Upload
riant-widariyanto
View
58
Download
6
Embed Size (px)
Citation preview
Kloning - definisi
Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.
Kloning Gen
Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut
Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)
Tujuan mengklon Gen
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Sumber DNA untuk diklon
DNA kromosom
cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA sebagai
cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR
Mensintesis cDNA
Perbanyakan DNA dengan
PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Bahan / Alat untuk Mengklon Enzim endonuklease restriksi
Enzim ligase
Vektors
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
Memotong DNA Menggunakan enzim
endonuklease restriksi Ujung “lengket” (sticky ends)
Ujung “tumpul” (blunt ends)
Penamaan enzim EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli) R = strain
I = # of enzyme
Ujung “lengket” dan “tumpul”
(Blunt & Sticky ends)
Penyambungan (pasting)
DNA Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)
Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA
Vektor untuk
Mengklon Diperlukan suatu wahana (vehicle)
untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA tersebut
dapat disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut
Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat
dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda
Vektor untuk
Mengklon
Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan
Plasmid Khimera (Chimeric
Plasmids) Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan
tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai
Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan
DNA asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA vektor
maupun DNA sumber gen yang dikehendaki
menggunakan dua enzim restriksi yang
berbeda
Vektor untuk
Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Vektor berupa Plasmid
Multiple Cloning Site (MCS)
Vektor berupa Plasmid
Vektor berupa Plasmid
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (> 10kbp)
Bakteriofaga (l phage)
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
Lengan kiri:
Protein penyusun kepala
& ekor
Lengan kanan:
Sintesis DNA
Pengendalian
Lisis inang
Daerah yang dihilangkan:
integrasi & eksisi
Pengendalian
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
Vektor berupa
Bakteriofaga
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
Vektor
Cosmid
Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan: Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna
dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)
Vektor Cosmid
l ZAP
Vektor BAC Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel
Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR
Vecktor YAC
Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp
dan dimasukkan ke dalam yeast
telomere telomere centromere
URA3 ARS HIS3
replication
origin
markers
large
inserts
BACs dan YACs
Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA
dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan
basa nukleotida total genom
Kelemahan: Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
Shuttle Vector Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang
(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
Memilih Vektor
Ukuran DNA yang disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi yang tersedia
Jumlah salinan (copy number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk menapis DNA sisipan
Rencana penelitian selanjutnya
Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning (plasmid
bacterial) & DNA sumber gen
Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning
menggunakan enzim restriksi
yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
Cara Mengklon DNA (2) Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki
Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang merupakan
vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel
inang
Transformasi sel
Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel harus
diberi perlakuan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang
mampu menerima DNA dari luar.
Kemampuan yang paling tinggi memasukkan DNA dari luar
terjadi pada saat berada dalam fase logaritmik (waktu
pertumbuhan sel yang sangat cepat)
Perlakuan CaCl2 dinding sel menjadi permeabel dan
bermuatan positif DNA dapat masuk
Setelah sel menjadi kompeten sel dicampur dgn DNA dan
diberi kejutan panas yang singkat ( 42 C, 1-2 menit).
Kejutan panas membran memuai, terjadi aliran air ke
dalam sel DNA TERBAWA KE DALAM SEL
Transforman kemudian ditumbuhkan dalam
media non-selektif selama 1-2 jam memberi
kesempatan sel untuk mengekspresi gen
resistensi antibiotik yang terdapat dalam
plasmid.
Kemudian transforman disebar ke media
selektif padat hanya sel yang mempunyai
plasmid yang tumbuh menjadi koloni.
Transformasi (1)
PRA-INKUBASI Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi (2)
INKUBASI Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.
coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.
Transformasi (3)
KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90
detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini
memaksimumkan masuknya plasmid
menembus membran dan dinding sel.
Transformasi (4)
PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) ditumbuhkan dalam
medium kaya nutrisi untuk memberi
kesempatan penyembuhan setelah mengalami
cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan
biasanya berlangsung satu waktu generasi
(untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45
menit)
Transformasi (5)
PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami
penyembuhan ditapis pada medium padat
yang mengandung senyawa penapis
berdasarkan penanda yang dibawa oleh
plasmid.
Koloni E. coli yang membawa
plasmid dengan penanda gen
pendar fluor (pGLO)
E. coli yang Membawa Plasmid
pGlo
Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi
DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
Penanda selektif
Penapisan Klon Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin
Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya
Penapisan warna koloni
Biru/Putih lacZ insert
Enzim tidak berfungsi
X-gal produk
lacZ
Enzim berfungsi
X-gal produk
Penapisan Koloni Bakteri
pembawa Plasmid
Rekombinan
Hibridisasi Koloni
Dapat dilakukan jika memiliki DNA pelacak Bagian dari gen
yang dikehendaki
Bagian dari gen yang mirip dari jasad lain
Oligonukleotida sintetik
Ampicillin resistant marker
E.coli contain vector – grow
E.coli without vector – don’t grow
white colonies contain inserts
blue colonies contain religated vector
BLUE WHITE CLONING METHOD
Examples of light blue (LB),
white (W) and blue (B)
colonies.
Cloning Basics
DNA
Vector
Basic Elements:
Piece of DNA
Appropriate vector
Insertion Site
Competent Cells
Using the Ti Plasmid to Transfer
Genes to Plants Genes can be introduced into plants with
specialized vectors
Common bacterial vector promoters and replication origins are not recognized by plant cells
Plasmids are used containing T-DNA
T-DNA is derived from a plasmid known as tumor-inducing (Ti)
Ti plasmid comes from bacteria that cause plant tumors called crown galls
Ti Plasmid Transfers Crown Gall
Candidate Identification The transformation culture is plated on special media to help
identify which cells have received the recombinant plasmid.
Two types of media: LB + X-gal, & LB+ X-gal + amp
Selection:
Cells with the plasmid can grow on ampicillin media.
Cells without the plasmid cannot grow on ampicillin media.
Screening:
Cells with a functional LacZ gene can convert X-gal to X + gal.
X-gal -------------------------------> X + galactose
Colorless ß-galactosidase
Blue
Cells which produce ß-galactosidase form BLUE colonies.
Cells which are able to grow on ampicillin without ß-galactosidase production form WHITE colonies. (Suspect l fragment insert)
More Information
Gallery of λInCh Homology Maps
http://beck2.med.harvard.edu/resources/InCh/lambd
a_InCh_frames.htm
λInCh page
http://beck2.med.harvard.edu/resources/InCh/lambd
a_InCh_frames.htm
Manual