PLACE ET INTERET DE LA DETECTION DES ANTICORPS ANTI-HLA DE CLASSE LORS DE LA RECHERCHE DES ANTICORPS ANTI-PLAQUETTES

Pierre Moncharmont a,*, Valerie Dubois a, Martine Vignal a, Yves Merieux a, Lucette Gebuhrer a, Dominique Rigal a

R ~ s u m ( ~

Lors de la recherche des anticorps (Acs) anti-plaquettes (PS), la mise en evidence d'Acs anti-HLA de classe Iest possible.

Ces Acs ont ete recherches avec le test de ,, Monoclonal antibody- specific immobilization of platelet antigen ~, (MAIPA) & I'aide d'un

Acs monoclonal anti-132 microglobuline. En cas de resultat positif, le depistage des Acs anti-HLA a ete pratique avec un test speci-

fique (ELISA) et la confirmation effectuee par lymphocytotoxicit&

Sur 263 patients positifs avec I'Acs anti-132 microglobuline,

223 (84,8 %) sent positifs au depistage des Acs anti-HLA et

159 (71,3 O/o) confirmes en lymphocytotoxicit& Parmi ces 159

echantillons, 6 ont une densite optique faible, situee entre 0,100

et 0,149 pour 3 et, entre 0,150 et 0,199, pour les 3 autres. Les

60 echantillons avec une densite optique superieure ou egale &

1,500 au MAIPA sont tous positifs au depistage des Acs anti-HLA et 54 (90 %) sont confirmes en lymphocytotoxicit& Parmi 50 sujets

contr61es negatifs en MAIPA, 4 (8,0 %) ont des Acs anti-HLA en

lymphocytotoxicit& En clinique, dans certaines pathologies, la detection d'Acs anti-HLA de classe I represente un element d'infor-

mation utile pour le diagnostic et le traitement. En presence d'une

densite optique meme faible (< 0,150) au test de MAIPA, la realisa-

tion de tests specifiques de recherche des Acs anti-HLA est

recommandee.

A n t i c o r p s - p l a q u e t t e s - H L A - c l a s s e I - d e p i s t a g e .

S u m m a r y : P l a c e a n d i n t e r e s t o f t h e d e t e c t i o n o f t h e c l a s s I H L A a n t i b o d i e s in p l a t e l e t a n t i b o d y t e s t i n g .

In platelet antibody testing, detection of Class I HLA antibody is possible. Presence of HLA antibody was screened by

a Etablissement frangais du sang Rh6ne Alpes - Site de Lyon 1-3, rue du Vercors 69364 Lyon cedex 07

* Correspondance pierre.moncharmont@efs.sante.fr

article rec;u le 2 d~cembre, accepte le 30 juin 2004.

© Elsevier SAS.

introducing a monoclonal anti-62 microglobulin antibody in a ,, Monoclonal Antibody-specific Immobilization of Platelet Antigen ,, (MAIPA) assay. When a positive result was obtained, the sample was tested with a specific ELISA screening test and confirmed by a lymphocytotoxicity assay. Among 263 patients positive with the anti-~2 microglobulin antibody, 223 (84,8 O/o) are positive on the HLA antibody screening test and 159 (71,3 O/o) are confirmed by the lymphocytotoxicity assay. Among the 159 samples positive on the lymphocytoxicity assay, 6 have a low opti- cal density, 3 between O, 100 and O, 149 and 3 between O, 150 and O, 199. All the 60 samples with an optical density at 1 500 or more are positive on the HLA antibody specific scree- ning test and 54 (90,0 %) are confirmed by the lymphocytotoxicity assay. Among 50 subjects MAIPA negative, 4 (8,0 %) have HLA specific antibody on the lymphocytotoxicity assay. In several diseases, detection of anti-HLA antibody is informative for diagno- sis and treatment. Specific testing of HLA antibody is recomman- ded even when a weak (< O, 150) optical density is observed on the MAIPA assay.

A n t i b o d y - p l a t e l e t - H L A - c lass I - s c r e e n i n g .

1. Introduction

A Pr6s transfusion de plaquettes (PS), la presence d'anticorps (Acs) anti-HLA de classe I represente une des causes majeures des

etats refractaires ou d'inefficacite transfusionnelle observes [4]. De plus, rexistence d'Acs anti-PS specifiques associes & des Acs anti- HLA accroft le risque d'inefficacite transfusionnelle [10, 12]. Les femmes sont frequemment porteuses d'Acs anti-HLA, jusqu'& 3 1 % selon les etudes [3, 6]. Ces Acs anti-HLA proviennent d'une immu- nisation secondaire & une grossesse, une transfusion ou une trans- plantation. Le r61e des Acs anti-HLA a ete suspecte dans certains cas de thrombopenies foetales et neonatales [1,9, 11, 14] mais cette don- nee demeure controversee [13]. Les antigenes HLA de classe I sont presents & la surface des PS [8] et, Iors de la recherche d'Acs anti- PS specifiques, la detection d'Acs anti-HLA de classe I est possible [5]. Afin de preciser si la positivit6 pour les Acs anti-HLA observee au cours de la realisation d'un test utilise pour la recherche des Acs anti- PS presentait un caractere informatif ou non, une confrontation aux resultats obtenus avec les tests specifiques de recherche des Acs anti- HLA a ete realisee.

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2. Materiels et methodes

2.1. Materiei

Les tests ont ete effectues & partir de sang peripherique preleve sur tubes secs et EDTA chez des patients oQ une recherche d'Acs anti- PS specifiques avait ete prescrite.

Pour chaque patient, il a ete demande au prescripteur d'apporter des renseignements cliniques succincts mais informatifs, tels que des ante- cedents transfusionnels, une grossesse en cours, la detection ante- rieure d'Acs anti-PS, des antecedents de thrombopenie foetale ou neonatale, la (les) pathologie(s) actuelle(s).

2 .2 Methodes

2.2.1. D~pistage et identification des Acs anti-PS sp~cifiques - d~pistage associ~ des Acs anti-HLA de classe I

Les conditions de realisation du depistage et de I'identification des Acs anti-PS specifiques ont ete exposees anterieurement [7]. Brievement, le depistage des allo-Acs et auto-Acs anti-PS a ete effec- tue par immunecapture (Modified Capture P, Immucor, [~tats-Unis, dis- tribue par Biorad, France) en respectant les instructions fixees par le fabricant. Ce test detecte, dans le serum ou le plasma, les Acs anti- PS specifiques mais egalement les Acs diriges contre les antigenes HLA de classe I portes par les PS [5]. Un echantillon trouve positif au depistage est soumis & une identification avec le test immuno- enzymatique sur microplaque ,, Monoclonal antibody-specif ic immo- bilization ofplatelet antigen ,, (MAIPA) [2]. Trois glycoproteines (GP) plaquettaires majeures ont ete testees, tes GP la Ila, GP lib Ilia et GP Ib IX et trois systemes de groupes plaquettaires explores : Human Platelet Antigen (HPA) 1,3 et 5.

Pour le test de MAIPA indirect, un pool de plaquettes prelevees chez dix donneurs de sang de groupes HPA-1,3 et 5 connus est employ& Les plaquettes de donneurs utilisees dans le pool et le panel d'iden- tification ont ete choisies et associees pour ta recherche des Acs anti-PS specifiques et non celle des Acs anti-HLA de classe I. Les don- neurs selectionnes n'ont pas ete types pour les antigenes HLA. Les propres plaquettes du patient, sous reserve qu'elles soient en quan- rite suffisante, sont employees dans le test de MAIPA direct.

En parallele, pour detecter la presence d'Acs anti-HLA de classe I, un Acs monoclonal murin anti-~2 microglobuline (anti-152m) (Clone B1 G6, Immunotech, France) a ete introduit dans le test de MAIPA indirect. Cet Acs reconnaTt le complexe HLA-62m libre ou associe & une mem- brane cellulaire.

La mise en evidence des Acs anti-PS et/ou anti-HLA fixes sur les pla- quettes du pool est realisee & l'aide d'un Acs de chevre anti-immu- noglobulines G humaines couple & de la peroxydase (Peroxydase- conjugated AffinPure F(ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcy Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA, I~tats-Unis).

Que ce soit pour les Acs anti-PS specifiques ou pour les Acs anti-HLA de classe I, une reaction est positive au test de MAIPA indirect pour une densite optique (DO) egale ou superieure & 0,100.

Des contreles internes ont ete places dans chaque serie de tests (deux serums contenant des Acs anti-PS specifiques, un serum positif pour les Acs anti-HLA et un serum negatif pour les deux categories d'Acs).

2.2.2. D~pis tage et identif ication des Acs anti-HLA de classe I par les tests sp~cif iques

Les echantillons positifs avec I'Acs monoclonal anti-~2m au test MAIPA indirect ont ete soumis & un test immunoenzymatique de depistage des Acs anti-HLA specifiques (LAT-M ~', One Lambda, Canoga Park, CA, #tats-Unis, distribue par Ingen, France). Ce reactif detecte uni- quement des Acs anti-HLA de classe G. Des quantites definies d'an-

tigenes HLA purifies ont ete placees dans differents puits de plaques de TerazakL La fixation des Acs specifiques contenus dans I'echan- tillon teste avec un ou plusieurs antigenes HLA presents dans le pool a ete detectee par une incubation en presence d'un Acs anti-immu- noglobuline G humaine conjugue & la phosphatase alcaline. I 'intensite de la reaction coloree a ete mesuree par spectrophotometrie apres addition du substrat appropri& Le test a ete realise en suivant les instructions donnees par le fabricant. Le seuil de positivite de la reaction a ete calcule & partir de I'equation definie par le fabricant. Un contrele interne (serum positif humain connu) a ete place dans chaque serie et utilise pour la valider.

Chaque echantillon depiste positif a ete confirme par un test de lym- phocytotoxicite (LOT) compose d'un panel incluant 34 lymphocytes T differents, phenotypes pour les antigenes HLA-A, -B, -Cw issus de don- neurs. Ce test a ete realise sur des plaques de Terazaki : 1 FL de chaque serum et 1 FL de lymphocytes T (3 x 10 ~ cellules/mL) ont ete deposes dans chaque puits des plaques. Apres incubation, le com- plement a ete ajout& La lyse cellutaire a ete revelee par incorporation d'eosine et la lecture effectuee au microscope inverse. Dans chaque puits, la positivite de la reaction a ete determinee par le pourcentage de cellules lysees rapporte au puits de contrele negatif. En fonction du nombre de cellules trouvees positives, un pourcentage de reacti- vite, ,, percent reactive antigen ,, (PRA) est defini pour chaque serum positif en LOT (par exemple, 12 cellules positives sur 34 cellules tes- tees ; PRA 35,0 %).

Afin de verifier le caractere informatif et les limites de I'addition d'un Acs monoclonal anti-#2m dans le test de MAIPA indirect, des echan- tillons trouves positif au test d'immunocapture indirect, mais negatif au test de MAIPA indirect ont ete utilises comme contreles.

3. R6suitats

Sur 263 patients, 243 femmes (92,4 %) et 20 hommes (7,6 %) posi- tifs avec I'Acs anti-1~2m au test de MAIPA indirect, 223 (84,8 %) sont positifs avec le test immunoenzymatique de depistage des Acs anti- HLA specifiques et 159 sur ces 228 (71,3 %) sont trouves porteurs d'Acs anti-HLA de classe I au test de LOT. Parmi les 159 patients avec Acs anti-HLA confirmes, 89 (56,0 %) ont des Acs avec une ou des specificites definies, 20 (12,6 %) ont des Acs polyspecifiques et 50 (31,4%) ont des Acs pour lesquets aucune specificite n'a pu etre eta- bile avec le panel utilis& La repartition des 6chantillons en fonction de la DO est recapitulee sur le tableau I.

Parmi les 37 echantillons avec une DO faible, inferieure & 0,200 au test de MAIPA indirect pour I'Acs monoclonal anti-132m, 6 (16,2 o/0) sont trouves porteurs d'Acs anti-HLA au test de LCT (tableau II). I'oppose, Iorsque la DO est superieure ou egale & 1,500, tousles echantillons positifs avec le test de MAIPA indirect sont trouves posi- tifs avec le test de depistage des Acs anti-HLA specifiques. La pre- sence d'Acs anti-HLA est de plus, tres frequemment confirmee en LCT, puisque sur 60 echantillons depistes positifs, 54 (90,0o/0) sont por- teurs d'Acs anti-HLA. Un phenomene analogue est constate pour les echantillons dont la DO au test de MAIPA indirect est comprise entre 1,000 et 1,499. Sur 31 echantillons depistes, 20 sont confirmes en LCT (64,5 %).

Sur les 50 echantillons contreles incluant 24 femmes (48,0 %) et 26 hommes (52,0 %), 7 (14,0 %) ont ere detectes positifs avec ]e test immunoenzymatique de depistage des Acs anti-HLA. Quatre ont ere confirmes positifs en LOT. Un presente un PRA de 42,0 % et les trois autres des PRA de 6,0 %, 3,0 % et 3,0 % respectivement. Aucune specificite HLA n'a pu etre etablie pour ces 4 echantillons.

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4. Discussion

Cette etude montre que la detection d'Acs anti-HLA de classe I lots des tests de depistage et d'identification des Acs anti-plaquettes est possible. Dans les conditions d'utilisation du test de MAIPA indirect, le pourcentage de patients confirmes porteurs d'Acs anti-HLA au test de LCT se revele elev@, atteignant plus de 70,0 %. De plus, I'existence d'Acs anti-HLA peut @tre suspectee, re@me pour des valeurs de DO basses. Six @chantillons avec une DO inferieure & 0,200 ont et@ confir- m@s porteurs d'Acs anti-HLA en LCT.

La strat@gie consistant & ajouter un Acs monoclonal anti-62m dans un test de MAI PA indirect presente un int@ret en clinique, notamment chez les patients devant recevoir des transfusions de plaquettes pour des h@mopathies ou & la suite de chimiotherapies Iourdes, et chez les femmes en cours de grossesse. Dans le cadre de I'oncologie, I'association d'Acs anti-PS et anti-HLA majore les risques d'@tat refrac- taire post-transfusionnel et accroft les difficultes pour obtenir des pla- quettes compatibles. II enest de re@me Iorsqu'il est n@cessaire de transfuser en urgence un nouveau-n@ dans le cadre d'une thrombo-

penie n@onatale. En I'absence d'un donneur de plaquettes compatibles, le recours aux PS de la mere, avec lavage et irradiation peut s'av@rer indispensable. L'existence d'Acs anti-HLA maternels transmis & I'en- fant accroit la difficulte d'obtention de PS compatibles. Enfin, dans cette etude, les renseignements cliniques n'ont et@ que tr@s rarement transmis au laboratoire r@alisant les examens.

En I'@tat, I'introduction de I'Acs monoclonal anti-132m dans le test de MAIPA indirect en vue de detecter des Acs anti-HLA de classe I pre- sente des limites.

Ellene permet pas potentiellement, de deceler la totalit@ des Acs anti- HLA de classe I presents chez les patients. Sur 50 @chantillons posi- tifs en immunocapture mais negatifs au test de MAIPA indirect, 7 ont @t@ trouves positifs avec le test immunoenzymatique de depistage des Acs anti-HLA specifiques et 4 confirm@s en LCT.

Le test de MAIPA indirect est realise avec un pool de plaquettes issues de dix donneurs de sang de groupes plaquettaires connus pour les systemes HPA-1,3 et 5. Les plaquettes du pool comme du panel ont @t@ s@lectionn@es initialement pour ta detection des Acs anti-PS spe- cifiques pr@sents dans un @chantillon biologique et non des Acs anti-

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HLA de classe I. Les groupages HLA des donneurs n'ont pas ete rea- lises. Le defaut de detection des Acs anti-HLA lots d'un test de MAIPA indirect peut 6tre de & une absence, dans le pool de plaquettes, d'un ou plusieurs antigenes H LA contre lesquels le patient est porteur d'Acs specifiques.

Le test de MAIPA indirect et le test de depistage immunoenzymatique, LAT-M TM detectent les Acs anti-HLA de nature IgG, mais pas de nature IgM (conjugue anti-immunoglobuline G humaine).

Enfin, le nombre de molecules d'antigenes HLA presentes & la surface des PS est inferieur & celui observe & la surface des lymphocytes [8], ce qui peut rendre la mise en evidence des Acs anti-HLA de classe I avec I'aide de PS plus difficile.

La detection d'Acs anti-HLA de classe I de nature IgG represente une information. C'est un argument supplementaire qui peut #tre utilise par le clinicien dans le cadre d'etats refractaires apres transfusion de plaquettes pour prescrire des tests specifiques de recherche des Acs anti-HLA, etayer le diagnostic et orienter la selection des donneurs

de PS. En obsterique, elle peut expliquer la presence d'une throm- bopenie neonatale de decouverte fortuite ou avec expression clinique sous la forme de petechies, d'un purpura voire d'hemorragies.

5. Conclusion

L ' ajout au test de MAIPA indirect d'un Acs monoclonal anti-132m permet de detecter des patients porteurs d'Acs anti-

HLA de classe I confirmes en LOT. Au quotidien, I'implication de ces Acs dans te cadre des etats refractaires apres transfusion de PS est bien etablie. L'information apportee constitue, pour le clinicien une aide & la prescription de tests specifiques de recherche des Acs anti-HLA et au final, pour le patient, de beneficier d'une thera- peutique transfusionnelle plus adaptee. Enfin, en obstetrique, I'existence d'une thrombopenie neonatale par Acs anti-H LA peut etre discutee.

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