Praktikum 2019 MS-Anleitung - ETH Z · 2019. 2. 25. · Praktikum Physikalische und Analytische Chemie MALDI-MS Versuch Kontakt Timo Niepel HCI D325 ... Die Proben werden durch ein

Praktikum Physikalische und Analytische Chemie

MALDI-MS Versuch

Kontakt

TimoNiepel HCID325,34834,[email protected]

BettinaStreckenbach HCID325,23875,[email protected] HCIE337

Version20Februar2019

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Aufgabe

Dieser Versuch dient der Einführung in die (Matrix-unterstützte) Laser-Desorption/IonisationTime-of-FlightMassenspektrometrie(MA)LDI-TOF-MS.Eigenhändig werden sowohl einige LDI-, als auch MALDI-Proben von einem SetbekannterVerbindungenvorbereitetundgemessen.DieerhaltenenSpektrensollenaufdemeigenenRechnerprozessiertundausgewertetwerden. Die dazu notwendige Software ist als Open Source Software vorhanden (MSWindows,MacOSXundLinux).ZielistdiemöglichstvollständigeSignalidentifizierungderVerbindungendurchzuführenunddenEinflussderMessparameterzuerklären.ProGruppesolleinBerichtabgegebenwerden.DieAnforderungenandenBerichtsindausführlichamEndederVersuchsanleitungbeschrieben.

Achtung!

Das in diesem Versuch verwendete Spektrometer kostet mehrereHunderttausendFrankenundwirdvonallenForschungsgruppenimLOCgenutzt.Das LOC erwartet darum äusserste Sorgfalt im Umgang mit dem Gerät.Insbesondere sollen die Vorschriften zu diesem Versuch genau befolgt werden.Jacken,Taschenetc.dürfennichtmit indenRaumgenommenwerden.MöglicheDefekte am Gerät oder Verschmutzung durch zerbrochene Proben etc. müssendemzuständigenAssistentensofortgemeldetwerden.


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Hintergrund

MassenspektrometrieberuhtaufderIonisierungvonMolekülen,ihrerTrennungdurchelektrische und magnetische Felder sowie zum Teil auch in feldfreien Regionen undihreranschliessendenDetektion.Für Ionenerzeugung, -trennung und -detektion sind verschiedene Lösungsansätzeentwickelt worden. Klassische Methoden zur Ionenerzeugung (Elektronenstoss) sindsehr destruktiv und verursachen eine Fragmentierung der Moleküle. Um dies zureduzieren,wurdenu.a.Elektrospray-Ionisierung(ESI)undMALDIentwickelt.Wir werden für diesen Versuch MALDI in Kombination mit Time-of-Flight (TOF)Detektioneinsetzen.BeiderProbenvorbereitungderLDI-undMALDI-Messungenwirddie zu analysierende Substanz auf eine Metalloberfläche aufgebracht. Die Ionisierungerfolgt durch einen Laserpuls auf diese Metalloberfläche. Der genaueIonisationsmechanismusistbisheutenochnichtvollständigaufgeklärt.LDIundMALDIunterscheidensichinderAnwesenheiteinerMatrix.Diesebestehtausrelativ kleinen Molekülen, die leicht UV-Strahlung absorbieren und dadurch ionisiertwerden.BeiderBildungvonKationenpassiertz.B.folgendes:

𝑀"#$%⎯' 𝑀(∙ + 𝑒,

DieresultierendenMatrixionen(M)übermittelnihreLadungandieAnalytmoleküle(A),dieinverdünnterFormvorliegen.

𝑀(∙ + 𝐴 → 𝑀 + 𝐴(∙Die Entstehung der Anionen ist komplizierter zu verstehen. Hier wird ein Elektronaufgenommen,welcheserstanderswoproduziertwerdenmuss.

𝑒, + 𝑀 → 𝑀,∙𝑀,∙ + 𝐴 → 𝑀 + 𝐴,∙

Die geringe Menge Analytmoleküle und die relativ niedrige Laserfluenz(Laserpulsenergie proOberfläche; J/m2) imVergleich zur LDImachtMALDI zu einemsensitivenundweichenIonisierungsverfahren.

Abb.1:ÜbersichteineslinearenTOFInstruments.DievoneinemLaserpulserzeugtenIonenwerdenvoneinergeerdetenBeschleunigungsplatteinRichtungdesDetektorsbeschleunigtund in Abhängigkeit ihres Masse-zu-Ladungsverhältnisses (m/z) in der Driftregion desGerätesgetrennt(bearbeitetvonReferenz4).


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Dieerzeugten Ionenkönnen jetztbezüglich ihresMasse-zu-Ladungsverhältnisses(m/zin Thompson) getrennt und in Richtung des Detektors transportiert werden. Dazuwerden sie in einem MALDI-TOF Instrument erst in einem elektrischen Feldbeschleunigt und anschließend in einer feldfreien Region nach m/z getrennt (sieheAbbildung1).Die elektrische Ladung q des Ions mit der Masse mi ist ein Vielfaches z derElementarladungeundwirdangegebendurchq=ez.DieEnergieaufnahmedesIonsEeldurchPassiereneineselektrischenPotentialsUwirdbeschriebendurch:

Eel=qU=ezU

DiedurchdasPotentialaufgenommeneEnergiewirdumgesetztinkinetischeEnergie:Eel=ezU=½miv2=Ekin

DieGeschwindigkeitdesIonsistdanngegebendurch:

v=/012345

DiebenötigteZeit(t=s/v)desIonsmitderMassemiundderLadungz,umdiefeldfreieDriftstrecke nach Beschleunigung durch das Potential U zu durchqueren, ist damitgegebendurch:

t= 6√013

/452

Allerdings erhalten nicht alle Ionen der gleichen Ladung und Masse genau dieselbekinetischeEnergiewährendderLaserablationderProbe,wodurchdieSignalauflösungreduziertwird.DamitdieIonenmitdengleichenm/zWertengleichzeitigdenDetektorerreichenundsomitdieAuflösungverbessertwird,sinddie„DelayedExtraction“-unddas Reflektronverfahren (siehe Abbildung 2 und 3; Abbildung 4 zeigt die Laser- undIonenoptikdesverwendetenMassenspektrometers)entwickeltworden.

Abb. 2: „Delayed Extraction“-Verfahren. Unterschiede in der kinetischen Energie amAnfangdesIonentransportswerdendurchdasAnlegeneineselektrischenFeldesteilweiseaufgehoben.


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Abb. 3: Übersicht eines Reflektron TOF Instruments. Die von einem Laserpuls erzeugtenIonen werden von einer geerdeten Beschleunigungsplatte in Richtung des Detektorsbeschleunigt und in der Driftregion des Gerätes hinsichtlich ihres Masse-zu-Ladungsverhältnisses getrennt. Diesmal werden jedoch unterschiedliche kinetischeEnergiendergleichenIonendurchdaselektrischeFelddesReflektors(Ur>U)aufgehoben,wodurchdieAuflösungverbessertwird.(bearbeitetvonReferenz4).


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Abb. 4: Übersicht der Ionenoptik des verwendeten Massenspektrometers „AB 4800“.ZusätzlichhatdasSpektrometernocheineMS-MS-Möglichkeit,wobeiausgewählte Ionenweiterfragmentiertwerdenkönnen.

FüreineausführlichereErklärungvonMALDI-TOF-MSwirdaufdasSkriptzurVorlesungAnalytischeChemieI&IIundinsbesondereIII(Wahlfachim5.Semester:ModerneMassenspektrometrieundKopplungstechnikeninderAnalytik)verwiesen.


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Versuchsdurchführung

1. MALDI-Platte putzen

DamitdieneueProbenichtdurchRückständekontaminiert ist,wirddieMALDI-PlattevorihremEinsatzinmehrerenSchrittengereinigt:

• Schalten Sie die Kapelle ein und tragen Sie die erforderliche Schutzkleidung(Brille,Handschuhe,Laborkittel).

• AlsersteswerdenmiteinemPapiertuchundeinwenigEthanoldieMatrixundandereAnalytresteentfernt.

• DaraufhinwirddiePlattemitdemPoliermittelElsterglanzpoliert.

• AnschliessendwirddiePlattemitPentanunddanachmitMethanolfürjeweils5MinuteninsUltraschallbadgegeben.

2. Probenpräparation

Zunächst sollen verschiedene Matrix- und Analytlösungen hergestellt werden (sieheTabelle1undAbbildung5).

• Dazu wird die benötigte Menge Substanz in einem 1.5mL Eppendorfgefässeingewogen.Berechnen Sie imVoraus für jede Substanzwie vielmg Sie davonpermLvondemausgewähltenLösungsmittellösenmüssen:

o 2,5-Dihydroxybenzoesäure(DHB)in30:70[v/v]Acetonitril:0.1%TFAinH2O(75.0mM)

o 9-Aminoacridin(9AA)inMethanol(75.0mM)o α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in 30:70 [v/v] Acetonitril : 0.1%

TFAinH2O(75.0mM)Die Analytlösungen stehen schon als Stammlösungen im Gefrierschrank bereitundmüssennurnochimgleichenLösungsmittelauf0.1mMLösungenverdünntwerden:

o Fulleren-C60(C60)inXylol(2.0mM)o Bradykinin(BDK)in30:70[v/v]Acetonitril:0.1%TFAinH2O(5.0mM);

10µLaliquots


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Berechnen Sie jeweils den Verdünnungsfaktor und verwenden Sie 10µL derStammlösung.

• DieMatrixlösungenwerdenmit demVortex homogenisiert. Die Substanzmusssich vollständig im gewählten Lösungsmittel auflösen! Falls der Vortex nichtausreicht,benutzenSiedasUltraschallbadfürwenigeSekunden.

• Anschließend werden die MALDI-Lösungen durch die Kombinationen vonMatrix- und verdünnten Analytlösungen im Volumenverhältnis 1:1 in 0.5mLEppendorfgefässen(jeweils25µL)hergestellt.DieLösungenwerdenwiedermitdemVortexhomogenisiert.

• Damit die Massenspektren ausgewertet werden können, muss das Gerätkalibriertwerden.DazuwirdeineLösungvon50mMCsI3inTetrahydrofuranimVolumenverhältnis 1:1 in 0.5mL Eppendorfgefässen (jeweils 25µL) mit einer

Lösungvon100mMDCTBalsMatrixinTetrahydrofuranvermischt.

DCTBodertrans-2-(3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methylallyliden)propandinitril

• Für den Versuch wird eine Platte „Opti-TOF™ 96 Well Insert (123 x 81mm)“

benutzt(sieheAbbildung5und6).BenutzenSiedieTabelleimAnhang!Im Allgemeinen: Vorsicht beim Auftragen eines apolaren Lösungsmittels mitgeringer Oberflächenspannung, da das Lösungsmittel dazu neigt, sich auf derMetallplatteauszubreiten.Auf den grauen Punkten werden 0.5µL der CsI3/DCTB-Lösung aufgebracht.Stellen Sie sicher, dass ausreichend Kalibrierungslösung aufgebracht ist, weilDCTBlangsamsublimiertundCsI3inCsIundI2zerfällt.VonjederMatrix-Lösung(ReiheA)werdenjeweils4undvonjedemAnalyten(ReiheB)jeweils6Spotsaufdie (MA)LDI-Platte aufgebracht.Von jederMALDI-LösungwerdenproReihe (Cbis H) jetzt noch 12 Spots hergestellt. Notieren Sie im Laborjournal, welcheSubstanzenwoaufgetragensindundbenutzenSiedieTabelle imAnhang!Dazuwirddie sogenannte „drieddroplet“-Methodeeingesetzt:0.5µLwerdenaufdieMetallplatte aufgebracht und an der Luft getrocknet. Erst wenn alle Tropfengetrocknetsind,darfdiePlatteindasMassenspektrometereingeführtwerden!

Nun sollte von jeder Probe ein Massenspektrum wie im Folgenden beschriebenaufgenommenwerden.Weiterhin sollen alle Signale den entsprechendenMatrix- wieAnalytionenundihrenFragment-undAdduktionenzugeordnetwerden.

N

N


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Tabelle1.:ÜbersichtderzuverwendendenMatricesundAnalyten.BeachtenSie,dassdiemittlere Molmasse nicht der monoisotopischen Masse entspricht. Die Ionenmasse hängtvonderZusammensetzungdesIonsab(z.B.+/-H+,+Na+,+/-e-usw.).

Matrix Mittlere Molmasse [g/mol]

Analyt Mittlere Molmasse [g/mol]

2,5-Dihydroxy-benzoesäure

154.12 Fulleren-C60

720.66

9-Aminoacridin

194.23 Bradykinin 1060.22

α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

189.17

HOOH

O

OH

N

NH2

CN

O

OH

HO


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Abb.5:Übersichtder„96-WellInsertMALDI-Platte“.ReiheAenthältdieMatrix-Lösungen,Reihe B die Analyt-Lösungen und in Reihe C-H ist für jede Reihe eine Matrix-Analyt-Mischungvorgesehen.DiegrauenPunkte entsprechendenKalibrierungspunktenmitderDCTB/CsI3-Mischung. Die zu verwendenden Methoden sind angegeben: positive (+),negative (-) Polarität und Linear- (L) und Reflektron- (R) Modus. Die übrigen, nichtbeschriftetenPunktekönnenzurBestimmungderoptimalenLaserfluenzund„Extractiondelaytime“benutztwerden.

Abb.6:Die„Opti-TOF™96WellInsert(123x81mm)MALDI-Platte“.DiePlatteistaufderUnterseite mit einem Strichcode versehen, woran die Platte erkannt wird und wodurchwichtige Parameter (Positionierungskoordinaten, Spotidentifizierung etc.) nur einmaleingestellt werden müssen. Es gibt verschiedene alternative Platten, die es erlauben,verschiedensteProben(z.B.Gewebe)zuuntersuchen.


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3. Spektrometer-Software Einführung & erste Schritte

DieProbenwerdendurcheinMALDI-TOF/TOF-Analyzer-Massenspektrometer„AppliedBiosystems/MDS SCIEX 4800“ mithilfe der Software „4000 Series Explorer V3.7.07“gemessen.

• Öffnen der Spektrometer-Software: Doppelklick auf das 4000 Series ExplorerIcon.

DerBildschirmsolltenunfolgendermassenaussehen:

Abb. 7: Öffnungsfenster des 4000 Series Explorers. Links oben befindet sich das „ManualControl Fenster“ und darunter der „Video Viewer“. Das grosse Fenster ist der „Spot SetWindow/MethodEditor“.Darunterbefindetsichder„SpectrumViewer“unddarunterdie„StatusBar“.


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Neues Spot Set öffnen

JetztwerdenSieeinneues„SpotSet“erstellen:

• Auswählen:File>New>SpotSet• EinFensteröffnetsichund3Schrittesolltendurchlaufenwerden:

1. Geben Sie dem „Spot Set“ einen Namen: Wählen Sie “96 Opti-TOF123mmx81mmRevA3“, ersetzen Sie “A3“mit „Group#“und drückenSieaufCreate.

2. GebenSieIhrerPlatteeinenNamen:WählenSie„001500000562_spots“(dies entspricht dem Strichcode auf der Platte) und drücken Sie aufYesimPop-up-Fenster.

3. Auswählendes “SpotSet”Templates: ItemType:“UserDefinedSpotSetTemplate”,Auswahl:“AnalyticalChemistryPracticum\Opti-TOF96WellInsertwithCsIcalibrationspots”undKlickaufSelect.

(MA)LDI-Platte einsetzen

• Die MALDI-Platte muss erst auf einem Träger platziert werden. Dieser ist mitMagnetenversehenundsichertdiePlatte(beachtenSiedieabgeschnitteneEcke;sieheunten).

• Der Träger wird jetzt in dasMassenspektrometer eingebracht. Dazumuss derDeckel geöffnet werden und der Träger an der linken Seite mit derabgeschnittenen Ecke links unten platziert werden. Der „Eject pad“ sollte leersein.

• KlickenSieaufPlate>LoadPlate.EsöffnetsichdieSelect„SpotSetDialogbox“.• Wählen Sie unterProject dasVerzeichnis „AnalyticalChemistryPracticum“aus,

danach„96Opti-TOF123mmx81mmSSGroup#“unddrückenaufSelect.• EsöffnetsicheinneuesFenster.WählenSieLoadunddieMALDI-Plattewirdin

die „Main Source Chamber“ geladen. Dies nimmt etwa 1-2 Minuten Zeit inAnspruch.DasVakuuminderSourceregionmusswiedererreichtwerden(wirdim„Load/EjectCycleStatus“Fenstergezeigt)


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Spektrenaufnahme vorbereiten

Bevor man ein Spektrum aufnehmen kann, müssen noch einige Schritte absolviertwerden.

Acquisition Methode auswählen

Weil die Optimierung einerMethode viel Zeit in Anspruch nehmen kann, sind alle zuverwendenden Methoden (abgesehen von der Laserfluenz, weil diese stark vomAnalyten und der Matrix abhängt) schon optimiert worden und im Systemabgespeichert:

• Linearnegmode• Linearposmode• Reflectornegmode• Reflectorposmode

ÖffnenSiealleMethoden:File>Open>AcquisitionMethod

• Wählen Sie die „AcquisitionMethod“, die der richtigenMethode entspricht, imReiteruntenimMethodEditor

• WählenSie imAnschlussdaranFile>SetasActiveAcquisitionMethod oderklickenSieauf .DieaktiveMethodeerscheintjetztingrünim„MethodEditor“.

Jetzt sollte die Hochspannung eingeschaltet werden, mindestens 30 Minuten vorSpektrenaufnahme ergibt die besten Ergebnisse. Dazu wird Instrument > Turn on

High Voltage oder ausgewählt. Der „Video Viewer“ sollte automatisch starten.AnsonstenselektierenSieView>VideoViewer.ÖffnenSieauchdas„ManualControlPanel“(damitkannjederSpotangefahrenwerden)fallsesnochnichtgeöffnetist:View>ManualControl.

Processing Methode auswählen

Auch alle zu verwendenden Spektrum-Verarbeitungsmethoden sind schon optimiert(abernochnichtkalibriert!)wordenundimSystemabgespeichert:

• Linearnegmode• Linearposmode• Reflectornegmode• Reflectorposmode

ÖffnenSiewiederumalleMethoden:File>Open>ProcessingMethod

• WählenSiedieaktiveProcessingMethod,diederrichtigenMethodeentspricht,imReiteruntenimMethodEditor.

• WählenSie imAnschlussdaraufFile>SetasActiveProcessingMethod oderklickenSieauf .DieaktiveMethodeerscheintjetztingrünim„MethodEditor“.

• Jetzt sindsowohleine „AcquisitionMethod“, als aucheine „ProcessingMethod“mitdernächstenKalibrierungoderMessungverknüpft.


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4. Kalibrierung

Intern und extern kalibrieren

Die„ProcessingMethod“kalibriertdieMessungen,abersollteerstselbernochkalibriertwerden.EsgibtzweiMöglichkeitenzukalibrieren:Die interne Kalibrierung basiert auf den beobachteten Flugzeiten der Ionen derStandards im selben Sample Spot. InterneKalibrierung bietet in der Regel im Linear-Modus 0.02% (200ppm) und im Reflektron-Modus 0.0005% (5ppm)Massengenauigkeit.ExterneKalibrierungbasiertaufdenbeobachtetenFlugzeitenderIonenderStandardsin einem anderen intern kalibrierten Sample Spot. Externe Kalibrierung bietet in derRegelimLinear-Modus0.05%(500ppm)undimReflektron-Modus0.0025%(25ppm)oderwenigerMassengenauigkeit.

Intern kalibrieren der Processing Methoden mit CsI3 und DCTB

In Prinzip kann man jede Mischung verschiedener, bekannter und relativ stabilerSubstanzen füreineKalibrierungnutzen.Cäsiumund Iodhabenallerdings jeweilsnurein Isotopundeignensichdadurchoptimal fürKalibrierzwecke.AusserdembildetCsIfürbeideMesspolaritätengeladeneSalzclustermitbekanntenMassen(sieheTabelle2undReferenz1).

Tabelle2:Übersichtder(Cluster-)Ionenundihrem/zfürKalibrierungmitCsI3undDCTBals Matrix im positiv und negativ Modus. Die Massen sind schon in denKalibrierungsdateien„CsIpos./neg.mode“abgespeichert.

(Cluster)ion m/z

Neg. Modus

I- 126.905026

[(CsI)I]- 386.714936

[(CsI)2I]- 646.524846

[(CsI)3I]- 906.334756

[(CsI)4I]- 1166.144666

[(CsI)5I]- 1425.954576

Pos. Modus

Cs+ 132.904884

[(CsI)Cs]+ 392.714794

[(CsI)2Cs]+ 652.524704

[(CsI)3Cs]+ 912.334614

[(CsI)4Cs]+ 1172.144524

[(CsI)5Cs]+ 1431.954434


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• FürdieKalibrierungder„Processing“MethodenwähltmaneinenderCsI3/DCTB-spotsausundwähltdieKalibrierungsdateidesCsI3’s,diederrichtigenPolaritätentspricht. Die Kalibrierungsdateien sind schon in derMethode aufgenommen.Aus Tabelle 2 kann man ableiten, dass entsprechend der Polarität desMassenspektrometersbestimmteMassenfürdieKalibrierunggebrauchtwerden.

• Wählen Sie die richtige Set-„Acquisition“- und „Processing“-Methoden für dieKalibrierungausundaktivierenSiesiewieobenbeschrieben.WählenSiebeider„ProcessingMethod“denReiter„Calibration“ausundwähle„Internal“.

• Wählen Sie im „Manual Control Manager“ einen Kalibrierungsspot. Durchzeichnen eines Quadratesmit dem Cursor innerhalb des Spotswählen Sie denMessbereich. Sobald Sie dieMaustaste loslassen, fangen die Laserpulse an. AmEndederMessungwirddasKalibrierungspektrumgezeigt.FallsdieKalibrierungscheitert, einfach nochmal versuchen, bis die Signale für eine Kalibrierungintensivgenugsind.Eventuellkannmanbeider„AcquisitionMethod“unterdemReiter„AutomaticControl“nochdenLaserfluenzerhöhen:„LaserIntensityMode“:„Fixed laser intensity“. Siehe Seite 20 für eine ausführlichere Beschreibung.Ansonsten kann man die Voraussetzungen einer erfolgreichen Kalibrierungwenigerstriktmachen(sieheAbb.8).

Abb. 8: Beispiel einer Kalibrierungmit einerMischung bekannter Standards. „Min S/N“,„MassTolerance“ (in ppmoderm/z), „MinPeaks toMatch“ und „MaxOutlier Error“ (inppmoderm/z) könnennachBeliebengeändertwerden. Falls dieKalibrierung scheitert,kann man die Bedingungen auflockern und bei einer erfolgreichen Kalibrierungschrittweiseoptimieren.


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Abb. 9: Beispiel eines AB 4800 MALDI-Kalibrierungsspektrums im positiven ReflektronModusmitCsI3undDCTB(1:2molaresVerhältnisvermischt).

• SpeichernSiedieKalibrierungabmit:Interactive>SaveSpot.WechselnSieinder„ProcessingMethod“imReiter„Calibration“auf„External“undspeichernSiedie „Processing Method“ ab: File > Save Processing Method. Jetzt kann derabgespeicherteinternkalibriertePunktfürdieexterneKalibrierungderanderenSampleSpotsfürdieseSet-„Acquisition“-und„Processing“-Methodenverwendetwerden.

• Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen drei „Acquisition“- und„Processing“-Methoden. Das Wechseln der Polarität kann ein wenig Zeit inAnspruchnehmen.DamitistdieKalibrierungfürdieseMessungenvollständig.


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5. Hintergrund zur Spektrenaufnahme

Nachdem alleMethoden für die Spektrenaufnahmebereit sind,werden noch kurz diewichtigenParameterfürdieAufnahmeeinesMassenspektrumserklärt:

Positiver und negativer Modus

Der Massenspektrometeraufbau erlaubt nur eine einzige Polarität einzustellen. DieIonen, die nicht der Polarität der Messmethode entsprechen, werden wieder auf derMALDI-Platte landen und dort neutralisiert. Die anderen Ionen werden mit demelektrischenBeschleunigungspotentialausderMALDI-WolkeextrahiertundinRichtungdesDetektorsbeschleunigt.

Linear- und Reflektron-Modus

Die Ionen werden hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Flugzeiten durch das erzeugteVakuum getrennt. Notieren Sie den Enddruck inmBar derMessungen: Instrument>HardwareMonitor;oderschauenSieuntenimFenster:Source1undSource2.

Abb.10:DerEnddruckdesInstrumentswirdsowohlinder„VacuumTable“unter„Source1“und“Source2“angezeigtalsauchuntenimFensteringrün.

DieIonenbekommenbeiderAblationdurchdenLaserpulsnichtallediegleicheMengean kinetischer Energie und sind deshalb auch nicht alle gleich schnell. Um dieseunterschiedlichen kinetischen Energien zu reduzieren und damit die Auflösung zuerhöhen, ist ein Reflektor eingebaut. Dieser erzeugt ein elektrisches Feld, in dasschnellere Ionentiefereindringenals langsamere.SobalddiekinetischeEnergiedurchden Reflektor ausgeglichen ist,werden die Ionen in Richtung des Reflektor-Detektors


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umgelenktundkommennunmitweitausgeringerenZeitdifferenzen(imVergleichzumLinear-Modus)beimDetektoran.(SieheAbbildungen3und4)

Extraction delay time und Potentiale

Die optimale „Extraction delay time“ (die Zeit zwischen Laserpuls und Senken desExtraktorpotentials) wird automatisch, abhängig von den ausgewähltenBeschleunigungspotentialen, durch die Software des AB4800 bestimmt. Aber dasMassenspektrometererlaubtesdemBenutzerauch,diesenWertselberzubestimmenundzuoptimieren.Die „Extractiondelay time“hängtvorallemvondenausgewähltenBeschleunigungspotentialenundvomm/z der zuuntersuchendenAnalytenabund istdamitbesonderswichtigfürdieAuflösungderAnalyten.

Laserenergie

Die „Laserenergie“,genaugenommenFluenzundausgedrückt inLaserpulsenergieproOberfläche (J/m2)bestimmt,wievielePhotonendasMALDITarget erreichenundvonderMatrix/Analytmischungmaximal absorbiertwerdenkönnenunddamitdieMengeMoleküle,dieablatiertundionisiertwerden.FallsdieLaserenergiezuniedrigist,wirdkeineAblationundIonisierungstattfinden.Wennsiezuhochist,fragmentierenMatrix-undAnalytmoleküleoderbildenCluster.Deshalb istesnotwendigbei jedem(MA)LDI-Versuch die optimale Laserenergie in Kombination mit den oben angegebenenParameternfestzustellen.

Salzkonzentration

Die Anwesenheit von Salzen ist im Allgemeinen in der Massenspektrometrie eherunerwünscht. Vor allembei Elektrospray Ionisation kann es zuProblemen führen. ImVergleich dazu ist MALDI noch sehr robust. Manchmal wird die Präsenz von Salzensogar ausgenutzt für sehr apolare Moleküle, die schwierig zu ionisieren sind. DabeibildensichbeiAnwesenheitvonMetallkationenAddukte,diemanmitMSbeobachtenkann.AbermeistensmachendieKationadduktedie InterpretierungderSpektreneherschwierigoderführenzuArtefakten.


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6. Spektrenaufnahme

DiePlatte ist verknüpftmit einemSpotSet,wobei jederPunktmit einerAcquisitionMethodundProcessingMethodversehenist.FürjedenPunktaufderMALDI-Platteistjetzteine„AcquisitionMethod“bestimmt.JedeMethodebeziehtsichaufeinebestimmtePolarität(positivodernegativ)undentwederdenLinear-oderReflektron-Modus.

BestimmenSiefürjedeMatrix/AnalytkombinationzuerstinbeidenReflektron-ModidieoptimaleLaserfluenzund „Extractiondelay time“undverwendenSiediesedannauchfür die Linear-Modi. Verwenden Sie dazu die übrigen Punkte auf der MALDI-Platte.NotierenSiedieWerteimLaborjournal.

Laserfluenzbestimmung

DieLaserfluenzkannmanim„ManualControlFenster“ändern:

oderim„MethodEditor“:WählenSiedieaktive„AcquisitionMethod“aus,klickenSieaufden Reiter „Automatic Control“ und geben Sie im Bereich “Laser IntensityMode“ denLaserfluenzwertbei„Fixedlaserintensity“ein.

FangenSiebeiniedriger(ca.4000)LaserfluenzanundmessenSiedieübrigenPunkteaufderMALDI-Platte.ErhöhenSiedenLaserfluenzwertbismax.7500.BestimmenSiefür jedeMatrixdieoptimaleLaserfluenzimpositivenundnegativenReflektron-ModusundbenutzenSiedieWertefürdieLinear-Modi.Achtung:NichtjedeSubstanzistleichtionisierbar und nicht jedeMatrix-Analyt-Kombination erzeugt Analytionen. EigentlichwirdLaserfluenzausgedrücktinJ/m2,aberweildieLaserleistunglangsamabnimmt,istdie Bestimmung der Laserfluenz eine Momentaufnahme und der benötigte arbiträreWertwirddaherimLaufederZeithöher.


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Extraction delay time-Bestimmung

Um die „Extraction delay time“ zu ändern, selektieren Sie die aktive „AcquisitionMethod“.WählenSieden„Instrument“-ReiterundklickenSieauf„Open“ im„OperatingMode“-Bereich.UnterstehenderReiteröffnetsich,woim„DelayTimes(ns)“-Bereichdie„Extraction delay time“ in Nanosekunden eingegeben werden können. Die bestenErgebnisse werden, abhängig von der Masse des Ions, zwischen 500-800ns erreicht.Ändern Sie diesenWert, bis Sie zufrieden sindmit der Signalform und der Signal-to-Noise-Ratio(S/N)fürjedenAnalytenimpositivenundnegativenReflektron-Modus,undbenutzen Sie die Werte für die Linear-Modi. Den „Operating Mode“ der „AcquisitionMethod“könnenSieabspeichernundschließen,indemsiedengrünenReiterauswählenunddannFile>Save/CloseOperatingModeauswählen.

EinewichtigeRegelbeiderOptimierung:Nur1Parametergleichzeitigändern!!!SobaldSiedieParameterausreichendoptimierthaben,speichernSiedasSpektrumabmit: Interactive > Save Spot. Notieren Sie die optimierten Werte der Parameter(Laserfluenzund „Extractiondelay time“) in Ihr Laborjournal.Wiederholen Sie diesesVorgehenfürdasVermessenallerSpots.

Reihenfolge Spektrenaufnahme

Messen Sie jetzt erst alle Spots, die im Reflektron-Positiv-Modus gemessen werdensollen und danach im Linear-Positiv-Modus. Verwenden Sie für jede MALDI-KombinationdiegleichenoptimiertenWertefürLaserfluenzund„Extractiondelaytime“wieimReflektron-Modus.VermessenSieanschliessenddieSpotsimReflektron-NegativModusundanschließendLinear-Negativ-Modus.


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Beispielspektrum:

EinMALDI-Spektrumaufdem„AB4800“aufgenommensiehtfolgendermaßenaus:

Abb. 11: Beispiel eines „AB 4800“-MALDI-Spektrums vom Bradykinin und α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure im positiven Reflektron-Modus (oben: ganzes Spektrum; unten:Vergrößerung).

In der „4000 Series Explorer“-Software können Sie mithilfe der Zoomknöpfe dieSpektrengenaueransehen.UmdasganzeSpektrumwiederanzuzeigen,klickenSieauf.

Peak List anschauen

• WählenSieView>Output>Window,umdasOutputfensterzuöffnen.• WählenSiedenReiterPeakListaus.DieAuflösungderPeaks(sieheunten)wird

automatisch berechnet. Notieren Sie für jede Messung die Auflösung derwichtigsten Peaks im Laborjournal. Um Auflösung und Signal-to-Noise-Ratioautomatisch zu zeigen, wählt man Spectrum > Peak Label aus,wählt unterOtherLabelAttributesResolutionundSignal toNoise aus unddrückt aufOK.(Ansonsten kann man auch nachher in der Verarbeitungssoftware mMass dieAuflösungnochberechnen.)

Einzelne Spektren und Spot Set abspeichern

Das Abspeichern einzelner kalibrierter Spektren geschieht durch Auswahl vonSpectrum > Save Spectrum To File ... . Dann das Verzeichnis C: \Documents andSettings\All Users Desktop\Analytical Chemistry Practicum\2019\Gruppe# auswählenundaufSaveklicken.DerNamedesSpektrumssolltedemMuster„Gruppe#_Spot#“(z.B.Group3_B11)folgen.DaskalibrierteSpektrumunddie„PeakList“sindjetztindem„SpotSet“ zusammen mit Kopien der „Acquisition Methods“ und „Processing Methods“ als„.t2d“-Dateiabgespeichert.


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Dasganze „SpotSet“mitallenaufgenommenenSpektrenabspeicherngeschiehtdurchFile>SaveSpotSet.

Dateiformat: t2d > ASCII

Damit die Dateien weiterverarbeitet werden können, müssen sie erst in ASCII-Textdateienumgewandeltwerden.Dazuwirddie„DataExplorerSoftware“(Version3.7;build126)verwendet.

DieSpektrenwerdengeöffnetmitFile>Open...WählenSieallePunkte(haltenSiedieShift-Tastegedrückt),klickenSieaufAddAllundanschließendaufFinish.(AlternativklickenSiemitderrechtenMaustasteaufdieNummervordemSpotvonInteresse im„SpotSetManager“undwählenSieViewSpectruminDataExplorer).Mit File > Export > ASCII Spectrum oder File > Convert All Spectra > ASCII Textexportieren Sie das Spektrum im aktiven Fenster als ASCII-„.txt“-Datei. DerName desSpektrumssolltewiederumdemMuster„Gruppe#_Spot#“(z.B.Group3_B11)folgen.Nehmen Sie sicherheitshalber schon am Praktikumstag einen Laptop mit derinstallierten „mMass“-Software (siehe unten)mit und überprüfen Sie gleich, obderDatentransfererfolgreichwar.Datentransfer

DieDatensindbisjetztnuraufdemComputerdesSpektrometersgespeichert.Fürdenweiteren Gebrauch werden Ihnen die ASCII-„.txt“-Dateien vom Assistenten per EmailzugeschicktundkönnendannaufdemeigenenComputerheruntergeladenwerden.

Sample aus dem Massenspektrometer nehmen

• Hochspannung abschalten (Instrument > Turn off High Voltage oder

selektierenSie )undwartenSieeinigeSekunden.• WählenSiePlate>EjectPlate...undwarten1-2Minuten.• ÖffnenSiedenDeckelundentfernenSiedenTräger.


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7. Prozessieren und Auswerten der Spektren in mMass

Installation

Auf der „mMass“-Website http://www.mmass.org/download/ kann das Open-Source„Mass Spectrometry Tool“ heruntergeladen werden. Installieren und starten Sie dieSoftware.

Öffnen eines Spektrums

WenndieobigeVorschriftbefolgtwordenist,solltenalleSpektrenalsASCII-„.txt“-DateiineinemOrdnermitNamen<GruppeNr>gespeichertsein.Öffnen Sie die „.txt“-Dateien in einem Text-Editor und entfernen Sie die ersten zweiZeilen, z.B.: „SPEC#: 1, SIZE: 106853, TIME: 0.000000“. Speichern Sie die “.txt“-Dateiwiederab.NachdemStartvon„mMass“müssenjetztdieDateiennurnochaufdieArbeitsflächedesProgrammsgezogenwerden:File>Open>.

NachdemÖffneneinesSpektrumssiehtderBildschirmsoaus:

Abb. 12: Beispiel eines „AB 4800“-MALDI-Spektrums vom Bradykinin und α-Cyano-4-hydroxyzimtsäureimpositivenReflektron-Modus.


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Peak-Markierung

MitProcessing oderProcessing>PeakPicking...könnendiewichtigstenSignaleannotiertwerden.RechtsimBilderscheintdie„PeakList“mitderFWHM.Die„mMass“-Software zeigt auchdieAuflösung,wennman inView>PeakListColumns dasFeld‚Resolution’markiert.

MitView>NotationskönnenSiediePeaksmiteinerm/zundeinemLabelversehen.Labels können Sie eintragen, indem sie im „Peak List“ auf der entsprechendenm/zdoppelklicken.TragenSiedasLabeleinunddrückenSieaufAdd.


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Spektrum abspeichern

Die verarbeiteten Spektren können mit File > Export... in verschiedenen Formatenabgespeichertwerden.

Bestimmung der Signalauflösung

DieSignalauflösung(„massresolution“,R)wirdangegebendurchdenkleinstenAbstand(„resolvingpower“)inm/z(Δm/z),derfüreinenbestimmtenm/z-Bereichaufgetrenntwerdenkann:

R= 4∆4= 4/2

∆4/2

Die Auflösung ist damit dimensionslos und wird durch die Signalbreite bei einerdefinierten Signalhöhe bestimmt. Sie wird als eine Funktion der Masse ausgedrückt(sieheAbbildung13).

Abb. 13.: Signalhöhe ist nicht skaliert. Definition des FWHM und R10% (bearbeitet vonReferenz4).


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Die „10%Tal“-Definition der Auflösung (R10%)wird erfüllt,wenn die Signalbreite bei5% der relativen Signalhöhen (∆m1) gleich ist wie die Distanz zwischen den beidenSignalmaxima (∆m2). Desto kleiner ∆m1 im Vergleich zu ∆m2 ist, desto höher ist dieAuflösung. Die Signalbreite bei 50% der Signalhöhe definiert die Full Width at HalfMaximum(FWHM).DiedavonabgeleiteteR50%verhältsichmiteinemFaktor1.8zuderR10%beieinergaussschenSignalverteilung.Die Spektren oder Ausschnitte aus den Spektren können nach demBearbeiten direktgedruckt oder als PNG, TIFF oder JPEG für die weitere Verwendung im Berichtexportiertwerden:File>Export>(wähleFormat,etc.)>Export. DiebearbeitetenSpektrenkönnenseparatabgespeichertwerden:File>SaveAs...>.


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Bericht zum MS-Versuch

Generelles

Es wird ein kurzer, präzise geschriebener Bericht erwartet. Englisch wird bevorzugt,aberDeutsch ist aucherlaubt.Damit genügendPlatz fürKorrekturenbleibt, sollte einZeilenabstand von 1.5 verwendet werden. Inhalt des Berichts betrifft nur eine kurzeErklärungdesAblaufsder Ionisierung fürLDIundMALDIunddieSpektrenaufklärungdergemessenenSubstanzen.AusschlaggebendfürdieBewertungderBerichteistdieausreichendeBeschreibungderResultate sowie derenDiskussion in Bezug auf die verwendeteMessmethode (positiv/negativ,Linear-/Reflektron-Modus,Matrix,Laserfluenz,„Extractiondelaytime“).

Aufbau

DerBerichtsollteinfolgendeTeilegegliedertsein:

Titelblatt:•PraktikumPhysikalischeundAnalytischeChemie/Massenspektrometrie

•Assistent:TimoNiepeloderBettinaStreckenbach•Titel

•GruppenNr.

•Namen(alphabetisch)undE-Mail-AdressenallerPersonen•VersionNr.,Ort,Datum

•kurzesAbstract

AEinleitung:Geben Sie eine kurze Einführung in die Theorie der Massenspektrometrie undbeschreibenSiedieAufgabenstellung.

BMaterialienundMethoden:Verwendete Messinstrumente (inklusive Software) und eine kurze Beschreibung derdurchgeführtenExperimentewerdenaufgeführt.

CErgebnisseundDiskussion:Abbildungen der LDI und MALDI-Spektren aller Substanzkombinationen, so dass alleSignale gut sichtbar sind (falls nötig, bestimmte Ausschnitte als Vergrösserungenseparat darstellen). Im Spektrum sind alle Peaksmit dem vorgeschlagenen FragmentundderMasse zu beschriften.DieAuflösungdesPrecursorsignals (Matrix undAnalytbeiMALDI)solltefürjedesaufgenommeneSpektrumberechnetwerden.Auchsolltefürjedes Spektrum berechnet werden, wieviel von den Substanzen (in pmol) maximalaufgetragenwordenist.


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Diskussion der Vorgehensweise zur Spektrumaufklärung (Precursorsignal undFragment- und Adduktsignale). Die Argumente sollen dabei durch Ausschnitte dergemessenen Spektren und der darin enthaltenen Massenverschiebungen unterstütztwerden.Am Ende sollen die Unterschiede zwischen LDI und MALDI und der verschiedenenMatrices sowie experimentellen Parametern für die gemessenen Verbindungenbesprochenwerden.

CLiteratur:Angabe der verwendeten oder zitierten Literatur: Referenzen in der Reihenfolgeauflisten,inwelcherdieseimTextzitiertwerden.DieNamenallerAutorenderzitiertenPublikation sollen aufgeführtwerden.DieNamender Zeitschriften und dieNummernderBändewerdenkursivgeschrieben.BeispielevonReferenzenzuArtikelninZeitschriften[1],Buchkapiteln[2],Büchern[3],Patenten[4],Computerprogrammen[5]undDissertationen[6].

[1] X.W.,Lou,J.L.J.vanDongen,E.W.Meijer,‘GenerationofCsIClusterIonsforMassCalibrationinMatrix-AssistedLaserDesorption/IonizationMassSpectrometry’,JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrometry,2010,21,7,1223-1226.

[2] H.A.Krässig,in'CelluloseStructure,AccessibilityandReactivity',Ed.M.B.Huglin,GordonandBreachSciencePublishers,Yverdon,1992,Vol.11,p.6

[3] J.H.Gross,‘MassSpectrometry–ATextbook’,2ndEdition,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,2011.

[4] T.Kamata,N.Wasada,Jap.Pat.2-204469,1990,p.381-384.

[5] G.M.Sheldrick,SHELXL97,ProgramfortheRefinementofCrystalStructures,UniversityofGöttingen,Germany,1997.

[6] B.R.Peterson,Ph.D.Thesis,UniversityofCaliforniaatLosAngeles,1994.

DAnhang:Spektren, Liste der verwendetenAbkürzungen undBerechnungen sowie ein Scan desLaborjournals.

Kontakt

TimoNiepel HCID325,34834,[email protected] HCID325,23875,[email protected]


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Appendix I

Punkt Matrix Analyt Polarität Linear/Reflektron A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11

C12


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Punkt Matrix Analyt Polarität Linear/Reflektron D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12


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Punkt Matrix Analyt Polarität Linear/Reflektron G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12