63
Kloning - definisi Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi) Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Plasmid 2014

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Plasmid 2014

Kloning - definisi

Dari Bahasa Yunani - klon, ranting

Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Page 2: Plasmid 2014

Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan

memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)

yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan

DNA yang kompleks.

Page 3: Plasmid 2014

Kloning Gen

Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut

Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Page 4: Plasmid 2014

Tujuan mengklon Gen

Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut

Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut

Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut

Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan

Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Page 5: Plasmid 2014

Sumber DNA untuk diklon

DNA kromosom

cDNA (complementary DNA) yang

disintesis menggunakan mRNA sebagai

cetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan

menggunakan PCR

Page 6: Plasmid 2014

Mensintesis cDNA

Page 7: Plasmid 2014

Perbanyakan DNA dengan

PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Page 8: Plasmid 2014

Bahan / Alat untuk Mengklon Enzim endonuklease restriksi

Enzim ligase

Vektors

Inang (Host)

Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

Page 9: Plasmid 2014

Memotong DNA Menggunakan enzim

endonuklease restriksi Ujung “lengket” (sticky ends)

Ujung “tumpul” (blunt ends)

Penamaan enzim EcoRI

E = genus (Escherichia)

co = species (coli) R = strain

I = # of enzyme

Page 10: Plasmid 2014

Ujung “lengket” dan “tumpul”

(Blunt & Sticky ends)

Page 11: Plasmid 2014

Penyambungan (pasting)

DNA Pembentukan ikatan-

H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)

Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA

Page 12: Plasmid 2014
Page 13: Plasmid 2014

Vektor untuk

Mengklon Diperlukan suatu wahana (vehicle)

untuk memasukkan suatu potongan

DNA ke dalam sel agar DNA tersebut

dapat disimpan dan diperbanyak di

dalam sel tersebut

Page 14: Plasmid 2014

Plasmid

DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad

Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat

dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Page 15: Plasmid 2014

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu

membawa potongan DNA lain ke dalam sel

bila memiliki:

Replikator (origin of replication)

Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)

Situs untuk mengklon (potongan DNA yang

memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi

sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di

dalam daerah replikator atau penanda

Vektor untuk

Mengklon

Page 16: Plasmid 2014

Plasmid yang Dimiliki oleh

Escherichia coli

Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Page 17: Plasmid 2014
Page 18: Plasmid 2014

Plasmid Khimera (Chimeric

Plasmids) Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan

tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Page 19: Plasmid 2014
Page 20: Plasmid 2014

Kloning Terorientasi

Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan

DNA asing dengan orientasi tertentu

Dilakukan dengan memotong DNA vektor

maupun DNA sumber gen yang dikehendaki

menggunakan dua enzim restriksi yang

berbeda

Page 21: Plasmid 2014
Page 22: Plasmid 2014

Vektor untuk

Mengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)

& YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Page 23: Plasmid 2014

1. Memiliki origin of replication dari inang yang

dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara

independen terhadap genom inang.

2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel

pembawa plasmid tersisipi DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple

cloning sites, MCS)

4. Mudah diisolasi dari sel inang.

Vektor berupa Plasmid

Page 24: Plasmid 2014

Multiple Cloning Site (MCS)

Page 25: Plasmid 2014

Vektor berupa Plasmid

Page 26: Plasmid 2014

Vektor berupa Plasmid

Keunggulan:

Kecil, mudah pengerjaannya

Strategi seleksi mudah

Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran

kecil (< 10kbp)

Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan

DNA ukuran besar (> 10kbp)

Page 28: Plasmid 2014

Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)

Lengan kiri:

Protein penyusun kepala

& ekor

Lengan kanan:

Sintesis DNA

Pengendalian

Lisis inang

Daerah yang dihilangkan:

integrasi & eksisi

Pengendalian

Page 29: Plasmid 2014

Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)

Page 30: Plasmid 2014

Vektor berupa

Bakteriofaga

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA

ukuran besar (10 - 23 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Kelemahan:

Lebih sulit pengerjaannya

Page 31: Plasmid 2014

Vektor

Cosmid

Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan

DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan: Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan

plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna

dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)

Page 32: Plasmid 2014

Vektor Cosmid

Page 33: Plasmid 2014

l ZAP

Page 34: Plasmid 2014

Vektor BAC Replikasi dimediasi

oriS dan oriE

parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel

Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR

Page 35: Plasmid 2014

Vecktor YAC

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp

dan dimasukkan ke dalam yeast

telomere telomere centromere

URA3 ARS HIS3

replication

origin

markers

large

inserts

Page 36: Plasmid 2014

BACs dan YACs

Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA

dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)

Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan

basa nukleotida total genom

Kelemahan: Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan

ukuran sangat besar

BACs : Bacterial Artificial Chromosomes

YACs : Yeast Artificial Chromosomes

Page 37: Plasmid 2014

Shuttle Vector Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang

(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

Page 38: Plasmid 2014

Memilih Vektor

Ukuran DNA yang disisipkan

Ukuran vektor

Situs enzim restriksi yang tersedia

Jumlah salinan (copy number)

Efisiensi kloning

Kemampuan untuk menapis DNA sisipan

Rencana penelitian selanjutnya

Page 39: Plasmid 2014

Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning (plasmid

bacterial) & DNA sumber gen

Pemotongan DNA sumber gen

& vektor kloning

menggunakan enzim restriksi

yang sama

Penyisipan potongan DNA

sumber gen ke dalam vektor

kloning yang telah dipotong

menggunakan enzim restriksi

yang sama; potongan

disambung dengan bantuan

enzim DNA ligase

Page 40: Plasmid 2014

Cara Mengklon DNA (2) Vektor kloning yang telah

tersisipi potongan DNA

dimasukkan ke dalam sel

inang (transformasi sel

inang)

Penapisan sel pengklon

(dan gen yang

dimasukkan)

Identifikasi sel pengklon

pembawa gen yang

dikehendaki

Page 41: Plasmid 2014

Transformasi Sel Inang

Memasukkan plasmid (yang merupakan

vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel

inang

Page 42: Plasmid 2014

Transformasi sel

Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel harus

diberi perlakuan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang

mampu menerima DNA dari luar.

Kemampuan yang paling tinggi memasukkan DNA dari luar

terjadi pada saat berada dalam fase logaritmik (waktu

pertumbuhan sel yang sangat cepat)

Perlakuan CaCl2 dinding sel menjadi permeabel dan

bermuatan positif DNA dapat masuk

Setelah sel menjadi kompeten sel dicampur dgn DNA dan

diberi kejutan panas yang singkat ( 42 C, 1-2 menit).

Kejutan panas membran memuai, terjadi aliran air ke

dalam sel DNA TERBAWA KE DALAM SEL

Page 43: Plasmid 2014

Transforman kemudian ditumbuhkan dalam

media non-selektif selama 1-2 jam memberi

kesempatan sel untuk mengekspresi gen

resistensi antibiotik yang terdapat dalam

plasmid.

Kemudian transforman disebar ke media

selektif padat hanya sel yang mempunyai

plasmid yang tumbuh menjadi koloni.

Page 44: Plasmid 2014

Transformasi (1)

PRA-INKUBASI Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .

Page 45: Plasmid 2014

Transformasi (2)

INKUBASI Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.

coli kompeten.

Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.

Page 46: Plasmid 2014

Transformasi (3)

KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid

maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90

detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini

memaksimumkan masuknya plasmid

menembus membran dan dinding sel.

Page 47: Plasmid 2014

Transformasi (4)

PENYEMBUHAN (RECOVERY)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid

maupun kontrol) ditumbuhkan dalam

medium kaya nutrisi untuk memberi

kesempatan penyembuhan setelah mengalami

cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan

biasanya berlangsung satu waktu generasi

(untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45

menit)

Page 48: Plasmid 2014

Transformasi (5)

PENAPISAN (SCREENING)

Sel kompeten yang telah mengalami

penyembuhan ditapis pada medium padat

yang mengandung senyawa penapis

berdasarkan penanda yang dibawa oleh

plasmid.

Page 49: Plasmid 2014

Koloni E. coli yang membawa

plasmid dengan penanda gen

pendar fluor (pGLO)

Page 50: Plasmid 2014

E. coli yang Membawa Plasmid

pGlo

Page 51: Plasmid 2014

Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi

DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

Penanda selektif

Page 52: Plasmid 2014
Page 53: Plasmid 2014

Penapisan Klon Medium pertumbuhan

diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin

Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Page 54: Plasmid 2014

Penapisan warna koloni

Biru/Putih lacZ insert

Enzim tidak berfungsi

X-gal produk

lacZ

Enzim berfungsi

X-gal produk

Page 55: Plasmid 2014

Penapisan Koloni Bakteri

pembawa Plasmid

Rekombinan

Page 56: Plasmid 2014

Hibridisasi Koloni

Dapat dilakukan jika memiliki DNA pelacak Bagian dari gen

yang dikehendaki

Bagian dari gen yang mirip dari jasad lain

Oligonukleotida sintetik

Page 57: Plasmid 2014

Ampicillin resistant marker

E.coli contain vector – grow

E.coli without vector – don’t grow

white colonies contain inserts

blue colonies contain religated vector

BLUE WHITE CLONING METHOD

Page 58: Plasmid 2014

Examples of light blue (LB),

white (W) and blue (B)

colonies.

Page 59: Plasmid 2014

Cloning Basics

DNA

Vector

Basic Elements:

Piece of DNA

Appropriate vector

Insertion Site

Competent Cells

Page 60: Plasmid 2014

Using the Ti Plasmid to Transfer

Genes to Plants Genes can be introduced into plants with

specialized vectors

Common bacterial vector promoters and replication origins are not recognized by plant cells

Plasmids are used containing T-DNA

T-DNA is derived from a plasmid known as tumor-inducing (Ti)

Ti plasmid comes from bacteria that cause plant tumors called crown galls

Page 61: Plasmid 2014

Ti Plasmid Transfers Crown Gall

Page 62: Plasmid 2014

Candidate Identification The transformation culture is plated on special media to help

identify which cells have received the recombinant plasmid.

Two types of media: LB + X-gal, & LB+ X-gal + amp

Selection:

Cells with the plasmid can grow on ampicillin media.

Cells without the plasmid cannot grow on ampicillin media.

Screening:

Cells with a functional LacZ gene can convert X-gal to X + gal.

X-gal -------------------------------> X + galactose

Colorless ß-galactosidase

Blue

Cells which produce ß-galactosidase form BLUE colonies.

Cells which are able to grow on ampicillin without ß-galactosidase production form WHITE colonies. (Suspect l fragment insert)

Page 63: Plasmid 2014

More Information

Gallery of λInCh Homology Maps

http://beck2.med.harvard.edu/resources/InCh/lambd

a_InCh_frames.htm

λInCh page

http://beck2.med.harvard.edu/resources/InCh/lambd

a_InCh_frames.htm

Manual