.

Praėjus 48 val., atliekami matavimai fluorometru prie sužadinimo 355±10 nm ir emisijos - 460±10

nm bangos ilgių.

0

10

20

30

40

50

60

wi38 RMB MSC ASM

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v.

KSalPBAAMA*

**

33

3.12 pav. BC2, BC5, MDA-MB-231 ir MCF-7 ląstelių proliferacija po 5 val. poveikio hipertermija

ir 48 val. poveikio slopikliais (n=3)

Ląstelės 5 valandas 40 °C temperatūroje buvo laikomos siekiant jas įjautrinti, tam, kad

pasiekti efektyvesnį slopiklių poveikį ląstelių proliferacijos slopinimui. Buvo gautas ir netikėtas

hipertermijos efektas, ląsteles paveikus 40°C temperatūra 5 val., kai kuriais atvejais stebėtas

didesnis ląstelių atsparumas slopiklių poveikiui. Abiem atvejais, paveikus ląsteles minėtais

veiksniais, buvo pasiektas skirtingas efektas su skirtingoms ląstelių linijoms. Po 48 val. slopiklių

poveikio, BC2 ląstelių kultūros proliferacija paveikus jas antimicinu A buvo patikimai mažesnė,

negu ląstelių, paveiktų abiem veiksniais. BC5 ląstelių proliferacija patikimai padidėjo lyginant su

kontrolinėmis ląstelėmis paveikus 5 val. hipertermija, antimicinas A ląstelių prioliferaciją taip pat

mažino. MDA-MB-231 ląstelių proliferaciją sumažino ir slopikliai ir hipertermija, tačiau naudojant

natrio fenilbutiratą buvo stebėta didesnė proliferacija naudojant abu veiksnius. MCF-7 ląstelių

proliferaciją hipertermija patikimai didino, kaip ir paveikus natrio fenilbutiratu bei hipertermja, o

naudojant vien antimiciną A bei su hipertermja buvo stebimas proliferacijos sumažėjimas beveik

perpus (3.12 pav).

3.5. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 gyvybingumo ir kamieniškumo įvertinimas

pagal kolonijų formavimo testą, paveikus slopikliais

Pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų (BC2 ir BC5) bei krūties adenokarcinomos MDA-

MB-231 ląstelių gyvybingumas ir kamieniškumas paveikus navikiniais slopikliais buvo vertinamas

kolonijų formavimo testu. Kolonijų formavimo arba klonogeninė analizė yra in vitro ląstelių

gyvybingumo analizė, pagrįsta vienos ląstelės gebėjimu formuoti koloniją. Ląstelė identiškų

ląstelių, t.y. klonų, koloniją formuoja dalindamasi.

0

10

20

30

40

50

60

BC2 BC5 MDA-MB-231 MCF-7

Fluo

resc

enci

ja, s

.f.v. K

K+TSalSal+TAMAAMA+TPBAPBA+T

**

*

***

*

*

**

**

*

34

Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 12 šulinėlių plokšteles, maža (100 ląstelių/

šulinėlį) koncentracija. Po 24 val. DMEM/Ham‘s F12 terpė keičiama į paruoštą terpę su atitinkama

slopiklio koncentracija (slopikliai keičiami kas antrą dieną) ir po 5, 7 ir 10 parų ląstelės fiksuojamos

paraformaldehidu, dažomos kristalo violetu ir skaičiuojamos kolonijos.

Kolonijų kiekio bei ploto skaičiavimai atliekami dviem skirtingais būdais: 1) naudojant

SynGene GBox įrangą, nuotraukos darytos Genesys vaizdinimo programine įranga, analizuotos

GeneTools analizės programa (3.13 pav.); 2) darant nuotraukas invertuotu mikroskopu Olympus

IX81 ir atliekant analizę Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės sistema (3.14 pav.).

3.13 pav. Ląstelių kolonijų skaičiavimo pavyzdys, naudojant GeneTools analizės programą, raudona spalva automatiškai pažymimas kolonijos plotas, geltonai – kolonija, kaip vnt.

3.14 pav. Ląstelių kolonijų skaičiavimo pavyzdys, naudojant Olympus xcellence 2.0 analizinę programą, kolonijos apvedamos mechaniškai, suskaičiuojamas jų kiekis, o pagal nustatytą mąstelį

automatiškai apskaičiuojamas kolonijų plotas

35

3.15 pav. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių kiekis veikiant slopikliais 7 paras pagal kolonijų formavimo testą (A – skaičiavimai atlikti su Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės sistema,, B –

skaičiavimai atlikti su GeneTools analizės programa), n=3

Ląstelių kolonijų kiekio bei ploto analizė buvo atlikta abiem analizės metodais, praėjus 7

eksperimento paroms. Didžioji dalis rezultatų koreliuoja, o nekoreliuojančių rezultatų priežastis gali

būti žmogiškasis faktorius, duomenis apdorojant Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės sistema,

kolonijas apibrėžiant mechaniškai (3.15 pav.).

Vertinant ląstelių kolonijų plotą abiem analizės metodais, stebėta geresnė koreliacija tarp

aptartų rezultatų (3.16 pav.)

3.16 pav. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 bendras ląstelių plotas veikiant slopikliais 7 paras pagal kolonijų formavimo testą (A – skaičiavimai atlikti su Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės

sistema, rezultatai pateikti mm2, B – skaičiavimai atlikti su GeneTools analizės programa, rezultatai pateikti procentais (%)), n=3

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

BC2 BC5 MDA-MB-231

Kol

onijų

kie

kis,

vnt.

* *

**

0

10

20

30

40

50

60

70

BC2 BC5 MDA-MB-231

KSalAMAPBA

**

**

*

*

0

20

40

60

80

100

120

BC2 BC5 MDA-MB-231

Kol

onijų

ben

dras

plo

tas,

mm

2

*

* *

*

*

0

5

10

15

20

25

30

35

BC2 BC5 MDA-MB-231

Kol

onijų

ben

dras

plot

as, %

K

Sal

AMA

PBA*

*

**

*

A

36

3.2 lentelė. BC2, BC5 ir MD

A-M

B-231 ląstelių gyvybingumas ir kam

ieniškumas pagal kolonijų form

avimo testą,

paveikus slopikliais 5, 7 ir 10 parų, n=3 (žalia spalva pažymėtas patikim

as gyvybingumo m

ažinimas, raudona –

didinimas)

37

Kolonijų formavimo analizės duomenys buvo analizuojami GeneTools analizės programa po 5,

7 ir 10 eksperimento parų.

BC2 kolonijų kiekio ir ploto mažėjimas praėjus 5 eksperimento paroms buvo stebimas po

antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikio, BC5 ląstelių kolonijų kiekį ir bendrą plotą sumažino visi

naudoti slopikliai. MDA-MB-231 ląstelių kolonijų formavimąsi sumažino antimicinas A ir natrio

fenilbutiratas, o salinomicinas padidino šių ląstelių kolonijų bendrą plotą.

Po 7 eksperimento parų buvo stebimas BC5 ląstelių kolonijų kiekio padidėjimas po

salinomicino ir natrio fenilbutirato poveikio, o MDA-MB-231 ląstelių kolonijų kiekį antimicinas A

sumažino. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių kolonijų bendrą plotą sumažino antimicino A poveikis,

o BC5 ląstelių kolonijų plotą salinomicinas padidino ~7%.

Po 10 eksperimento parų kolonijų kiekio mažinimas BC2 ir MDA-MB-231 ląstelėms pasiektas

naudojant antimiciną A. Visų ląstelių bendrą kolonijų plotą efektyviai mažino antimicino A poveikis, o

BC2 ir MDA-MB-231 kolonijų plotą mažino ir natrio fenilbutiratas.

Apie ląstelių kamienškumą galima spręsti iš gebėjimo formuoti kolonijas, nes tai yra metodas

ne tik apibūdinantis ląstelių gyvybingumą, dėl vienos ląstelės gebėjimo formuoti klonus. Šis metodas

gali apibūdinti skirtingo fenotipo ir biologinių savybių ląsteles, tokias kaip kamieninės ir naviko

kamieninės ląstelės. Vertinant šių trijų linijų kontrolinių ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas,

kamieniškiausiomis ląstelėmis galima vadinti MDA-MB-231, kurios pagal literatūroje aprašomus

duomenis turi kamieninių ląstelių fenotipą (Hiraga ir kt., 2011). Vertinant pirmines ląstelių kultūras

BC2 ir BC5, kamieniškesnėmis galima vadinti BC2 dėl didesnio gebėjimo formuoti kolonijas

(3.2 lentelė).

3.6. Naviko slopiklių poveikis kriūties naviko ląstelių judėjimui

Ląstelių judėjimo tyrimai buvo atlikti su krūties adenokarcinomos MDA-MB-231 bei pirmine

krūties naviko ląstelių kultūra BC2. Šios ląstelės per trumpą laiką puikiai suformuoja monosluoksnį

(apie 90 % konfluenciją).

Sutrikimai ląstelių judėjimo procese gali turėti rimtų pasekmių, tokių kaip naviko formavimasis

ir metastazavimas.

3.17 paveikslėlyje pateiktas pavyzdys, kaip skaičiuojamas ląstelių plotas įbraižoje.

38

3.17 pav. Ląstelių judėjimo įvertinimas “žaizdos gijimo” metodu. A – raudona spalva apvestas plotas žymi tuščią plotą po ką tik atliktos įbraižos; B – žalia spalva pavaizduotas ląstelių užpildytas plotas po

5 arba 10 val.

Literatūroje aprašytuose salinomicinu paveiktų ląstelių judėjimo greičio tyrimuose buvo

naudojamos palyginus didelės salinomicino koncentracijos, todėl negalima vertinti jo poveikio

judėjimo slopinimui, tokiais atvejais reikėtų įvertinti nespecifinį citotoksiškumą (Dong ir kt., 2011;

Kusunoki ir kt., 2013; Lieke ir kt., 2012).

Kontrolinės ląstelės po atliktos įbraižos praėjus 5 val., užėmė apie 45 % ploto „žaizdoje“, tai yra

net tris kartus daugiau nei antimicinu A ir salinomicinu paveiktų ląstelių užimamas plotas (~15 %).

Natrio fenilbutiratu paveiktos ląstelės įbraižoje užėmė dvigubai mažiau ploto nei kontrolinės ląstelės

(~23 %).

Po 10 val. kontrolinės ląstelės įbraižoje užėmė ~74 % „žaizdos“ ploto, o tai yra 1,5 karto

daugiau nei ląstelės, paveiktos salinomicinu. Antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikis pasireiškė du

kartus mažesniu užimamu plotu, nei kontrolinių ląstelių, ląstelės užėmė ~38 % ir ~39 % įbraižos ploto

(3.18 pav.).

BC2 ląstelės, paveiktos salinomicinu po įbraižos praėjus 5 val. užėmė didesnį plotą, o

antimicinu A paveiktos ląstelės užėmė perpus mažesnį plotą lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis.

Natrio fenilbutiratu paveiktos ląstelės „žaizdoje“ užėmė ~28 % ploto.

Po įbraižos praėjus 10 val., kontrolinės ląstelės ir salinomicinu paveiktos ląstelės užėmė

vienodą plotą įbraižoje (~86 %). Antimicino A poveikis pasireiškė du kartus mažesniu užimamu plotu,

nei kontrolinių ląstelių, o PBA paveiktų ląstelių užimtas plotas buvo ~58 % (3.19 pav.).

A B

39

3.18 pav. MDA-MB-231 ląstelių judėjimas, paveikus slopikliais 5 ir 10 val.

3.19 pav. BC2 ląstelių judėjimas, paveikus slopikliais 5 ir 10 val.

Po naviko slopiklių naudojimo nustatytas sumažėjęs ląstelių judėjimo greitis, lyginant su

kontrolinių ląstelių judėjimu. Sumažėjęs navikinių ląstelių judrumas parodo ir sumažėjusį naviko

invazyvumą į kitus audinius, todėl tai yra labai svarbus kriterijus vertinant naviko savybes ir kovojant

0 10 20 30 40 50 60 70 80

K

Sal

AMA

PBA

Ląstelių užimtas plotas įbraižoje, %

10 h

5h

*

0 20 40 60 80 100

K

Sal

AMA

PBA

Ląstelių užimtas plotas įbraižoje, %

10h5h

*

*

40

su onkologiniais susirgimais. Naviko ląstelės gali keisti judėjimo mechanizmus kaip atsaką į

pasikeitusias sąlygas, pavyzdžiui paveikus slopikliais (Krakhmal ir kt., 2015).

41

3.7. Rezultatų apibendrinimas

Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis kiekvienais metais užregistruojama apie 14

mln., o Lietuvoje nacionalinio vėžio instituto duomenimis kasmet apie 17000 naujų onkologinių

susirgimų atvejų. PSO nurodo, jog kiekvienais metais nuo naviko miršta daugiau nei 8 mln. žmonių.

Nors žinoma vis daugiau apie naviko išsivystymo veiksnius, tikslūs mechanizmai iki šiol nėra iki galo

ištirti. Mirštamumas dėl onkologinioų susirgimų yra tiesiogiai susijęs su išplitimo laipsniu ir metastazių

atsiradimu. Dėl genetinių ir epigenetinių bei morfologinių naviko ląstelių skirtumų, sunku rasti vaistą

ar būdą gydymui, tinkantį visiems onkologinių ligų atvejams. Atliekant eksperimentus su pirminėmis

naviko ląstelių kultūromis, siekiama rasti efektyviausią būdą gydyti onkologiniams susirgimams, nes

tokios ląstelės labiau atspindi navikų įvairovę ir heterogeniškumą.

Pirminės krūties naviko ląstelių kultūros buvo tirtos atlikus tik keletą persėjimų, todėl šios

ląstelės labiau atitinka naviko savybes ir gali būti panaudotos kaip ligos modelis. Nors pirminės ląstelių

kultūros laikui bėgant keičia fenotipą, o tai sukelia sunkumų interpretuojant gautus tyrimų rezultatus,

tačiau šios ląstelės labiau atitinka naviko mikroaplinkos modelį ir gali būti panaudotos personalizuotos

medicinos vystymui.

Siekiantt apibūdinti pirmines naviko ląstelių kultūras, buvo atlikta kiekybinė ir kokybinė

navikui būdingų žymenų analizė. Visose tirtose BC ląstelių kultūrose nustatyta CD24 žymens raiška,

tačiau jo kiekis kultūrose skiriasi – mažiausia šio žymens raiška pasižymi BC4 ląstelės. BC1, BC5 ir

BC6 ląstelių kultūrose CD44 žymenį turinčių ląstelių yra daugiausia. Visos tirtos ląstelių kultūros, kaip

ir dažnai eksperimentams naudojamos krūties naviko ląstelių linijos pasižymi didele proliferacijos

žymens Ki67 raiška. BC ląstelių kultūros yra heterogeniškos – yra tiek FAB raiška pasižyminčių, tiek

šio baltymo neturinčių ląstelių.

Darbe naudoti slopikliai turi skirtingus veikimo mechanizmus ir veikia įvairius ląstelių tipus.

Nors tikslus salinomicino veikimo mechanizmas nėra nustatytas, tačiau žinoma, kad jis specifiškai

veikia naviko kamienines ląsteles įvairiuose žmogaus navikuose (manoma kad per wnt, mTOR arba

STAT3 kelius) taip pat nustatyta, kad jis geba keisti naviko kamieninių ląstelių fenotipą į naviko

epitelines ląsteles, kai ląstelės veikiamos mažomis salinomicino koncentracijomis. Naudojant šį vaistą,

atlikta daugybė tyrimų su įvairiais navikais, tačiau būtini ir tolimesni tyrimai, išsiaiškinti tiksliam jo

veikimui ir galimam pritaikymui klinikoje. Antimicinas A yra mitochondrijų „nuodas“ ir nors jo

veikimo mechanizmas žinomas, tačiau neseniai šis preparatas įvardytas kaip potencialus naviko

kamieninių ląstelių slopiklis. Kol kas atlikta nedaug tyrimų, naudojant antimiciną A, dėl nustatyto jo

42

citotoksinio poveikio naviko neformuojančioms ląstelėms. Literatūroje aprašyti tyrimai tik su plaučių

naviko ląstelėmis. Buvo parodyta, kad antimicino A naudojimas mažina šių ląstelių proliferaciją, tačiau

su kitais navikais tyrimų dar neatlikta. Trečiasis naudotas slopiklis – natrio fenilbutiratas, tai histono

diacetilazės slopiklis. Remiantis literatūra, būtent dėl šios savybės išmėgintas kaip vaistas gydyti

onkologiniams susirgimams. Atlikta nemažai tyrimų su krūties ir prostatos navikais, naudojant PBA,

tačiau su pirminėmis kultūromis tyrimų dar neatlikta. Būtent dėl šios priežasties šis preparatas buvo

pasirinktas, įvertinti jo poveikį ne išvestoms komercinėms ląstelių linijoms, o informatyvesniam

modeliui – ląstelėms, išskirtoms iš pirminio naviko.

Siekiant palyginti poveikį tarp pirminių ląstelių kultūrų ir komerciškai prieinamų išvestų

ląstelių linijų, buvo atliktas pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų ir MDA-MB-231 slopiklių poveikio

ląstelių proliferacijai tyrimas. Pagal gautus rezultatus, galima daryti išvadą, kad BC2 ląstelių kultūros

atsakas į naudotų slopiklių poveikį yra panašus į MDA-MB-231 atsaką – praėjus 48 eksperimento

valandoms, naudoti slopikliai šių ląstelių priliferaciją mažina, o po 72 eksperimento valandų,

salinomicinas jų proliferaciją skatina, o antimicinas A slopina. Taip pat atlikome kito audinio naviko

pirminių ląstelių proliferacijos tyrimą – pirminių gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos (LSCC) ląstelių

atsako į naudotus slopiklius tyrimą. Po 48 val. poveikio slopikliais LSCC ląstelėms, didelį ir panašų

poveikį ląstelių proliferacijos sumažęjimui turėjo visi naudoti slopikliai (~80 %), o po 72 val.,

didžiausią poveikį ląstelių augimui turėjo natrio fenilbutiratas – proliferacija sumažėjo net ~84 %,

paveikus antimicinu A - ~78 % ir salinomicinu - ~55 % . Įvertinus gautus tyrimų rezultatus, galima

daryti išvadą, kad jautresnės, nei pirminės krūties naviko ląstelių kultūros, po 48 ir 72 valandų

slopiklių poveikio yra LSCC ląstelės.

Įvertinus duomenis, gautus atlikus fluorescencinę BC ir naviko neformuojančių ląstelių

proliferacijos analizę, galime spręsti, kad didžiausią poveikį visoms BC ląstelių kultūroms pagal

fluorescencijos intensyvumą, praėjus 48 ir 72 val. po slopiklių poveikio, turėjo natrio fenilbutiratas, o

naviko neformuojančias ląsteles labiausiai paveikė antimicinas A, išskyrus fibroblastus.

Salinomicinas pirminėms krūties naviko ląstelių kultūroms po 48 val. veikimo turi proliferaciją

mažinantį poveikį, o praėjus 72 val. šios ląstelių kultūros auga sparčiau net už kontrolines ląsteles.

Mažos salinomicino koncentracijos turi gebėjimą keisti navikinių kamieninių ląstelių fenotipą į

navikines epitelines ląsteles (MET, ang. mesenchymal-epithelial transition) (Kopp ir kt., 2014), o

didelės koncentracijos sukelia ląstelių apoptozę, todėl manoma, kad būtent ši antibiotiko savybė

atsakinga už ląstelių augimo paskatinimą, nors žinoma, kad kamieninės ląstelės yra atsakingos už

naviko metastazavimą (dėl jų agresyvumo ir invazyvumo), o epitelinių navikinių ląstelių dalijimosi

greitis yra mažesnis, tačiau jos nėra nužudomos salinomicinu. Navikinės kamieninės ląstelės yra

43

esminė priežastis, kodėl naviko gydymas būna neveiksmingas arba liga pasikartoja, nes įprasti vaistai

nenužudo kamieninių ląstelių (kurių navike būna iki 10 % (Yakisich, 2012)) (Park ir kt., 2014;

Visvader ir Lindeman, 2008; Li ir Laterra, 2012). Kadangi antimicinas A yra potencialus preparatas

naikinti navikinėms kamieninėms ląstelėms, tačiau jis turi toksinį poveikį, naviką gydyti būtų galima

įprastiniais vaistais, o likusias kamienines ląsteles įveikti naudojant būtent antimiciną A (kaip

citotoksinį vaistą) arba salinomiciną (Lu ir kt, 2015).

Įjautrinus ląsteles 5 val. 40 °C temperatūra, pasiekti efektyvesniam slopinančiam slopiklių

poveikiui ląstelių proliferacijai, ląstelės parodė net didesnį atsparumą slopiklių poveikiui. 48 val.

veikiant ląsteles slopikliais, BC2 kultūros ląstelių proliferacija, paveikus jas antimicinu A, buvo net

patikimai mažesnė, nei paveikus šias ląsteles hipertermija ir antimicinu A. BC5 ląstelių proliferacija

patikimai padidėjo lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis vien paveikus 5 val. hipertermija, antimicinas

A suveikė taip pat, kaip ir BC2 ląstelių proliferacijai. MDA-MB-231 ląstelių proliferaciją sumažino ir

slopikliai ir hipertermija, tačiau naudojant natrio fenilbutiratą buvo stebėta didesnė proliferacija

naudojant ir slopiklį ir hipertermiją. MCF-7 ląstelių proliferaciją hipertermija patikimai padidino, kaip

ir paveikus natrio fenilbutiratu bei hipertermja, o naudojant antimiciną A su hipertermija ir be jos buvo

stebimas proliferacijos sumažėjimas beveik perpus.

Kolonijų formavimo analizės duomenys po 5, 7 ir 10 parų parodė, kad patikimas BC2 kolonijų

kiekio ir ploto mažinimas praėjus 5 eksperimento paroms buvo stebimas po antimicino A ir natrio

fenilbutirato poveikio, BC5 ląstelių kolonijų kiekio formavimąsi ir bendrą plotą patikimai sumažino

visi naudoti slopikliai. MDA-MB-231 ląstelių kolonijų kiekio formavimąsi sumažino antimicinas A

(sumažino ir bendrą kolonijų plotą) ir natrio fenilbutiratas, o salinomicinas padidino šių ląstelių

kolonijų bendrą plotą. Po 7 eksperimento parų buvo stebimas patikimas BC5 ląstelių kolonijų kiekio

padidėjimas po salinomicino ir natrio fenilbutirato poveikio, o MDA-MB-231 ląstelių kolonijų kiekį

antimicinas A patikimai sumažino. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių kolonijų bendrą plotą

patikimai sumažino antimicino A poveikis, o BC5 ląstelių kolonijų plotą salinomicinas padidino ~7%.

Po 10 eksperimento parų patikimas kolonijų kiekio sumažinimas pasiektas naudojant antimiciną A BC2

ir MDA-MB-231 ląstelėms. Visų ląstelių bendrą kolonijų plotą efektyviai mažino antimicino A

poveikis, o BC2 ir MDA-MB-231 kolonijų plotą sumažino ir natrio fenilbutiratas.

Vertinant šių trijų linijų kontrolinių ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas, kamieniškiausiomis

ląstelėmis galima vadinti MDA-MB-231, kurios pagal literatūroje aprašomus duomenis turi kamieninių

ląstelių fenotipą. Lyginant pirminių ląstelių kultūrų BC2 ir BC5 gebėjimą formuoti kolonijas nesant

išorinių dirgiklių, kamieniškesnėmis galima vadinti BC2 dėl didesnio kolonijų ploto ir kiekio, nei BC5

ląstelių kultūros.

44

Atlikus MDA-MB-231 ir BC2 ląstelių invazyvumo tyrimą „žaizdos gijimo“ metodu, MDA-

MB-231 ląstelės, nepaveiktos slopikliais, po 5 val. judėjimo tyrimo užėmė apie 45 % žaizdos ploto, tai

yra net tris kartus daugiau nei antimicinu A ir salinomicinu paveiktų ląstelių užimamas plotas. Natrio

fenilbutiratu paveiktos ląstelės „žaizdoje“ užėmė dvigubai mažiau ploto nei kontrolinės ląstelės (apie

23 % ploto). Po 10 val. kontrolinės ląstelės užėmė apie 74 % „žaizdos“ ploto, o tai yra 1,5 karto

daugiau nei ląstelės, paveiktos salinomicinu. Antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikis pasireiškė du

kartus mažesniu užimamu plotu, nei kontrolinių ląstelių ( ląstelės užėmė ~38 % ir 39~ %) įbraižos

ploto.

BC2 ląstelės, veiktos salinomicinu po 5 val. judėjimo tyrimo užėmė didesnį plotą, nei

kontrolinės ląstelės, o antimicinu A paveiktos ląstelės užėmė perpus mažesnį plotą lyginant su

kontrolinėmis ląstelėmis. Natrio fenilbutiratu paveiktos ląstelės užėmė apie 28 % įbraižos ploto. Po 10

val., kontrolinės ląstelės ir salinomicinu paveiktos ląstelės užėmė vienodą plotą žaizdoje (~86 %).

Antimicino A poveikis pasireiškė du kartus mažesniu užimamu plotu, nei kontrolinių ląstelių, o natrio

fenilbutiratu paveiktų ląstelių užimtas plotas buvo ~58 %.

Atlikti tyrimai parodė, kad skirtingų pacientų navikai skiriasi genetiškai ir fenotipiškai, nes

pastebėtas skirtingas atsakas į naudotų slopiklių poveikį. Siekiant gauti tikslesnius rezultatus, reikėtų

atlikti genetinius tyrimus, išsiaiškinti tam tikrų genų raišką tarp skirtingų pirminių naviko ląstelių

kultūrų prieš ir po slopiklių naudojimo.

45

IŠVADOS

1. Pirminės ląstelių kultūros, išskirtos iš krūties naviko yra heterogeniškos – pasižymi CD24,

CD44, Ki67 ir FAB žymenų raiška, tačiau žymenį turinčių ląstelių kiekis kultūrose skiriasi. Nustatyta,

kad mažiausiai ląstelių turinčių CD24 žymens yra BC4 ląstelių kultūroje. BC1, BC5 ir BC6 kultūrų

ląstelės turi daugiau CD44 žymens, nei BC2 ir BC ląstelių kultūros. Ki67 proliferacijos žymens

turinčių ląstelių daugiausia rasta BC5 ląstelių kultūroje, o FAB baltymo kiekis BC kultūrų ląstelėse

nesiekia 10 %.

2. Palyginus naudotų slopiklių poveikį pirminėms ląstelių kultūroms (BC) ir išvestai ląstelių linijai

(MDA-MB-231), nustatėme, kad BC2 ląstelių kultūros atsakas į naudotų slopiklių poveikį yra panašus

kaip ir MDA-MB-231 ląstelėms – praėjus 48 eksperimento valandoms, visi naudoti slopikliai šių

ląstelių proliferaciją mažina. Po 72 eksperimento valandų, salinomicinas paskatino BC2 ir MDA-MB-

231 ląstelių proliferaciją, o antimicinas A slopino. Atliktas kito audinio naviko pirminių ląstelių

(LSCC) proliferacijos tyrimas parodė, kad po 48 ir 72 val. poveikio slopikliais, ląstelių proliferaciją

mažina visi naudoti slopikliai. Gauti rezultatai parodė, kad LSCC ląstelės yra jautresnės, nei pirminės

krūties naviko ląstelių kultūros, po poveikio 48 ir 72 val. slopikliais. Didžiausias neigiamas poveikis

RMB ir ASM ląstelių proliferacijai buvo stebėtas paveikus šias ląsteles 48 val. antimicinu A, tačiau

wi38 ir MSC ląstelių proliferacijos šis slopiklis nemažino. Praėjus 72 val. po poveikio slopikliais,

salinomicinas ir natrio fenilbutiratas reikšmingo poveikio naviko neformuojančių ląstelių proliferacijai

neturėjo.

3. Įjautrinimas hipertermija (5 val., 40 °C) sukėlė BC2 ir MCF-7 ląstelių proliferacijos didėjimą.

Buvo nustatyta, kad įjautrinimas hipertermija neturėjo įtakos slopiklių sukeltiems proliferacijos

pokyčiams tirtose ląstelių linijose.

4. Efektyviausiai BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių gyvybingumą pagal gebėjimą formuoti

kolonijas slopino antimicinas A, mažindamas kolonijų plotą ir kiekį. Slopinantis natrio fenilbutirato

poveikis BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių gyvybingumui buvo stebėtas po 5 ir 10 parų. Po 7 parų

poveikio salinomicinu buvo nustatytas didesnis ląstelių kolonijų kiekis ir plotas BC5 ląstelių kultūroje.

5. Slopinantį efektą MDA-MB-231 ląstelių judėjimo greičiui po 5 ir 10 val. turėjo visi naudoti

slopikliai. BC2 ląstelių judrumą po 5 ir 10 val. AMA ir PBA slopino, o salinomicinas paskatino.

46

LITERATŪRA

1. Ilaria Turin, Roberta Schiavo, Marcello Maestri, Ombretta Luinetti, Barbara Dal Bello, Marco

Paulli, Paolo Dionigi, Marianna Roccio, Arsenio Spinillo, Federica Ferulli, Matteo Tanzi, Rita

Maccario, Daniela Montagna and Paolo Pedrazzoli. In Vitro Efficient Expansion of Tumor Cells

Deriving from Different Types of Human Tumor Samples. Med. Sci. 2014, 2, 70-81.

2. Ochs, R.L.; Fensterer, J.; Ohori, N.P.; Wells, A.; Gabrin, M.; George, L.D.; Kornblith, P.

Evidence for the isolation, growth and characterization of malignant cells in primary cultures of human

tumors. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2003, 39, 63–79.

3. Burdall SE, Hanby AM, Lansdown MRJ, Speirs V. Breast cancer cell lines: friend or foe?

Breast Cancer Res 2003;5(2):89–95

4. Hass, R.; Bertram, C. Characterization of human breast cancer epithelial cells (HBCEC) derived

from long term cultured biopsies. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2009, 28, 127.

5. Bonner-Weir, S.; Taneja, M.; Weir, G.C.; Tatarkiewicz, K.; Song, K.H.; Sharma, A.; O’Neil J.J.

In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97,

7999–8004

6. Tveit, K.M.; Pihl, A. Do cell lines in vitro reflect the properties of the tumours of origin? A

study of lines derived from human melanoma xenografts. Br. J. Cancer 1981, 44, 775–786.

7. Schiavo, R.; Tullio, C.; la Grotteria, M.; Andreotti, I.C.; Scarpati, B.; Romiti, L.; Bozzi, F.;

Pedrazzoli, P.; Siena, S. Establishment and characterization of a new Ewing’s sarcoma cell line from a

malignant pleural effusion. Anticancer Res. 2007, 27, 3273–3278.

8. Ricardo S, Vieira AF, Gerhard R, Leitão D, Pinto R, Cameselle-Teijeiro JF, Milanezi F,

Schmitt F, Paredes J. Breast cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1: expression

distribution within intrinsic molecular subtype. J Clin Pathol 2011;64(11):937-46.

9. Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Gerlach C, Stahmer I, Kloth S, Brandt

E, Flad HD. Immunobiochemical and Molecular Biologic Characterization of the Cell Proliferation-

associated Nuclear Antigen That Is Defined by Monoclonal Antibody Ki-67. Am J Pathol

1991;138(4):867–73

10. Lu DY, Lu TR, Che JY, Wu HY (2014) Individualized cancer therapy. IPP 2:458-469.

11. Abhisek Mitra, Lopa Mishra, Shulin Li. Technologies for deriving primary tumor cells for use

in personalized cancer therapy. Trends in Biotechnology, June 2013, Vol. 31, No. 6

12. Michel M. Ouellette, Lisa D. McDaniel, Woodring E. Wright, Jerry W. Shay, Roger A. Schultz,

47

The establishment of telomerase-immortalized cell lines representing human chromosome instability

syndromes. Human molecular genetics. 2000. Vol. 9, No. 3, 403-411.

13. Swartz MA, Iida N, Roberts EW, et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in

cancer therapy. Cancer Res 2012;72:2473-80.

14. Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumour-host interface. Nature

2001;411:375-9.

15. Marusyk, A; Polyak, K. "Tumor heterogeneity: Causes and consequences". Biochimica et

Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer 2009, 1805 (1): 105–117.

16. Almendro V, Marusyk A, Polyak K: Cellular heterogeneity and molecular evolution in cancer.

Annu Rev Pathol-Mech. 2013, 8: 277-302.

17. Campbell, P. J.; Pleasance, E. D.; Stephens, P. J.; Dicks, E; Rance, R; Goodhead, I; Follows, G.

A.; Green, A. R.; Futreal, P. A.; Stratton, M. R. (2008). "Subclonal phylogenetic structures in cancer

revealed by ultra-deep sequencing". Proceedings of the National Academy of Sciences 105 (35):

13081–13086.

18. Shipitsin, M; Campbell, L. L.; Argani, P; Weremowicz, S; Bloushtain-Qimron, N; Yao, J;

Nikolskaya, T; Serebryiskaya, T; Beroukhim, R; Hu, M; Halushka, M. K.; Sukumar, S; Parker, L. M.;

Anderson, K. S.; Harris, L. N.; Garber, J. E.; Richardson, A. L.; Schnitt, S. J.; Nikolsky, Y; Gelman, R.

S.; Polyak, K (2007). "Molecular definition of breast tumor heterogeneity". Cancer Cell 11 (3): 259–

273.

19. MacIntosh, C. A.; Stower, M; Reid, N; Maitland, N. J. (1998). "Precise microdissection of

human prostate cancers reveals genotypic heterogeneity". Cancer Research 58 (1): 23–28.

20. Alvarado, C; Beitel, L. K.; Sircar, K; Aprikian, A; Trifiro, M; Gottlieb, B (2005). "Somatic

mosaicism and cancer: A micro-genetic examination into the role of the androgen receptor gene in

prostate cancer". Cancer Research 65 (18): 8514–8518.

21. Konishi, N; Hiasa, Y; Matsuda, H; Tao, M; Tsuzuki, T; Hayashi, I; Kitahori, Y; Shiraishi, T;

Yatani, R; Shimazaki, J (1995). "Intratumor cellular heterogeneity and alterations in ras oncogene and

p53 tumor suppressor gene in human prostate carcinoma". The American Journal of Pathology 147 (4):

1112–1122.

22. Heppner, G. H. (1984). "Tumor heterogeneity". Cancer Research 44 (6): 2259–2265.

23. Califano, J; Van Der Riet, P; Westra, W; Nawroz, H; Clayman, G; Piantadosi, S; Corio, R; Lee,

D; Greenberg, B; Koch, W; Sidransky, D (1996). "Genetic progression model for head and neck

cancer: Implications for field cancerization". Cancer Research 56 (11): 2488–2492.

48

24. Sauter, G; Moch, H; Gasser, T. C.; Mihatsch, M. J.; Waldman, F. M. (1995). "Heterogeneity of

chromosome 17 and erbB-2 gene copy number in primary and metastatic bladder cancer". Cytometry

21 (1): 40–46.

25. González-García, I; Solé, R. V.; Costa, J (2002). "Metapopulation dynamics and spatial

heterogeneity in cancer". Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (20): 13085–13089.

26. Samowitz, W. S.; Slattery, M. L. (1999). "Regional reproducibility of microsatellite instability

in sporadic colorectal cancer". Genes, Chromosomes and Cancer 26 (2): 106–114.

27. Giaretti, W; Monaco, R; Pujic, N; Rapallo, A; Nigro, S; Geido, E (1996). "Intratumor

heterogeneity of K-ras2 mutations in colorectal adenocarcinomas: Association with degree of DNA

aneuploidy". The American Journal of Pathology 149 (1): 237–245.

28. Horvai, A. E.; Devries, S; Roy, R; O'Donnell, R. J.; Waldman, F (2009). "Similarity in genetic

alterations between paired well-differentiated and dedifferentiated components of dedifferentiated

liposarcoma". Modern Pathology 22 (11): 1477–1488.

29. Fujii, H; Yoshida, M; Gong, Z. X.; Matsumoto, T; Hamano, Y; Fukunaga, M; Hruban, R. H.;

Gabrielson, E; Shirai, T (2000). "Frequent genetic heterogeneity in the clonal evolution of

gynecological carcinosarcoma and its influence on phenotypic diversity". Cancer Research 60 (1): 114–

120.

30. Victoria R Zellmer and Siyuan Zhang, Evolving concepts of tumor heterogeneity. Cell &

Bioscience20144:69

31. Janet L. Markman, Arthur Rekechenetskiy, Eggehard Holler, Julia Y. Ljubimova.

Nanomedicine therapeutic approaches to overcome cancer drug resistance. Nanotechnology and drug

resistance Volume 65, Issues 13–14, 30 November 2013, Pages 1866–1879.

32. Shackleton, M; Quintana, E; Fearon, E. R.; Morrison, S. J. (2009). "Heterogeneity in cancer:

Cancer stem cells versus clonal evolution". Cell 138 (5): 822–829.

33. Nowell, P. C. (1976). "The clonal evolution of tumor cell populations". Science 194 (4260):

23–28.

34. Swanton, C (2012). "Intratumor heterogeneity: Evolution through space and time". Cancer

Research 72 (19): 4875–4882.

35. Merlo, L. M. F.; Pepper, J. W.; Reid, B. J.; Maley, C. C. (2006). "Cancer as an evolutionary and

ecological process". Nature Reviews Cancer 6 (12): 924–935.

36. Vicki Plaks, Niwen Kong, and Zena Werb, The Cancer Stem Cell Niche:How Essential Is the

Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell, 2015. 10.1016

37. Neethan A. Lobo, Yohei Shimono, Dalong Qian and Michael F. Clarke. The Biology of Cancer

49

Stem Cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. 23:675–99

38. Park CH, Bergsagel DE, McCulloch EA. 1971. Mouse myeloma tumor stem cells: a primary

cell culture assay. J. Natl. Cancer Inst. 46:411–22

39. Jeffrey A. Magee, Elena Piskounova, and Sean J. Morrison. Cancer Stem Cells: Impact,

Heterogeneity, and Uncertainty. Cancer Cell 21, March 20, 2012

40. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. Prospective

identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(7):3983-88

41. Naor D, Wallach-Dayan SB, Zahalka MA, Sionov RV. Involvement of CD44, a molecule with

a thousand faces, in cancer dissemination. Semin Cancer Biol 2008;18(4):260-67

42. Ponta H, Sherman L, Herrlich PA. CD44: from adhesion molecules to signalling regulators. Nat

Rev Mol Cell Biol 2003;4(1):33-45

43. Fang X, Zheng P, Tang J,Liu Y. CD24: from A to Z. Cell Mol Immunol 2010;7(2):100-3

44. Baumann P, Cremers N, Kroese F, Orend G, Chiquet-Ehrismann R, Uede T, Yagita H, Sleeman

JP. CD24 expression causes the acquisition of multiple cellular properties associated with tumor

growth and metastasis. Cancer Res 2005;65(23):10783-93

45. Rostoker R, Abelson S, Genkin I, Ben-Shmuel S, Sachidanandam R, Scheinman EJ, Bitton-

Worms K, Orr ZS, Caspi A, Tzukerman M, LeRoith D. CD24(+) cells fuel rapid tumor growth and

display high metastatic capacity. Breast Cancer Res 2015;17:78.

46. Sneath RJ, Mangham DC. The normal structure and function of CD44 and its role in neoplasia.

Mol Pathol 1998; 51(4):191–200

47. Adamia S, Maxwell CA, Pilarski LM. Hyaluronan and hyaluronan synthases: potential

therapeutic targets in cancer. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 2005;5(1):3-14

48. Stamenkovic I, Aruffo A, Amiot M, Seed B. The hematopoietic and epithelial forms of CD44

are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate-bearing cells. EMBO J

1991; 10(2): 343–8

49. Yang C, He Y, Zhang H, Liu Y, Wang W, Du Y, Gao F. Selective killing of breast cancer cells

expressing activated CD44 using CD44 ligand-coated nanoparticles in vitro and in vivo. Oncotarget

2015;6(17):15283–96

50. Pham PV, Phan NL, Nguyen NT,Truong NH, Duong TT,Le DV, Truong KD, Phan NK.

Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J

Transl Med 2011;9:209

51. Zöller M. CD44: can a cancer-initiating cell profit from an abundantly expressed molecule? Nat

Rev Cancer 2011;11(4):254-67

50

52. Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Gerlach C, Stahmer I, Kloth S, Brandt

E, Flad HD. Immunobiochemical and Molecular Biologic Characterization of the Cell Proliferation-

associated Nuclear Antigen That Is Defined by Monoclonal Antibody Ki-67. Am J Pathol

1991;138(4):867–73

53. Jonat W, Arnold N. Is the Ki-67 labelling index ready for clinical use? Ann Oncol

2011;22(3):500-2

54. Ross W, Hall PA. Ki67: from antibody to molecule tounderstanding? Clin Mol Pathol

1995;48(3):113-7

55. Stathopoulos GP, Malamos NA, Markopoulos C, Polychronis A, Armakolas A, Rigatos S,

Yannopoulou A, Kaparelou M, Antoniou P. The role of Ki-67 in the proliferation and prognosis of

breast cancer molecular classification subtypes. Anticancer Drugs 2014;25(8):950-7

56. van Dierendonck JH, Keijzer R, van de Velde CJ, Cornelisse CJ. Nuclear Distribution of the

Ki-67 Antigen during the Cell Cycle: Comparison with Growth Fraction in Human Breast Cancer

Cells. Cancer Res 1989;49(11):2999-3006

57. Cuzick J, Dowsett M, Pineda S, Wale C, Salter J, Quinn E, Zabaglo L, Mallon E, Green AR,

Ellis IO, Howell A, Buzdar AU, Forbes JF. Prognostic Value of a Combined Estrogen Receptor,

Progesterone Receptor, Ki-67, and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Immunohistochemical

Score and Comparison With the Genomic Health Recurrence Score in Early Breast Cancer. J Clin

Oncol 2011;29(32):4273-8

58. Munzone E, Botteri E, Sciandivasci A, Curigliano G, Nolè F, Mastropasqua M, Rotmensz N,

Colleoni M, Esposito A, Adamoli L, Luini A, Goldhirsch A, Viale G. Prognostic value of Ki-67

labeling index in patients with node-negative, triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat

2012;134(1):277-82

59. Aleskandarany MA, Rakha EA, Macmillan RD, Powe DG, Ellis IO, Green AR. MIB1/Ki-67

labelling index can classify grade 2 breast cancer into two clinically distinct subgroups. Breast Cancer

Res Treat 2011;127(3):591-9

60. Harper-Wynne C, Ross G, Sacks N, Salter J, Nasiri N, Iqbal J,A’Hern R, Dowsett M. Effects of

the Aromatase Inhibitor Letrozole on Normal Breast Epithelial Cell Proliferation and Metabolic Indices

in Postmenopausal Women: A Pilot Study for Breast Cancer Prevention. Cancer Epidemiol Biomarkers

Prev 2002;11(7):614-21

61. Clarke RB, Howell A, Potten CS, Anderson E. Dissociation between Steroid Receptor

Expression and Cell Proliferation in the Human Breast. Cancer Res 1997;57(22):4987-91

51

62. Subik K,Lee JF,Baxter L,Strzepek T,Costello D, Crowley P,Xing L, Hung MC,Bonfiglio T,

Hicks DG,Tang P. The Expression Patterns of ER, PR, HER2, CK5/6, EGFR, Ki-67 and AR by

Immunohistochemical Analysis in Breast Cancer Cell Lines. Breast Cancer (Auckl) 2010;4:35–41

63. Inwald EC, Klinkhammer-Schalke M, Hofstädter F, Zeman F, Koller M, Gerstenhauer M,

Ortmann O. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-

based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat 2013;139(2):539-52

64. Urruticoechea A, Smith IE, Dowsett M. Proliferation Marker Ki-67 in Early Breast Cancer. J

Clin Oncol 2005;23(28):7212-20

65. Shi M, Yu DH, Chen Y, Zhao CY, Zhang J, Liu QH, Ni CR, Zhu MH. Expression of fibroblast

activation protein in human pancreatic adenocarcinoma and its clinicopathological significance. World

J Gastroenterol 2012;18(8):840–6

66. Hamson EJ, Keane FM, Tholen S, Schilling O, Gorrell MD. Understanding fibroblast activation

protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. Proteomics Clin Appl

2014;8(5-6):454-63

67. Zhang M, Xu L, Wang X, Sun B, Ding J. Expression levels of seprase/FAPα and DPPIV/CD26

in epithelial ovarian carcinoma. Oncol Lett 2015;10(1):34-42

68. Shi M, Yu DH, Chen Y, Zhao CY, Zhang J, Liu QH, Ni CR, Zhu MH. Expression of fibroblast

activation protein in human pancreatic adenocarcinoma and its clinicopathological significance. World

J Gastroenterol 2012;18(8):840–6

69. Jis J, Martin TA, Ye L, Jiang WG. FAP-α (Fibroblast activation protein-α) is involved in the

control of human breast cancer cell line growth and motility via the FAK pathway. BMC

CellBiology2014, 15:16

70. Christiansen VJ, Jackson KW, Lee KN, Downs TD, McKee PA. Targeting inhibition of

fibroblast activation protein-α and prolyl oligopeptidase activities on cells common to metastatic tumor

microenvironments. Neoplasia 2013;15(4): 348–58

71. Liu F, Qi L, Liu B, Liu J, Zhang H, Che D, Cao J, Shen J, Geng J, Bi Y, Ye L, Pan B, Yu Y.

Fibroblast activation protein overexpression and clinical implications in solid tumors: a meta-analysis.

PLoS One 2015;10(3):e0116683

72. Peng Q, Zhao L, Hou Y, Sun Y, Wang L, Luo H, Peng H, Liu M. Biological characteristics and

genetic heterogeneity between carcinoma-associated fibroblasts and their paired normal fibroblasts in

human breast cancer. PLoS One 2013;8(4):e60321

73. Lai D, Ma L, Wang F. Fibroblast activation protein regulates tumor-associated fibroblasts and

epithelial ovarian cancer cells. Int J Oncol 2012;41(2):541-50

52

74. Lu DY, Chen EH, Ding J, Xu B, Lu TR. Anticancer Drug Combinations, A Big Momentum is

Needed. Metabolomics 2015, 5:3

75. Berlinda Verdoodt, Markus Vogt, Inge Schmitz, Sven-Thorsten Liffers, Andrea Tannapfel,

Alireza Mirmohammadsadegh. Salinomycin Induces Autophagy in Colon and Breast Cancer Cells with

Concomitant Generation of Reactive Oxygen Species. PlosOne, September 2012, Volume 7, Issue 9,

e44132.

76. Fuchs D, Heinold A, Opelz G, Daniel V, Naujokat C (2009) Salinomycin induces apoptosis and

overcomes apoptosis resistance in human cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 390: 743–749.

77. Florian Kopp, Adam Hermawan, Prajakta Shirish Oak, Annika Herrmann, Ernst Wagner and

Andreas Roidl. Salinomycin treatment reduces metastatic tumor burden by hampering cancer cell

migration. Kopp et al. Molecular Cancer 2014, 13:16.

78. Naujokat C, Steinhart R: Salinomycin as a drug for targeting human cancer stem cells. J

Biomed Biotechnol 2012, 2012:950658.

79. Florian Kopp, Adam Hermawan, Prajakta Shirish Oak, Vijay Kumar Ulaganathan, Annika

Herrmann, Nefertiti Elnikhely, Chitra Thakur, Zhiguang Xiao, Pjotr Knyazev, Beyhan Ataseven,

Rajkumar Savai, Ernst Wagner and Andreas Roidl. Sequential Salinomycin Treatment Results in

Resistance Formation through Clonal Selection of Epithelial-Like Tumor Cells. Translational

Oncology (2014) 7, 702–711

80. Gunasinghe NP, Wells A, Thompson EW, Hugo HJ. Mesenchymal-epithelial transition (MET)

as a mechanism for metastatic colonisation in breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 2012 Dec;31(3-

4):469-78. doi: 10.1007/s10555-012-9377-5.

81. Dianbo Yao, Chaoliu Dai, and Songlin Peng. Mechanism of the Mesenchymal–Epithelial

Transition and Its Relationship with Metastatic Tumor Formation. Mol Cancer Res; 9(12) December

2011

82. Hyunsook An, Ji Young Kim, Eunhye Oh, Nahyun Lee, Youngkwan Cho, Jae Hong Seo.

Salinomycin Promotes Anoikis and Decreases the CD44+/CD24- Stem-Like Population via Inhibition

of STAT3 Activation in MDA-MB-231. PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0141919 November 3,

2015.

83. Kodappully Sivaraman Siveen, Sakshi Sikka, Rohit Surana, Xiaoyun Dai, Jingwen Zhang, Alan

Prem Kumar, Benny K.H. Tan, Gautam Sethi , Anupam Bishayee,. Targeting the STAT3 signaling

pathway in cancer: Role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -

Reviews on Cancer Volume 1845, Issue 2, April 2014, Pages 136–154

84. Peibin Yue, James Turkson. Targeting STAT3 in cancer: how successful are we? Expert Opin

53

Investig Drugs. 2009 January ; 18(1): 45–56

85. Yong Hwan Han, Suhn Hee Kim, Sung Zoo Kim and Woo Hyun Park. Antimycin A as a

mitochondrial electron transport inhibitor prevents the growth of human lung cancer A549 cells.

ONCOLOGY REPORTS 20: 689-693, 2008 689.

86. Mohamad Hafizi Abu Bakar, Kian-Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Harisun Yaakob and

Hasniza Zaman Huri. Celastrol Protects against Antimycin A-Induced Insulin Resistance in Human

Skeletal Muscle Cells. Molecules 2015, 20, 8242-8269.

87. Chi-Tai Yeh, Chun-Li Su, Chi-Ying F. Huang, Justin Kung-Yi Lin,8Wei-Hwa Lee, Peter M.-H.

Chang, Yu-Lun Kuo, Yu-Wen Liu, Liang-Shun Wang, Chih-Hsiung Wu, Yi-Shing Shieh, Yi-Hua Jan,

Yung-Jen Chuang, Michael Hsiao, Alexander T. H. Wu. A Preclinical Evaluation of Antimycin A as a

Potential Antilung Cancer Stem Cell Agent. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine

Volume 2013, Article ID 910451, 13 pages.

88. Seisuke Mimori, Yasunobu Okuma, Masayuki Kaneko, Koichi Kawada, Toru Hosoi, Koichiro

Ozawa, Yasuyuki Nomura and Hiroshi Hamana. Protective Effects of 4-Phenylbutyrate Derivatives on

the Neuronal Cell Death and Endoplasmic Reticulum Stress. Biol. Pharm. Bull. 35(1) 84—90 (2012).

89. Erica S. DYER, Michelle T. PAULSEN, Sonja M. MARKWART, Meidee GOH, Donna L.

LIVANT and Mats LJUNGMAN. Phenylbutyrate Inhibits The Invasive Properties Of Prostate And

Breast Cancer Cell Lines In The Sea Urchin Embryo Basement Membrane Invasion Assay. Int. J.

Cancer: 101, 496–499 (2002) Wiley-Liss, Inc.

90. Reynolds S, Cederberg H, Chakrabarty S. Inhibitory effect of 1-O (2 methoxy) hexadecyl

glycerol and phenylbutyrate on the malignant properties of human prostate cancer cells. Clin Exp

Metastasis 2000; 18:309–12.

91. Noh, Jae Myoung, et al. “In vivo verification of regional hyperthermia in the liver.” Radiation

oncology journal 32.4 (2014): 256-261.

92. Sugahara, Tsutomu, et al. “Kadota fund international forum 2004. Application of thermal stress

for the improvement of health, 15–18 June 2004, Awaji Yumebutai international conference center,

Awaji island, Hyogo, Japan. Final report.” International journal of hyperthermia: the official journal of

European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group 24.2 (2008): 123.

93. Bettaieb, Ahmed, Paulina K. Wrzal, and Diana A. Averill-Bates. “Hyperthermia: Cancer

treatment and beyond.” Cancer treatment—conventional and innovative approaches (2013).

94. Lepock, James R. “How do cells respond to their thermal environment?.” International journal

of hyperthermia 21.8 (2005): 681-687.

95. Richter, Klaus, Martin Haslbeck, and Johannes Buchner. “The heat shock response: life on the

54

verge of death.” Molecular cell 40.2 (2010): 253-266.

96. Sonna, Larry A., et al. “Invited review: effects of heat and cold stress on mammalian gene

expression.” Journal of Applied Physiology 92.4 (2002): 1725-1742.

97. Van der Zee, Jill. “Heating the patient: a promising approach?.” Annals of oncology 13.8

(2002): 1173-1184.

98. Van der Zee, J. “Hyperthermia in addition to radiotherapy.” Clinical Oncology 19.3 (2007):

S18.

99. Babbs, C. F., and D. P. DeWitt. “Physical principles of local heat therapy for cancer.” Medical

instrumentation 15.6 (1980): 367-373.

100. Moriyama-Gonda, N., et al. “Heat–Induced Cellular Damage and Tolerance in Combination

with Adriamycin for the PC–3 Prostate Cancer Cell Line: Relationships with Cytotoxicity, Reactive

Oxygen Species and Heat Shock Protein 70 Expression.” European urology 38.2 (2000): 235-240.

101. Katschinski, Dörthe M., et al. “Role of tumor necrosis factor α in hyperthermia-induced

apoptosis of human leukemia cells.” Cancer research 59.14 (1999): 3404-3410.

102. Bettaieb, Ahmed, and Diana A. Averill-Bates. “Thermotolerance induced at a fever temperature

of 40 C protects cells against hyperthermia-induced apoptosis mediated by death receptor signalling.”

Biochemistry and Cell Biology 86.6 (2008): 521-538.

103. Lord-Fontaine, Stephanie, and Diana A. Averill. “Enhancement of cytotoxicity of hydrogen

peroxide by hyperthermia in chinese hamster ovary cells: role of antioxidant defenses.” Archives of

biochemistry and biophysics 363.2 (1999): 283-295.

104. Drummond, Daryl C., et al. “Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to

solid tumors.” Pharmacological reviews 51.4 (1999): 691-744.

105. Bogovič, J., et al. “Posttreatment histology and microcirculation status of osteogenic sarcoma

after a neoadjuvant chemo-and radiotherapy in combination with local electromagnetic hyperthermia.”

Oncology Research and Treatment 24.1 (2001): 55-58.

106. Calderwood, Stuart K., Salamatu S. Mambula, and PHILLIP J. GRAY. “Extracellular heat

shock proteins in cell signaling and immunity.” Annals of the New York Academy of Sciences 1113.1

(2007): 28-39.

107. Toru Hiraga, Susumu Ito and HiroAki Nakamura. Side population in MDA-MB-231 human

breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.

Oncology Reports 25: 289-296, 2011.

108. N. V. Krakhmal, M. V. Zavyalova, E. V. Denisov, S. V. Vtorushin, V. M. Perelmuter. Cancer

Invasion: Patterns and Mechanisms. ACTA NATURAE , VOL. 7, No. 2 (25) 2015

55

109. Dong TT, Zhou HM, Wang LL, Feng B, Lv B, Zheng MH. Salinomycin selectively targets

‘CD133’+‘ cell subpopulations and decreases malignant traits in colorectal cancer lines. Ann Surg

Oncol. 2011;18:1797–1804.

110. Kusunoki S, Kato K, Tabu K, Inagaki T, Okabe H, Kaneda H, Suga S, Terao Y, Taga T, Takeda

S. The inhibitory effect of salinomycin on the proliferation, migration and invasion of human

endometrial cancer stem-like cells. Gynecol Oncol. 2013;129:598–605.

111. Lieke T, Ramackers W, Bergmann S, Klempnauer J, Winkler M, Klose J. Impact of

Salinomycin on human cholangiocarcinoma: induction of apoptosis and impairment of tumor cell

proliferation in vitro. BMC Cancer. 2012;12:466.

112. Florian Kopp, Adam Hermawan, Prajakta Shirish Oak, Vijay Kumar Ulaganathan, Annika

Herrmann, Nefertiti Elnikhely, Chitra Thakur, Zhiguang Xiao, Pjotr Knyazev, Beyhan Ataseven,

Rajkumar Savai, Ernst Wagner and Andreas Roidl. Sequential Salinomycin Treatment Results in

Resistance Formation through Clonal Selection of Epithelial-Like Tumor Cells. Translational

Oncology (2014) 7, 702–711

113. Yakisich JS (2012) Challenges and limitations of targeting cancer stem cells and/or the tumour

microenvironment. Drug Therapy Study 2: e10.

114. Park TS, Donnenberg VS, Donnenberg AD, Zambidis ET, Zimmerlin L (2014) Dynamic

interactions between cancer stem cells and their stromal partners. Current Pathobiol Reports 2: 41-52.

115. Visvader JE, Lindeman GJ (2008) Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence

and unresolved questions. Nat Rev Cancer 8: 755-768.

116. Li Y, Laterra J (2012) Cancer stem cells: distinct entities or dynamically regulated phenotypes?

Cancer Res 72: 576-580.

56

Dalyvavimas konferencijose

1. Milašiūtė G., Puidokaitė S., Ceslevičienė I., Antanavičiūtė I., Mikalayeva V. Effect of

salinomycin, antimycin, sodium phenylbutyrate and glucose deprivation on cancer cell viability and

mobility. 9 th International Scientific Conference "The Vital Nature Sign" : May 14-16, 2015 Kaunas,

Lithuania. Proceedings, p. 78-78

2. Rimkutė L., Marandykina A., Palacios-Prado N., Jotautis V., Milašiūtė G., Venclovas Č.,

Bukauskas F., Skeberdis V.A. Modulation of Cx36 gap junction conductance by intracellular pH and

Mg2+. XIIIth International Conference of Lithuanian Biochemical Society "50th anniversary of FEBS"

June 18-20, 2014; Symposium "Young biochemistry" : June 17, 2014, Birštonas, Lithuania

57

1 PRIEDAS

1 pav. Išskirtų pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų (BC1, BC2, BC4, BC5, BC6) bei žmogaus krūties duktalinės karcinomos (MCF-7) ir adenokarcinomos (MDA-MB-231) ląstelių linijų šviesinės

mikroskopijos nuotraukos (10x didinimas)

BC1 BC2

BC4

MCF-7

BC6

BC5

MDA-MB-231