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Praktikum „Zelluläre Biochemie“
am Institut für Biochemie
Goethe-Universität Frankfurt am Main
Max-von-Laue Str. 9
60438 Frankfurt am Main
Gruppe A: 2. – 19.12.2013
Gruppe B: 13. – 30.01.2014
2
Inhaltsverzeichnis
1 Allgemeines ------------------------------------------------------------------------------- 3
2 Abfallentsorgung ------------------------------------------------------------------------ 5
3 Zeitplan ----------------------------------------------------------------------------------- 5
4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls ---------------------------------- 7
5 Bioinformatik --------------------------------------------------------------------------- 12
6 Einführung in Origin ------------------------------------------------------------------ 13
7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern ---------------------------------------------- 21
8 Der Peptidtransporter TAP ---------------------------------------------------------- 31
8.1 Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A) ------------------------------------- 34
8.2 Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B) --------------------------- 39
8.3 Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP (Versuch 1C) ---------- 42
8.4 Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D) ------------------------------------ 45
8.5 Peptidtransportassay (Versuch 1E) -------------------------------------------------------------------- 51
9 Glutathion-S-Transferase ------------------------------------------------------------ 53
9.1 Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A) ------------------------------------------------------- 56
9.2 Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B) -------------------------------------------------------------- 59
9.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C) ------------------------------------------------ 63
9.4 Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D)---------------------------------- 66
9.5 Enzymkinetik (Versuch 2E) ----------------------------------------------------------------------------- 68
9.6 FRET-Messung (Versuch 2F) --------------------------------------------------------------------------- 72
Allgemeines 3
1 Allgemeines
Das Biochemische Praktikum im Rahmen des Praktikums „Zelluläre Biochemie“ dauert 3
Wochen und läuft für alle Gruppen jeweils von Montag bis Donnerstag ab 9.00 Uhr s.t.
(Ausnahmen siehe Zeitplan). Freitag ist jeweils „Riedberg-Tag“ und ist für Vorlesungen
reserviert.
Für die Gruppen A1 – A10 findet das Praktikum vom 2.12. bis 19.12.13 und für die Gruppen
B1 – B11 vom 13.01. bis 30.01.14 im Institut für Biochemie statt.
Vorbereitungs- und Kontrollseminare finden nach Bedarf statt und werden zeitlich günstig in
das Praktikum eingepasst.
Von den Praktikumsteilnehmern wird erwartet, dass sie sich anhand der Skripte auf der
Biochemie Homepage gut auf das Praktikum vorbereiten.
Nach dem Ende des Praktikums liefert jede Gruppe (A1,.....B1,....) ein ausgedrucktes
Gruppenprotokoll getrennt nach Teilversuchen bei den Versuchsbetreuern (TAP 1A–1E und
GST 2A-2E) ab (Deadline: 28.02.14). Jedes Protokoll ist mit einem Deckblatt zu versehen,
auf dem der Teilversuch, die Gruppe und die Teilnehmer vermerkt sind, sowie die
Emailadresse des Verfassers. Die korrigierten Protokolle werden am 21.03.14 persönlich
von den Studenten abgeholt. Endgültige Abgabe der verbesserten Endversion beim Betreuer:
4.04.14. Bei ungenügender Ausarbeitung muss der Praktikumsteil wiederholt werden. Erst die
verbesserte Endversion wird vom Betreuer abgezeichnet und dann bei Dr. Abele archiviert.
Der Protokollaufbau richtet sich nach dem einer Publikation: a. Einleitung, b. Material und
Methoden, c. Ergebnisse, d. Diskussion. Der Teil Material und Methoden darf sehr kurz sein
oder weggelassen werden, muss aber im Falle von Abweichungen vom Skript dringend
detailliert geschrieben werden.
Am letzten Praktikumstag findet eine Präsentation der Ergebnisse statt. Die Powerpoint-
Präsentation umfasst eine Einleitung, in der der Versuch dargestellt wird. Anschließend
werden die Ergebnisse vorgestellt und kritisch diskutiert. Bei Versuchen, bei denen
unterschiedliche Eigenschaften der Proteine untersucht wurden, werden die Ergebnisse aller
Gruppen dargestellt.
Allgemeines 4
Als Abschlussprüfung findet ein ca. 30 minütiges Einzelkolloquium in der Woche vom 17.
– 21.02.14 statt. Die Termine werden vor den Weihnachtsferien bekanntgegeben.
Praktikumsleitung Prof. Robert Tampé
PD. Dr. Rupert Abele
Betreuer Andreas Blees
Markus Braner
Hanna Fischbach
Karl Gatterdam
Volker Gatterdam
Milan Gerovac
Elisa Hain
Irina Jan
Kristin Kiosze
Alina Kollmannsperger
Anne Nöll
Elina Nürenberg
Tina Puth
Katrin Schanner
Sabine Schmidt
Michael Urban
Agnes Wycisk
Abfallentsorgung 5
2 Abfallentsorgung
Zu Beginn der Laborarbeit erfolgt eine Unterweisung in die Laborarbeit. Um den anfallenden
Abfall sachgerecht zu entsorgen, gibt es einen Entsorgungsplan:
Abfallart Entsorgung Ort
Wässrige Säuren und Laugen Kanalisation (nach
Neutralisation)
Waschbecken
Organische Lösungsmittel z.B.
Acetonitril (ohne Feststoffe, Ether und
Schwermetalle)
Weißer 5 L Kanister Abzug Raum 1
Schwermetalle (z.B. Cu, Ni, Fe, Pb, Cd,
Hg)
Schwarzer 10 L Kanister Abzug
Glasbruch Spezialbehälter Unter Waschbecken in Raum 1
Acrylamid (polymerisiert) Hausmül Mülleimer
Mikrobiell verunreinigt autoklavieren Autoklaviertüten in weißen
Ständern (voll? weiße Tonne) +
Autoklav Hausmüll
Pipetten ab 2 ml Desinfektion in Speziallösung weiße runde Behälter auf dem
Boden
Leergut (Glas) Ausgespült oder ausgedampft Lösungsmittellager
Skalpelle, Kanülen, scharfe Gegenstände
(auch mikrobiell verunreinigt)
Gelbe Behälter
autoklavieren
Autoklav
3 Zeitplan
Das Praktikum besteht aus zwei großen Blöcken. Zuerst findet am Montag eine allgemeine
Einleitung statt (Treffpunkt Biozentrum N100 R1.14 um 9 h). Am Montag und Dienstag
wird das Internet als Werkzeug für biochemische Studien vorgestellt und grundlegende
Methoden des Laboralltags durchgeführt. Gruppe 1 – 5 sind morgens an den Computern und
nachmittags im Labor und Gruppe 6 – 11 umgekehrt. Daran schließen sich Experimente mit
dem Peptidtransporter TAP an (Versuch 1). In der zweiten Hälfte des Praktikums werden Sie
biochemische Studien mit dem Fusionsprotein bestehend aus der Gluthationtransferase und
GFP durchführen (Versuch 2). Am letzten Tag findet ein Seminar statt, in dem jede Gruppe
einen Versuch aus dem Praktikum darstellt und noch offene Fragen diskutiert werden. Dabei
stellt jede Gruppe die Ergebnisse aller Gruppen von diesem Versuch vor.
Zeitplan 6
Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag
1. Woche
9 h Einführung1
Bioinformatik3/
Puffer/Medium
Gr. 1 – 5 Bioinf.
Vorm.
Gr. 6 – 11 Bioinf.
nachm.
9 h
Bioinformatik3 /
Puffer/Medium
Gr. 1 – 5 Bioinf.
Vorm.
Gr. 6 – 11 Bioinf.
nachm.
9 h Vortrag1
Gr. 1-11
V 1A
Gr. 1-4 (ab 15 h)
Vorkultur animpfen
9 h
Gr. 1-4 V 1B
Gr. 5-8 V 1C
Gr. 9-11 V 1D
Gr. 1-4
GST Expression
(V 2A)
2. Woche
9 h
Gr. 1-4 V 1E
Gr. 5-8 V 1B
Gr. 9-11 V 1C
Gr. 9-11 (ab 15 h)
Vorkultur animpfen
9 h
Gr. 1-4 V 1D
Gr. 5-8 V 1E
Gr. 9-11 V 1B
Gr. 9-11
GST Expression
Gr. 5-8 (ab 15 h)
Vorkultur animpfen
9 h
Gr. 1-4 V 1C
Gr. 5-8 V 1D
Gr. 9-11 V 1E
Gr. 5-8
GST Expression
(V 2A)
9 h Vortrag1
Gr. 1-11 V. 2B
3. Woche
9 h Labor
Gr. 1/2 V 2E
Gr. 3/4 V 2C
Gr. 5/6 V 2F
Gr. 7/8 V 2D
Gr. 9/10
Gr. 11
13 h
Gr. 1/2 V 2E Auswert
Gr. 3/4 V 2E
Gr. 5/6 V 2F Auswert
Gr. 7/8 V 2F
Gr. 9/10 V 2C
Gr. 11/12 V 2D
9 h Labor
Gr. 1/2 V 2F
Gr. 3/4 V 2E Auswert
Gr. 5/6 V 2E
Gr. 7/8 V 2F Auswert
Gr. 9/10 V 2D
Gr. 11 V 2C
13 h
Gr. 1/2 V 2F Auswert
Gr. 3/4 V 2D
Gr. 5/6 V 2E Auswert
Gr. 7/8 V 2C
Gr. 9/10 V 2E
Gr. 11 V 2F
9 h Labor
Gr. 1/2 V 2C
Gr. 3/4 V 2F
Gr. 5/6 V 2D
Gr. 7/8 V 2E
Gr. 9/10 V 2E Ausw
Gr. 11 V 2F Auswert
13 h
Gr. 1/2 V 2D
Gr. 3/4 V 2F Auswert
Gr. 5/6 V 2C
Gr. 7/8 V 2E Auswert
Gr. 9/10 V 2F
Gr. 11 V 2E
9 h Labor
Gr. 9/10 V 2F Auswert
Gr. 11 V 2E Auswert
Seminarvorbereitung
Gr. 1-8
12:30 h Labor
Aufräumen
13 h
Abschlussseminar2
Gr. 1 V 2F
Gr. 2 V 2E
Gr. 3 V 2D
Gr. 4 V 2C
Gr. 5 V 2B
Gr. 6 V 2A
Gr. 7 V 1E
Gr. 8 V 1D
Gr. 9 V 1C
Gr. 10/11 V 1A/B 1 Treffpunkt N100 R1.14
2 Gruppe A in N100 R1.14; Gruppe B in N100 B2
3 Beilsteinzentrum
Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 7
4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls
Das Abfassen eines Praktikumprotokolls beginnt mit dem Aufschreiben aller Versuchsdetails
wie Versuchsdaten und Versuchsbeobachtungen in einem Laborjournal. Protokollieren Sie
alles sehr sorgfältig, vertrauen Sie nicht auf Ihr Gedächtnis! Da das Laborjounal ein
Dokument ist, ist es empfehlenswert, ein fest gebundenes Heft zu benutzen statt eines
Ringbuchs oder einer losen Blattsammlung und die Seiten alle durchzunummerieren. So
können Sie es auf Verlangen vorzeigen oder abgeben.
Alle Eintragungen in das Laborjournal können stichpunktartig knapp gehalten sein, sofern sie
nur eindeutig und vollständig sind. Im Laborjournal – aber auch nur hier und sonst nirgends –
ist auch Laborjargon (LJ) zulässig. Das krasse Gegenteil gilt für das später
niederzuschreibende, eigentliche Protokoll!
Bei der Erstellung des endgültigen Protokolls sind bestimmte formale und inhaltliche
Standards einzuhalten.
Form und Inhalt des Protokolls
Allgemeines
Das Protokoll sollte mit einem Deckblatt beginnen, das Ihnen zur Verfügung gestellt wird. Es
trägt den Namen des Praktikums und der Universität, sowie den des(r) Ver-fassers(in) und
einige zeitliche Angaben.
Strukturelle Übersichtlichkeit und sprachlicher Stil helfen dem Leser des Protokolls, den
Gang ihrer Experimente und Gedankengänge nachzuvollziehen. Unübersicht-lichkeit und
unnütze kleine Fehler lenken vom Inhalt ab. Deshalb fügen Sie Leerzei-len und Abstände ein,
wo es sinnvoll ist. Schreiben Sie Überschriften fett, gegebe-nenfalls in verschiedenen
Schriftgrößen.
Formulieren Sie wissenschaftlich kurz und prägnant und vermeiden Sie umständliche
Darstellungen in Wort und Länge der Sätze.
Gliederung einer Bachelorarbeit bzw. eines Protokolls:
Jedes Protokoll soll aus den folgenden Abschnitten bestehen:
▪
Titelblatt: Hier wird der Titel der Arbeit, die Art der Arbeit, der Name und das Institut,
an dem die Arbeit verfasst wurde, aufgeführt.
Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 8
Zusammenfassung: Hier wird auf maximal einer Seite das Thema der Arbeit und die
wichtigsten Ergebnisse dargestellt.
Abkürzungsverzeichnis: Hier werden alle verwendeten Abkürzungen aufgeführt
Inhaltsverzeichnis: Angabe der Kapitel mit Seitenangaben
Einleitung: Gibt eine Übersicht über das Thema und leitet zur speziellen Fragestellung
hin.
Motivation: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Welches Problem wurde
untersucht, welche Frage studiert?
▪ Material, Methoden, Versuchsdurchführung: Hier findet sich die Antwort auf die
Frage: Wie wurde die Frage, das Problem bearbeitet?
▪ Ergebnisse: Hier wird die Frage beantwortet: Welche Resultate wurden erzielt?
▪ Diskussion: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Was bedeuten diese Resultate?
▪ Literaturverzeichnis:
▪ Anhang: (wenn nötig)
A. Einleitung
Die Einleitung wird im Präteritum geschrieben. Halten Sie die Einleitung so kurz wie
möglich, aber so informativ wie notwendig. Zur Einleitung gehören auch eventuelle
Formelschemata, also z.B. wie das zu isolierende Enzym ein Edukt in das Produkt
umwandelt. Die Einleitung endet immer mit der kurzen Beschreibung der
Aufgabenstellung auch Motivation genannt.
B. Material, Methoden, Versuchsdurchführung
Unter Material sind aufzählungsartig unter Angabe des vollen Namens, einer
eventuellen Abkürzung, der Bezugsfirma und des Reinheitsgrades die verwendeten
Chemikalien, Biochemikalien und andere Hilfsmittel wie z.B. Platten für die
Dünnschichtchromatographie anzugeben.
Der Teil Methoden wird als einziger im Präsens geschrieben. Methoden müssen
nachvollziehbar und vollständig (reproduzierbar) erläutert werden. Änderungen oder
Varianten müssen klar herausgestellt werden. In dieses Kapitel gehören auch
statistische Auswertungs- und Fit-Methoden und die verwendete Software.
Die Versuchsdurchführung wird in der Vergangenheit geschrieben und beschreibt im
Detail den tatsächlichen Ablauf der Experimente. Halten Sie sich eng an Ihr
Laborjournal und beschreiben Sie, was Sie tatsächlich gemacht haben (nicht etwa, was
Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 9
man machen könnte). Denken Sie auch im Sinne Ihrer Nachfolger an wichtige Details
wie: Welchen Zentrifugentyp habe ich über welche Zeit mit welchem Rotor bei
welcher Drehzahl benutzt. Sehr hilfreich ist hier auch die Angabe der g-Zahl!
C. Ergebnisse
Der Ergebnisteil wird ebenfalls in der Vergangenheit geschrieben. Stellen Sie all Ihre
Ergebnisse in Text und, soweit möglich und notwendig, auch in Abbildungen und
Tabellen dar. Der Leser muss mühelos Text und Inhalt nachvollziehen können.
Untergliedern Sie gegebenenfalls den Ergebnisteil. Klarheit der Darstellung ist
ungemein wichtig. Durch unklare Aussagen überlassen Sie die Interpretation dem
Leser! Stellen Sie im Text einen Bezug her zu Ihren Abbildungen und Tabellen: Dabei
wechseln Sie beim Schreiben in die Gegenwart!
Abbildungen und Tabellen werden grundsätzlich nummeriert und die Legende, die
selbsterklärend sein soll, mit einer Überschrift versehen.
Grundsätzlich müssen die Achsen von Diagrammen vernünftig skaliert, mit der Größe
beschriftet und mit einer Einheit versehen werden. Unterschiedliche Symbole müssen
erklärt werden. Denken Sie daran, dass die Beschriftungen auch nach Einfügen ins
Dokument noch lesbar sein müssen.
D. Diskussion
Die Diskussion kann, wenn Sie es für sinnvoll halten, mit dem Ergebnisteil
zusammengefasst werden. Auch die Diskussion wird im Präteritum geschrieben.
Interpretieren und diskutieren Sie Ihre Ergebnisse jeweils unter Verweis auf die
entsprechende Textstelle (Abb., Tab.). Lassen Sie sich von der Frage leiten: Wo
können aufgrund der gewählten Methodik Fehler in der Durchführung auftreten?
Dabei ist Denkarbeit erforderlich! Nicht immer können „komische Werte“ einfach auf
fehlerhafte Geräte, fehlerhaftes Material oder mögliche Fehler beim Pipettieren
geschoben werden! Bei der Diskussion ist es elementar wichtig, auf bestehende
Literatur zurückzugreifen und die erzielten Ergebnisse in einen größeren Kontext zu
setzen.
E. Literaturverzeichnis
Sobald Sie im Text Informationen aus der Literatur verwenden, müssen Sie die
entsprechende Literatur zitieren. Im Text nennen Sie dabei nur die Autoren und die
Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 10
Jahreszahl (z.B. Tampé 2005). Bei mehr als zwei Autoren schreiben Sie „et al.“ hinter
den Erstautor (z.B. Tampé et al. 2006).
Die verwendeten Literaturzitate müssen unter Angabe der erforderlichen Details im
Literaturverzeichnis aufgeführt werden.
Beispiel: BEISMANN-DRIEMEYER, S. und TAMPE, R. (2004): Funktion der
Antigen-Transportmaschinerie TAP im zellulären Immunsystem – Angew. Chemie
116, 4104-4122.
Das Literaturverzeichnis kann alphabetisch nach Erstautor aber auch nach Erscheinen
im Text sortiert werden. Zur Erstellung des Literaturverzeichnisses empfiehlt sich das
Programm Citavi (kostenlos auf der Uni Homepage). Kontrollieren sie das
Literaturverzeichnis auf Fehler, denn nicht immer ist alles richtig abgespeichert. Bei
der Verwendung von Abkürzungen von Zeitschriften, muss die international
anerkannte Liste von „Web of Science“ verwendet werden. Auch da ist wieder zu
unterscheiden ob die Abkürzungen mit oder ohne Punkt enden.
F. Anhang
In manchen Fällen folgt noch ein Anhang, der meistens aus längeren Tabellen mit
Messdaten oder größeren Abbildungen besteht.
Schluss
Versuchen Sie beim Schreiben Ihres Protokolls vollständige und klare Sätze zu formulieren.
Lesen Sie den Text nach Fertigstellung auf Plausibilität, Aufbau und Formulierung sowie auf
Rechtschreibfehler nochmals durch und/oder bitten Sie jemand um Hilfe! Vermeiden Sie
ständige Wiederholungen, das langweilt den Leser.
Abbildungen
Jede Abbildung muss klar und deutlich sein. Die Beschriftung muss leserlich sein. Bei
Diagrammen hat jede Achse einen Titel mit Angabe der untersuchten Größe und Einheit. Jede
Abbildung hat eine logische Nummer und auch eine Überschrift. Wobei auf die Abbildung im
Text verwiesen wird. In der Legende muss soviel Information vorhanden sein, damit die
Abbildung ohne Lesen des Textes verständlich ist. Bei einem Western-Blot muss somit die
Menge an geladenem Protein, die Prozentzahl des SDS-Gels sowie die Antikörper spezifiziert
werde. Bei einer Säulenchromatographie muss das Laufmittel, der mögliche Gradient, die
Säule sowie die Menge an analysiertem Stoff angegeben werden. Auch die
Detektionswelllänge und die Flussrate sind zu nennen.
Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 11
Bemerkung
Wenn es sinnvoll erscheint, sind Abweichungen von diesen Richtlinien erwünscht, Kreativität
wird nicht bestraft!
Bioinformatik 12
5 Bioinformatik
Die Bioinformatik ist mittlerweile ein wichtiger Teil der biochemischen Forschung. Mit Hilfe
der Bioinformatik kann gezielt Literatur gesucht werden und DNA- und Proteinsequenzdaten
analysiert und verglichen werden.
In diesem Teil des Praktikums sollen Sie eine Übersicht über die wichtigsten Server und
Programme bekommen, die für die tägliche Arbeit hilfreich sind.
Wichtige Internetadressen für Biochemiker:
www.ncbi.nlm.nih.gov (National Center for Biotechnology informatiom)
www.rcsb.org/pdb (Brookhaven Protein data bank)
www.ebi.ac.uk/services (European Bioinformatics Institute)
http://www.embl.de/services/bioinformatics/index.php (EMBL Heidelberg)
www.expasy.org (ExPASy Proteomics server)
http://isiknowledge.com (web of science)
http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php (webcutter)
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html (Primer Design)
http://www.genebee.msu.ru/clustal/ (ClustalW/phylogenetischer Baum)
http://ezb.uni-regensburg.de/fl.phtml?bibid=UBFM (online Zugriff auf Zeitschriften)
Aufgabe
Literatur:
1. Suchen Sie die Veröffentlichung über TAP von P. Cresswell, die in Nature
veröffentlicht wurde.
2. Wieviele Veröffentlichungen über TAP erschienen in „Journal of Biologcal
Chemistry“?
3. Wie oft wurde folgende Veröffentlichung zitiert:
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE
UNITED STATES OF AMERICA 98 (13): 7241-7246 JUN 19 2001
4. Suchen Sie verwandte Publikationen.
DNA-Sequenz:
1. Suchen Sie die DNA-Sequenz von humanem TAP1.
2. Bestimmen Sie die Schnittstelle mit dem Restriktionsenzym DraIII.
3. Translatieren Sie die Sequenz und schneiden Sie die Proteinsequenz zurecht, so dass
ein Protein mit 748 Aminosäuren entsteht (N-Terminus: MASSRCPAPR; C-
Terminus: QAPADAPE)
Protein-Sequenz:
1. Bestimmen Sie den pI, Molekulargewicht, Extinktionskoeffizienten und die
Membrantopologie von TAP1.
2. Finden Sie in ABC-Transporter konservierte Sequenzen.
3. Finden Sie zu TAP1 homologe Proteine aus Säugetieren, Fischen und Vögel.
4. Erstellen Sie einen Sequenzvergleich.
5. Erstellen Sie einen phylogenetischen Baum.
Einführung in Origin 13
6 Einführung in Origin
Diese Anleitung dient dazu die grundlegenden Eigenschaften von Origin kennen zu lernen.
Eine detaillierte Anleitung gibt es als pdf File von OriginLab. Für das Praktikum werden drei
verschiedene Funktionen von Origin benötigt.
1. Arbeiten mit Tabellen (Workbooks in Origin)
Importieren von Daten
Modifizieren von Tabellen
Daten exportieren
2. Erstellen von Graphen
Erstellen verschiedener Graphen
Hinzufügen von Daten in einen Graph
Exportieren von Graphen
3. Kurven fitten
Linearer Fit
Nicht-linearer Fit
Erstellen eigener Gleichungen
Erstellen eines einfachen Graphen
Workbook
Das Workbook stellt die oberste Struktur zur
Organisation der Daten dar. Jedes Workbook
besteht aus mehreren Worksheets und jedes
Worksheet enthält Spalten von Daten. Es gibt
verschiedene Datenspalten wie X. Y, Z yError
etc..
Um zu verstehen wie man mit dem Workbook umgeht, versuche folgendes:
1. Wähle Datei: Neu: Workbook
2. Wähle Datei: Import: Simple ASCII und öffne in \Samples\Curve Fitting die Datei
Gaussian.dat.
3. Das Worksheet bekommt den Namen der Datei und in Sparkline gibt es eine kurze
Übersicht über die Kurvenform. Unter Langname wird angegeben was dargestellt wird
(stellt auch die Achsenbeschriftung dar). Um die Spalte C als FY-Fehler Spalte zu
markieren, mit rechter Maustaste auf den Spaltentitel klicken, Setzen als :Y
Fehlerbalken auswählen.
Einführung in Origin 14
4. Um die Daten in einem Graphen darzustellen, werden alle Daten markiert: Zeichnen:
Symbol: Punktdiagramm auswählen.
5. Alternativ die Spalten nicht markieren und Zeichnen: Symbol: Punktdiagramm
auswählen. Es erscheint folgendes Fenster, in dem die X- und Y-Daten getrennt
ausgewählt werden können.
6. Um die Darstellung des Graphen zu verändert, muss man auf eine Achse doppel-
klicken.
Einführung in Origin 15
7. Um ein erstellten Graphen als Template zu benutzen, muss dieses Format gespeichert
werden: Datei: Template Speichern unter.
8. Es gibt zwei Möglichkeiten Graphen zu exportieren:
a) Als Grafikdatei, dabei bietet sich das WMF Format an: Datei: Export
b) Direkt ins Dokument kopieren, wodurch der Graph auch noch verändert werden
kann.
Einführung in Origin 16
Erstellen eines Linearen Fits
1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.
2. Graph erstellen.
3. Linearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Linearer Fit: Dialog öffnen. Hier können
die Fitoptionen eingestellt werden. Bei einem Linearen Fit ist vor allem zu beachten, ob
die Gerade durch den Nullpunkt geht oder nicht.
4. Im Worksheet: FitLinear1 werden die Fitparameter und die Statistik aufgelistet. Aus
dem Fit werden folgende Parameter erhalten Steigung und Schnittpunkt mit der Y-
Achse samt Standardfehler. Zusätzlich wird in der Statistik noch die Qualität des Fits
bewertet durch z.B. den Korrelationskoeffizienten. Wichtig ist das Diagramm mit den
Residuen zu analysieren, denn hier sieht man am besten systematische Abweichungen,
die auf eine falsche Fitfunktion oder Probleme in der Messung schließen lassen. Die
Residuen stellen die Abweichung der Datenpunkte von der Fitfunktion dar.
Einführung in Origin 17
Erstellen eines Nichtlinearen Fits
1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.
2. Graph erstellen.
3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Hier
können unter Kategorie und Funktion die verschiedenen Gleichungen für die
Fitoptionen ausgewählt werden. Hierbei ist vor allem auf die richtige Gleichung und die
Gewichtung der Fehler beim Fitten zu achten.
4. Falls Daten wissentlich aus dem Fitprozess genommen werden können, so werden sie
maskiert: Daten: Datenpunkte maskieren und im Graph anklicken
Einführung in Origin 18
Erstellen einer eigenen Gleichung
1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.
2. Graph erstellen.
3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Eine
Kategorie auswählen und unter Funktion <Neu…> anklicken. Den Funktionsname
und Funktionstyp definieren. Anschließend die Variablen und Parameter definieren. Es
empfiehlt sich auch Konstanten als Parameter zu definieren. Die Funktion wird
eingegeben (Form: y=m*x + 5).
4. Vor dem Fitten Parameter anklicken und definieren, ob es sich um veränderliche
Parameter handelt oder um Konstanten mit festem Wert.
Einführung in Origin 19
Fitten mit logarithmischen Skalen
Beim Fitten von Inhibitionskurven, bei denen die X-Achse in log10-Skala dargestellt wird,
gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder werden die Konzentrationen auf der X-Achse in log10-
Werte transformiert oder man benutzt eine selber verfasste Gleichung. Die zweite
Möglichkeit erlaubt anschließend die X-Achse in einer sinnvolleren logarithmischen Skala
darzustellen.
Darstellung mit transformierten X-Werten
1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.
2. Spalte hinzufügen: Spalte: Spalte hinzufügen
3. Transformation der X-Werte: Spalte: Spaltenwerte errechnen. Zur Transformation der
A(X)-Werte gibt man nun in das geöffnete Dialogfeld ein: log(Col(A)).
4. Erstellen eines Punktdiagramms mit den transformierten X-Werten (C(X2)).
5. Fitten der Daten mit sigmoidaler Funktion: Kategorie Pharmacology; Funktion
Doseresp
Einführung in Origin 20
Darstellung mit linearer X-Achse
1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten, Langname und Einheiten definieren.
2. Punktdiagramm erstellen.
3. X-Achse in Log10-Darstellung ändern:
4. Die bestehende DoseResp Funktion kopieren (anklicken von f(x), dann duplizieren)
und in folgende Funktion ändern:
y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-(log10(x)))*p)),danach speichern
5. Fitten mit dieser Formel.
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 21
7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern
Theoretischer Teil
Sehr kleine Mengen einer starken Säure oder einer starken Base reichen aus, die
Konzentration der Wasserstoffionen in Wasser im schwach sauren, neutralen oder schwach
alkalischen Gebiet erheblich zu verändern. Der Zusatz eines Tropfens konzentrieter Säure zu
einem Volumen reinen Wassers macht dieses deutlich sauer, beim Zufügen eines Tropfens
konzentrierter Alkalilauge wird die Lösung deutlich basisch. Gleichwohl gibt es Lösungen,
deren Wasserstoffionenkonzentration sich bei Zusatz auch größerer Mengen starker Säure
oder starker Base nur recht wenig ändert. Man bezeichnet solche Lösungen als gepuffert.
Pufferlösungen
Im Stoffwechsel laufen zahlreiche Reaktionen ab, bei denen H+-Ionen freigesetzt oder
verbraucht werden. Andererseits ist ein konstanter pH-Wert im Zytoplasma oder in
bestimmten Körperflüssigkeiten, wie z.B. dem Blut, lebenswichtig. Schon leichte
Abweichungen können zu schweren Krankheitssymptomen führen.
Stoffwechsel bedingte pH-Änderungen müssen also abgepuffert werden. Im Blut wird diese
Funktion von verschiedenen Puffersystemen wahrgenommen.
Allgemein werden Lösungen, deren pH-Wert sich bei Zugabe von Säure oder Lauge nur
wenig verändert, als Pufferlösungen bezeichnet. Sie enthalten ein konjugiertes Säure-Base-
Paar, wobei die Säure OHˉ-Ionen neutralisiert, die Base H+-Ionen.
Pufferlösungen lassen sich herstellen, indem man
▪ schwache Säuren mit ihrem Salz (z.B. Acetatpuffer aus Essigsäure und
Natriumacetat) bzw.
▪ schwache Basen mit ihrem Salz (z.B. Ammoniumpuffer aus Ammoniumchlorid und
Ammoniak) mischt.
Sind beide Spezies in genügend großer Konzentration vorhanden, reagiert der Acetatpuffer
so:
H3O+ + CH3COOˉ CH3COOH + H2O
Pufferung bei Zugabe starker Säure
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 22
Die zugegebene starke Säure reagiert vollständig zu HOAc. Dass der pH-Wert sich dennoch
geringfügig ändert, hat damit zu tun, dass die gebildete Essigsäure wieder zu einem geringen
Anteil dissoziieren kann.
OHˉ + CH3COOH CH3COOˉ + H2O
Pufferung bei Zugabe starker Base
Die Pufferwirkung zeigt sich in der Titrationskurve schwacher Säuren und Basen durch das
Plateau im Bereich des pK-Wertes, ist also der Grund für den geringen Anstieg der
Titrationskurve der Essigsäure bei pH 4 bis 6.
Ähnlich verläuft die Abpufferung starker Säuren und starker Laugen durch den
Ammoniumpuffer:
H3O+ + NH3 NH4+ + H2O
Pufferung bei Zugabe starker Säure
OHˉ + NH4+ NH3 + H2O
Pufferung bei Zugabe starker Base
In dieser Form wird der Ammoniumpuffer allerdings nur in Ausnahmefällen benutzt.
Dagegen sind Derivate des Ammoniaks wie z.B. als Triethanolammoniumpuffer und
Triethylammoniumpuffer häufig in Gebrauch (s. unten).
Puffergleichung
Das Verhalten einer Pufferlösung lässt sich auch quantitativ beschreiben. Ausgehend vom
Massenwirkungsgesetz für die Dissoziation einer Säure ergibt sich für den Acetatpuffer:
+
=S
[H ] [CH COO ]3K
[CH COOH]3
Durch Umformung erhält man:
= S
[CH COOH]3[H ] K
[CH COO ]3
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 23
Durch Logarithmieren:
= S
[CH COOH]3pH pK log
[CH COO ]3
Die Gleichung zeigt, dass der pH-Wert der Pufferlösung vom pKS-Wert der Essig-säure und
vom Verhältnis Essigsäure/Acetat bestimmt wird. In allgemeiner Form ist die Puffergleichung
als Henderson-Hasselbalch-Gleichung bekannt.
-
= S
[ A ]pH pK log
[HA]
Liegt zum Beispiel in einem Acetat-Puffer Essigsäure in einer Konzentration von 0,1 mol/L
und Acetat mit 0,5 mol/L vor, so lässt sich mit Hilfe der Puffergleichung der pH-Wert
bestimmen:
= 0,5
pH 4,8 log = 5,50,1
Liegen Säure und konjugierte Base in gleicher Konzentration vor, so ist [HA]/[Aˉ] = 1 und
die Puffergleichung wird zu pH = pKS. Die Pufferlösung kann bei diesem pH-Wert Zugaben
von Säuren und Basen gleich gut abpuffern Liegt die Säure in zehn-fach höherer
Konzentration vor, so gilt pH = pKS – 1. Der Puffer wirkt dann effektiv gegen die Zugabe von
Basen, kann aber nur noch geringe Mengen Säure abpuffern. Als Faustregel gilt deshalb für
den optimalen Einsatzbereich von Pufferlösungen:
pH = pKS ± 1
Da sich der Pufferbereich in der Titrationskurve deutlich abzeichnet, lässt sich an-hand von
Titrationskurven der pKS-Wert schwacher Säuren oder Basen ermitteln (geringste Steigung
der Kurve).
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 24
Beispiel 1: Phosphatpuffer
Phosphorsäure dissoziiert über drei Stufen:
H3PO4 + H2O H2PO4ˉ + H3O+ pKS1 = 2,0
H2PO4ˉ + H2O HPO42ˉ + H3O
+ pKS2 = 7,2
HPO42ˉ + H2O PO4
3ˉ + H3O+ pKS3 = 12,3
Die pK-Werte machen deutlich, dass die Protonenabgabe nach jeder Stufe schwieriger wird.
H3PO4 ist eine mittelstarke Säure, während H2PO4ˉ eine schwache und HPO42ˉ eine sehr
schwache Säure ist. Entsprechend sind die Plateaus der Titrationskurve verteilt.
Zu Beginn der Titration liegt der pH bei etwa 1,5. Die Lösung enthält fast nur die Spe-zies
H3PO4 und H2PO4ˉ. Durch die Zugabe der Natronlauge werden sukzessive die H3PO4-
Moleküle in H2PO4ˉ-Ionen überführt, bis beim ersten Äquivalenzpunkt (ÄP1) fast nur noch
H2PO4ˉ-Ionen vorliegen. Beim zweiten Äquivalenzpunkt (ÄP2) liegen nur noch HPO42ˉ-Ionen
vor und beim dritten (ÄP3) nur noch PO43ˉ, wobei der dritte Äquivalenzpunkt keine markante
Steigung aufweist, weil er in den pH-Bereich des Titrationsmittels Natronlauge fällt (0,1 M
NaOH hat einen pH-Wert von 13). Das Pla-teau im Bereich des pKS2 basiert auf der
Pufferung durch das konjugierte Säure-Base-Paar H2PO4ˉ/HPO42ˉ. In der Praxis wird der
Phosphatpuffer häufig verwendet, um neutrale pH-Bereiche einzustellen, denn nach pH = pKS
± 1 liegt der Pufferbe-reich zwischen pH 6,2 und 8,2.
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 25
Beispiel 2: Kohlensäurepuffer
Kohlendioxid (CO2) und Wasser sind die mengenmäßig wichtigsten Endprodukte des
Stoffwechsels. In Wasser gelöstes Kohlendioxid reagiert zur zweiprotonigen Kohlen-säure
(1), die in einer Nachfolgereaktion dissoziiert (2).
(1) CO2 + H2O H2CO3 pK = 3,1
(2) H2CO3 + H2O HCO3ˉ + H3O+ pKS1 = 3,3
Gesamtreaktion:
CO2 + 2 H2O HCO3ˉ + H3O+ pK = 6,4
Das Gleichgewicht der ersten Reaktion liegt auf der linken Seite (pK = 3,1). Löst man also
Kohlendioxid in Wasser, so liegt es vorwiegend als CO2 und nur zu einem gerin-gen Teil als
H2CO3 vor.
Reaktion (1) und (2) lassen sich zusammenziehen und die pK-Werte addieren. Das
Gleichgewicht der Gesamtreaktion liegt noch stärker auf der linken Seite: gelöstes
Kohlendioxid reagiert als schwache Säure. Die konjugierte Base ist das Hydrogen-carbonat.
Kohlendioxid und Hydrogencarbonat bilden ein Puffersystem mit einem pH-Optimum bei pH
= 6,4.
-
3=
2
[HCO ]pH 6,4 log
[CO ]
Das Kohlendioxid-Hydrogencarbonat-Puffersystem ist das bedeutendste Puffersystem des
Blutes, das auf einen pH von 7,4 gepuffert ist. Das Konzentrationsverhältnis der
Puffersubstanzen bei pH 7,4 lässt sich somit berechnen:
S
-(pH pK ) 1 3
=
2
[HCO ] 1010 10 =
[CO ] 1
Da die Reaktionskonstante aber temperaturabhängig ist, der pKS der Gesamtreaktion im Blut
bei 37°C 6,1 statt 6,4 bei 25°C beträgt, wird das Konzentrationsverhältnis dann zu:
-1,3 3
=
2
[HCO ] 2010 =
[CO ] 1
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 26
Es liegt also ein Überschuss an Hydrogencarbonat vor, so dass das Puffersystem vor allem
gegen H3O+-Ionen wirkt. Da CO2 ein Gas ist, steht das gelöste CO2 im Gleich-gewicht mit
dem CO2 der Luft in der Lunge. Hier zeigt sich eine Besonderheit dieses Puffersystems. Es
kann nämlich nicht nur H3O+-Ionen am Entstehungsort abpuffern, sondern auch das
Reaktionsprodukt aus dem Gleichgewicht entfernen:
H3O+ + HCO3ˉ → CO2 ↑ + 2 H2O
Der senkrechte Pfeil deutet an, dass das Kohlendioxid die Lösung verlässt und in die
Gasphase geht (das System verlässt). Man spricht deshalb auch von einem offenen
Puffersystem.
Praktischer Teil
1. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) pH 8,0
(HO-CH2-)3C-NH2 + H3O+ (HO-CH2-)3C-NH3
+ + H2O
FgTRIS 121,14
pK 8,1
Menge: 0,5 L
Einwage: ? g Tris
pH einstellen mit HCl
2. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) pH 7,5
(HO-CH2-)3C-NH2 + H3O+ (HO-CH2-)3C-NH3
+ + H2O
FgTRIS 121,14
pK 8,1
Menge: 0,5 L
Einwage: ? g Tris
pH einstellen mit HCl
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 27
3.a Dinatriumhydrogenphosphat/NaCl/KCl
Zunächst muss eine 1 M KCl-Lösung hergestellt werden.
FgKCl 74,55
Menge: 100 mL
Einwage: ? g KCl
Na2HPO4 14,2 g Molarität: ? M
NaCl 81,82 g Molarität: ? M
KCl (1 M) 13,25 mL Molarität: ? M
Auffüllen auf 1000 mL mit Wasser.
FgNaCl 58,44
FgNa2HPO4 141,96
3.b Natriumdihydrogenphosphat/NaCl/KCl
NaH2PO4 x H2O 2,84 g Molarität: ? M
NaCl 13,36 g Molarität: ? M
KCl (1 M) 2,65 mL Molarität: ? M
Auffüllen auf 200 mL mit Wasser.
FgNaH2PO4 x H2O 137,99
3.c 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4
Der 10x PBS-Puffer wird hergestellt, indem ein vorgelegtes Volumen von 1000 mL
Puffer Nr. 3a mit Puffer Nr. 3b auf pH 7,4 eingestellt wird.
4. 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5):
300 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung (Na2HPO4)
500 ml 0,1 ml Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (KH2PO4)
KH2PO4 wird vorgelegt und der pH von 6,5 mit 0,1 M Na2HPO4 eingestellt
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 28
5. 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0
(HOOC-CH2-)2N-CH2-CH2-N(-CH2-COOH)2
EDTA + Mg2+ Mg2+EDTA + 2 H+
FgEDTA 292,24
Menge: 0,4 L
Einwage: ? g EDTA
pH einstellen mit NaOH
6. 50 mM HEPES pH 7,4
4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure
FgHEPES 238,3
pK 7,5
Menge: 0,1 L
Einwage: ? g Hepes
pH einstellen mit NaOH
7. TBS pH 8.0:
50 mM Tris ? g FgTRIS 121,14
150 mM NaCl ? g FgNaCl 58,44
pH 8.0 eiskalt!
Menge: 4 L
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 29
8. Regenerationspuffer 1 (GST Versuch)
0,5 M Tris ? g FgTRIS 121,14
0,5 M NaCl ? g FgNaCl 58,44
pH 8.5
Menge: 0,5 L
Regenerationspuffer 2 (GST Versuch)
0.5 M Tris ? g
0,5 M NaCl ? g
pH 4.5
Menge: 0,5 L
9. Elutionspuffer GST Versuch
TBS (Puffer 8) + 10 mM GSH (Kühlschrank)
Einwage: ? g GSH FgGSH 307,32
pH 8.0 muss neu eingestellt werden, eiskalt
Menge: 200ml; IM KÜHLSCHRANK LANGERN
Anleitung zum Ansetzen von Puffern 30
10. LB Medium
je Liter:
5g Hefeextrakt
5g NaCl
10g Trypton/Pepton Mischung
Menge: insgesamt 3,6 Liter, aufteilen in:
6 x 250ml Kolben (mit Schikane) mit je 100 ml LB-Medium
6 x 2l Kolben (mit Schikane) mit je 500ml LB-Medium
Autoklavieren!
Der Peptidtransporter TAP 31
8 Der Peptidtransporter TAP
Der Peptidtransporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt eine
zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort (Abbildung 1). TAP transportiert Peptide, die
vornehmlich durch proteasomale Degradation von endogenen Proteinen erzeugt wurden, vom
Zytosol ins Endoplasmatische Rekikulum. Dort binden diese Peptide an MHC (major
histocompatibility complex) I Moleküle. Peptidbeladene MHC I Moleküle werden an die
Zelloberfläche transportiert, um dort cytotoxischen T-Zellen die antigene Fracht zu
präsentieren. Erkennt eine T-Zelle ein MHC I gebundenes Peptid so führt dies zur
Eliminierung dieser Virus infizierten oder entarteten Zelle.
Abbildung 1: MHC I abhängige Antigenpräsentation. Bei der klassischen MHC I Antigenpräsentation
werden endogene Proteine vornehmlich durch das Proteasom degradiert. Die Peptide werden mit Hilfe von TAP
ins Lumen des ER transportiert und dort auf MHC I Moleküle geladen. Anschließend werden die MHC I-
Peptidkomplexe an der Zelloberfläche cytotoxischen T-Zellen präsentiert. Die Faltung, Assemblierung und
Beladung der MHC I Moleküle wird durch mehrere Chaperone gesteuert.
TAP gehört der Familie der ABC-Transporter an. TAP bildet einen Heterodimer bestehend
aus TAP1 und TAP2 (Abbildung 2). Jede Untereinheit ist aus einer N-terminalen
Transmembrandomäne (TMD) und einer C-terminalen Nukleotidbindungsdomäne, die sich
im Zytosol befindet, aufgebaut. Die TMD von TAP1 besteht aus 10 und von TAP2 aus 9
Transmembranhelizes. Die TMD bildet sowohl die Translokationspore und die
Der Peptidtransporter TAP 32
Peptidbindungsregion. Die NBD bindet über konservierte Sequenzmotive ATP und treibt
durch die ATP-Hydrolyse den Peptidtransport an.
TAP1
ER Lumen
Zytosol
TAP2
N
N
C C
Peptidbindungsregion
1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1
KerndomäneN-Domäne Kerndomäne N-Domäne
Nukleotid-
bindungs-
domäne
Transmebran-
domäne
TAP1
ER Lumen
Zytosol
TAP2
N
N
C C
Peptidbindungsregion
1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1
KerndomäneN-Domäne Kerndomäne N-Domäne
Nukleotid-
bindungs-
domäne
Transmebran-
domäne
Abbildung 2: Topologiemodell des TAP-Komplexes. TAP besteht aus den zwei Halbtransportern TAP1 und
TAP2, die je aus einer TMD und einer NBD aufgebaut sind. Die sechs C-terminalen Transmembranhelices
bilden die Kerndomäne. Die äußeren Helices sind nicht essentiell für die Transportfunktion, sondern sind an der
Rekrutierung von Tapasin beteiligt. Die Peptidbindungsregion ist gelb dargestellt.
Eine Vorraussetzung für den Peptidtransport ist die Bindung des Peptids an TAP. Im
Gegensatz zum Peptidtransport, der die ATP-Hydrolyse zwingend erfordert, ist die
Peptidbindung ATP-unabhängig. TAP bindet vorzugsweise Peptide mit einer Länge von 8 –
16 Aminosäuren, wobei die höchste Transporteffizienz für 8 – 12 Aminosäuren lange Peptide
erzielt wird. Allerdings werden auch Peptide mit einer Länge bis zu 40 Aminosäuren so wie
sterisch anspruchsvolle Peptide, die Modifikationen an den Seitenketten tragen, von TAP
erkannt und transportiert.
Mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken wurde die Peptidspezifität von TAP im
Detail untersucht. Demnach sind für die Erkennung der Peptide die drei N-terminalen und die
C-terminale Aminosäuren von Bedeutung. Da die Spezifität des C-terminalen Restes sowohl
für das Immunproteasom, TAP und auch MHC I übereinstimmt, geht man von einer
Koevolution dieser drei Faktoren der Antigenpräsentation aus. Die unterschiedliche Spezifität
von MHC I und TAP bzgl. des N-Terminus des Peptids führt dazu, dass im ER-Lumen ein
Trimmen durch Exopeptidasen erfolgt. Der mittlere Bereich des Peptides, welcher
vornehmlich an der T-Zellrezeptorbindung beteiligt ist, kann höchst divergent sein in Bezug
auf MHC I und TAP-Bindung. Dadurch wird gewährleistet, dass eine kleine Menge von
Der Peptidtransporter TAP 33
Peptidtransportern und MHC I Molekülen eine sehr große Peptiddiversität darstellen kann,
um den Körper vor einem viralen Angriff zu schützen.
Im Rahmen dieses Praktikums sollen die enzymatischen Eigenschaften von TAP, wie z.B. die
Kinetik der Peptidbindung, die ATP-Bindung und der ATP-getriebene Transport
charakterisiert werden. Dazu müssen TAP-haltige Membranen aus Insektenzellen isoliert
werden und die Peptide für die kinetischen Untersuchungen mit Fluorophoren markiert
werden.
Der Peptidtransporter TAP 34
8.1 Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A)
Humanes TAP, bestehend aus TAP1 und TAP2, wird mit Hilfe des Baculovirus, der die Gene
für TAP1 und TAP2 trägt, in Sf9 Insektenzellen exprimiert. Bei dem Baculovirus handelt es
sich um ein DNA-Virus, der der Familie der Baculoviridae angehört. Dieses Virus befällt
Endothelzellen des Mitteldarms von bestimmten Insekten wie Spodoptera frugiperda. Das
Baculovirusgenom besteht aus einer zirkulären, doppelsträngigen, 130 kb langen DNA. Die
Gene für TAP1 und TAP2 befinden sich auf dem Baculovirusgenom hinter dem Polyhedrin-
und P10-Promotor. Beides sind starke Promotoren, die schon kurz nach der Infektion
angeschaltet werden. Ca. 24 h nach der Infektion ist TAP im Western Blot nachweisbar. Die
Ernte der Zellen erfolgt ca. 48 h nach der Infektion. Längere Expressionszeiträume sind
ungünstig, da proteolytische Degradationsprodukte von TAP auftreten. Die Insektenzellen
werden bei einer Zelldichte von 1.8 * 106 Zellen pro ml mit einer MOI 3-5 (muliplicity of
infection, gibt das Verhältnis von Virus zu Zellen an) infiziert. Die Zellen werden nach 48h
geerntet, einmal mit PBS gewaschen und das Zellpellet bei -20 °C gelagert.
Um biochemische Versuche mit TAP durchführen zu können, werden TAP-haltige
Membranen hergestellt. Dabei werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen, nicht
aufgeschlossene Zellen, Zelltrümmer und Nuclei werden durch Zentrifugation bei niedrigen
g-Zahlen entfernt. Anschließend werden die Membranen durch eine
Ultrazentrifugationsschritt aufkonzentriert und bei -80 °C gelagert.
Material
20 mM Tris/HCl, pH 7,4
1 M DTT
2,5 M Sucroselösung
1×PBS (Phosphate buffered saline)
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
pH 7,0
Der Peptidtransporter TAP 35
Protease-Inhibitoren
250 mM Benzamidin in H2O
100 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in Isopropanol
Protokoll
Alle Schritte werden auf Eis oder bei 4°C (Zentrifugationen) durchgeführt.
Das Pellet einer 300 ml Sf9-Insektenzellkultur wird auf Eis aufgetaut und in 20 ml Tris-Puffer
aufgenommen, 1% (v/v) Proteaseinhibitoren und 1 mM DTT werden zugegeben. Die Zellen
werden in einem Dounce-Homogenisator durch Hoch-und Runterziehen (40×) des Pistills
(tight) aufgeschlossen. Die Suspension wird mit 2,5 M Sucroselösung zu einer
Endkonzentration von 250 mM Sucrose versetzt, noch 3x gedouncet und in ein 50 ml
Falconröhrchen überführt. Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer werden mittels
Zentrifugation pelletiert (4 min bei 200×g und 8 min bei 700×g). Der Überstand wird in ein
UZ-Röhrchen überführt und 20 min bei 20.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird
verworfen und das Pellet in 2 ml 1×PBS resuspendiert. 50-100 µl Aliquots werden in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
Protein-Bestimmung: BCA-Assay (Versuch 1A)
Die Konzentration des Gesamtproteins wird mit Hilfe eines Bicinchoninsäure (BCA) Assays
bestimmt. Der sensitive, kolorimetrische Nachweis von Proteinen bei diesem Assay resultiert
aus der Reduktion von Cu2+
zu Cu+
durch die Peptidbindung und bestimmte Aminosäuren.
BCA bildet mit dem reduzierten Kupfer einen Farbkomplex, dessen Absorption bei 584 nm
gemessen wird.
Der BCA-Test wird nach Anleitung des Herstellers (Fa. Pierce) durchgeführt. Die
Standardkurve mit 7 Punkten wird wie folgt zusammenpipettiert:
Verdünnung PBS BSA-Quelle BSA Endkonzentration µg/ml
A 1000 µl 53 µl stock [2 mg/ml] 100 µg/ml
B 100 µl 300 µl Verdünnung A 75 µg/ml
C 375 µl 375 µl Verdünnung A 50 µg/ml
D 375 µl 375 µl Verdünnung C 25 µg/ml
E 375 µl 375 µl Verdünnung D 12,5 µg/ml
F 375 µl 375 µl Verdünnung E 6,25 µg/ml
G 375 µl - 0 µg/ml
Der Peptidtransporter TAP 36
Die zu messenden Proben werden in verschiedenen Konzentrationen vermessen: 1:10, 1:100,
1:200, 1:500 und 1:1000 verdünnt in PBS. Die Anzahl der einzelnen Messungen des BCA-
Testes wird berechnet und die Färbelösung laut folgender Formel angesetzt (pro Messung
werden 150 µl Färbelösung benötigt). Alle Proben und Standardpunkte werden in Duplikaten
vermessen.
Ansatz der Färbelösung
25 Teile Komponente A
24 Teile Komponente B
1 Teil Komponente C Gesamt 50 Teile
Aufgrund von Pipettierfehlern wird empfohlen, 10 % mehr Färbelösung als benötigt
anzusetzen.
150 µl angesetzte Färbelösung und 150 µl verdünnte Probe werden in einer Mikrotiterplatte
gemischt. Die Platte wird mittels Parafilm vor Verdunstung geschützt und für 30 min bei 37
°C inkubiert. Anschließend werden die Absorptionen am Fluostar bei einer Wellenlänge von
584 nm ermittelt und die Proteinkonzentration berechnet.
Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid (Versuch 1A)
Der Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid dient der Quantifizierung
von TAP in den Membranen. Aufgrund der Tatsache, dass in Membranen gegen einen großen
Hintergrund von Proteinen gearbeitet wird, bietet dieser Assay die Möglichkeit, die Menge an
TAP über die Menge an TAP-spezifisch gebundenem Peptid zu bestimmen. Die Spezifität der
Bindung wird durch einen 400fachen Überschuss an unmarkiertem Kompetitor Peptid
bestimmt.
Material
Peptide
Fluoreszenz Peptid (RRYC(F)KSTEL) C4F 30 µM
Kompetitor Peptid (RRYQKSTEL) R9LQK 3.5 mM
1×PBS (Phosphate buffered saline)
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
pH 7,0
Der Peptidtransporter TAP 37
Lyse-Puffer
1xPBS pH 7.0
SDS 1% (w/v)
Platte (Fluoplate)
96-well schwarz, für Fluoreszenz Messungen
Protokoll
1. TAP – Bestimmung mittels Zentrifugationsassay (3fach-Bestimmung)
Tabelle 1
Bindung Kompetitor
TAP1/2 100 µl 100 µl
C4F Peptid [30 µM] 2.5 µl
2.5 µl
Kompetitor Peptid [R9LQK, 3.5 mM] - 8.5 µl
PBS
47.5 µl
39µl
1. zu 150 µl TAP-haltigen Membranen werden 500 µl PBS gegeben.
2. Wie in Tabelle 1 dargestellt, alle Komponenten bis auf TAP-haltige Membranen (wie
in 1 verdünnt) zusammenpipettieren (Die Messung erfolgt in Triplikaten).
3. Durch Zugabe der TAP-haltigen Membranen die Bindung starten.
4. 15 min auf Eis inkubieren.
5. Bindungsansatz durch Zugabe von 1 ml eiskaltem PBS verdünnen und anschließend
sofort bei 14.000 rpm und 4°C für 8 min abzentrifugieren.
6. Pellets in 100 µl eiskaltem PBS resuspendieren und anschließend nochmals mit 900 µl
PBS verdünnen (zügig arbeiten).
7. Zentrifugation bei 14.000 rpm bei 4°C für 8 min.
8. Pellets in 300 µl Lyse-Puffer bei Raumtemperatur resuspendieren und 10 min
inkubieren.
Der Peptidtransporter TAP 38
9. Jeweils 250 µl der lysierten TAP-haltigen Membranen bzw. 250 µl der Standardreihe
in ein Well der Fluoreszenz-Platte überführen und die Fluoreszenz am ELISA-Reader
vermessen ( λex/em = 485/520 nm)
2. Erstellen der Standardkurve
Tabelle 2
C4F Endkonz. 0 nM 2 nM 4 nM 8 nM 10 nM
Lysis-Puffer 600 µl 596 µl 592 µl 584 µl 580 µl
C4F Peptid (300 nM) 0 4 µl 8 µl 16 µl 20 µl
Auswertung
Bestimmung der TAP-Konzentration:
Anhand der Standardkurve soll die Menge an TAP (Mw TAP1/2: 150 kDa)
bestimmt werden
a. Konzentration in mol/l
b. in Gewichtsprozenten der Gesamtproteinmenge
Der Peptidtransporter TAP 39
8.2 Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B)
Zur biochemischen Charakterisierung von TAP werden Fluoreszenz-markierte Peptide
verwendet. Die Markierung des Peptides, welches ein Cystein enthält, erfolgt über dessen
nukleophilen Angriff an den mit einer reaktiven Gruppe (z. B. Iodoacetamido, Maleimido)
funktionalisierten Fluorophor. Zur Entfernung freien Farbstoffs und nicht markiertem Peptid
wird im Anschluss an die Reaktion das Reaktionsgemisch über eine „reversed phase high
performance liquid chromatography“ (RP-HPLC) aufgereinigt. Die vereinigten
Elutionsfraktionen werden zur Entfernung des Lösungsmittels lyophyilisiert
(gefriergetrocknet). Die Qualität des aufgereinigten Produkts wird mittels analytischer HPLC
und MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass
spectrometry) verifiziert.
Material
10x PBS pH 6.5
1.37 M NaCl
27 mM KCl
100 mM Na2HPO4
20 mM KH2PO4
Tricinpuffer
100 mM Tricin pH 9.0
PBS/DMF (Dimethylformamid)
PBS pH 6.5
20 % (v/v) DMF
Fluorophor
50 mM in 100 % DMF lösen
Peptid
3.5 mM Peptid in PBS/DMF lösen
RP-HPLC
HPLC Anlage der Firma Jasco
Säule: PerfectSil-300ODS-C18 5 µm Protein & Peptid Säule (4.6 x 250 mm)
Der Peptidtransporter TAP 40
Äquilibrierung der Säule und Entwicklung eines Elutionsgradienten
Linearer Gradient von 5 auf 100 % Acetonitril (ACN) in 20 min + Waschschritt:
Eluent A: H2O + 0.1 % TFA (trifluoroacetic acid)
Eluent B: ACN + 0.1 % TFA
Flussrate: 1 mL/min
0 – 20 min linearer Gradient 5 – 100 % B (1 mL/min)
20 – 24 min 100 % B (1 mL/min)
24 – 25 min linearer Gradient 100 – 5 % B (1.5 mL/min)
25 – 30 min 5 % B (1.5 mL/min)
Ein alternatives Programm zur Reinigung des Reaktionsgemisches muss anschließend
etabliert werden, um eine optimale Trennung der Substanzen zu gewährleisten.
Protokoll
Zu Beginn des Praktikumsversuches werden sowohl die Peptidsequenz als auch die
chemische Zusammensetzung des Fluorophors bekannt gegeben und der entsprechende
Reaktionsansatz berechnet. Nach Lösen der Edukte werden der frisch angesetzten
Peptidlösung 10 µL und der Fluorophorlösung 1 µL entnommen. Diese werden mit je
400 µL Wasser verdünnt und zur späteren Zuordnung der einzelnen Peaks lichtgeschützt
aufbewahrt. Die verbleibenden Eduktlösungen werden zur Vermeidung von Nebenreaktionen
(Welche?) möglichst schnell gemischt und für ca. 60 min im Dunkeln bei Raumtemperatur
inkubiert. Im Anschluss erfolgt die Reinigung des Reaktionsgemisches mittels RP-HPLC.
Zunächst muss ein geeigneter Elutionsgradient etabliert werden, um das Produkt von den
Edukten zu trennen. Dazu werden pro Lauf 10 µL des Reaktionsansatzes auf die Säule
aufgetragen. Nach der Etablierung eines Gradienten werden mit diesem zusätzlich die Edukte
analysiert, um die Peaks den einzelnen Substanzen zweifelsfrei zuordnen zu können und eine
Quantifizierung der Produktmenge über die Peakflächen zu ermöglichen. Abschließend wird
der Rest des Reaktionsgemisches mit dem etablierten Gradienten aufgetrennt und das
Säuleneluat in 0.5 mL Fraktionen gesammelt. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt,
in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophylisiert. Am nächsten Tag wird das
Peptid in 100 µL Wasser gelöst und dessen Konzentration über die Absorption des
Fluorophors bestimmt. Dazu werden eine 1:10 und 1:100 Verdünnung in Tricin-Puffer pH 9
hergestellt (jeweils 20 µL) und mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrometers die Absorption
gemessen. Zur Verifizierung werden nochmals 20 µL des markierten Peptids mittels HPLC
analysiert und die Masse mittels MALDI-TOF-MS an einem Voyager-DE (PerSeptive
Biosystems) Massenspektrometer bestimmt. Dazu werden 0.5 µL des markierten Peptids mit
Der Peptidtransporter TAP 41
0.5 µL gesättigter -Cyano-4-hydroxyzimtsäure in Wasser/Acetonitril/TFA (33:67:0.1) auf
dem Probenteller gemischt. Durch Verdunstung bilden sich Kristalle für die MALDI-TOF-
MS (Die Massenbestimmung findet nicht während des Praktikums statt).
Auswertung
Bestimmen Sie die Ausbeute der Markierungsreaktion über zwei verschiedene Ansätze!
a) Integration der Peakflächen von Produkt und Edukten
b) Konzentrationsbestimmung des Produktes über UV/VIS-Spektroskopie
Der Peptidtransporter TAP 42
8.3 Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP
(Versuch 1C)
Der Peptidtransporter TAP transportiert Peptide vom Zytosol ins Lumen des
Endoplasmatischen Retikulums. Die höchste Transporteffizienz wird für Peptide mit einer
Länge von 8 – 12 Aminosäuren beobachtet. Die Spezifität der Peptide beschränkt sich auf die
drei N-terminalen und den C-terminalen Aminosäurenrest(e). Bevor die Peptide jedoch
transportiert werden, binden sie an TAP.
In diesem Praktikumsversuch soll in einem Bindungssättigungsexperiment mit den zuvor
isolierten TAP-haltigen Membranen die Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP
bestimmt werden. Dazu wird die Peptidbindung an TAP in Abhängigkeit von der
Peptidkonzentration untersucht. Um das Peptid detektieren zu können, wurde es mit dem
Fluorophor Fluoreszein markiert, der sich mit Hilfe eines Fluoreszenzspektometers sehr
empfindlich nachweisen lässt. Als Peptid wurde ein Nonamer (RRYQC(Fluoreszein)STEL)
ausgewählt, da dies der optimalen Peptidlänge für TAP entspricht.
Material
10x PBS pH 7.0
1,37M NaCl
27mM KCl
100mM Na2HPO4
20mM KH2PO4
Bindungspuffer
1x PBS
Peptide
C4F: RRYC(Fluoreszein)KSTEL
R9LQK: RRYQKSTEL
TAP
TAP-haltige Membranen
Zum Absättigen der Filtermembranen
0,3% PEI-Lösung (Poly-ethylenimin)
Solubilisierungspuffer
1xPBS/1% SDS
Der Peptidtransporter TAP 43
Protokoll Bindungssättigungsexperiment:
Auf einer 96-well Platte werden die TAP-haltigen Membranen, das Fluoreszein-markierte
Peptid (C4F) und das unmarkierte Kompetitorpeptid bei 4°C zusammengegeben und mit
Bindungspuffer auf das gleiche Volumen gebracht. Die Zugabe des 400-fachen molaren
Überschusses von unmarkiertem Kompetitorpeptid (RRYQKSTEL) ermöglicht die
Unterscheidung zwischen unspezifischer Bindung (an Gefäßwände, an die Lipidschicht der
Membranen) und spezifischer Assoziation an TAP.
Durch 20 min Inkubation der Proben auf Eis wird die Einstellung des
Bindungsgleichgewichtes abgewartet. Währenddessen werden Filterplatten mit einem
Porendurchmesser von 1 µm erst mit 200 µL 0,3%iger PEI-Lösung (lädt Filtermembran
positiv) für 10 min inkubiert anschließend abgesaugt. Dann werden die Proben mit 100 µl
Bindungspuffer verdünnt. So bleibt die Menge an Membranen, die in der 96-well Platte
zurückgebliebenen sind möglichst gering. Anschließend können die Proben auf die
vorbereiteten Filterplatten übertragen und ungebundenes Peptid abgesaugt werden. Die
zurückbleibenden Membranen werden dreimal durch Zugabe und Absaugen von 100 µl
kaltem Bindungspuffer gewaschen. Diese Arbeitsschritte sind wegen der einsetzenden
Dissoziation bereits gebundener Peptide sehr zeitkritisch und werden daher mit einer Multi-
Kanal-Pipette durchgeführt. Danach wird die Filterplatte von dem Filtrationsapparat
abgenommen.
Durch Zugabe von 250 µl Solubilisationspuffer (enthält 1% SDS, daher bei
Zimmertemperatur aufbewahren) wird TAP denaturiert (Achtung: Schaumbildung vermeiden)
und die gebundenen Peptide innerhalb von 5 Minuten freigesetzt. Aus den 250 µl Solubilisat
werden 200 µl entnommen und auf eine schwarze Fluoreszenzmicrotiterplatte überführt.
Um die exakte Menge an gebundenem Fluoreszein-Peptid zu quantifizieren, werden
Eichlösungen zubereitet und je 200 µl in die Fluoreszenzmicrotiterplatte pipettiert. Für alle
Proben wird mit einem Elisa-Reader (Ex/Em: 485/520 nm) die Fluoreszenz bestimmt.
Pipettierschemata:
Von allen Konzentrationen werden Triplikatbestimmungen angefertigt.
Das Pipettierschema soll sich anhand folgender Endkonzentrationen von Fluoreszenz-Peptid,
Kompetitor-Peptid (400 x Überschuss, jedoch min. 1µl von der 4,2mM Stocklösung) und
TAP-haltigen Membranen (40 µg Gesamtproteinmenge/“well“) erstellt werden. Das
Der Peptidtransporter TAP 44
Gesamtvolumen beträgt 50 µl. Die Stocklösung des C4F Peptids beträgt 10 µM. Aus dieser
Stocklösung müssen X weitere Verdünnungen (C4F X nM) angesetzt werden, um die im
Pipettierschema angegebenen C4F Konzentration (3-300 nM) pipettieren zu können.
Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment
Probe C4F
Endkonz.
[nM]
Kom-
petitor
R9LQK
TAP
5mg/ml
[µl]
C4F
X
nM
C4F
X
nM
C4F
X
nM
C4F
X
nM
C4F
X
nM
R9LQK
4,2 mM
Bindung-
spuffer
[µl]
1-3 3 -
4-6 +
7-9 10 -
10-12 +
13-15 30 -
16-18
19-21 60 -
22-24 +
25-27 100 -
28-30 +
31-33 200 -
34-36 +
37-39 300 -
40-42 +
Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment Eichgerade:
Konzentration [nM] 0 0.5 2.5 5 7.5 10
Fluoreszein-Peptid [µl]#
-
3#
15#
30#
45#
60#
Solubilisationspuffer [µl] 600 597 585 570 555 540
# aus Stocklösung: 100 nM
Auswertung
1. Stellen Sie eine Eichbeziehung zwischen der Fluoreszenzintensität im Emissionsmaximum
und der C4F-Peptidkonzentration her.
2. Wie ist der Kd-Wert für das untersuchte Peptid?
Der Peptidtransporter TAP 45
8.4 Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D)
Als Mitglied der ABC-Transporterfamilie besitzt TAP die Eigenschaft ATP zu hydrolysieren,
um den Transport von Peptiden über die ER-Membran zu energetisieren. Eine Voraussetzung
für die ATP-Hydrolyse ist die ATP-Bindung. Sowohl TAP1 als auch TAP2 besitzen eine
Nukleotidbindungsdomäne (NBD). Beide NBDs bilden zusammen zwei ATP-Bindestellen,
die durch hochkonservierte Motive charaktrisiert sind.
In diesem Versuch wird die Affinität von TAP für verschiedene Nukleotiddi- und
triphosphate mittels Kompetitionsexperimenten bestimmt. Dabei wird über Immunoblotting
die Nukleotid abhängige Kompetition von TAP von ATP-Agarose quantifiziert.
Material
Membran
TAP-haltige Membranen (12,5 mg Gesamtprotein)
Solubilisierung-Puffer (10 ml)
20 mM HEPES pH 7.4
150 mM NaCl
1 mM KCl
5 mM MgCl2
2% NP-40
15% Glycerin
Wasch-Puffer (50 ml)
20 mM HEPES pH 7.4
150 mM NaCl
1 mM KCl
5 mM MgCl2
0.2% NP-40
15% Glycerin
ATP-Agarose (32 mg)
C8-immobilisierte ATP-Agarose
Stocklösungen
200 mM HEPES pH 7,4
1,5 M NaCl
1 M MgCl2
1 M KCl
100% NP-40
86% Glycerin ( = 1,23 g/ml)
Der Peptidtransporter TAP 46
Protokoll
Wichtig: Alle folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt! Sowohl die Puffer als
auch die Zentrifuge müssen kalt sein.
Solubilisierung:
Zu TAP-haltigen Membranen (12,5 mg Gesamtprotein) wird das gleiche Volumen PBS
gegeben und die Membrane werden auf Eis aufgetaut. Anschließend werden die Membranen
8 min bei 4°C und 14000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 2,5 ml Solubilisierung-Puffer
resuspendiert und mindestens 30 min auf Eis inkubiert (Achtung: Luftblasen vermeiden!).
Anschließend wird der Solubilisierungs-Ansatz 30 min bei 4°C und 80.000 rpm im TLA-110
Rotor (Tisch-Ultrazentrifuge) zentrifugiert.
Vorbereiten der ATP-Agarose:
Während der Zentrifugation wird die ATP-Agarose vorbereitet. Es werden 3,5 mg ATP-
Agarose pro Ansatz benötigt, d.h. insgesamt werden 28 mg auf einer Feinwaage abgewogen.
Die Gesamtmenge an ATP-Agarose wird in H2O aufgenommen und 30 min inkubiert (1 ml
pro 3,5 mg). Die Beads werden dann zweimal mit 4 ml Wasch-Puffer gewaschen (2 min @
200x g, 4°C). Anschließend werden die Beads gleichmäßig auf die verschiedenen Ansätze
verteilt. Dazu werden die Beads in 4 ml Waschpuffer aufgenommen und jeweils 500 µl auf
ein Reaktionsgefäß gegeben (wichtig: immer auf Eis und nie austrocknen lassen).
Vorbereiten der Nukleotide:
Es müssen 8 verschiedene Ansätze mit verschiedenen Nukleotidkozentrationen vorbereitet
werden. Das Gesamtvolumen eines Ansatzes beträgt 300 µl. Von diesen 300 µl sind 250 µl
Solubilisat – der Rest besteht aus Wasch-Puffer und Nukleotid.
Es soll der IC50-Wert für verschiedene Nukleotide bestimmt werden (ATP, ADP, CTP und
GTP) – jeweils eine Gruppe wird einen IC50 Wert bestimmen.
Nachdem die Zentrifugation für das Solubilisat abgeschlossen ist, kann das Solubilisat
abgenommen werden und jeweils 250 µl auf den Nukleotidansatz gegeben werden.
Inzwischen werden die Beads nochmals abzentrifugiert und der Überstand verworfen
(Achtung keine Beads mit abnehmen). Nach 15 min werden die Nukleotidansätze auf die
vorbereiteten Beads gegeben 1 h bei 4°C rotierend inkubiert.
Die Ansätze werden danach 3 mal mit 500 µl Wasch-Puffer gewaschen (jeweils 2 min bei
200x g zentrifugieren). Die Beads werden in 50 µl 3x SDS-Ladepuffer resuspendiert und
20 min bei 65°C inkubiert. Danach werden die Beads bei 21000x g abzentrifugiert. 15 µl des
Der Peptidtransporter TAP 47
Überstands der Proben und 4 µl vom Marker werden auf das Gel geladen, das Gel gefahren
und TAP durch den Western-Blot sichtbar gemacht.
Folgende Konzentrationen im jeweiligen Ansatz werden benötigt:
Enkonzentration
Nukleotid [µM] 0 3 10 30 100 300 1000 5000
c (Nukleotid)
V (Nucleotid)
V (Wasch-P.)
V(Solubilisat) 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl
V (gesamt) 300 µl
Kleinere Volumina als 1 µl können nicht exakt pipettiert werden. Es sollten nicht mehr als
zwei Vorverdünnungen vom Nukleotid gemacht werden. c - Konzentration; V – Volumen
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen
diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die
Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro
Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem
Molekulargewicht getrennt werden.
Materialien
BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur
30% Acrylamid/Bisacrylamid (Verhältnis 37,5/1))
Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/ HCl, 0,4 % SDS, pH 8,8
Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/ HCl 0,4 % SDS, pH 6,8
10% APS (Ammoniumperoxidsulfat)
TEMED
Lauf-Puffer:
25 mM Tris/HCl
192 mM Glycin
0.1% (w/v) SDS
pH 8.8
Der Peptidtransporter TAP 48
Protokoll
Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der
Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema
angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend
mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe
Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist,
wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die
Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (eingeschlagen in feuchte Papiere und
Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert.
Pipettierschema für 2 SDS-PAGE Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems:
Trenngel 10% Sammelgel 5%
H2O 3,95 ml 2,7 ml
Acrylamid/Bisacrylamid 3,1 ml 650 µl
Trenngelpuffer 3,95 ml -
Sammelgelpuffer - 1,1 ml
APS 10% 40 µl 30 µl
TEMED 20 µl 10 µl
Immunoblot
Material
SDS-PAGE
Nitrocellulose-Membran (8 x 10 cm)
Filterpapier (4 Stück a 10 x 10 cm)
Transfer-Puffer
25 mM Tris/HCl
192 mM Glycin
0.03% (w/v) SDS
20% (v/v) Methanol
pH 7.5
10x TBS
200 mM Tris
2.5 M NaCl
5% Milch-TBS-T
1x TBS
0,1% Triton X-100
3% Milchpulver
Der Peptidtransporter TAP 49
ECL1
9 ml H2O
1 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0
100 µl 250 mM Luminol (in DMSO)
44 µl 90 mM Coumarinsäure (in DMSO)
ECL2
9 ml H2O
1 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0
6,4 µl 30% H2O2
Antikörper
1: 20 anti-TAP1 (148.3) in 5% Milch-TBS-T
1:20000 anti-Maus Meeretichperoxidase gekoppelter Antikörper in TBS-T
Protokoll
Nitrocellulosemembran und Filterpapiere und das Gel werden zunächst in Transferpuffer
getränkt. Die Anode und Kathode (untere und obere Elektrodenplatte) des Semi-Dry-Blots
werden vor dem Auflegen der Filterpapiere mit dem Transferpuffer angefeuchtet. Auf zwei
Filterpapiere werden die Membran und anschließend das Gel aufgelegt. Zum Schluss wird
eine weitere Lage von zwei Filterpapieren auf das Gel aufgelegt. Die obere Elektrodenplatte
schließt den Aufbau ab. Achtung! Luftblassen zwischen den einzelnen Schichten des Blots
lassen sich gut durch vorsichtiges Rollen mit einem 50 ml Falcon herausdrücken. Die
Dauer des Elektrotransfers beträgt 90 min bei 100 mA pro Gel. Anschließend werden die
Membranen 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 5% Milch-TBS-T inkubiert. TAP1 wird mit dem
148.3 Hybridomüberstand nachgewiesen. Dabei wird die Membran mit dem Antikörper
mindestens 1 h bei RT (besser über Nacht bei 4°C) inkubiert. Anschließend wird die
Membran 3 x 5 min mit TBS-T gewaschen und 1 h mit dem Ziege-Anti-Maus-HRP-Konjugat
(Fc spezifisch), bei RT inkubiert. Schließlich werden die Membranen 3 x 5 min mit TBS-T
gewaschen und mit ECL1- und ECL2-Lösung 1 min inkubiert. Abschließend werden die
Membranen in einem Lumi-Imager (Roche) ausgewertet und die Daten mit dem
Computerprogramm „Origin“ mit einer sigmoidalen Kurve gefittet.
Der Peptidtransporter TAP 50
Gleichung:
)*( 50101 nXLogIC
BABY
A: maximales Signal
B: Hintergrund
IC50: Halbmaximale Verdrängung
X: Logarithmus zur Basis 10 der ATP Konzentration
n: Hill-Koeffizient
Auswertung
Bestimmen Sie den IC50 Wert für die Nukleotide.
Im Protokoll müssen der Western-Blot, eine Tabelle mit den quantifizierten Banden und der
Graph mit dem Fit dargestellt werden.
Molekulargewichte des Markers:
Der Peptidtransporter TAP 51
8.5 Peptidtransportassay (Versuch 1E)
Der in vitro Peptidtransportassay basiert auf der Glykosylierung des transportierten Peptids
im Lumen des Endoplasmatischen Reticulums (ER), sowie dessen spezifische Bindung an
Concanavalin A-Sepharose und anschließender Trennung von nicht transportiertem Peptid.
Der Transport wird in Abhängigkeit von der ATP-Konzentration (0.1-10 mM), Peptid-
Konzentration (0.1-2 µM), Temperatur (4-40°C), Kationen und pH (pH 5-9) untersucht.
Durch Ermittlung der Fluoreszenz im ELISA-Reader wird der Peptidtransport quantifiziert.
Material
Peptid: RRYQNSTCL (NST-f)
1×PBS (Phosphate buffered saline)
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
pH 7,0
Stopp-Puffer 1xPBS
10 mM EDTA (pH 8,0)
Lyse-Puffer
50 mM Tris/HCl, pH 7.5
150 mM NaCl
5 mM KCl
1 mM CaCl2
1 mM MnCl2
1% NP-40
Elutionspuffer
Lyse-Puffer
200 mM Methyl α-D-Mannopyranoside
(15 ml Lyse-Puffer versetzt mit 582.6 mg Methyl α -D-Mannopyranoside)
Der Peptidtransporter TAP 52
Gruppe 1, 2, 6: ATP-Konz. ( 0; 0,1; 0,2; 0,3; 1; 3; 6; 10 mM)
Gruppe 4, 5: Peptid-Konz. (0.1; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2 µM)
Gruppe 3, 7: Temperatur (4, 12, 24, 32, 40 °C)
Gruppe 8, 9: pH (pH 5: MES-Puffer; pH 6: Na-Phosphatpuffer; pH 7: HEPES-Puffer;
pH 8: Tris-Puffer; pH 9: CHES-Puffer)
Gruppe 10, 11: Kationen (statt 5 mM MgCl2 im Puffer: NiCl2, CuCl2, MnCl2, CaCl2)
Protokoll
Das Pipettierschema für den Transportassay sieht folgender Weise aus:
Transport Negativ Kontrolle
Membranen 20 µl 20 µl
ATP [30mM] 5 µl -
MgCl2 [100 mM] 2.5 µl 2,5 µl
1x PBS 17.5 µl 22,5 µl
NST-f peptid [10 µM] 5 µl 5 µl
Der Reaktionsansatz wird bis auf das Peptid in 1,5 ml Reaktionsgefäße vorgelegt (auf Eis!).
Je nach untersuchtem Parameter bietet es sich an, einen Mastermix anzusetzen. Der Transport
wird durch Zugabe vom NST-f Peptid gestartet und erfolgt für 3 min bei 32 °C. Anschließend
wird durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Stopp-Puffer der Transport gestoppt. Nach
Zentrifugation für 8 min bei 14000 rpm und 4°C wird der Überstand verworfen und das Pellet
in zunächst 100 µl Lyse-Puffer resuspendiert und mit weiteren 800 µl versetzt. Die
Reaktionsansätze werden nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur für 8 min
bei 14000 rpm zentrifugiert. In der Zwischenzeit werden ConA-beads (50%ige Suspension
(w/v)) in ein kleines Falcon überführt und 2 x mit Lysepuffer gewaschen (2 min @ 1000 x g).
Der Überstand der lysierten Membranen wird zu 50 µl gewaschenen ConA-beads pipettiert
und 1 h bei 4°C bzw. 30 min bei RT überkopf rotiert. Die Reaktionsansätze werden für 2 min
bei 1000 rpm und 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die ConA-beads werden
zweimal mit je 1 ml Lyse-Puffer gewaschen, mit 300 µl Elutionspuffer versetzt und 30 min
bei RT inkubiert. Die beads werden für 2 min bei 1000 rpm pelletiert, 250 µl der Elution in
eine schwarze Microtiterplatte pipettiert und im ELISA-Reader quantifiziert
(λex/em=485/520 nm).
Glutathion-S-Transferase 53
9 Glutathion-S-Transferase
Zellen sehen sich einer ständigen Konfrontation von toxischen Substanzen ausgesetzt, die
endogen produziert oder aus der Umgebung aufgenommen werden. Zur Abwehr dieser
Toxine haben sich Abwehrmechanismen entwickelt wie zum Beispiel das sofortige
Ausschleusen von Zytostatika durch entsprechende Pumpen oder die Transformation der
Zytostatika mit anschließender Extrusion. Bei der Biotransformation wird die Detoxifizierung
in drei Phasen untergliedert (Abb. 2.1): In Phase I und II werden die zumeist hydrophoben
toxischen Substanzen in wasserlösliche Metabolite mit geringerer Toxizität umgewandelt, die
dann in Phase III durch spezielle Transportsysteme aus der Zelle ausgeschleust werden. In
Phase I werden die Zytostatika vornehmlich durch das Cytochrom P450 System oxidiert.
Phase II Enzyme katalysieren im Folgenden die Konjugation von wasserlöslichen Substraten
an die aktivierten Toxine. Meistens geschieht dies mittels Kopplung von Glutathion durch
verschiedene Glutathion-S-Transferasen (GST).
Abb.: 2.1: Schematische Darstellung der Detoxifizierung von Benzopyren: Benzopyren diffundiert durch die
Membran, wo es in mehreren Schritten zum Epoxid oxidiert wird. Nach der Aktivierung wird das Toxin durch
GST mit Glutathion markiert, wodurch es wasserlöslicher wird und von verschiedenen Transportsystemen als
Substart erkannt wird (entnommen aus Sheehan et al. 2001).
GSTs stellen dimere Enzyme dar, die hauptsächlich im Zytosol vorkommen. Es werden aber
mit geringerer Häufigkeit mikrosomale GSTs gefunden. Die GSTs bilden sowohl Homo- als
auch Heterodimer. Neben ihrer detoxifizierenden Eigenschaft sind GSTs auch noch an
anderen Reaktionen wie zB. Isomerisierung von Retinolsäure und der Prostaglandinsynthese
Glutathion-S-Transferase 54
beteiligt oder fungieren als Peroxidasen. Zudem nehmen GSTs durch die Bindung an eine
Vielzahl verschiedener zellulärer Komponenten regulatorische Funktionen ein.
Wie schon erwähnt, bilden die GSTs dimere Enzyme, wobei jede Untereinheit ein
katalytisches Zentrum trägt (Abb. 2.2). Trotz zweier katalytischer Zentren konnte keine
Kooperativität festgestellt werden. Zur Addition oder Substitution muss die Thiolgruppe des
Glutathions in seiner anionischen Form vorliegen. Zur Stabilisierung des Thiolatanions des
Glutathions findet man im katalytischen Zentrum eine Base, die je nach Klasse von GST ein
Tyrosin oder Serin sein kann.
Humane GSTs werden in die vier Klassen Alpha, Mu, Pi und Theta eingeteilt. Neuerdings
wurden auch noch die Klassen Omega und Kappa definiert. Weitere Klassen werden in
Invertebraten gefunden.
Abbildung 2.2: Struktur der Glutathion-S-Transferase: A) Kristallstruktur der murinen Glutathion-S-Transferase
in Komplex mit 4-Hydroxynon-2-enal in einer Untereinheit und Glutathion in der anderen Untereinheit (PDB
Code: 1B48). B) Modellierte Struktur des Fusionsproteins GST-eGFP.
Schistosomen sind Helminthen, die die parasitische Krankheit Schistosomiasis (Bilharziose)
verursachen, an der weltweit mehr als 275 Millionen Menschen erkrankt sind. Die GSTs von
Schistosoma japonicum wurde detailliert untersucht, da angenommen wird, dass diese
A B
Glutathion-S-Transferase 55
Enzyme an der Resistenz gegen Praziquantel, das meist benutzte Medikament gegen diese
Krankheit, beteiligt sind.
Im Praktikum arbeiten wir mit der 26 kDa Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma
japonicum (SJ26). Dieses 218 Aminosäure umfassende Protein ist über einen kurzen Linker
mit einem eGFP (enhanced green fluorescence protein) am C-Terminus verbunden (Abb.
2.2). Dieses Fusionsprotein umfasst 486 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 55,7
kDa. In der modellierten Struktur bildet sowohl das GST wie auch das GFP einen Dimer. Die
Fluoreszenz von eGFP vereinfacht die Detektion des Proteins und dient zur Charakterisierung
der Substratbindung über fluorescence resonance energy transfer (FRET).
Literatur:
Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A.; 2001; Structure, function and evolution of
glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of
ancient enzyme superfamily. Biochem. J.; 360; p. 1 - 16
Glutathion-S-Transferase 56
9.1 Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A)
Für die Überexpression werden kompetente BL21(DE3) Zellen mit dem Plasmid pEGGsH6
(Abb. 2.3) transformiert. N-terminal des GST-eGFP-Gens befindet sich ein TAC-Promotor.
Dieser kann durch Zugabe von IPTG (Isopropyl--D-thiogalactopyranosid) induziert werden,
wodurch es zu einer Überexpression von GST-eGFP kommt.
Abbildung 2.3: Vektorkarte des Expressionsvektors pEGGsH6. Die Expression steht unter dem starken IPTG
induzierbaren T7-Polymerase abhängigen TAC-Promotor. GST ist über einen Linker, der eine Thrombin- und
TEV (tobacco etch virus) Schnittstelle enthält, mit eGFP verbunden, das am Ende einen His6-Tag trägt. Als
weitere offene Leseraster findet man das Gen für die -Lactamase (bla) und den Lac-Repressor (lacIq).
E. coli hat eine optimale Wachstumsrate bei einer Temperatur von 37°C und einer
Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm. Nach Erreichen einer optischen Dichte (OD600) von
0,8 in LBAmp-Medium (Selektionsmarker Ampicillin) werden die Zellen mit IPTG induziert.
Die eigentliche Proteinexpression nach Induktion erfolgt bei 28°C, da bei dieser Temperatur
eine höhere Ausbeute an korrekt gefaltetem Protein und weniger Abbauprodukte zu erwarten
sind. Die Zellen werden für 5 h kultiviert und anschließend durch Zentrifugation geerntet.
Ansetzen der Medien und der Vorkultur
Materialien
Autoklavierter 250 ml Erlenmeyerkolben
Autoklaviertes LB-Medium
Glutathion-S-Transferase 57
Autoklavierte Zahnstocher
Ampicilin [100 mg/ml]
Schüttler für die Zellkultur, Temperatur 37°C und 28°C
Medienzusammensetzung:
LB (Luria Betani)-Medium 5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
10 g Trypton/Pepton Mischung
Ad 1 l H2O, autoklavieren
Das Antibiotikum Ampicillin wird in einer Endkonzentration von 100 µg/ml zu dem
abgekühlten Medium gegeben.
Protokoll
Sterile Bedingungen Alle Arbeiten werden an der Flamme ausgeführt!
Alle geöffneten Gefäße und Deckel sollten in
unmittelbarer Nähe der Flamme liegen! Zahnstocher
nicht mit der Hand berühren!
Am Abend wird der autoklavierte 250 ml Erlenmeyerkolben unter sterilen Bedingungen mit
50 ml Ampicillin-haltigem LB-Medium gefüllt, mit Hilfe eines Zahnstochers (Zahnstocher
mit abgeflammter Pinzette anfassen) in dem vorbereiteten Medium angeimpft und über Nacht
bei 37°C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm inkubiert.
Proteinexpression in E. coli
Materialien
Autoklavierte 2 l Kolben mit 500 ml LB-Medium
Ampicillin [100 mg/ml]
IPTG Stammlösung [1 M]
50 ml Übernachtkultur
Sterile Pipetten 1 und 10 ml
Photometer, Fluoreszenzküvetten und Absorptionsküvetten
Fluoreszenzspektrometer
500 ml Zentrifugenbecher
Sorvall Zentrifuge
50 ml Falcons
Pufferzusammensetzung
100 ml 1x PBS, pH 7,4
Glutathion-S-Transferase 58
Protokoll
Am Morgen werden 500 ml LB-Medium mit der vorbereiteten Übernachtkultur angeimpft.
Hierzu wird dem autoklavierten LB-Medium Ampicillin in einer Endkonzentration von
100 µg/ml unter sterilen Bedingungen zugegeben. Das Medium wird mit dem gesamten
Inhalt der Übernachtkultur (V = 50ml) angeimpft. Die Kulturen werden bei 37°C und
180 rpm inkubiert. In Zeitabständen von 20 min wird eine Probe von der Kultur entnommen
und im Photometer bei einer OD von 600 nm vermessen. Die Genexpression wird bei
Erreichen einer OD600 von 0,7 bis 0,8 mit IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM
induziert. Vor der Induktion wird zusätzlich zur OD600 Bestimmung die GFP-Fluoreszenz (Ex
= 470 nm; Em = 511 nm) gemessen. Nach der Induktion werden jede Stunde die optische
Dichte sowie die GFP-Fluoreszenz einer 1:10 Verdünnung (in LB-Medium) gemessen. Nach
5 Stunden Inkubation bei 28°C und 180 rpm werden die Zellen durch Zentrifugation
(6.000x g, 20 min, 4°C) geerntet (Sorvall Zentrifuge, GS-3 Rotor). Die Pellets (Überstand
nach Zentrifugation vollständig entfernen) werden in 1x PBS (40 ml) resuspendiert, in 50 ml
Falcon-Röhrchen überführt und für 20 min bei 6.000x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wird verworfen und die Zellen bei -20 °C gelagert.
Auswertung
Das Wachstumsverhalten der Kulturen vor und nach Induktion ist in einem Diagramm (OD600
gegen Zeit) festzuhalten. Ebenso wird ab dem Zeitpunkt der Induktion die Emission bei 511
nm im Diagramm mit angegeben (zweite y-Achse). Diese Kurven sollen im Protokoll
diskutiert werden.
Glutathion-S-Transferase 59
9.2 Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B)
Um mit GST-eGFP biochemische Experimente durchführen zu können, ist es wichtig das
überexprimierte Protein aus E. coli Zellen zu isolieren. Hierzu werden die Zellen zunächst mit
Ultraschall aufgeschlossen. GST-eGFP wird über die Glutathionagarose (GSH-Agarose)
gereinigt, wobei das Glutathion über seine Cysteinseitenkette mit einem 12-atomigen Spacer
an die Agarose gebunden ist. Zuerst wird GST-eGFP an die GSH-Agarose gebunden, im
Anschluss folgen mehrere Waschschritte, wodurch niederaffin-assoziierte Proteine abgetrennt
werden. Die Elution findet mit 10 mM reduziertem Glutathion statt. Das Gluthation wird
durch eine Gelfiltration entfernt, da das Glutathion mit den funktionalen Assays interferiert.
WICHTIG: Es wird zwar bei Raumtemperatur gearbeitet, aber es werden nur kalte
Lösungen verwendet und das Protein wird immer auf Eis gelagert.
Reinigung mittels GSH-Agarose
Materialien:
E. coli Zellpellet mit GST-eGFP
PMSF [200 mM]
Stab-Ultraschall
Zentrifuge (Sorvall), Zentrifugatinosröhrchen (Rotor: A8.24)
Equilibrations/Wasch Puffer
Elutions Puffer
Gravity-flow Column (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen)
Konzentrator (Centriprep, molecular weight cut off (MWCO) 30 kDa)
Pufferzusammensetzung
1 l TBS pH 8,0 (filtriert durch 0,22 µm Filter): 50 mMTris
150 mMNaCl
pH 8,0, Filtrieren
25 ml Elutions Puffer: TBS + 10 mM red.GSH
pH 8,0 (Erneute pH Einstellung!)
50 ml Regenerationspuffer 1 0,5 M Tris
0,5 M NaCl;
pH 8,5
50 ml Regenerationspuffer 2 0,5 M Tris
0,5 M NaCl;
pH 4,5
10% NaN3
Glutathion-S-Transferase 60
Protokoll
Die vorbereiteten Zellpellets werden aufgetaut (Gesamtvolumen mit TBS-Puffer auf 25 ml
auffüllen, damit die Zentrifugationsröhrchen vollständig gefüllt sind) und mit dem
Protesaseinhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in einer Endkonzentration von 1 mM
versetzt. Die Zellen werden im Eisbad 7 min beschallt (outputcontrol 5, duty cycle 50).
Anschließend werden die Zelltrümmer und unaufgeschlossene Zellen durch Zentrifugation
entfernt (A8.24 Rotor, 20 min, 20.000 rpm, 4°C). Die Reinigung des Proteins aus dem
Zelllysat erfolgt mittels GSH-Agarose. Dazu wird eine Gravity-flow Column vorbereitet. Es
werden 2 ml GSH-Agarose auf die Säule gepackt (gut resuspendieren vor der Entnahme) und
der Aufbewahrungspuffer entfernt (niemals trocken laufen lassen!). Die Säule wird mit
20 ml TBS equilibriert. 20 ml des Zelllysats werden auf die Säule gegeben und diese für
20 min im Kühlraum im Überkopfrotor inkubiert. Anschließend wird der Durchfluss
gesammelt und die Säule dreimal mit je 20 ml TBS gewaschen. Das Säulenmaterial, welches
GST-eGFP gebunden hat, wird mit 4 ml Elutionspuffer resuspendiert und anschließend
fraktionierend (5 Fraktionen mit je ca. 750 µl) eluiert. Anschließend wird für eine zweite
Reinigung das Säulenmaterial mit 20 ml TBS gewaschen und der Durchfluss der ersten
Reinigung nochmals an die Säule gebunden und wie erwähnt gewaschen und eluiert.
Regeneration der GSH-Agarose
Die GSH-Agarose kann bis zu fünfmal wieder verwendet werden ohne an Proteinausbeute
oder -reinheit zu verlieren. Zwischen jeder Verwendung muss die GSH-Agarose regeneriert
werden.
10 ml Regenerationspuffer 1 (0,5 M Tris; 0,5 M NaCl; pH 8,5)
10 ml H2O (milliQ)
10 ml Regenerationspuffer 2 (0,5 M Tris; 0,5 M NaCl; pH 4,5)
10 ml H2O (milliQ)
Zur Lagerung der GSH-Agarose werden 5 ml H2O (milliQ) mit 0,05 % NaN3 dazugegeben,
Lagerung bei 4°C.
Nach einer zweiten Aufreinigung werden die entsprechenden Eluate vereinigt und für eine
anschließende Gelfiltration mittels CentriPrep aufkonzentriert. Die Eluate werden in das
große Gefäß des Konzentrators gegeben und bei 1000x g für 10 min zentrifugiert (wichtig:
Deckel des Konzentrators und der Zentrifuge weglassen!). Da das aufkonzentrierte Protein
Glutathion-S-Transferase 61
ein maximales Volumen von ca. 750 µl für eine folgende Umpufferung haben sollte, kann
dieser Vorgang bis zum gewünschten Volumen wiederholt werden.
WICHTIG: Nach zwei Reinigungen wird die regenerierte GSH-Agarose dem Betreuer
übergeben.
Während dieses Versuchs ist es wichtig, Proben für eine folgende Bradford-
Proteinkonzentrationsbestimmung und eine SDS-PAGE aufzuheben. Vom Lysat, dem
Flowthrough (FT), allen Waschschritten (W1-W3), von der vereinigten Elution (EL)
und des aufkonzentrierten Proteins (Konz) werden Aliquots (1/50) entnommen. Von den
Proben wird die Absorption bei 488 nm gemessen und der Rest bei -20°C gelagert.
Umpufferung mittels Gelfiltration
Materialien
Aufkonzentriertes Eluat von der GSH-Agarose-Aufreinigung
Gravity Flow Säule (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen)
5 g Sephadex G 25 (Sepharose)
25 ml Becherglas
TBS
20% Ethanol mit MEK vergällt
Nanodrop
Flüssiger Stickstoff
5 g Säulenmaterial werden mit H2O zum Quellen in einem Becherglas vermischt. Nach
30 min wird der Überstand dekantiert (entfernen von kaputtem Säulenmaterial). Daraufhin
wird zweimal mit Wasser aufgefüllt, gewartet bis sich das Material gesetzt hat und wieder der
Überstand dekantiert. Mit dem Material wird die Gravity Flow Säule beladen (am besten in
einem Schritt). Die Säule sollte nachdem sich das Material gesetzt hat ca. 15 ml beinhalten.
Nachdem die Säule mit 50 ml TBS equilibriert wurde, wird das konzentrierte GST-eGFP auf
die Säule aufgetragen (langsam, Material darf nicht aufgeschlemmt werden). Dabei ist
wichtig, dass fast keine Flüssigkeit mehr über dem Säulenbett steht. Die Proteinfraktion sollte
langsam in das Säulenmaterial hineinlaufen. Eluiert wird mittels TBS, das Eluat wird
fraktionierend in 1,5 ml Eppendorf Gefäßen gesammelt (Fraktionsgröße 0,5 ml). Das Protein
kann visuell auf der Säule verfolgt werden, so dass nicht alles fraktioniert werden muss. Die
entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und die Konzentration über die Absorption von
eGFP bei 488 nm mittels Nanodrop bestimmt (ε488=61.000/M*cm). Zusätzlich wird auch die
eGFP-Konzentration im Zelllysat und Durchfluss bestimmt. Nach der Elution wird die Säule
Glutathion-S-Transferase 62
zuerst mit 30 ml H2O und anschließend mit 30 ml 20% Ethanol gewaschen. Die Lagerung
erfolgt in 20% Ethanol. Falls die Konzentration unter 10 µM liegt, wird das Protein nochmals
ankonzentriert. Zuletzt wird das Protein aliquotiert (Aliqouts zwischen 50 µl und 500 µl),
schockgefrostet und bei -80°C gelagert (Ein Aliquot wird für eine SDS-PAGE verwendet).
Protein-Bestimmung: Bradford-Assay
Um die Prorteinkonzentration im Zelllysat, Durchfluß und umgepufferter Fraktion zu
bestimmen wird ein Bradford-Test durchgeführt. Hierfür wird eine Standardkurve mit
6 Punkten wie folgt pipettiert:
A [1 mg/ml] B [500 µg/ml] C [250 µg/ml] D [125 µg/ml]
E
[62,5 µg/ml]
F
[0 µg/ml]
H2O 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 100 µl
BSA 50 µl
[2 mg/ml]
50 µl
[1 mg/ml]
50 µl
[500 µg/ml]
50 µl
[250 µg/ml]
50 µl
[125 µg/ml] -
Zunächst wird H2O in alle beschriftete Eppendorfgefäße vorgelegt. Im Anschluss wird in die
erste Probe BSA [2 mg/ml] pipettiert (gut mischen). 50 µl dieser Lösung werden in die
nächste Verdünnungsstufe pipettiert, mit einer neuen Pipettenspitze gemischt und wieder
50 µl in die nächste Verdünnungsstufe (usw.). 10 µl des jeweiligen Standards werden in eine
Mikrotiterplatte vorgelegt. Das Protein wird 1:10, 1:20 und 1:50 in H2O verdünnt
(Gesamtvolumen ca. 50 µl). Im Anschluss werden 10 µl jeder Verdünnung in die
Mikrotiterplatte pipettiert (alle Messpunkte werden in Dreifachbestimmung durchgeführt).
300 µl Bradfordreagenz werden zügig zu allen Proben zugegeben. Nach 10 min Inkubation
bei RT werden die Proben bei 595 nm im Fluostar vermessen.
Auswertung
Die Eichgerade mit Gleichung und Bestimmtheitsmaß werden in einem Diagramm dargestellt
und daraus die Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen berechnet, mit der der
Konzentration an GST-eGFP verglichen und die Anreicherung von GST-eGFP bestimmt.
Glutathion-S-Transferase 63
9.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C)
Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen
diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die
Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro
Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem
Molekulargewicht getrennt werden.
Materialien
30 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1)
Tris-HCl [1,5 M], SDS [0,4%] pH 8,8
Tris-HCl [0,5 M], SDS [0,4%] pH 6,8
APS (Ammoniumperoxodisulfat) [10%]
TEMED [99%, p.a.]
BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur
Protokoll
Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der
Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema
angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend
mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe
Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist,
wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die
Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (einschlagen in feuchte Papiere und
Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert.
Pipettierschema für 2 SDS-Page Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems:
Sammelgel 5% Trenngel 12%
Acrylamid/Bisacrylamid 650 µl 3,76 ml
Tris/SDS pH 8,8 [1,5 M] - 2,82 ml
Tris/SDS pH 6,8 [0,5 M] 1,1 ml -
H2O 2,7 ml 2,82 ml
APS [10%] 30 µl 40 µl
TEMED 10 µl 20 µl
Glutathion-S-Transferase 64
Um überprüfen zu können, ob GST-eGFP in der Expression vorhanden ist, wird eine SDS-
PAGE durchgeführt.
Materialien
Proteinproben in SDS-Ladepuffer (10-fach)
SDS-PAGE Standard
Spannungsgeber
Laufpuffer für SDS-PAGE (10-fach)
Coomassie-Färbelösung
Coomassie-Entfärbelösung
Zusammensetzung der Puffer und Lösungen:
Laufpuffer für SDS-Page (10-fach)
250 mM Tris-HCl
1,92 M Glycin
Einstellung des pH-Wertes auf 8,3
1% SDS
Coomassie-Färbelösung
0,25% (w/v) Coomassie R Brilliant Blue in
Coomassie-Entfärbelösung lösen
Coomassie-Entfärbelösung
50% H2O
40% Ethanol
10% Eisessig
SDS-PAGE-Ladepuffer
500 mM Tris-HCl, pH 8,0
44 % (v/v) Glycerin
15 % (w/v) SDS
0,5 mg/ml Bromphenolblau
1 M DTT
Probenvorbereitung
Probe Marker Lysat FT W1 W2 W3 Eluat Konzentrat Umgepuffert
Volumen [µl] -
Um die Reinigung mittels SDS-PAGE sinnvoll darzustellen, werden entsprechende Aliquots
der einzelnen Schritte aufgetragen. Damit aber ein gleichmäßiges Laufverhalten erzielt wird,
sollen in alle Taschen 15 µl aufgetragen werden. Deswegen werden die Volumina mit TBS
ergänzt. Zudem empfiehlt es sich immer die doppelte Menge anzusetzen, um
Glutathion-S-Transferase 65
Pipettiertverluste auszugleichen. Nachdem die Proben mit Ladepuffer versetzt wurden,
werden sie für 10 min bei 95 °C inkubiert.
Protokoll
Die Gelelektrophorese-Kammern werden nach Herstellerangabe zusammengebaut und mit
Laufpuffer (1-fach) gefüllt. Je 20 µl der denaturierten Proteinproben werden auf das SDS-
Gele aufgetragen. Als Standard werden 5 µl eines Proteinmarkers mit auf das Gel
aufgetragen, mit dessen Hilfe das Molekulargewicht von GST-eGFP identifiziert wird. Die
Trennung der Proteine erfolgt bei 150 V. Nach der Gelelektrophorese werden die Gele in
Coomassie-Färbelösung für 20 min bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln gefärbt.
Anschließend wird das nicht gebundene Coomassie durch Entfärbelösung weggewaschen, so
dass die Proteinbanden sichtbar werden. Anschließend wird das Gel gewässert und zur
Dokumentation gescannt.
Auswertung
Das SDS-Gel soll sinnvoll beschriftet dargestellt werden und die Bande des GST-eGFP soll
identifiziert werden.
Glutathion-S-Transferase 66
9.4 Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D)
Materialien
Aufgereinigts GST-eGFP
Superdex 200-Säule (PrepGrade, V = 24 ml)
TBS pH 8,0 (filtriert und frisch entgast durch Ultraschall (20 min im Ultraschallbad))
H2O (milliQ, entgast)
Äkta System (Prime)
Lösung für die Eichgerade
Aceton
Protokoll
Für die Gelfiltration wird eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200, Säulenvolumen 24 ml) mit
filtriertem TBS bei einem Fluss von 1,0 ml/min equilibriert. Anschließend werden 200 µg
GST-eGFP injiziert und das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von 280 nm
aufgezeichnet. Für die Eichgerade werden β-Amylase (200 kDa), Albumin (66 kDa) und die
Carboanhydrase (29 kDa) verwendet. Alle 3 Komponenten werden in einer Lösung
bereitgestellt (200 µg/ml). Zur Bestimmung des Totvolumens wird Bluedextran (2000 kDa)
gesondert injiziert (200 µg/ml).
Um die Qualität der Säule (der Säulenpackung) zu bestimmen, wird ein Effizienztest
durchgeführt (Bestimmung der theoretischen Böden und Peaksymmetrie). Dazu wird in die
Säule 200 µl Aceton (0,4 %) mit einer linearen Flussrate von 1,0 ml/min injiziert. Die
theoretischen Böden und die Peaksymmetrie werden mit den folgenden Formeln berechnet:
L
1000
W
V54,5
m
N2
h
e
a
bAs
N/m: Anzahl der theoretischen Böden pro Meter
Ve: Elutionsvolumen in ml
Wh: Peakbreite bei halber Höhe in ml
L: Gelbetthöhe in mm
As: Peaksymmetrie
a/b: linker/rechter Abstand zur Senkrechten des Maximums des Acetonpeaks bei 10% der
Gesamthöhe
Glutathion-S-Transferase 67
Auswertung
Chromatogramme der Gelfiltrationsläufe erstellen und diskutieren
Kalibrierungsgerade aus dem Chromatogramm des Eichlaufs erstellen
Berechnung des Molekulargewichtes von GST-eGFP
Berechnung der theoretischen Böden und der Peaksymmetrie der Säule
Glutathion-S-Transferase 68
9.5 Enzymkinetik (Versuch 2E)
In diesem Versuchsteil soll die Enzymkinetik von GST-eGFP in Abhängigkeit von
Glutathion, 1-Chloro-2,4-Dinitrochlorobenzol und Inhibitoren analysiert werden, um somit
Km und vmax zu bestimmen.
GST-eGFP katalysiert die nukleophile Substitution von 1-Chloro-2,4-dinitrobenzol an
reduziertes Glutathion Dabei entsteht S-(2,4-Dinitrobenzyl)-Glutathion (Abb. 2.4), das
photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm nachweisbar ist.
Abbildung 2.4: Reaktionsgleichung der durch GST-eGFP katalysierten Reaktion. Nukleophile Substitution von
1-Chloro-2,4-Dinitrobenzol an reduziertes Glutathion. Es entsteht S-(2,4-Dinitrobenzyl)-Glutathion.
Materialien
Aufgereinigtes GST-eGFP
Phosphatpuffer (pH 6,5):
Glutathion-S-Transferase 69
200 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung (Na2HPO4) werden vorgelegt und
der pH von 6,5 mit 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (KH2PO4) eingestellt
(ca. 350 ml)
TBS-Puffer pH 7,5 (beim Versuch mit dem Inhibitor Triphenylzinnchloride
Glutathione (GSH)
1-Chloro-2,4-dinitrobenzol (CDNB)
S-Methyl-Glutathion
Triphenylzinnchloride
Absorptionsküvetten aus PMMA
Absorptionsspektrometer mit Messschlitten
Protokoll
GST-eGFP: 2,5 µM Stammlösung in Phosphatpuffer
CDNB (M=202,55 g/mol): 100 mM Stammlösung in reinem Ethanol, zum Lösen für
5 min ins Ultraschallbad stellen (daraus weitere Verdünnungen ansetzten). Die Lösung
muss vor Licht geschützt werden.
GSH (307,33 g/mol): 300 mM Stammlösung in Phosphatpuffer
S-Methyl-GSH (321,35 g/mol): 10 mM Stammlösung in Phosphatpuffer
Triphenylzinnclorid (385,45 g/mol): 10 mM Stammlösung in reinem Ethanol (daraus
weitere Verdünnungen in Ethanol ansetzen)
WICHTIG: Zuvor berechnen wieviel der Reagenzien angesetzt werden muss!
Da das Absorptionsspektrometer über einen Messschlitten verfügt, können sechs Messungen
gleichzeitig durchgeführt werden. Für jede verwendete Küvette muss vorher eine Leer-
Messung (nur Puffer) durchgeführt werden, die Positionen sollten anschließend nicht mehr
vertauscht werden. Das Gesamtvolumen beträgt 1 ml. Die unterschiedlichen Ansätze werden
bis auf CDNB in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgemischt und mit dem entsprechenden
Puffer (Phosphatpuffer bzw. TBS) aufgefüllt (GST-eGFP (Endkonzentration immer 25 nM)
und GSH, S-Methyl-GSH oder Triphenylzinnchlorid(Konzentration entsprechend der
Ansätze). Zum Starten wird die Mischung in die Küvette gegeben, in der die entsprechenden
Konzentrationen an CDNB in absolutem Ethanol vorgelegt sind. Die Messung muss sofort
gestartet werden, da CDNB auch nichtenzymatisch mit GSH reagiert. Eine gute
Durchmischung ist wichtig, da CDNB in Wasser schwerlöslich ist und ausfallen kann. Die
Messung erfolgt im Absorptionsspektrometer bei einer Wellenlänge von 340 nm. Die
Messung findet über 10 min statt, der datapitch (minimale Zeit zwischen 2 Messungen)
beträgt 2,5 s. Der Versuch wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
Um zu überprüfen, ob ein nichtenzymatischer Umsatz stattfindet, misst jede Gruppe eine
Probe mit den höchsten eingesetzten CDNB und GSH Konzentrationen. Ist die Absorption bei
340 nm konstant, oder der Anstieg im Vergleich mit den anderen Messungen sehr gering,
Glutathion-S-Transferase 70
kann angenommen werden, dass der nichtenzymatische Umsatz an CDNB mit GSH
vernachlässigt werden kann.
Gruppe 1 und 4:
Apparente Km- und vmax-Bestimmung von GSH, durch vier Messungen mit je
unterschiedlichen Konzentrationen von CDNB. Dadurch die Bestimmung von Km- und vmax-
für CDNB.
CDNB 2 mM; 1 mM; 0,5 mM, 0,25 mM
GSH 10 mM; 3 mM; 1 mM; 0,3 mM; 0,1mM; 0,03 mM
Gruppe 2 und 5:
Apparente Km- und vmax-Bestimmung von CDNB, durch vier Messungen mit je
unterschiedlichen Konzentrationen von GSH. Dadurch die Bestimmung von Km- und vmax-für
GSH.
CDNB 1 mM; 0,75 mM; 0,5 mM; 0,25 mM; 0,1 mM; 0,05 mM
GSH 1 mM, 0,45 mM, 0,15 mM, 0,05 mM
Gruppe 3 und 7:
Km- und vmax-Bestimmung von GSH, bei konstanter CDNB Konzentration und vier
unterschiedlichen Konzentrationen von S-Methyl-GSH.
CDNB 1 mM
GSH 10 mM; 3 mM; 1 mM; 0,3 mM; 0,1 mM; 0,03 mM
S-Methyl-GSH 1 mM; 0,5 mM; 0,1 mM; 0 mM
Gruppe 6 und 8:
Km- und vmax-Bestimmung von GSH, bei konstanter CDNB Konzentration und fünf
unterschiedlichen Konzentrationen von Triphenylzinnchloride. Proben dieses Ansatzes
werden alle in TBS angesetzt.
CDNB 1 mM
GSH 10 mM; 3 mM; 1 mM; 0,3 mM; 0,1 mM; 0,03 mM
Triphenyltinchloride 100 µM; 10 µM; 1 µM; 0,1 µM; 0 µM
WICHTIG: Alle Triphenylzinnchloridhaltigen Abfälle werden als Schwermetallabfall
getrennt gesammelt.
Glutathion-S-Transferase 71
Auswertung
Bei der Messung werden ASCI Dateien erhalten, welche in Spalten dargestellt werden
müssen. Die Daten werden anschließend im linearen Bereich mittels Origin gefittet, dabei
entspricht die Steigung der Absorption bei 340 nm pro Zeiteinheit. Die Absorption kann über
das Lambert-Beersche Gesetz in Umsatz von CDNB durch GST-eGFP umgerechnet werden
(mol CDNB pro min und mol GST-eGFP). Der Extinktionskoeffizient ε340 von S-(2,4-
Dinitrobenzyl)-Glutathion beträgt 9,6*103 M-1cm-1. Um nun eine Kinetik untersuchen zu
können, muss der Umsatz gegen die Substratkonzentration aufgetragen werden und ein Fit
durchgeführt werden. Mittels der Michaelis-Menten-Gleichung werden die apparenten Km-
und vmax-Werte bestimmt. Alternativ kann eine Auswertung auch mittels Lineweaver-Burk
erfolgen. Das bietet sich immer dann an, wenn keine sättigenden Substratkonzentrationen
erreicht werden können.
Bei den Messungen ohne Inhibitor, soll zusätzlich zu dem apparenten Km von GSH (Gruppe 1
und 4) bzw. CDNB (Gruppe 2 und 5) auch der wahre Km und vmax von CDNB (Gruppe 1 und
4) bzw. GSH (Gruppe 2 und 5) bestimmt werden. Dazu wird 1/vmax gegen 1/c an in der
Messung konstantem Edukt aufgetragen. Das Diagramm besteht somit aus 4 Punkten welche
linear gefittet werden müssen. Der Schnittpunkt mit der x-Achse entspricht dem – 1/Km-Wert
für CDNB (Gruppe 1 und 4) bzw. GSH (Gruppe 2 und 5) und der Schnittpunkt mit der y-
Achse entspricht 1/vmax für unendliche Substratkonzentrationen.
Glutathion-S-Transferase 72
9.6 FRET-Messung (Versuch 2F)
Die Methode fluorescence resonance energy transfer (FRET) erlaubt es Distanzen oder
Veränderungen in Biomolekülen zu beschreiben. eGFP als Donor- und GSHAtto565 als
Akzeptorfluorophor können als FRET-Paar verwendet werden, um die Dissoziationskonstante
(Kd) zu bestimmen. Dazu werden zu einer konstanten Proteinkonzentration (GST-eGFP als
Donor) unterschiedliche Konzentrationen an Substrat (GSHAtto565 als Akzeptor) gegeben und
die Abnahme der Donoremission gemessen. Bei dieser Bestimmung müssen zusätzlich zwei
Kontrollexperimente durchgeführt werden. So muss die Donoremission bzgl. des
Verdünnungseffektes und andererseits. die direkte Fluoreszenzanregung des Akzeptors unter
den gegebenen Bedingungen bestimmt werden.
Materialien
TBS-T (1x TBS, 0,05% (v/v) Tween-20), pH 7,5
Aufgereinigtes GST-eGFP
GSHAtto565 (100 µM Stock)
GSHS-Methyl (1 mM Stock)
Fluoreszenzquarzküvette (Fassungsvolumen 1 ml; mit Rührfisch)
Fluoreszenzspektrometer
Protokoll
Im Versuch werden 1 ml GST-eGFP (10 nM in TBS-T) vorgelegt und mit verschiedenen
Mengen an GSHAtto565 titriert, so dass die unten erwähnten Endkonzentrationen erreicht
werden. Um Pipettierfehler zu vermeiden ist darauf zu achten, dass eine ausreichende Menge
an Proteinlösung in TBS-T verdünnt wird, um mehrere Experimente aus einem Ansatz
durchzuführen. Neben der Messung von GST-eGFP mit GSHAtto565, werden für die
beschriebenen Kontrollen GST-eGFP mit GSHS-Methyl und TBS-T Puffer ohne Protein mit
GSHAtto565 gemessen. Die Extinktionswellenlänge beträgt 450 nm, die Emission wird von 470
bis 650 m gemessen. Die Blende („slit“) des Exitationssmonochromators werden auf 5 nm
und des Emissionsmonochromators auf 10 nm eingestellt. Die Messungen werden jeweils bei
Raumtemperatur durchgeführt. Folgende GSHAtto565 Endkonzentrationen werden verwendet,
wobei die Ausgangskonzentration von GSHAtto565 10 und 100 µM betragen. Bei der
Kontrollmessungen mit steigenden GSHS-Methyl Konzentrationen ist darauf zu achten, dass
gleiche Volumina wie mit GSHAtto565 pipettiert werden, da diese Kontrolle dazu dient, die
Änderung der Donorfluoreszenz auf Grund der Verdünnung zu bestimmen. Bitte benötigte
Messungen für Versuch 2F beachten und mit durchführen (Skript bis zum Ende lesen!!!).
Glutathion-S-Transferase 73
Endkonzentration GSHAtto565 bzw. GSHS-Methyl [µM]
0 µM; 0,01 µM; 0,025 µM; 0,05 µM; 0,1 µM; 0,15 µM; 0,2µM; 0,3 µM; 0,4 µM; 0,5 µM
Auswertung
Es werden drei Diagramme (eines für GST-eGFP*GSHAtto565, GST-eGFP*GSHS-Methyl, Puffer*
GSHAtto565) erstellt, in denen jeweils die entsprechenden Emissionspektren eines
Experimentes in Abhängigkeit der GSH Konzentration dargestellt werden. Für die
Bestimmung der Dissoziationskonstante Kd ist die Emission von GST-eGFP bei 511 nm
ausschlaggebend. Dabei wird die Abnahme der Emission bei 511 nm gegen die GSH
Konzentration aufgetragen. Für die weitere Korrektur muss die Fluoreszenzdifferenz
(Fluoreszenz) berechnet werden, gefolgt von der Korrektur bezüglich der
Fluoreszenzänderungen durch Verdünnung (GST-eGFP*GSHS-Methyl) und der geringen direkt
angeregten Fluoreszenz von GSHAtto565 (Puffer* GSHAtto565).
ΔFluoreszenz = Fluoreszenzmax- Fluoreszenz(GSH abhängig) für alle drei Messreihen
ΔFluoreszenz GST-eGFP mit GSH-Atto korrigiert
= ΔFluoreszenz (GST-eGFP mit GSHAtto565)
– ΔFluoreszenz (GST-eGFP mit GSHS-Methyl)
+ ΔFluoreszenz (Puffer mit GSHAtto565)
Die Daten werden mit folgenden Gleichungen gefittet und die Ergebnisse verglichen:
DF =DFmax ×L0
Kd + L0
(Gleichung 1)
0
00
2
00d00d
maxR2
LR4)LRK()LRK(FF
(Gleichung 2)
L0 = Ausgangskonzentration Ligand [GSH-ATTO565]
R0 = Ausgangskonzentration Rezeptor [GST-eGFP]
ΔFmax = ΔF bei Rezeptorsättigung
Der Kd Wert ist zu ermitteln und die Ergebnisse (auch aus den Emissionsdiagrammen) sollen
diskutiert werden.
Glutathion-S-Transferase 74
Distanzberechnung mittels FRET zwischen Glutathionbindungsstelle und C-terminalen
GFP (Versuch 2F)
Der strahlungslose Übergang des angeregten Zustandes des Donorfluorophors auf den
Akzeptorfluorophor ist ein relativ langsamer Übergang, wobei die Effizienz des Übergangs
von vielen Faktoren, wie der Entfernung des FRET Paars zueinander (R), der
Quantenausbeute des Donors (QD), der Überlappung von Emissionsspektrum des Donors und
Absorptionsspektrum des Akzeptors (JDA) und die Orientierung der Übergangsdipole der
Fluorophore zueinander (K2) abhängt. Um die Distanz korrekt bestimmen zu können müssen
immer alle Donormoleküle ein FRET Paar mit einem Akzeptor bilden. In unserem Fall heißt
das, dass unter einer sättigenden Ligandenkonzentration gearbeitet werden muss. Die
Einstellungen am Fluoreszenzspektrometer sind die gleichen wie bei den vorhergehenden
Messungen, so dass manche Spektren direkt übernommen werden können (solange die
Einstellungen am Spektrometer identisch sind).
Zur Bestimmung der Distanz eines FRET Paares muss zuerst die FRET Effizienz (E) aus dem
Verhältnis der korrigierten Emissionsspektren des Donors in Abwesenheit (ID) und in
Gegenwart des Akzeptors (IDA) bestimmt werden.
Materialien
TBS-T, pH 7,5
Aufgereinigtes GST-eGFP
GSHATTO565 (100 µM Stock)
S-Methyl-GSH (1 mM Stock)
Fluoreszenzquarzküvette (Fassungsvolumen 1 ml; mit Rührfisch)
Fluoreszenzspektrometer
Absorptionsspektrometer
Protokoll
Die korrigierten Spektren werden wie folgt aufgenommen:
ID: (Emissionsspektrum von 10 nM GST-eGFP mit 500 nM GSHS-Methyl)
- (Emissionsspektrum von 500 nM GSHS-Methyl)
IDA: (Emissionsspektrum: 10 nM GST-eGFP mit 500 nM GSHATTO565)
- (Emissionsspektrum von 500 nM GSHS-Methyl)
- (Emissionsspektrum von 500 nM GSHATTO565)
Mittels des Verhältnisses der integrierten, korrigierten Emissionsspektren (Integration von
495 bis 540 nm) wird nach Gleichung 1 die FRET Effizienz bestimmt.
Glutathion-S-Transferase 75
)I
I(1E
D
DA (Gleichung 1)
Über die FRET Effizienz kann die Entfernung (R) eines bestimmten Donor/Akzeptor Paares
wie folgt berechnet werden:
06
1
R)1E
1(R (Gleichung 2)
R0 stellt den Försterradius dar und gibt die Entfernung eines FRET Paares an, bei der die
FRET Effizienz 50% beträgt. R0 hängt von den spektralen Eigenschaften des Donor- und
Akzeptorfluorophors ab und wird folgendermaßen berechnet:
61
DAD
42
0 )JQnK(211,0R Einheit (Å) (Gleichung 3)
QD = Quantenausbeute Donor (eGFP = 0,6)
K2 stellt den Orientierungsfaktor dar und nimmt für schnell, frei rotierende Fluorophore einen
Wert von 2/3 an. QD ist die Quantenausbeute des Donors in Abwesenheit des Akzeptors, n ist
der refraktive Index des Mediums (1.4 für proteinhaltige wässrige Lösungen) und JDA ist das
Überlappintegral, das den Grad der Resonanz zwischen Donor- und Akzeptordipol
widerspiegelt. JDA wird durch Integration der überlappenden Fläche des Emissionsspektrums
des Donors und des Absorptionsspektrums des Akzeptors bestimmt. Dafür werden das
Emissions- und Absorptionsspektrum normalisiert (der höchste Wert entspricht eins).
JDA(l) =FD(l) ×eA × AA(l) × l 4 dlò
FD(l)dlò Einheit (M-1 cm-1 nm4) (Gleichung 4)
FD = normalisierte Donorfluoreszenz
AA = normalisierte Akzeptorabsorption
εA = Extinktionskoeffizient von ATTO565 (ε563 = 120.000 M-1 cm-1)
FD gibt die normalisierte Donoremissionsintensität bei einer Wellenlänge und A den
Absorptionskoeffizienten des Akzeptors bei dieser Wellenlänge an, was dem Produkt aus
normalisierter Absorption und Extinktionskoeffizient beim Absorptionsmaximum entspricht.
Glutathion-S-Transferase 76
Zur Bestimmung des Überlappintegrals werden folgende Spektren aufgenommen:
Korrigiertes Emissionsspektrum des Donors (Ex: 450 nm; Em: 490 – 650 nm):
FD: (Emissionsspektrum von 10 nM GST-eGFP)
– (Emissionsspektrum TBS-T Puffer)
Korrigiertes Absorptionsspektrum des Akzeptors (450 – 650 nm):
AA: (Absorptionsspektrum von 1 µM GSHAtto565)
– (Absorptionsspektrum von 1µM GSHS-Methyl)
Spektrale Eigenschaften von enhanced eGFP:
489 = 61.000 M-1cm-1; 280 = 21.980 M-1cm-1; QD = 0,6
Auswertung
Zur Berechnung der FRET-Effizienz werden die korrigierten Emissionsspektren ID
und IDA mittels dem Programm Excel über den angegebenen Bereich integriert und
damit die FRET-Effizienz bestimmt.
Um die Distanz R zu berechnen, muss zuerst der Försterradius des FRET Paares
bestimmt werden. Dafür wird das Überlappintegral ermittelt. Dazu werden die
korrigierten, normalisierten Spektren in einem Excel-Tabellenblatt eingetragen und
über den angegebenen Bereich integriert. Mit Hilfe der spektralen Parameter von
Atto565 und eGFP wird das Überlappintergral berechnet.