8/14/2019 Plant Physiol. (1982) 70, 42-445 0032-0889/82/70/0442/04/$00.50/0

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 8 2 ) 7 0 , 4 2 - 4 4 50 0 3 2 - 0 8 8 9 / 8 2 / 7 0 / 0 4 4 2 / 0 4 / $ 0 0 . 5 0 / 0

D i r e c t S p e c t r o p h o t o m e t r i c M e a s u r e m e n t o f P h o t o s y s t e m I a n dP h o t o s y s t e m I I A c t i v i t i e s o f P h o t o s y n t h e t i c M e m b r a n eP r e p a r a t i o n s f r o m C y a n o p h o r a p a r a d o x a , P h o r m i d i u m l a m i n o s u m ,a n d S p i n a c h '

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n J a n u a r y 2 6 , 1 9 8 2 a n d i n r e v i s e d f o r m M a r c h 3 , 1 9 8L E O P . VERNON AN D S T E P H A N CARDOND e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , B r i g h a m Y o u n g U n i v e r s i t y , P r o v o , U t a h 8 4 6 0 2

ABSTRACTV e s i c l e s p r e p a r e d w i t h t h e F r e n c h p r e s s f r o m m e m b r a n e s o f c y a n e l l e s

o f C y a n o p h o r a p a r a d o x a r e t a i n 0 2 e v o l u t i o n a c t i v i t y w i t h r a t e s u p t o 5 0 0m i c r o m o l e s 2 , 6 - d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l r e d u c e d p e r h o u r p e r m i l l i g r a mc h l o r o p h y l l . T h i s a c t i v i t y i s i m m e d i a t e l y l o s t w h e n t h e v e s i c l e s a r e t r a n s -f e r r e d f r o m t h e s u c r o s e - p h o s p h a t e - c i t r a t e p r e p a r a t i o n b u f f e r i n t o d i l u t ep h o s p h a t e b u f f e r . S i m i l a r p r e p a r a t i o n s f r o m P h o r m i d i u m l a m i n o s u m , at h e r m o p h i l i c c y a n o b a c t e r i u m r e t a i n a c t i v i t y u nd e r s u c h c o n d i t i o n s . P h o -t o s y s t e m I a c t i v i t i e s o f b o t h c y a n o b a c t e r i a l v e s i c l e p r e p a r a t i o n s w e r ed e t e r m i n e d b y d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t o f N , N , N ' , N ' - t e t -r a m e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e p h o t o o x i d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f a n t h r a q u i -n o n e - 2 - s u l f o n a t e . T h e r a t e s s o d e t e r m i n e d w e r e c o m p a r e d w i t h r a t e s o f 0 2t a k e n u p i n t h e p r e s e n c e o f m e t h y l v i o l o g e n o r a n t h r a q u i n o n e - 2 - s u l f o n a t ea s e l e c t r o n a c c e p t o r s . T h e p r e d i c t e d s t o i c h i o m e t r y o f t w o w a s o b s e r v e d f o rm o l e s o f N , N , N ' , N ' - t e t r a m e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e o x i d i z e d p e r m o l e o fo x y g e n t a k e n u p . A n t h r a q u i n o n e - 2 - s u l f o n a t e w a s t h e b e t t e F e l e c t r o n a c -c e p t o r , a n d m a x i m a l r a t e s o f 9 4 3 m i c r o m o l e s p e r h o u r p e r m i l l i g r a mc h l o r o p h y l l f o r 0 2 u p t a k e w e r e o b s e r v e d f o r P h o r m i d i u m l a m i n o s u m p r e p -a r a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e . F o r p u r p o s e s o f c o m p a r -i s o n , s p i n a c h c h l o r o p l a s t s w e r e a s s a y e d f o r s i m i l a r a c t i v i t i e s . A l l p r e p a r a -t i o n s w e r e r e a d i l y a s s a y e d f o r p h o t o s y s t e m I a c t i v i t y b y t h e d i r e c t s p e c t r o -p h o t o m e t r i c m e t h o d , w h i c h h a s a d v a n t a g e s o f s i m p l i c i t y a n d f r e e d o m f r o me r r o r s i n t r o d u c e d b y p h o t o x i d a t i o n o f o t h e r s u b s t r a t e s b y p h o t o s y s t e m Iw h e n 0 2 u p t a k e i s m e a s u r e d .

N u m e r o u s r e d o x a g e n t s h a v e b e e n u t i l i z e d a s a r t i f i c i a l d o n o r sa n d a c c e p t o r s f o r b o t h P S I a n d P S I I o f c h l o r o p l a s t s . T h e s e r e a c -t i o n s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y r e v i e w e d b y H a u s k a ( 4 ) . P S I I a c t i v i t yi s u s u a l l y a s s a y e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y b y c o u p l i n g t h e r e d u c -t i o n o f a n o p t i c a l l y a b s o r b i n g a g e n t t o 0 2 e v o l u t i o n . A s t a n d a r dm e a s u r e o f P S I a c t i v i t y i n v o l v e s t h e o x i d a t i o n o f d o n o r s s u c h a sD P I P , 2 DAD, o r TMPD k e p t i n t h e r e d u c e d f o r m b y e x c e s sa s c o r b a t e . T h e o x i d a t i o n o f t h e a s c o r b a t e - d o n o r c o u p l e i s l i n k e dt o t h e r e d u c t i o n o f a n a u t o o x i d i z a b l e a g e n t s u c h a s MV o r aS u p p o r t e d b y a r e s e a r c h g r a n t f r o m B r i g h a m Y o u n g U n i v e r s i t y .

2 A b b r e v i a t i o n s : D P I P , 2 , 6 - d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l ; TMPD,N , N , N ' , N ' - t e t r a m e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e ; MV, m e t h y l v i o l o g e n ; A Q S ,a n t h r a q u i n o n e - 2 - s u l f o n a t e ; DAD, d i a m i n o d u r e n e ; D B M I B , 2 , 5 - d i b r o m o -3 - m e t h y l - 6 - i s o p r o p y l - p - b e n z o q u i n o n e ; S P C , a b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g0 . 5 M s u c r o s e , 0 . 5 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e , a n d 0 . 3 M s o d i u m c i t r a t e ; S O D ,s u p e r o x i d e d i s m u t a s e .

q u i n o n e s u c h a s AQS ( 1 1 ) . S u c h r e a c t i o n s a r e m e a s u r e d b y m e a no f 0 2 u p t a k e w i t h a n 0 2 e l e c t r o d e .T M P D i s r e a d i l y r e d u c e d b y P S I I a n d o x i d i z e d b y P S I , as h o w n b y t h e f a c t t h a t i t o v e r c o m e s DBMIB i n h i b i t i o n o f N ADPp h o t o r e d u c t i o n c o u p l e d t o w a t e r o x i d a t i o n ( 1 2 ) . I n t h i s c a s e , is e r v e s a s a b y p a s s f o r e l e c t r o n f l o w p a s t t h e DBMIB i n h i b i t i os i t e . I n s p i n a c h c h l o r o p l a s t s , TMPD r e a c t s w i t h p l a s t o c y a n i nw h i c h s e r v e s a s a d i r e c t d o n o r t o P S I ( 3 ) . I n t h i s s t u d y w e r e p o ro n t h e P S I I a c t i v i t i e s o f c y a n o b a c t e r i a l p r e p a r a t i o n s a s w e l l a s t hd i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t o f TMPD p h o t o o x i d a t i ob y P S I . T h e r a t e s o b s e r v e d f o r P S I i n t h i s m a n n e r a r e c o m p a r et o t h e r a t e s m e a s u r e d i n t h e t r a d i t i o n a l w a y a s 0 2 u p t a k e w i te x c e s s a s c o r b a t e p r e s e n t . T h e i m p e t u s f o r t h e s t u d y w a s o ui n t e r e s t i n t h e p h o t o r e a c t i o n s o f t h e c y a n e l l e o f C y a n o p h o rp a r a d o x a , w h i c h a l t h o u g h a n e n d o s y m b i o t i c o r g a n e l l e , h a s t hp h o t o c h e m i c a l c a p a b i l i t i e s o f c y a n o b a c t e r i a . T h e l a b i l i t y o f t hc y a n e l l e P S I I i s s h o w n a s w e l l a s t h e a b i l i t y o f P S I t o u s e a s c o r b a ti t s e l f a s a d o n o r t o a s i g n i f i c a n t e x t e n t . T h i s i s i n c o n t r a s t t o o t h ep h o t o s y n t h e t i c s y s t e m s i n w h i c h a s c o r b a t e i s a p o o r d o n o r t o P S( 4 ) .

MATERIALS AND METHODSS p i n a c h w a s p u r c h a s e d f r o m a l o c a l m a r k e t . T h e m e t h o d s u s ef o r g r o w t h o f C . p a r a d o x a a n d f o r i s o l a t i o n o f t h e c y a n e l l e w e rt h o s e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 ) . T h e o r i g i n a l c u l t u r e o f P h o r m i d i u ml a m i n o s u m (OH 1 - P ) , a g i f t f r o m D r . R i c h a r d C a s t e n h o l z , w a sg r o w n a s d e s c r i b e d b y J a c k s o n a n d C a s t e n h o l z ( 5 ) . S p i n a c h c h l or o p l a s t s w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( 6 ) a n d f i n a l ls u s p e n d e d i n 0 . 4 M s o r b i t a l a n d 0 . 1 M T r i s b u f f e r ( p H 7 . 0 )P h o t o s y n t h e t i c a l l y a c t i v e v e s i c l e s w e r e p r e p a r e d f r o m c y a n e l l ea n d f r o m P . l a m i n o s u m c e l l s b y t r e a t m e n t i n a F r e n c h P r e s s a1 4 , 0 0 0 p . s . i . i n t h e m e d i u m d e s c r i b e d b y D i l w o r t h a n d G a n t t ( 1 2

w h i c h c o n t a i n e d 0 . 5 M s u c r o s e , 0 . 5 M K - p h o s p h a t e a n d 0 . 3 Ms o d i u m c i t r a t e , a l l a t pH 7 . 0 . T h i s i s d e s i g n a t e d SPC b u f f e r . S e r u ma l b u m i n w a s n o t a d d e d , a s w a s p r e v i o u s l y d o n e b y K a t o h a n dG a n t t ( 7 ) . B e t t e r a c t i v i t y w a s o b s e r v e d f o r P S I I i f t h e f i n a l v e s i c lp r e p a r a t i o n c o n t a i n e d 0 . 2 mg C h l / m l o r m o r e .P S I I w a s a s s a y e d b y DPIP p h o t o r e d u c t i o n i n a medium p r ep a r e d w i t h 0 . 5 m l SP C b u f f e r , 3 0 , t l 2 . 0 mm D P I P , a n d 1 0 , u l o f t hp r e p a r a t i o n t o b e t e s t e d . P S I a c t i v i t y w a s m e a s u r e d s p e c t r o p h o -t o m e t r i c a l l y i n 0 . 6 m l o f a m e d i u m c o n s i s t i n g o f 0 . 5 m l SP Cb u f f e r , 0 . 6 7 mm TMPD, 3 . 3 mm KCN, 0 . 6 7 mm MV o r 0 . 8 3 mMA Q S , a n d 2 0 , u l o f t h e p r e p a r a t i o n t o b e t e s t e d . T h e s t o c k s o l u t i oo f 2 0 mm T M P D w a s i n m e t h a n o l a n d w a s k e p t a t 0 C i n t hd a r k t o p r e v e n t o x i d a t i o n . A s t h e T M P D b e c a m e o x i d i z e d i n t h is t o c k s o l u t i o n , t h e b a c k g r o u n d r a t e o f TMPD o x i d a t i o n i n t ha s s a y b e c a m e g r e a t e r . N e w s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d w e e k l y . T h e4 4 2

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SP E CT R O P H O T O M E T RI C M E A SU R E M E N T OF P S Io r i g i n a l c h o l o r p l a s t o r c y a n o b a c t e r i a l p r e p a r a t i o n w a s u s u a l l yd i l u t e d 1 t o 1 0 i n SP C b u f f e r f o r t h e a s s a y . When DCMU w a sp r e s e n t , i t w a s a t 0 . 1 m m . F o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f P S I a c t i v i t y b ym e a n s o f 0 2 u p t a k e , t h e a s s a y m i x t u r e c o nt a i n e d 1 . 3 m l SP Cb u f f e r , 4 . 0 m m N H 4 C l , 1 . 0 m m KCN, 0 . 1 m m MV o r A Q S , 0 . 1 mMTMPD, a n d 2 . 0 m m a s c o r b a t e i n a f i n a l v o l u m e o f 2 . 6 m l . T h i sr e a c t i o n w a s m e a s u r e d w i t h a Y e l l o w S p r i n g s I n st r u m e n t C o . O x 2e l e c t r o d e i m m e r s e d i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e w h i c h w a s s t i r r e d w i t ha m a g n e t i c s t i r r e r a n d m a i n t a i n e d a t 2 C w i t h a w a t e r b a t h .I l l u m i n a t i o n w a s w i t h a 1 5 0 - w t u n g s t e n l a m p a u g m e n t e d w i t h t h ei l l u m i n a t o r d e s c r i b e d b e l o w f o r t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y .L i g h t i n t e n s i t y o n t h e r e a c t i o n v e s s e l w a s 1 x 1 0 6 e r g s / c m 2 . s .S p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y s w e r e p e r f o r m e d i n a DU 8 B e c k m a ns p e c t r o p h o t o m e t e r w h i c h h a d b e e n m o d i f i e d t o a c c o m m o d a t e a ni l l u m i n a t i o n s y s t e m c o n s i s t i n g o f a m o d e l 1 7 0 D i l l u m i n a t o r ( D o -l a n - J e n n e r C o . , W o b u r n , MA) w h i c h t r a n s f e r r e d l i g h t t o t h er e a c t i o n c u v e t t e t h r o u g h a l i g h t p i p e o f o n e - h a l f i n c h e s d i a m e t e r .T h e i n c i d e n t l i g h t w a s p a s s e d t h r o u g h a r e d c u t o f f f i l t e r ( C o m i n g2 - 5 8 ) a n d a b l u e c u t o f f f i l t e r ( C o m i n g 4 - 9 6 ) w a s p l a c e d b e t w e e nt h e r e a c t i o n c u v e t t e a n d t h e h o u s i n g c o n t a i n i n g t h e p h o t o c e l l . A1 - m l c u v e t t e w a s u s e d t o a l l o w t h e e n t i r e r e a c t i o n m i x t u r e t o b ei l l u m i n a t e d , o t h e r w i s e l o c a l d i f f e r e n c e s i n a b s o r b a n c e w e r e p r e s e n tw h i c h l e d t o s p u r i o u s r e s u l t s . L i g h t i n t e n s i t y a t t h e r e a c t i o n v e s s e lw a s 5 x 1 0 5 e r g s / c m 2 . S w h i c h w a s s a t u r a t i n g . B o t h r e a c t i o n s w e r ed e t e r m i n e d a t 5 9 0 n m , w h i c h i s c l o s e t o t h e a b s o r p t i o n p e a k o fD P I P , a n d i s l o c a t e d a t t h e s m a l l t r o u g h b e t w e e n t h e t w o m a j o ra b s o r p t i o n p e a k s o f TMPD. T h e s p e c i f i c m i l l i m o l a r a b s o r p t i v i t i e so f DPIP a n d TMPD u s e d f o r c a l c u l a t i o n o f r a t e s o f r e a c t i o n w e r e1 6 ( 1 0 ) a n d 8 . 0 4 / c m , r e s p e c t i v e l y .

RESULTS AND DISCUSSIONI n o u r e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g t h e p h o t o c h e m i c a l a p p a r a t u s o ft h e c y a n e l l e o f C . p a r a d o x a , i t w a s n e c e s s a r y t o m e a s u r e b o t hp h o t o s y s t e m a c t i v i t i e s i n d e p e n d e n t l y . O n c e i t w a s d e t e r m i n e d t h a tp r e p a r a t i o n o f c y a n e l l e v e s i c l e s b y u s e o f t h e F r e n c h P r e s s w i t hSP C b u f f e r ( 1 ) p r o d u c e d a n a c t i v e p r e p a r a t i o n f o r 0 2 e v o l u t i o n ,a s e v i d e n c e d b y DPIP p h o t o r e d u c t i o n , i t b e c a m e p o s s i b l e t o s t u d y

b o t h p h o t o s y s t e m s . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s d e s i g n e d t o f o l l o wP S I a c t i v i t y b y a d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t o fTMPD o x i d a t i o n p r o v e d p r o m i s i n g , a n d t h i s r e a c t i o n w a s u s e dr o u t i n e l y , n o t o n l y w i t h c y a n e l l e p r e p a r a t i o n s , b u t w i t h a no t h e rc y a n o b a c t e r i u m a n d w i t h s p i n a c h c h l o r o p l a s t s .E

00).36I L Ow0. 2 4zmz . 1 2C DC D

s oj l _ r A

o f f30 60 g o 3 0

TIME (seconds)F I G . 1 . S p e c t r o p h o t o m e t r i c measurement o f P S I a n d P S I I a c t i v i t i e s .V e s i c l e s o f C . p a r a d o x a a n d s p i n a c h c h l o r o p l a s t s w e r e p r e p a r e d f r o m t h ec y a n e l l e s as d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " A , DPIP p h o t o r e -

d u c t i o n as a m e a s u r e o f P S I I . Th e P S I I assay s y s t e m c o n t a i n e d 6 . 1 j i g C h la i n c y a n e l l e v e s i c l e s . B , TMPD p h o t o o x i d a t i o n as a m e a s u r e o f P S I . Th eP S I assay s y s t e m c o n t a i n e d AQS as t h e e l e c t r o n acceptor a n d 3 . 0 , u g C h la f r o m s p i n a c h c h l o r o p l a s t s . DCMU was p r e s e n t as i n d i c a t e d as 1 0 ' M .Th e r a t e s o f r e a c t i o n i n M m o l / h mg C h l w e r e 4 9 8 f o r DPIP p h o t o r e d u c -t i o n , a n d 1 , 5 3 2 a n d 1 , 8 4 8 f o r TMPD p h o t o o x i d a t i o n , t h e l a t t e r i n t h epr es en ce o f DCMU.

T a b l e I . I n s t a b i l i t y o f 0 2 E v o l u t i o n i n P h o t o s y n t h e t i c M e m b r a n e V e s i c l e sP r e p a r e d f r o m C y a n e l l e s o f C y a n o p h o r a p a r a d o x a

T h e a s s a y s y s t e m f o r P S I I a c t i v i t y c o u p l e d t o DPIP p h o t o r e d u c t i o n i sg i v e n u n d e r " M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " Where i n d i c a t e d , p h o s p h a t e b u f f e r( p H 7 . 0 ) o f 0 . 0 2 5 i o n i c s t r e n g t h w a s s u b s t i t u t e d f o r t h e s uc r o s e p h o s -p h a t e : c i t r a t e ( S P C ) b u f f e r i n t h e a s s a y m i x t u r e .

H 2 0 - - D P I P A c t i v i t yC o n d i t i o n s C y a n e l l e s P . l a m i n o s u m S p i n a c h

, i m o l / m g C h l . hSP C b u f f e r 3 9 0 2 0 4 3 3 0D i l u t e p h o s p h a t e b u f f e r 5 1 8 5 2 5 6D i l u t e p h o s p h a t e b u f f e ra f t e r 1 0 m i n 0 1 7 2 2 0 5

F i g u r e 1 s h o w s t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s t h a t o c c u r w i t h ac y a n e l l e p r e p a r a t i o n a t 5 9 0 n m w i t h e i t h e r DPIP ( m e a s u r i n g P S I I )o r TMPD ( m e a s u r i n g P S I ) . F o r t h e P S I r e a c t i o n , a n a u t o o x i d i z -a b l e r e a g e n t s u c h a s MV o r AQS m u s t b e p r e s e n t t o a c c e p te l e c t r o n s f r o m P S I . A s t h e TMPD p h o t o o x i d a t i o n r e a c t i o n p r o -c e e d s , i t d e p a r t s f r o m l i n e a r i t y a s t h e o x i d i z e d f o r m a c c u m u l a t e s ,m o s t l i k e l y d u e t o t h e a b i l i t y o f t h e o x i d i z e d f o r m t o s e r v e a s a na c c e p t o r f o r P S I I . T h e a d d i t i o n o f DCMU t o t h e r e a c t i o n m i x t u r ee x t e n d s t h e p e r i o d o f l i n e a r i t y a n d g e n e r a l l y c a u s e s a n i n c r e a s e i nt h e o b s e r v e d r a t e o f TMPD p h o t o o x i d a t i o n . A s s h o w n b e l o w , t h i sm e a s u r e o f P S I a c t i v i t y i s a v a l i d m e a s u r e m e n t , a s d e t e r m i n e d b ya c o m p a r i s o n w i t h t h e m o r e t r a d i t i o n a l m e t h o d o f m e a s u r i n g 0 2u p t a k e i n a s i m i l a r s y s t e m , i n w h i c h e x c e s s a s c o r b a t e i s p r e s e n t t ok e e p TPMD i n t h e r e d u c e d f o r m . T h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a yi s p a r t i c u l a r l y e a s y t o p e r f o r m w i t h t h e B e c k m a n DU 8 s p e c t r o -p h o t o m e t e r , i n a s m u c h a s a b s o r b a n c e d e c r e a s e s ( D P I P ) o r i n -c r e a s e s (TMPD) c a n b e f o l l o w e d u s i n g t h e s a m e a p p a r a t u s a n ds a m e p r o g r a m a t 5 9 0 n m . T h e r e i s a s l o w o x i d a t i o n o f TMPD i nt h e d a r k , a s e v i d e n c e d b y t h e s l o w r e a c t i o n b e f o r e t h e l i g h t i st u r n e d o n ( F i g . 1 ) . T h e i n i t i a l d a r k r e a c t i o n c a n b e m i n i m i z e d b yt h e a d d i t i o n o f c y a n i d e a n d u t i l i z a t i o n o f f r e s h l y p r e p a r e d TMPDs o l u t i o n s .I t i s k n o w n t h a t P S I I f r o m c y a n o b a c t e r i a i s d i f f i c u l t t o i s o l a t ei n a n a c t i v e f o r m , a n d i t w a s t h e e a r l i e r w o r k o f K a t o h a n d G a n t t( 7 ) w h i c h s h o w e d t h a t u s e o f t h e SP C b u f f e r , c o n t a i n i n g h i g hc o n c e n t r a t i o n s o f s u c r o s e , p h o s p h a t e , a n d c i t r a t e , a l l o w e d t h ei s o l a t i o n o f a c t i v e v e s i c l e s f r o m A n a b a e n a v a r i a b i l i s . T h i s w o r kw a s e x t e n d e d b y D i l w o r t h a n d G a n t t ( 1 ) w i t h t h e r e d a l g aP o r p h y r i d i u m c r u e n t u m , i n w h i c h t h e y d e m o n s t r a t e d a s t a b l e a c t i v ep r e p a r a t i o n f r o m t h i s o r g a n i s m , s h o w i n g r a t e s o f a b o u t 4 5 0 , t m o l /h . m g C h l f o r 0 2 e v o l u t i o n . T h e k e y t o r e t e n t i o n o f a c t i v i t y i s t h er e t e n t i o n o f t h e p h y c o b i l i s o m e s o n t h e m e m b r a n e s u r f a c e , i n d i -c a t i n g t h a t t h e p h y c o b i l i s o m e s a r e i n t i m a t e l y c o n n e c t e d t o t h e 0 2e v o l v i n g s y s t e m , a n d t h e i r r e m o v a l a l l o w s c h a n g e s i n P S I I c o n -f o r m a t i o n l e a d i n g t o i n a c t i v i t y .B y u s e o f t h e D i l w o r t h a n d G a n t t p r o c e d u r e , a c t i v e p r e p a r a t i o n sa r e r o u t i n e l y p r e p a r e d f r o m t h e c y a n e l l e o f C . p a r a d o x a , s h o w i n gt h a t t h e s a m e c o n s i d e r a t i o n s a p p l y i n t h i s c a s e . T h e p r e p a r a t i o n sr e t a i n a c t i v i t y f o r s e v e r a l d a y s i n SP C b u f f e r i n t h e c o l d ( 2 C ) ,a l t h o u g h i t d o e s d e c r e a s e s l o w l y . T a b l e I s h o w s t h a t t h e P S I Ia c t i v i t y o f c y a n e l l e p r e p a r a t i o n s i s l o s t i m m e d i a t e l y i f DPIPp h o t o r e a c t i o n i s a s s a y e d i n d i l u t e p h o s p h a t e b u f f e r . F o r p u r p o s e so f c o m p a r i s o n , t h e t h e r m o p h i l i c c y a n o b a c t e r i u m P . l a m i n o s u mw a s s u b j e c t e d t o a s i m i l a r t r e a t m e n t . T h i s c y a n o b a c t e r i u m i s muchm o r e s t a b l e i n t e r m s o f i t s 0 2 e v o l u t i o n a c t i v i t y , a n d t h e d a t a o fT a b l e I i l l u s t r a t e t h a t t h i s s t a b i l i t y i s r e f l e c t e d i n p r e p a r a t i o n sf r o m t h i s c y a n o b a c t e r i u m b e i n g a b l e t o p e r f o r m DPIP p h o t o r e -d u c t i o n i n a r e a c t i o n m i x t u r e w i t h d i l u t e b u f f e r . W e h a v e n o tp e r f o r m e d d e t a i l e d e x p e r i m e n t s t o d e t e c t t h e r e m o v a l o f p h y c o -b i l i s o m e s f r o m t h e v e s i c l e p r e p a r a t i o n s i n d i l u t e b u f f e r , b u t c e n -t r i f u g a t i o n o f v e s i c l e p r e p a r a t i o n a f t e r d i l u t i o n w i t h t h e o r i g i n a l

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T a b l e I I . P h o t o c h e m i c a l A c t i v i t i e s o f S p i n a c h C h l o r o p l a s t a n d C y a n o b a c t e r i a l Membrane P r e p a r a t i o n sP S I a c t i v i t i e s f o r T M P D p h o t o o x i d a t i o n w e r e m e a s u r e d e i t h e r d i r e c t l y b y s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e r m i na t i o n o f TMPD p h o t o o x i d a t i o n o r b y t h e 0e l e c t r o d e i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b a t e a n d e i t h e r MV o r A Q S . R a t e s a r e e x p r e s s e d a s p m o l / h . m g C h l o f TMPD o x i d a t i o n o r 0 2 u p t a k e . W h e ri n d i c a t e d , 0 . 1 mg SOD w a s p r e s e n t a n d DCMU w a s 0 . 1 m M . When SO D w a s p r e s e n t , KCN w a s o m i t t e d . T h e r a t i o s g i v e n f o r t h e t w o m e t h o d s f o

m e a s u r i n g P S I a c t i v i t y a r e c a l c u l a t e d a f t e r s u b s t r a c t i n g t h e r a t e o f 0 2 t a k e n u p i n t h e a b s e n c e o f TMPD, w h i c h i s a m e a s u r e o f a s c o r b a t e o x i d a t i o n bP S I .R a t e s o f T M P D P h o t o o x i d a t i o n

P r e p a r a t i o n H20 D P I P T M P D - * MV T M P D --AQS( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 5 )S p e c t r o E l e c t r o d e ( 2 ) / ( 3 ) S p e c t r o E l e c t r o d e ( 4 ) / ( 5 )p m o l / m g C h l . h r a t i o u m o l / m g C h l . h r a t i oS p i n a c h c h l o r o p l a s t s 2 7 4 1 , 4 5 2 9 1 2 1 . 6 7 1 , 9 1 1 9 4 2 2 . 1 2+DCMU 0 1 , 8 2 3 8 8 1 2 . 1 7 2 , 0 3 6 9 3 5 2 . 2 8+SOD 3 0 2 1 , 3 5 1 7 7 9 1 . 8 4 1 , 8 9 3 9 7 8 2 . 0 3+DCMU, SOD 0 1 , 3 0 7 6 8 0 2 . 0 9 1 , 8 2 0 8 4 8 2 . 2 6-T M PD + DCMU, SO D 0 4 3

C y a n e l l e 3 9 0 6 7 8 6 0 8 1 . 7 1 1 , 2 9 5 7 6 2 2 . 3 5+DCMU 0 6 4 0 5 8 5 1 . 6 3 9 6 2 6 9 1 2 . 0 0+SOD 3 9 7 5 7 9 5 7 0 1 . 6 2 7 5 7 6 2 1 1 . 9 2+DCMU, SOD 0 5 4 0 5 5 0 1 . 7 0 6 8 7 6 1 1 1 . 8 2-TMPD + DCMU, SOD 0 2 2 6

P . l a m i n o s u m 3 3 0 1 , 4 2 3 1 , 0 2 4 1 . 4 2 2 , 4 9 0 1 , 2 6 4 2 . 0 1+DCMU 0 1 , 6 1 9 7 2 8 2 . 3 0 2 , 6 0 5 1 , 2 4 3 2 . 1 3+SOD 3 7 0 1 , 2 4 7 6 5 3 1 . 9 9 2 , 0 7 9 9 9 7 2 . 1 4+DCMU, SOD 0 1 , 1 1 8 5 5 7 2 . 1 0 2 , 0 0 5 9 4 3 2 . 1 8-TMPD + DCMU, SOD 0 2 5SP C b u f f e r s o l u t i o n a n d a f t e r d i l u t i o n w i t h d i l u t e p h o s p h a t eb u f f e r s h o w s t h a t a l m o s t a l l o f t h e p h y c o c y a ni n f r o m t h e c y a n e l l ep r e p a r a t i o n i s r e c o v e r e d i n t h e s u p e r n a t a n t f r a c t i o n a f t e r d i l u t i o nw i t h p h o s p h a t e b u f f e r , a n d l e s s t h a n h a l f t h e p h y c o c y a n i n i sr e c o v e r e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t o f t h e s u s p e n s i o n d i l u t e d w i t hSP C b u f f e r . B y c o n t r a s t , m u c h l e s s o f t h e p h y c o c y a n i n i s r e c o v e r e di n e i t h e r s u p e r n a t a n t w h e n P . l a m i n o s u m v e s i c l e s a r e s u b j e c t e d t ot h e s a m e t r e a t m e n t . T h i s a g r e e s w i t h t h e m o r e d e t a i l e d a n a l y s i sp e r f o r m e d b y D i l w o r t h a n d G a n t t ( 1 ) .T h e d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t o f T M P D p h o -t o o x i d a t i o n i s s i m p l e t o p e r f o r m , b u t n e e d s t o b e c o m p a r e d t o t h eg e n e r a l l y a c c e p t e d a s s a y i n v o l v i n g 0 2 u p t a k e i n t h e p r e s e n c e o fe x c e s s a s c o r b a t e . T a b l e I I p r e s e n t s d a t a o b t a i n e d f r o m t h r e em a t e r i a l s , c o m p a r i n g b o t h r e a c t i o n s w i t h e i t h e r MV o r AQS a d d e da s t h e a u t o o x i d i z a b l e a c c e p t o r f o r P S I . T h e r a t e s r e p o r t e d a r e f o rTMPD o x i d a t i o n d i r e c t l y o r f o r 0 2 u p t a k e , i n t e r m s o f , u m o l / h -mg C h l . S i n c e 0 2 i s t a k e n u p t o f o r m H 2 0 2 , a s s h o w n b y O r t a n dI z a w a ( 1 1 ) , t h e r e a r e t w o e l e c t r o n s t r a n s f e r r e d p e r 0 2 i n t h i sr e a c t i o n c o m p a r e d t o t h e o n e e l e c t r o n i n v o l v e d i n t h e p h o t o o x i -d a t i o n i n TMPD, w h i c h i s o x i d i z e d t o a s t a b l e s e m i q u i n o n e k n o w na s W u r s t e r ' s b l u e ( 9 ) . S o l o n g a s i n i t i a l r a t e s a r e t a k e n f o r T M P Do x i d a t i o n , t h e o n e e l e c t r o n s t e p i s v a l i d . A s s h o w n i n T a b l e I I ,w i t h s o m e v a r i a t i o n , t h e e x p e c t e d s t o i c h i o m e t r y o f 2 m o l TMPDp h o t o o x i d i z e d t o e a c h m o l o f 0 2 c o n s u m e d i s r e a l i z e d f o r a l l t h r e ep r e p a r a t i o n s , s h o w i n g t h e e q u i v a l e n c e o f t h e t w o m e t h o d s o fm e a s u r i n g P S I a c t i v i t i e s .Some f e a t u r e s o f t h e d a t a o f T a b l e I I a r e w o r t h y o f n o t e .A d d i t i o n o f DCMU t o t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y c a u s e s a ni n c r e a s e i n t h e r a t e o f r e a c t i o n , w h i c h ma y r e f l e c t t h e a b i l i t y o ft h e o x i d i z e d f o r m o f TMPD t o s e r v e a s a n e l e c t r o n a c c e p t o r f o rP S I I . When DCMU i s a d d e d t o t h e 0 2 e l e c t r o d e a s s a y , a d e c r e a s ei n a c t i v i t y i s n o t e d , w h i c h i n d i c a t e s t h a t s o m e e l e c t r o n s a r e f l o w i n gt h r o u g h P S I I , e i t h e r f r o m w a t e r o x i d a t i o n o r o x i d a t i o n o f t h ea d d e d d o n o r , e i t h e r TMPD o r a s c o r b a t e . F o r a l l t h r e e p r e p a r a -t i o n s , t h e r a t e s o b s e r v e d w i t h AQS a s t h e e l e c t r o n a c c e p t o r w e r eg r e a t e r t h a n t h o s e f o r MV. T h i s w a s e s p e c i a l l y t r u e f o r P . l a m i -

n o s u m , f o r w h i c h t h e A Q S - s u p p o r t e d r e a c t i o n w a s a l m o s t t w i ct h a t o b s e r v e d w i t h MV.T h e r e a c t i o n s o b s e r v e d w i t h c y a n e l l e v e s i c l e s d i f f e r i n t ws i g n i f i c a n t w a y s . T h e y a r e t h e l o w e s t o f t h e r a t e s o b s e r v e d , a nt h e r e i s a p p r e c i a b l e p h o t o o x i d a t i o n o f a s c o r b a t e i n t h e a b s e n c e oTMPD. S i n c e DCMU i s p r e s e n t i n t h e a s s a y m i x t u r e , t h e a s c o r b a tm u s t b e o x i d i z e d b y P S I . T h i s i s i n c o n t r a s t t o m o s t p h o t o s y n t h e t is y s t e m s e x a m i n e d t o d a t e ( 2 , 4 ) .T h e e n z y m e SO D a f f e c t s b o t h p h o t o r e a c t i o n s s t u d i e d . I t s a dd i t i o n c a u se s a s l i g h t s t i m u l a t i o n o f DPIP p h o t o r e d u c t i o n , a n dm o r e s i g n i f i c a n t i n h i b i t i o n o f 0 2 u p t a k e . T h e n a t u r e o f t h e s t i mu l a t i o n o f DPIP p h o t o r e d u c t i o n i s n o t k n o w n , bu t t h e e f f e c t o0 2 u p t a k e b y a s c o r b a t e - s u p p o r t e d P S I r e a c t i o n s h a s b e e n s t u d i eb y O r t a n d I z a w a ( 1 1 ) . I n t h e a b s e n c e o f t h e e n z y m e , t h e s u p e ro x i d e i o n g e n e r a t e d i n t h e o x i d a t i o n o f t h e r e d u c e d a c c e p t o r , MVa n d A Q S , i n t e r a c t s w i t h a s c o r b a t e a n d i s r e d u c e d t o p e r o x i d e ba s c o r b a t e . T h i s i n c r e a s e s t h e a m o u n t o f 0 2 t a k e n u p b y t he l e c t r o n s f l o w i n g t h r o u g h P S I , a n d c h a n g e s t h e s t o i c h i o m e t r y ot h e r e a c t i o n . T h e a d d i t i o n o f SO D t o r e a c t i o n s g e a r e d f o r 0u p t a k e d e c r e a s e s t h e a m o u n t o f 0 2 t a k e n u p , a n d l e a d s t o t hc o r r e c t b a l a n c e o f 0 2 u p t a k e p e r e l e c t r o n f l o w i n g t h r o u g h P S IT h e f a c t t h a t SO D a l s o i n h i b i t s t h e o x i d a t i o n o f TMPD m e a s u r ed i r e c t l y i n d i c a t e s t h a t s u p e r o x i d e i o n c a n i n t e r a c t w i t h a n d o x i d i zTMPD i n s u c h r e a c t i o n m i x t u r e s , a l s o l e a d i n g t o a h i g h v a l u e oTMPD o x i d a t i o n .T h e e x p e r i m e n t s o u t l i n e d i n T a b l e I I a r e d i r e c t e d t o w a r d P Sr e a c t i o n s , a n d t h e DPIP a c t i v i t i e s o f t h e s e p a r t i c u l a r p r e p a r a t i o nw e r e s o m e w h a t l o w . T h e r a t e s o f DPIP p h o t o r e d u c t i o n b y c y a n e l lv e s i c l e s r a n g e u p t o 5 0 0 , u m o l / h . m g C h l , ( F i g . 1 ) . T h e m a x i m ar a t e o b s e r v e d f o r P . l a m i n o s u m v e s i c l e s i s i n t h e s a m e r a n g e , 4 8 1, u m o l / h - m g C h l .T h e d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y f o r TPMD p h o t o o x i d a t i ob y P S I i s s h o w n t o b e a v a l i d a s s a y . I t i s a l s o a n e a s y a s s a y tp e r f o r m i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e s t a n d a r d DPIP p h o t o r e d u c t i oa s s a y f o r P S I I a c t i v i t y . T h e 0 2 u p t a k e a s s a y s f o r P S I i n t hp r e s e n c e o f e x c e s s a s c o r b a t e a r e a l s o e a s y t o p e r f o r m , b u t a s s h o w

4 4 4 V E R N O N AND C A R D O N P l a n t P h y s i o l . V o l . 7 0 , 1 9 8

8/14/2019 Plant Physiol. (1982) 70, 42-445 0032-0889/82/70/0442/04/$00.50/0

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SP E CT R O P H O T O M E T RI C MEASUREMENT O F P S Ii n T a b l e I I , o n e m u s t b e s u r e t h a t a s c o r b a t e i t s e l f i s n o t c o n t r i b -u t i n g t o 0 2 u p t a k e i n a m a j o r w a y w h i c h c a n p r o d u c e e r r o n e o u sr e s u l t s , a s w a s o b s e r v e d w i t h c y a n e l l e v e s i c l e s . I n t h e c a s e o f t h ec y a n e l l e , we f e e l t h a t t h e d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c a s s a y i s t h em o r e a c c u r a t e a s s a y , i n a s m u c h a s i t d o e s n o t h a v e t h e p o t e n t i a lc o m p l i c a t i o n s o f o t h e r e l e c t r o n d o n o r s s u p p l y i n g e l e c t r o n s t o P S I ,a n d s o l o n g a s t h e i n i t i a l r a t e s o f TMPD p h o t o o x i d a t i o n a r e l i n e a r ,a r e l i a b l e r a t e f o r t h i s a c t i v i t y c a n b e o b t a i n e d .

T h e r a t e s o f P S I a c t i v i t i e s r e p o r t e d h e r e a r e i n a g r e e m e n t w i t ht h o s e r e p o r t e d b y o t h e r s . O r t a n d I z a w a r e p o r t r a t e s f o r s p i n a c hc h l o r o p l a s t ( 1 1 ) o f 7 7 5 f o r d i a m i n o t o l u e n e a n d 1 , 2 5 0 f o r d i a m i -n o d u r e n e , w h i l e H a u s k a e t a l . ( 2 ) r e p o r t r a t e s o f 8 6 0 f o r TMPD,8 9 0 f o r d i a m i n o d u r e n e , 1 , 8 8 0 f o r a m i x t u r e o f TMPD a n d d i a -m i n o d u r e n e , 4 5 0 f o r D P I P , a n d 2 , 1 0 0 f o r a m i x t u r e o f TMPD a n dD P I P . A l l t h e s e r a t e s a r e f o r 0 2 u p t a k e t o t h e p e r o x i d e l e v e l , o rt w o e l e c t r o n s p e r 0 2 m o l e c u l e .A d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c o x i d a t i o n o f DPIP c a n a l s o b eo b s e r v e d t o s o m e e x t e n t , b u t t h e o b s e r v e d r a t e i s n o t l i n e a r ( d a t an o t s h o w n h e r e ) . T h i s r e f l e c t s t h e f a c t t h a t DPIP i s a b e t t e re l e c t r o n a c c e p t o r f o r P S I I r e a c t i o n s t h a n i s TMPD bu t i s n o t a sg o o d a d o n o r t o P S I .T h e e x p e c t e d s t o i c h i o m e t r y o f 2 m o l TMPD p h o t o o x i d i z e d /m o l o f 0 2 t a k e n u p i s g e n e r a l l y r e a l i z e d , b u t w i t h s p i n a c h a n d P .

l a m i n o s u m t h e r a t i o s a r e s o m e w h a t a b o v e 2 , a n d f o r c y a n e l l e s t h er a t i o i s b e l o w 2 . T h e r e may s t i l l b e f a c t o r s r e l a t i n g t o p h o t o o x i -d a t i o n r e a c t i o n s o f P S I t h a t a r e n o t i m m e d i a t e l y a p p a r e n t . T h es i t u a t i o n w i t h c y a n e l l e s i s c o m p l i c a t e d b y t h e h i g h r a t e o f a s c o r -b a t e p h o t o o x i d a t i o n b y P S I . W i t h s p i n a c h a n d P . l a m i n o s u m t h er a t e s a r e c l o s e e n o u g h t o a l l o w e i t h e r m e t h o d t o b e u s e d i nc o m p a r a t i v e m e a s u r e m e n t s o f P S I a c t i v i t y . I n e i t h e r c a s e DCMU

a n d SO D m u s t b e a d d e d t o e n s u r e t h a t t h e TMPD o x i d i z e d o r 0 2t a k e n u p a c c u r a t e l y m e a s u r e P S I a c t i v i t y .LITERATURE CITED

1 . DILWORTH MF, E GANTT 1 9 8 1 P h y c o b i l i s o m e - t h y l a k o i d t o p o gr a p h y o n p h o t o -s y n t h e t i c a l l y a c t i v e v e s i c l e s . o f P o r p h y r i d i u m c r u e n t u m . P l a n t P h y s i o l 6 7 : 6 0 8 -6 1 22 . HAUSKA G , S R E I M E R , A T R E B S T 1 9 7 4 N a t i v e a r t i f i c i a l e n e r g y - c o n s e r v i n g s i t e s i nc y c l i c p h o t o p h o s p h o r y l a t i o n s y s t e m s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 3 5 7 : 1 - 1 33 . H A U S K A G , W O ET TM EI ER , S R E I M E R , A T R E B S T 1 9 7 5 S h u t t l e s o f a r t i f i c i a le l e c t r o n d o n o r s f o r p h o t o s y s t e m I a c r o s s t h e t h y l a k o i d m e m b r a n e . Z N a t u r -f o r s c h 3 0 c : 3 7 - 4 54 . H A u s K A G 1 9 7 7 A r t i f i c i a l a c c e p t o r s a n d d o n o r s . I n A T r e b s t , M A v r o n , e d s ,P h o t o s y n t h e s i s I . P h o t o s y n t h e t i c E l e c t r o n T r a n s p o r t a n d P h o t o p h o s p h o r y l a -t i o n . S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n , 2 5 3 - 2 6 55 . J A C K S O N J E , RW C A S T E N H O L Z 1 9 7 5 F i d e l i t y o f t h e r m o p h i l i c b l u e - g r e e n a l g a e t oh o t s p r i n g h a b i t a t s . L i m n o l O c e a n o g 2 0 : 3 0 5 - 3 2 26 . J A Y N E S J M , LP V E R N O N , SM K L E I N 1 9 7 5 P h o t o p h o s p h o r y l a t i o n a n d r e l a t e dp r o p e r t i e s o f r e a g g r e g a t e d v e s i c l e s f r o m s p i n a c h p h o t o s y s t e m I p a r t i c l e s .B i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 0 8 : 2 4 0 - 2 5 17 . KATOH T , E GANTT 1 9 7 9 P h o t o s y n t h e t i c v e s i c l e s w i t h b o u n d p h y c o b i l i s o m e sf r o m A n a b a e n a v a r i a b i l i s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 5 4 6 : 3 8 3 - 3 9 38 . K L E I N S , JM J A Y N E S , S S K E N T , LP VERNON 1 9 8 1 P r o p e r t i e s o f t h e p h o t o s y n t h e t i cs y s t e m a n d DNA o f C y an o p h o r a p a r a d o x a c y a n e l l e s . P l a n t P h y s i o l 6 8 : 4 0 7 -4 1 09 . L U V A L L E J E , DB G L A S S , A W E I S S B E R G E R 1 9 4 8 O x i d a t i o n p r o c e s s e s . X X I . T h ea u t o o x i d a t i o n o f t h e p - p h e n y l e n e d i a m i n e s . J Am Chem S o c 7 0 : 2 2 2 3 - 2 2 3 3

1 0 . N E W MA N P J , LA S H E R M A N 1 9 7 8 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o t o s y s t e mI a n d I I m e m b r a n e p a r t i c l e s f r o m t h e b l u e - g r e e n a l g a , S y n e c h o c o c c u s c e d r o r u m .B i o c h i m B i o p h y s A c t a 5 0 3 : 3 4 3 - 3 6 11 1 . OR T D R , S I Z A W A 1 9 7 4 S t u d i e s o n t h e e n e r g y - c o u p l i n g s i t e s o f p h o t o p h o s p h o r -y l a t i o n V . P h o s p h o r y l a t i o n e f f i c i e n c i e s ( P / e 2 ) a s s o c i a t e d w i t h a e r o b i c p h o t o o x -i d a t i o n o f a r t i f i c i a l e l e c t r o n d o n o r s . P l a n t P h y s i o l 5 3 : 3 7 0 - 3 7 61 2 . T R E B S T A , S R E I M E R 1 9 7 3 E n e r g y c o n s e r v a t i o n i n p h o t o r e d u c t i o n s b y p h o t o s y s -t e m I I . R e v e r s a l o f d i b r o m o t h y m o q u i n o n e i n h i b i t i o n o f H i l l - r e a c t i o n s b yp h e n y l e n e d i a m i n e s . Z N a t u r f o r s c h 2 8 c : 7 1 0 - 7 1 6

4 4 5