Elektrochemische Mikrosensoren

Glucosesensor

Verfasser:

S. Lysenko, W. Dachtler

Übersicht

I. Hintergründe und Grundlagen1. Was ist Diabetes ?

2. Sensorenarten

3. Funktionsprinzip des Glucosesensors

4. Aufbau des Glucosesensors

5. Herstellung der Sensoren

6. Elektrochemische Grundlagen

II. Charakterisierung des Sensors und praktische Anwendung

1 Was ist Diabetes?1.1 Wesen und Arten der Erkrankung

- Der Diabetes ist eine Stoffwechselstörung

- Typ-1-Diabetes: - Insulin wird nicht gebildet- Ursache: Zusammenwirken von Erbfaktoren, Virusinfekten und Autoimmunerkrankungen

- Seltene Krankheit, an der in Deutschland zwischen 150000-200000 Menschen leiden

-Typ-2-Diabetes: - Vorhandener Insulin wird nicht freigesetzt oder gelangt nicht richtig zum Einsatz

- Ursache: angeborene oder erworbene Insulinunempfindlichkeit

- In Deutschland 5-7 Mio. Typ-2-Diabeteskranke- Insulin: Verdauungsenzym, das überflüssige Nährstoffe in Speicherformen

umbaut; ermöglicht Abbau von Glucose; Bildung in der Bauchspeicheldrüse- Weltweit etwa 117 Mio. Diabeteskranke- Beide Arten unheilbar- Therapie: ständige Gabe von Insulin

1.1 Tägliche Kontrolle

- Zur Kontrolle der Therapie des Diabetes mellitus sind regelmäßige Eigenmessungen – d.h. die Selbstkontrolle der Blut- und Harnzuckerwerte wichtig, um erhöhte oder erniedrigte Blutzuckerwerte sofort zu erkennen und zu behandeln.

- Durch den (dauerhaft) erhöhten Blutzuckerspiegel können körperliche Schwäche; Gefäßverschlüsse; Nierenversagen; Ketoacidose und Coma Diabeticum auftreten.

=> Motivation einen geeigneten Sensor zu bauen .

2 Sensorenarten

• Sensoren sind Messfühler, die eine bestimmte Messgröße erfassen können und diese z.B. in eine elektrische Größe transformieren.

• Unterteilung in

a) Chemosensoren- Reagieren auf die Anwesenheit eines bestimmten Analyten mit einem physikalisch-chemischen Prozess

c) Biosensoren - Nutzen zur Erkennung eines Analytenbiochemische Prozesse

2.1 Funktionsprinzip der Biosensoren

• Alle Biosensoren arbeiten nach einem einheitlichen Funktionsschema

2.2 Biosensoren-Einteilung nach dem Detektionsprinzip

• Nach der Art des Detektionsprinzips erfolgt die Einteilung der Biosensoren in vier Gruppen

- Kalorimetrie

- Microgravimetrische Detektion

- Optische Detektion

- Elektrochemische Detektion

2.2.1 Kalorimetrie (Temperatureffekte)

- Die Temperaturerhöhung einer exothermen Reaktion ist direkt proportional zu der Stoffmenge der Reaktionspartner

- Nachteile:� Temperatureffekte klein � Gut isolierte Gefäße notwendig � Ebenso exakt die gleiche

Temperatur der Reaktionspartner vor der Messung

2.2.2 Mikrogravimetrische Detektion

(Piezoelektrische Sensoren)

- Bei diesem Sensortyp reagiert ein in Resonanz schwingender Kristall auf die Veränderung der Massebeladung

- Nachteil:

Einmalige Anwendung (Allerdings geringe Herstellungskosten)

2.2.3 Optische Sensoren (Optoden)

- Gut geeignet für die Sauerstoffgehaltsmessungen in Flüssigkeiten (oder bei den Enzymreaktionen, bei denen Sauerstoff gebildet oder verbraucht wird)

- Meßprinzip: Fluoreszenzlöschung

- Lichtwellenleiter mit einem Indikator als optische Meßeinrichtung

- Lumineszenz- oder Absorbtionseigenschaften des Indikators sind O2-Abhängig

- Vorteile:

- Räumliche Trennung von Meßgerät und optischer

Meßeinrichtung

- Lichtwellenleiter sind von magnetischen oder elektrischen

Störfeldern unbeeinflußt

2.2.4 Elektrochemische Detektion

- 2 Unterarten: Amperometrie und Potentiometrie

- Amperometrie: Messung des Stromflusses bei konstanter Spannung. Gut geeignet für Stoffwechselprodukte, die leicht oxidiert bzw. reduziert werden können (H2O2).

- Potentiometrie: Messung des elektrochemischen Potentials von ionischen Reaktionsprodukten (NH4

+, CO32-, H+)

3. Funktionsprinzip des Glucosesensors

• Glucose und Sauerstoff werden durch das Enzym Glucoseoxidase zu H2O2 und Gluconolacton umgesetzt, das anschließlich zu Gluconsäure hydrolisiert:

O

H

H O

H

H O

H

H

O HHO H

O H

G O DO 2 H 2O

O

H

H O

H

H O

H

O HH O

O H

H 2O 2

C O O H

O HH

O H

H

O HH

O H

C H 2O H

H

β -D -G lucose D -G lucono lacton

H ydro lyse

D -G luconsäure

• Das entstandene Wasserstoffperoxid wird bei einem Potential von U = +600 mV vs. Ag/AgCl an einer Platinelektrode oxidiert. Dadurch wird ein Stromfluss möglich:

• Der Stromfluss wird über ein hochempfindliches Amperemeter registriert.

=> Die Stromstärke ist dabei proportional zur Glucosekonzentration.

H2O2

U = 600 mVO2 + 2H+ + 2e-

4. Aufbau des Glucosesensors4.1. Chip-Layout

• Einkristallines Siliciumsubstrat als Basis, das

pyramidenstumpfförmige Hohlräume

(Containments) aufweist

• Innere Oberfläche ist mit einer Elektrodenschicht

aus Platin bedeckt

• Containments werden mit GOD in einer PVA-Matrix

gefüllt

• Verschluss durch eine Verkapselungsschicht

• Messflüssigkeit wird mit einer konstanten

Fließgeschwindigkeit durch den Chip gepumpt

• Glucose kann durch die diffusionshemmende

Membran in das Containment diffundieren

4.2 Vorteile der Containmenttechnologie

- Die Containmentsensoren werden auf der Rückseite kontaktiert� Vereinfachte Verbindungs- und Verkapselungstechnik;

einfacher Anschluss an Durchflusszellen.

- Gute Verankerung der Stofferkennenden Membran

- Minimale Enzymauswaschung in der Stofferkennenden Membran gegenüber Immobilisierung von GOD auf planarer Oberfläche

- Mechanische Stabilität von Membranen und Biokomponente.

- Aufbringen mehrerer Analysensysteme auf einem Chip.

- Massenproduktionstauglichkeit

4.3 Abbildung des Glucosesensors

5. Herstellung des Glucosesensors

Sämtliche Prozesse zur Herstellung der Sensor-Chips erfolgen im Reinraum (gleichmäßige Klimabedingungen und Vermeidung einer Contamination)

Einkristalline Si-Scheibe als Ausgangsprodukt

1) Vertiefung für Durchflüsskanal

2) Bildung der beiden Containments und Zu- bzw. Ausführungsöffnungen

3) Metallisierung des Containments

4) Verschließung des Kanals mit einem Glasdeckel

5) Befüllung und Verkapselung

6. Elektrochemische Grundlagen6.1. Dreielektrodenanordnung

• Der Glucosesensor arbeitet mit einer Dreielektrodenanordnung

• An der Arbeitselektrode findet die Redox-Reaktion statt

• Die hochohmigen Referenzelektrode und der Potentiostat kontrollieren das Potential

• Die niederohmige Gegenelektrode dient als Stromkontakt.

• Dreielektrodenanordnung: die Messung wird nicht von Stromabhängigen Prozessen an der Gegenelektrode beeinflusst

� Die Stromstärke ist somit nur noch vom Stofftransport abhängig

6.2 Stofftransport

� Stofftransport

- Migration: Wanderung aufgrund eines elektrischen Feldgradienten- Diffusion: Wanderung aufgrund eines Konzentrationsgradienten- Konvektion: durch eine Strömung verursachte Bewegung

� Problem

- Diffusionsgrenzstrom ist proportional zur Konzentration

� Lösung

• Migration wird durch Leitelektrolytzusatz (NaCl) verringert• Konvektion wird ausgeschlossen da im Elektrolyt keine Strömung auftritt

6.3 Mathematische Grundlagen

• Diffusionsgrenzstrom

• Nach dem 1. Fickschen Gesetz gilt:

• Für die elektrochemische Stromdichte gilt:

• Bei Überspannung geht ci,0 gegen 0:

• Somit ist der Diffusionsstrom nur von der Anfangskonzentration abhängig:

dx

dcD

dt

dN−=

N

i,0Eli,

0x

TeilchenLadungδ

cczFD

dx

dczFDjzFj

−=

=⋅=

=

A

I

δ

czFDj Grenz

N

Eli,

Ladung ==

Eli,

N

Grenz cδ

zFDAI ⋅=

ekschichtdicDiffusions NernstscheNδ

Elektrode;der an ion Konzentrati,0

c ;Elektrolyt imion KonzentratEli,

c

konstante;DiffusionsD stante;FaradaykonF l;Ladungszahz

=

==

===

II. Charakterisierung des Sensors und praktische Anwendung

7.1.Apparaturaufbau Rollenpumpe

Potentiostat

Messlösungen

Sensor mit den Elektroden

7.2. Voltammetrie und Voltammogramm

• Voltammetrie- Messung des Stromes in

Abhängigkeit vom Elektrodenpotential

- Ermittlung des Arbeitspotentials

� Voltammogramm

- Kein Signal für den Phosphatpuffer

� Keine Störung seitens des Puffers

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-4,0x10-7

-2,0x10-7

0,0

2,0x10-7

4,0x10-7

6,0x10-7

8,0x10-7

1,0x10-6

1,2x10-6Voltammogramm eines 100 mM Phosphatpuffers

Str

omst

ärke

[A]

Spannung [V]

7.3. Ermittlung des Arbeitespotentials

• Ermittlung des Arbeitspotentials für die amperometrische Bestimmung von H2O2

1. Beginn der Zersetzung von H2O2

2. Sättigungswert oder Diffusionsgrenzstrom

3. Verarmung von Wasserstoffperoxid an der Elektrode, δN wächst in die Lösung hinein

4. Zersetzung von H2O-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-2,0x10-6

-1,0x10-6

0,0

1,0x10-6

2,0x10-6

3,0x10-6

4,0x10-6

Voltammetrie einer Pufferlösung mit 2 mM H2O

2

Str

omst

ärke

[A]

Spannung [V]

7.4. Kalibration des Glucosesensors

• Messung verschiedener Lösungen unterschiedlicher Konzentration• Phosphatpuffer fängt die entstehenden H+-Ionen ab• Kein Plateau bei 50 mM, nicht genügend Pufferkapazität

� Erniedrigung der Aktivität der GOD

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

0,0

2,0x10-7

4,0x10-7

6,0x10-7

8,0x10-7

1,0x10-6

Sensorkennlinie bei 100 mM Phosphatpuffer50 mM

40 mM

30 mM

20 mM

15 mM

10 mM

6 mM4 mM

2 mM1 mM

Puffer

Str

omst

ärke

[A]

Zeit [s]

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

0,0

2,0x10-8

4,0x10-8

6,0x10-8

8,0x10-8

30 mmol

40 mmol

15 mmol20 mmol

6 mmol

10 mmol

2 mmol

Abhängigkeit der Sensorkennlinie von der Pufferkapazität

(20mmol Puffer)

Str

omst

ärke

[A

]

t [sec]

7.5. Kalibrationskurve

• Auftragung von Stromstärke gegen Konzentration

• Abweichung der letzten beiden Werte ist auf ungenügende Pufferkapazität zurückzuführen

0 10 20 30 40 50-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Signalabhängigkeit von der Pufferkonzentration

20mmol/L 100mmol/L

I [1

0-8A

]

Glucosekonzentration [mmol/L]

7.6. Paremeter zur Charakterisierung des Glucosesensors

1. Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit

-Sauerstoffkonzentration im Reservoir

-Glucosekonzentration

1. Fliessgeschwindigkeit

2. Selektivität

3. Störsubstanzen

4. Interferenzen nach heterogenem und homogenem Mechanismus

7.6.1. Einfluss der Sauerstoffkonzentration

• Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt unter anderem von der Sauerstoffkonzentration ab

• Zu kleine Sauerstoffkonzentration begrenzt den linearen Messbereich

• Abhilfe: Verkapselung des Containments mit einer sauerstoffpermeablen Membran

• Reaktionsgeschwindigkeit wird von der Glucosekonzentration beeinflusst

• Um die Konzentration gering zu halten wird eine diffusionshemmende Membran an der Öffnung des Containments angebracht

Amperogramme zweier Sensoren

7.6.2. Fliessgeschwindigkeit

• Gemessene Stromstärke abhängig von der Fliessgeschwindigkeit

0 500 1000 1500 2000 2500

0,0

5,0x10-8

1,0x10-7

1,5x10-7

2,0x10-7

Abhängigkeit von der Fliessgeschwindigkeit

5 µl/min

10 µl/min

5 µl/min

10 µl/min

5 µl/min

10 mM

2 mM

PufferS

trom

stär

ke [A

]

Zeit [s]

7.6.3. Selektivität

• GOD reagiert selektiv auf Glucose

• Bei Fructose gibt es kein Signal

� Hohe Selektivität des Sensors

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000,0

1,0x10-7

2,0x10-7

3,0x10-7

4,0x10-7

5,0x10-7Selektivität des Glucosesensors

Puffer 10 mmol Fructose

10 mmol Glucose

Str

omst

ärke

[A]

Zeit [s]

7.6.4 Einfluss von Störsubstanzen

• Auch geringe Mengen Ascorbinsäure können das Ergebnis der Messung stören

0 500 1000 1500 2000

0,0

1,0x10-7

2,0x10-7

3,0x10-7

4,0x10-7

5,0x10-7

Einfluss von Störsubstanzen am Beispiel von Ascorbinsäure

Puffer

10 mmol Glucose + 1 mmol Ascorbinsäure

10 mmol Glucose

Str

omst

ärke

[A]

Zeit [s]

• Bei 600 mV oxidierbare Substanzen verursachen Störungen, z.B. Ascorbinsäure, Harnsäure, Medikamentenrückstände u.s.w.

• Bei einem Potential von 600 mV kommt es zur folgenden Reaktion

O

OHHO

OH

OH

OO

OO

OH

OH

OU = 600 mV, Pt

+ 2 e-+ 2 H+

7.6.6. Ansätze zur Unterdrückung von Störungen

• Differenzmessung

• Parallelmessung ohne Glucose

• Differenz der Werte ergibt Glucosekonzentration

• Beide Sensoren müssen gleiche Diffusionseigenschaften aufweisen

• Diffusionsbarrieren für hochmolekulare Verbindungen

• Aufbringen einer nur für H2O2 permeablen Membran

• Störsubstanzen können nicht in die Containments diffundieren

Literatur• F. Scheller, F. Schubert, Biosensoren, Birkhäuser Verlag, Basel,

1989• V. M. Schmidt, Elektrochemische Verfahrenstechnik, Wiley. VCH

GmbH & Co. KGaA, 2003• Knoll M., Verfahren zur Herstellung von miniaturisierten Chemo- und

Biosensorelementen mit ionenselektiver Membran sowie von Trägern für diese Elemente, Deutsches Patent, DE 4115414, 1991

• Knoll M., Miniaturisierte Durchflussmesskamer mit integrierten Chemo- und Biosensorelementen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung, Deutsches Patent, DE 44 08 352, 1994

• R. Holze, Leitfaden der Elektrochemie, B. G. Teubner Stuttgart-Leipzig, 1998

• Internet: www.diabeticus.de/infos/technik/biosensor.html