Instituto Tecnolgico de VeracruzIngeniera Bioqumica

Prctica No. 2

Cintica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae

Ingeniera de Biorreactores Dra. Guadalupe Aguilar Uscanga

Presenta

Rosa Elena Domnguez Cadena Selene Martnez Silverio Cristian Cullel Lpez

H. Veracruz, Ver.

Junio 2011

Prctica No. 2: Cintica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiaeIntroduccin

Una fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, siendo el producto final un compuesto orgnico. Esta se lleva a cabo dentro de un biorreactor, el cual es un recipiente fabricado generalmente de acero inoxidable, en el que se llevan a cabo procesos qumicos que involucran a organismos o sustancias activas derivadas de dichos organismos, y su funcin es la de proporcionar un ambiente adecuado para el crecimiento de clulas y/o la formacin de algn producto de inters.

Marco terico Los tipos de fermentaciones se clasifican de acuerdo a los distintos tipos de productos que se obtienen. La fermentacin alcohlica es un proceso originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los carbohidratos (azcares como la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales alcohol (etanol), dixido de carbono y molculas de ATP. La fermentacin se lleva a cabo por medio de la ruta metablica de la gliclisis (Fig 1), en la cual participa inicialmente una molcula de azcar (glucosa) para dar como resultado dos molculas de etanol. A continuacin se describe la ecuacin general de este proceso: CHO + 2 ADP 2 CH-CHOH + 2 CO + 2 ATP

El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, aunque actualmente tambin empieza a ser empleado como biocombustible. Durante una fermentacin las clulas de levadura se ven sometidas a varios tipos de estrs a medida que la reaccin avanza, esto porque las condiciones del medio cambian con respecto al tiempo. Tanto el dao provocado por el estrs como la respuesta de la levadura al mismo, depende del tipo y grado del estrs, y del estado de desarrollo de la levadura al momento en que ocurre el estmulo.

Fig 1. Ruta de la gliclisis

Algunos de los factores que limitan la produccin de etanol por levaduras son:

Concentracin de etanol resultante (la resistencia de las levaduras a altas concentraciones de etanol) Acidez del substrato Concentracin de azcares La temperatura Ritmo de crecimiento de las cepas

La Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular levaduriforme el cual presenta clulas alargadas, globosas o elipsoidales con gemaciones o blastoconidios multilaterales de 3-10 x 4,5-1 m (Fig 2). Este es un hongo ambiental comn, al igual que es un componente transitorio de las microbiotas digestiva y cutnea humanas. La levadura S. cerevisiae puede fermentar la glucosa a etanol en condiciones anaerobias, y en presencia de oxgeno solo lleva a cabo el proceso de respiracin celular. Sin embargo se puede tener una fermentacin alcohlica aun en presencia de oxgeno, esto siempre y cuando la concentracin de glucosa sobrepase el valor lmite. A este efecto se le conoce como efecto Crabtree. La S. cerevisiae es utilizada a nivel industrial para la fabricacin de pan, cerveza y vino debido a su rpido crecimiento, la dispersin de clulas que presenta, su ausencia de patogenecidad, la facilidad con que se replican los cultivos y se pueden aislar las clulas recombinantes, de la misma forma destaca por un sencillo y verstil sistema de transformacin de ADN. Este microorganismo muestra cinco fases de crecimiento bien definidas cuando se cultiva en medios lquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la fase logartmica, el cambio diuxico, la fase postdiuxica y la fase estacionaria. Estas levaduras presentan se reproducen de forma asexual, pero la reproduccin sexual tambin se puede dar en determinadas condiciones. Se duplica por medio de la gemacin, y presentan dos formas las cuales se van alternando, una haploide y otra diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide Fig 2. Posicin taxonmica de la S. cerevisiae se pueden realizar estudios de complementacin. Para que esta levadura pueda crecer y generar el producto deseado (etanol) es necesario satisfacer sus requerimientos nutricionales. Pueden utilizar distintas fuentes de carbono como son carbohidratos, aminocidos, etanol y/o glicerol; entre los azcares que puede utilizar estn monosacridos (glucosa, fructosa, manosa y galactosa), disacridos (maltosa y la sacarosa) y trisacridos (rafinosa). Uno de los azcares que no puede metabolizar es la lactosa, utilizndose este azcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis . Por norma general, las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo, por una parte cuando existen altas concentraciones de azcares tiende a realizar una fermentacin alcohlica, y una vez los azcares escasean se produce la respiracin del etanol, va ciclo de Krebs. Las levaduras, adems de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrgeno (amonio y urea),fsforo (aminocidos) y distintos elementos traza.

Fig 3. Levaduras de S. cerevisiae. Microscopa electrnica de barrido.

Fig 4. Levaduras de S. cerevisiae. Microscopa ptico.

En cultivos por lote, la S. cerevisiae consume primero el azcar, formando de esta manera el etanol; despus sigue una corta fase lag, en la cual la fuente de carbono pasa de ser al azcar al etanol, esto se debe a la induccin de enzimas del ciclo del glioxilato y de la gluconeognesis las cuales se requieren en la sntesis de compuestos C-C a partir del C del sustrato etanol. La fermentacin alcohlica por lote a partir de esta levadura se utiliza generalmente en los procesos industriales debido a que se caracteriza por una baja densidad celular debido a la inhibicin por etanol y por un bajo rendimiento de biomasa.

Objetivos Aprender a armar y desarmar un biorreactor. Conocer las partes que conforman a un biorreactor. Poner a operar el biorreactor (programacin del sistema de control). Realizar cintica de crecimiento de la S. cerevisiae. Aplicacin de los conocimientos aprendidos durante el curso (clculo de rendimientos, productividades, velocidades de reaccin, balanceo de ecuaciones, etc.)

Material -Biorreactor New Brunswick Scientific Co., INC. Edison, N.J., U.S.A. -Matraz de 3 L -Centrifuga 5424 eppendorf -Vasos precipitados de 1 L y 500 mL -Microscopio Motic BA300 -Buretas de 2L, 1L, 500 mL y 10 mL -Medidor de pH -Cubeta de 10 L -Micropipetas de 100-1000 L -Puntas azules estriles y no estriles -Papel aluminio -Agua destilada -Compresor -Refrigerador y congelador -Tubos con taparosca de 10 mL -Hielo -Parafilm -Tubos de 8 mL -Gradilla para tubos y eppendorf -Tubos eppendorf de 1.5 mL -Autoclave -Mangueras de plstico, cinturones y ligas -Jeringa -HPLC -Microfiltros -Balanza analtica -Intercambiador de calor

Reactivos -Solucin de BaO 0.3 N -Solucin de ZnSO al 5% p.p. -Miel B -Hidrxido de sodio 3 M -Etanol -Glucosa -Extracto de levadura -Sulfato de amonio -Azul de metileno -Solucin de HCl 1.2 N -Antiespumante -cido sulfrico 0.5 M - Antiespumante Tween 80 -Fosfato monobsico -Sulfato Mg7HO

Mtodo

1) Preparar 600 mL de medio de cultivo sinttico y depositar en dos matraces de 500 mL (300 mL en cada uno). Tabla 1. Composicin del medio sinttico Componente Concentracin (g/L) Glucosa 20 Fosfato monobsico 5 Sulfato de magnesio7HO 0.5 Sulfato de amonio 2 Extracto de levadura 1 2) Tomar la caja Petri donde est sembrada la levadura Saccharomyces cerevisiae ITV-01, tomar tres azadas de la levadura e inocular uno de los matraces preparados con medio sinttico para reactivar la cepa. Dejar el matraz inoculado en la incubadora a 30 C y 200 rpm por 12 h. Pasadas las 12 h tomar muestra del cultivo. Hacer una solucin 1:1 de muestra del cultivo y azul de metileno. Dejar reaccionar por 5 min. En el microscopio contar el nmero de clulas vivas y muertas. La cantidad de clulas vivas debe de mantenerse en un rango de 50-350 clulas. Una vez obtenida la cantidad de clulas, calcular las clulas por mililitro con la siguiente ecuacin:

3) 4) 5) 6) 7)

8) Conociendo que se requieren de 6x10 clulas por mililitro en el segundo matraz, se calcula la concentracin que debe de haber en l cuando el volumen del medio es de 300 mL: ( )( )

9) Teniendo la concentracin de clulas obtenidas en el primer matraz y la cantidad de clulas necesarias para inocular el segundo matraz, se calculan los mL de medio que se deben de pasar del primer matraz al segundo:

10) Una vez inoculado el segundo matraz se repiten los pasos del 3) al 9) para poder obtener ahora el volumen necesario de medio para inocular el biorreactor. 11) Antes del paso 10) de debe de preparar el medio de cultivo que se tendr dentro del biorreactor. (Una vez hecho esto esterilizar el reactor junto con el medio de cultivo a 15 Bar durante 30 min) Tabla 2. Medio de cultivo utilizado en el biorreactor Componente Composicin Miel B 1.32 L (22% v/v) Agua 4.68 L 12) Las condiciones dentro del biorreactor deben mantenerse en 250 rpm, a una temperatura de 30 C y un pH de 5.3. 13) Realizar anlisis de la reaccin cada 4 h durante un lapso de 32 h, iniciando desde el tiempo cero (tiempo de inoculacin del reactor). - Llenar 4 tubos eppendorf con muestra y centrifugar a 1,000 rpm por 10 min. Vaciar sobrenadante en tubos y sellar con parafilm. Congelar para despus hacer un anlisis por HPLC. - Tomar una muestra del medio (diluir si es necesario) y realizar una solucin 1:1 con azul de metileno. Contar el nmero de clulas vivas y muertas. 14) Una vez se termine la fermentacin desarmar el fermentador y lavarlo. 15) Hacer clculos correspondientes para el anlisis de la cintica de crecimiento de la S. serevisiae. 16) Para determinar la cantidad de producto generado por medio del HPLC es necesario descongelar las muestras para someterlas a un tratamiento de defecacin. 17) Tomar 0.8 mL de cada tubo y depositarlos en un tubo eppendorf. Agregar 0.1 mL de BaO 0.3 N y 0.1 mL de ZnSO al 5% p.p. 18) Dejar reposar durante 10 min en el refrigerador. 19) Centrifugar los tubos eppendorf a 1,000 rpm por 10 min. 20) Del sobrenadante tomar 0.8 mL y depositarlo en tubos con rosca. Agregar 0.8 mL de solucin de HCl y mezclar. 21) Calentar los tubos a 60 C por 15 min a bao mara. 22) Realizar un bao de agua fra a los tubos por 10 min. 23) Microfiltrar la solucin obtenida con ayuda de un microfiltro y vaciar el medio en los viales del HPLC. Llenar slo hasta la mitad. 24) Meter viales en torretas del HPLC y meter al equipo para el anlisis. El primer vial debe de contener agua y cada muestra dura 30 min en ser analizada. 25) Reportar resultados obtenidos.

Observaciones Durante la prctica se trabaj con el microorganismo Saccharomyces cerevisiae ITV-01 de la coleccin del laboratorio de bioingeniera del Instituto Tecnolgico de Veracruz. A continuacin se presentan los pasos realizados durante la prctica.

3 azadas S. cerevisiae ITV-01

30 C 12 h 200 rpm (1)

Matraz 2 con 300 mL de medio sinttico

(2)

Matraz 1 con 300 mL de medio sinttico 2 impulsores tipo Rushton 4 bafles 0.2 vvm 250 rpm Flujo aire: 1200 mL/min 30 C pH 5.30

Medio con miel B

Fermentador (1) De acuerdo a la Ec.1 se tiene: ( )

Como se tiene que se requiere en el segundo matraz una concentracin de 6x10 clulas por mL:

Por lo que se determina que ser necesario pasar:

(2) De acuerdo a la Ec.1 se tiene: ( )

Como se tiene que se requiere en el segundo matraz una concentracin de 6x10 clulas por mL:

Por lo que se determina que ser necesario pasar:

Al momento de contar el nmero de clulas viables del segundo matraz para conocer con cunto volumen inocular el fermentador se topo con que se necesitaba un volumen mayor del que se tena dispuesto, por lo que se decidi tomar una muestra del matraz 1. ( )

Sin embargo se encontr que a pesar de que se posea ese volumen para poder inocular el fermentador, la viabilidad de las clulas era del 50%. Para poder tener una viabilidad esperada se tena que agregar el doble del volumen calculado, por lo que se determin agregar ambos matraces con 300 mL cada uno al fermentador que contena 6 L de medio. Se utiliz una solucin bufer de 3 M NaOH, que se prepar en base al siguiente clculo:

De esta forma se diluyeron 12 g de NaOH en 100 mL de agua estril para tener el bufer a utilizar. Durante la fermentacin no se pudo controlar el pH, ya que se present un fallo en la bomba. Por esa razn cada tiempo que se tom muestra se fue monitoreando el cambio de pH con ayuda de un electrodo. Durante la cintica el conteo celular se realiz por duplicado.

Dimensionamiento del fermentador Conociendo la ecuacin del clculo del volumen del sistema reaccionante y asumiendo que Dt = H, se despeja Dt, con lo cual la ecuacin quedara:

(

)

Se asume que el reactor est diseado con las relaciones estndar de la tabla 3. Tabla 3. Relaciones estndar de un reactor Dimensin Dimetro del impulsor Altura del tanque Ancho del bafle Altura del impulsor Ancho del impulsor Largo del impulsor Separacin del bafle Por lo que las medidas del reactor son: Relacin

0.19 m

Clculo de Potencia Como no se conocen la densidad y la viscosidad del medio se supondr que son las mismas que el agua. (= 1000 kg/m; = 0.001 kg/m*s)

(

) (

)(

)

Np(

) ( )

Despejar P de la ecuacin (2) para obtener la potencia. P = (6)(4.16 rps)(0.063 m)(1000 kg/m) = 0.42 W Pero como son dos impulsores de turbinas, la potencia se debe de multiplicar por dos, lo que da un resultado de 0.84 W. Se tiene que la aireacin es de 0.2 vvm, por lo que la queda de 0.00002 m/s.

(

)

(

)

(

(

)(

) ) (

(

( )(

( )(

) ( )(

) )

)

) =0.87 W

Esterilizacin del fermentador El volumen del fermentador utilizado en la fermentacin fue de 6 L (0.006 m3) a una temperatura de 30 C. Se necesita hacer el clculo para la esterilizacin de este biorreactor si en dado caso se requiere realizar la esterilizacin por medio de inyeccin directa de vapor. Suponiendo que la cantidad de bacterias en el medio es cerca de 5*10 12 / m3, de las cuales se necesita reducir hasta que solo sobreviva 1 de 1000 bacterias. El vapor inyectado (30 bar) va a un flujo de 5000 Kg/h el cual ser detenido cuando el medio llegue a una temperatura de 122 C. Durante el tiempo de mantenimiento el calor perdido a travs del recipiente se asume insignificante. Despus del tiempo de mantenimiento el fermentador ser enfriado pasando 100 m3/h de agua a 20 C hasta que el medio alcance una temperatura de 30 C. El serpentn tiene un rea de transferencia de calor de 40 m3 y para esta operacin se necesita el coeficiente global de transferencia de calor U que es igual a 2500 kJ/ m3 La resistencia al calor de las esporas bacteriales en el medio puede ser caracterizada por el coeficiente de Arrhenius kdo igual a 5.7 x 10 5 hr -1 y una energa de activacin Ed igual a 2.834 x 10 5 kJ/kmol la capacidad calorfica y la densidad son 4.187 kJ/kg K y 1000 Kg/m 3respectivamente. Con los anteriores datos se estim el tiempo de mantenimiento requerido.

Datos: V= 6 L (0.006 m3) no = 5*10 12 / m3 n=0.001 U= 2500 kJ/ m3 Solucin kdo = 5.7 x 10 5 hr -1 Ed = 2.834 x 10 5 kJ/kmo cp = 4.187 kJ/kg K =1000 Kg/m 3 ms= 5000 Kg/h M= (0.006m3)(1000Kg/m3)=6kg

Con el criterio de diseo se puede calcular de la siguiente forma: ( )( )

La inyeccin directa de vapor sigue un perfil hiperblico, para calcular el tiempo requerido para calentamiento de 30 C a 122 C, se obtienen las entalpias del vapor saturado a 345 kPa y agua a 25 C. Son 2731 105 kJ/kg respectivamente: H= 2731-105= 2626 kJ/kg

La ecuacin para inyeccin de vapor es: ( Resolviendo la ecuacin, se tiene que: ( ( )( )( ) ) ) )

Si T=395 K y To= 298K, entonces t=1.46 horas. Sustituyendo la ecuacin anterior dentro de

(

)

Esta integracin da como resultado De la ecuacin de enfriamiento:

0.881

( La solucin a esta ecuacin da: 1.26 Sustituyendo en la ecuacin de enfriamiento: (

)

(

)( 1.41

(

))

)

(

)

28.74=197.6t t = 0.145 h = 8.726 min

Balance estequiomtrico

Composicin elemental de S.cerevisiae con respecto a la glucosa:

RQ=d/a=1.033 Balances: C:6= c+2d+e H:12+3b=1.70c+6d+2f O:6+2a=0.46c+d+2e+f N:b=0.17c Yp/s=1.32 d:1.08 1.08/a=1.033; a=1.0454 Yx/s=0.69 C=0.69 b=0.17c; b=0.1173 12+3(0.1173)=1.70(0.69)+6(1.08)+2f; f=2.34 6=0.69+2(1.08)+e ; e=3.15 6=0.69+2(1.08)+(3.15) 0.1173=0.17(0.69) C:6=6 N:0.1173=0.1173 12+3(0.1173)=1.70(0.69)+6(1.08)+2(2.34) H:12.35=12.35 6+2(1.045)=0.46(0.69)+1.08+2(3.15)+(2.34) O:8.09=8.11 Balance de carbono

1=C+d+e C= ( ) ( d= ( ) ) ( )=0.09( )

d=1.08( e=

Resultados

Durante la cintica se sigui el crecimiento de biomasa as tambin como el consumo y formacin de productos, obtenindose los siguientes resultados: Tabla 3. Resultados obtenidos respecto a la biomasa. (x: concentracin de clulas por mililitro de medio) Conteo 1 tiempo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 5.38 5.28 5.28 5.03 4.87 4.85 4.75 4.73 4.74 Dilucin 0 10 15 20 20 25 25 30 30 Cl. Vivas 179 153 196 165 206 166 220 178 131 Cl. Muertas 1 50 27 40 14 24 42 21 26 Conteo 2 Cl. Cl. Vivas Muertas 162 3 151 59 190 34 172 44 160 16 140 33 132 6 199 8 128 19 x1 (x10) 8.95 76.5 294 330 412 415 550 534 393 x2 (x10) 8.1 75.5 225 344 320 350 330 597 384

De acuerdo al nmero de clulas vivas y muertas contadas, y con ayuda de la siguiente ecuacin, se calcula el porcentaje de viabilidad de las clulas en el tiempo. Los resultados se muestran en la tabla 4. ( Donde: %V = Porcentaje de viabilidad = Cl. Viables totales = Cl. Muertas totales Tabla 4. Viabilidad presentada en cada conteo. Conteo 1 tiempo 0 1 2 3 4 5 Cl. Vivas 179 153 196 165 206 166 Cl. Muertas 1 50 27 40 14 24 Cl. Vivas 162 151 190 172 160 140 Conteo 2 Cl. Muertas 3 59 34 44 16 33 %V1 99.44 75.37 87.89 80.49 93.64 87.37 %V2 98.18 71.90 84.82 79.63 90.91 80.92 )

Tabla 4. Continuacin Conteo 1 tiempo 6 7 8 Cl. Vivas 220 178 131 Cl. Muertas 42 21 26 Cl. Vivas 132 199 128 Conteo 2 Cl. Muertas 6 8 19 %V1 83.97 89.45 83.44 %V2 95.65 96.14 87.07

Tabla 5. Resultados obtenidos en el HPLC. Componente Glucosa Fructosa Glicerol c. Actico Etanol Concentracin (g/L) t (3) t (4) t(5) t (6) t (7) 5.373 0.015 0 0 0 9.217 8.354 7.545 0 0.001 0.925 1.206 1.871 1.776 1.879 0.108 0.24 0.24 0.399 0.476 6.36 6.337 18.054 19.053 20.341

t (0) 20.417 23.878 0.235 0.188 0

t (1) 17.67 1.04 0.278 0.186 1.055

t (2) 16.639 20.465 0.462 0.184 2.455

t (8) 0 0.048 2.098 0.568 22.093

En base a los resultados obtenidos en las tablas 3 y 5 se obtuvieron las velocidades medias y especficas de reaccin, la productividad y los rendimientos de produccin, las cuales se muestran en las tablas de a continuacin. Nota: para el clculo de la concentracin celular se conoce que el peso aproximado de una clula es de 1 ng.

Tabla 6. Concentraciones y velocidades de reaccin del conteo 1.t (h) sustrato 0 4 8 12 16 20 24 28 32 20.417 17.67 16.639 5.373 0.015 0 0 0 0 EtOH 0 0 2.455 6.337 6.36 18.054 19.053 20.341 22.093 X 8.95 76.6 294 330 412 415 550 534 393 rx 16.912500 54.350000 9.000000 20.500000 0.750000 33.750000 -4.000000 rp rs x 42.775 185.3 312 371 413.5 482.5 542 463.5 Vp Vs Lnx

0.000000 -0.686750 1.889665 0.613750 -0.257750 0.709530 0.970500 -2.816500 0.030612 0.005750 -1.339500 0.062121 2.923500 -0.003750 0.001820 0.249750 0.322000 0.000000 0.081325 0.000000 -0.007273 0.000000 -0.066011

0.000000 -0.076732 2.191654 0.008012 -0.003365 4.338597 0.003301 -0.009580 5.683580 0.000017 -0.004059 5.799093 0.007096 -0.000009 6.021023 0.000602 0.000585 0.000820 0.000000 6.028279 0.000000 6.309918 0.000000 6.280396

-35.250000 0.438000

-13.375172 -0.257690 0.715862 -0.034034 199.06 -0.000656 0.001822 5.973810

7.000000 6.000000 5.000000 Lnx 4.000000 3.000000 2.000000 1.000000 0.000000 0 20 t (h) 40 Series1

Grfica 1. Crecimiento de la biomasa en el tiempo.600 500 Concentracin (g/L) 400 300 200 100 0 -100 0 20 t (h) 40 sustrato producto biomasa Concentracin (g/L) 25 20 15 10 5 0 0 -5 20 t (h) 40 sustrato producto

Grfica 2. Concentracin de sustrato, producto y biomasa.

Grfica 2a. Concentracin de sustrato y producto.

Grfica de velocidades promedio60.000000 Velocidad (g/L h) Velocidad (g/L h) 40.000000 20.000000 0.000000 0 -20.000000 -40.000000 t (h) 20 40 rp rs rx

Grfica de velocidades promedio4.000000 3.000000 2.000000 1.000000 0.000000 -1.000000 0 -2.000000 -3.000000 -4.000000 t (h) 10 20 30 40 rp rs

Grfica 3. Velocidades promedio.

Grfica 3a. Velocidades promedio del producto y el sustrato.

Grfica de velocidades especficas2.500000 Velocidad (g/g h) 2.000000 Velocidad (g/g h) 1.500000 1.000000 0.500000 0.000000 -0.500000 0 10 20 t (h) 30 40 vp vs m

Grfica de velocidades especficas0.020000 0.000000 -0.020000 -0.040000 -0.060000 -0.080000 -0.100000 t (h) 0 10 20 30 40 vp vs

Grfica 4. Velocidades especficas.

Grfica 4a. Velocidades especficas del sustrato y producto.

Tabla 7. Concentraciones y velocidades de reaccin del conteo 2.t (h) sustrato 0 4 8 12 16 20 24 28 32 20.417 17.67 16.639 5.373 0.015 0 0 0 0 EtOH 0 0 2.455 6.337 6.36 18.054 19.053 20.341 22.093 X 8.1 75.5 225 344 320 350 330 597 384 rx 16.850000 37.375000 29.750000 -6.000000 7.500000 -5.000000 66.750000 rp rs x 41.8 150.25 284.5 332 335 340 463.5 490.5 Vp Vs Lnx

0.000000 -0.686750 2.080247 0.613750 -0.257750 0.495033 0.970500 -2.816500 0.132222 0.005750 -1.339500 -0.017442 2.923500 -0.003750 0.023438 0.249750 0.322000 0.000000 -0.014286 0.000000 0.202273 0.000000 -0.089196

0.000000 -0.084784 2.091864 0.008129 -0.003414 4.324133 0.004313 -0.012518 5.416100 0.000017 -0.003894 5.840642 0.009136 -0.000012 5.768321 0.000714 0.000976 0.000734 0.000000 5.857933 0.000000 5.799093 0.000000 6.391917

-53.250000 0.438000

-13.064828 -0.257690 0.715862 -0.034023 194.56 -0.000671 0.001864 5.950643

7.000000 6.000000 5.000000 Lnx 4.000000 3.000000 2.000000 1.000000 0.000000 0 20 t (h) 40 Series1

Grfica 5. Crecimiento de la biomasa en el tiempo.

700 600 Concentracin (g/L) 500 400 300 200 100 0 -100 0 20 t (h) 40 sustrato producto biomasa Concentracin (g/L)

25 20 15 10 5 0 -5 0 20 t (h) 40 sustrato producto

Grfica 6. Concentracin de sustrato, producto y biomasa.

Grfica 6a. Concentracin de sustrato y producto.

Grfica de velocidades promedio80.000000 60.000000 Velocidad (g/L h) Velocidad (g/L h) 40.000000 20.000000 0.000000 -20.000000 -40.000000 -60.000000 t (h) 0 10 20 30 40 rp rs rx

Grfica de velocidades promedio4.000000 3.000000 2.000000 1.000000 0.000000 -1.000000 0 -2.000000 -3.000000 -4.000000 t (h) 20 40 rp rs

Grfica 7. Velocidades promedio.

Grfica 7a. Velocidades promedio del producto y sustrato.

Grfica de velocidades especficas2.500000 Velocidad (g/g h) Velocidad (g/g h) 2.000000 1.500000 1.000000 0.500000 0.000000 -0.500000 0 10 20 t (h) 30 40 vp vs m

Grfica de velocidades especficas0.020000 0.000000 -0.020000 0 -0.040000 -0.060000 -0.080000 -0.100000 t (h) 20 40 vp vs

Grfica 8. Velocidades especficas.

Grfica 8a. Velocidades especficas del producto y sustrato.

Rendimiento de etanol

Rendimiento de biomasa Conteo 1

Conteo 2

Productividad:

Eficiencia:

Discusin En cultivos por lote, la S. cerevisiae consume primero el azcar, formando de esta manera el etanol; despus sigue una corta fase lag, en la cual la fuente de carbono pasa de ser el azcar al etanol. La fermentacin alcohlica por lote a partir de esta levadura se utiliza generalmente en los procesos industriales debido a que se caracteriza por una baja densidad celular debido a la inhibicin por etanol y por un bajo rendimiento de biomasa. En nuestro trabajo se observo la accin de la S. cerevisiae, esta es constatada al evaluar cada sistema inoculado a travs del tiempo, el anlisis se realizo desde la activacin de la levadura, en el pre inoculo y durante la fermentacin durante 32 horas.

Se observo como el crecimiento de la biomasa conforme pas el tiempo de fermentacin aumento constantemente as como la formacin de etanol. Puede observarse que durante el periodo de la fermentacin y al termino de esta no hubo gran disminucin en el crecimiento de la biomasa. El conteo de clulas nos permiti conocer la cantidad de clulas vivas contenidas por mililitro conforme el avance de la fermentacin, esto nos da una idea de cmo se comporta la S. cerevisiae en estas condiciones y como se desarrolla el crecimiento de esta a travs del tiempo. Durante el desarrollo de la fermentacin se midi el pH en cada toma de muestra debido a que el medidor de pH del fermentador estaba descalibrado, este se mantuvo relativamente constante, pero a un nivel adecuado para la fermentacin. Debido a la alta concentracin de la biomasa las graficas que muestran las concentraciones de productos y el consumo de sustrato durante la fermentacin se tuvieron que separar para observar de una mejor manera el comportamiento de estos durante el desarrollo de la fermentacin. De la misma manera las graficas que muestran las velocidades especificas y promedio de el etanol, la biomasa y el sustrato se separaron, es decir, en una grafica se muestran las velocidades de reaccin de biomasa y en otra, aparte se muestran las velocidades de reaccin especificas y promedio de la formacin del etanol y el consumo de sustrato. Los resultados obtenidos de la fermentacin y del anlisis posterior a esta se tabularon, y al representarlos en graficas se hicieron conforme a la formacin de producto de inters, es decir, conforme a la formacin de etanol y biomasa ya que el glicerol y acido actico producido en la fermentacin se da en menor proporcin.

Conclusion

La levadura S. cerevisiae puede fermentar la glucosa a etanol en condiciones anaerobias, y en presencia de oxgeno solo lleva a cabo el proceso de respiracin celular. Sin embargo se puede tener una fermentacin alcohlica aun en presencia de oxgeno, esto siempre y cuando la concentracin de glucosa sobrepase el valor lmite. Los resultados de las evaluaciones realizadas a las muestras tomadas durante la fermentacin desde el pre inoculo hasta el trmino de esta nos muestra la afinidad que la levadura tiene por el sustrato. En los grficos obtenidos se puede observar que el crecimiento de biomasa y etanol fue favorable bajo las condiciones en las que se llevo a cabo la fermentacin. Se observo tambin que el pH vario entre 4.74 y 5.38, sin embargo no altero el curso de la fermentacin. Se puede concluir que a pesar de detalles como la medicin de pH, entre otros la fermentacin se llevo a cabo con xito y se llego al objetivo planeado, que era el observar el desarrollo de la S. cerevisiae durante una fermentacin para obtener valores que constataran su funcin en el proceso de fermentacin para la obtencin de productos de inters como lo es el etanol.

Bibliografa y referencias

-Lee. Manual de ingeniera bioqumica. Editorial Prentice Hall -Fermentacin alcohlica: Disponible en lnea en: -http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n_alcoh%C3%B3lica -http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n_alcoh%C3%B3lica Consultado el da 25 de junio del 2011.