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Praktikum „Zelluläre Biochemie“ am Institut für Biochemie Goethe-Universität Frankfurt am Main Max-von-Laue Str. 9 60438 Frankfurt am Main Gruppe A: 2. 19.12.2013 Gruppe B: 13. 30.01.2014

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Praktikum „Zelluläre Biochemie“

am Institut für Biochemie

Goethe-Universität Frankfurt am Main

Max-von-Laue Str. 9

60438 Frankfurt am Main

Gruppe A: 2. – 19.12.2013

Gruppe B: 13. – 30.01.2014

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Inhaltsverzeichnis

1 Allgemeines ------------------------------------------------------------------------------- 3

2 Abfallentsorgung ------------------------------------------------------------------------ 5

3 Zeitplan ----------------------------------------------------------------------------------- 5

4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls ---------------------------------- 7

5 Bioinformatik --------------------------------------------------------------------------- 12

6 Einführung in Origin ------------------------------------------------------------------ 13

7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern ---------------------------------------------- 21

8 Der Peptidtransporter TAP ---------------------------------------------------------- 31

8.1 Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A) ------------------------------------- 34

8.2 Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B) --------------------------- 39

8.3 Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP (Versuch 1C) ---------- 42

8.4 Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D) ------------------------------------ 45

8.5 Peptidtransportassay (Versuch 1E) -------------------------------------------------------------------- 51

9 Glutathion-S-Transferase ------------------------------------------------------------ 53

9.1 Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A) ------------------------------------------------------- 56

9.2 Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B) -------------------------------------------------------------- 59

9.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C) ------------------------------------------------ 63

9.4 Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D)---------------------------------- 66

9.5 Enzymkinetik (Versuch 2E) ----------------------------------------------------------------------------- 68

9.6 FRET-Messung (Versuch 2F) --------------------------------------------------------------------------- 72

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Allgemeines 3

1 Allgemeines

Das Biochemische Praktikum im Rahmen des Praktikums „Zelluläre Biochemie“ dauert 3

Wochen und läuft für alle Gruppen jeweils von Montag bis Donnerstag ab 9.00 Uhr s.t.

(Ausnahmen siehe Zeitplan). Freitag ist jeweils „Riedberg-Tag“ und ist für Vorlesungen

reserviert.

Für die Gruppen A1 – A10 findet das Praktikum vom 2.12. bis 19.12.13 und für die Gruppen

B1 – B11 vom 13.01. bis 30.01.14 im Institut für Biochemie statt.

Vorbereitungs- und Kontrollseminare finden nach Bedarf statt und werden zeitlich günstig in

das Praktikum eingepasst.

Von den Praktikumsteilnehmern wird erwartet, dass sie sich anhand der Skripte auf der

Biochemie Homepage gut auf das Praktikum vorbereiten.

Nach dem Ende des Praktikums liefert jede Gruppe (A1,.....B1,....) ein ausgedrucktes

Gruppenprotokoll getrennt nach Teilversuchen bei den Versuchsbetreuern (TAP 1A–1E und

GST 2A-2E) ab (Deadline: 28.02.14). Jedes Protokoll ist mit einem Deckblatt zu versehen,

auf dem der Teilversuch, die Gruppe und die Teilnehmer vermerkt sind, sowie die

Emailadresse des Verfassers. Die korrigierten Protokolle werden am 21.03.14 persönlich

von den Studenten abgeholt. Endgültige Abgabe der verbesserten Endversion beim Betreuer:

4.04.14. Bei ungenügender Ausarbeitung muss der Praktikumsteil wiederholt werden. Erst die

verbesserte Endversion wird vom Betreuer abgezeichnet und dann bei Dr. Abele archiviert.

Der Protokollaufbau richtet sich nach dem einer Publikation: a. Einleitung, b. Material und

Methoden, c. Ergebnisse, d. Diskussion. Der Teil Material und Methoden darf sehr kurz sein

oder weggelassen werden, muss aber im Falle von Abweichungen vom Skript dringend

detailliert geschrieben werden.

Am letzten Praktikumstag findet eine Präsentation der Ergebnisse statt. Die Powerpoint-

Präsentation umfasst eine Einleitung, in der der Versuch dargestellt wird. Anschließend

werden die Ergebnisse vorgestellt und kritisch diskutiert. Bei Versuchen, bei denen

unterschiedliche Eigenschaften der Proteine untersucht wurden, werden die Ergebnisse aller

Gruppen dargestellt.

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Allgemeines 4

Als Abschlussprüfung findet ein ca. 30 minütiges Einzelkolloquium in der Woche vom 17.

– 21.02.14 statt. Die Termine werden vor den Weihnachtsferien bekanntgegeben.

Praktikumsleitung Prof. Robert Tampé

PD. Dr. Rupert Abele

Betreuer Andreas Blees

Markus Braner

Hanna Fischbach

Karl Gatterdam

Volker Gatterdam

Milan Gerovac

Elisa Hain

Irina Jan

Kristin Kiosze

Alina Kollmannsperger

Anne Nöll

Elina Nürenberg

Tina Puth

Katrin Schanner

Sabine Schmidt

Michael Urban

Agnes Wycisk

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Abfallentsorgung 5

2 Abfallentsorgung

Zu Beginn der Laborarbeit erfolgt eine Unterweisung in die Laborarbeit. Um den anfallenden

Abfall sachgerecht zu entsorgen, gibt es einen Entsorgungsplan:

Abfallart Entsorgung Ort

Wässrige Säuren und Laugen Kanalisation (nach

Neutralisation)

Waschbecken

Organische Lösungsmittel z.B.

Acetonitril (ohne Feststoffe, Ether und

Schwermetalle)

Weißer 5 L Kanister Abzug Raum 1

Schwermetalle (z.B. Cu, Ni, Fe, Pb, Cd,

Hg)

Schwarzer 10 L Kanister Abzug

Glasbruch Spezialbehälter Unter Waschbecken in Raum 1

Acrylamid (polymerisiert) Hausmül Mülleimer

Mikrobiell verunreinigt autoklavieren Autoklaviertüten in weißen

Ständern (voll? weiße Tonne) +

Autoklav Hausmüll

Pipetten ab 2 ml Desinfektion in Speziallösung weiße runde Behälter auf dem

Boden

Leergut (Glas) Ausgespült oder ausgedampft Lösungsmittellager

Skalpelle, Kanülen, scharfe Gegenstände

(auch mikrobiell verunreinigt)

Gelbe Behälter

autoklavieren

Autoklav

3 Zeitplan

Das Praktikum besteht aus zwei großen Blöcken. Zuerst findet am Montag eine allgemeine

Einleitung statt (Treffpunkt Biozentrum N100 R1.14 um 9 h). Am Montag und Dienstag

wird das Internet als Werkzeug für biochemische Studien vorgestellt und grundlegende

Methoden des Laboralltags durchgeführt. Gruppe 1 – 5 sind morgens an den Computern und

nachmittags im Labor und Gruppe 6 – 11 umgekehrt. Daran schließen sich Experimente mit

dem Peptidtransporter TAP an (Versuch 1). In der zweiten Hälfte des Praktikums werden Sie

biochemische Studien mit dem Fusionsprotein bestehend aus der Gluthationtransferase und

GFP durchführen (Versuch 2). Am letzten Tag findet ein Seminar statt, in dem jede Gruppe

einen Versuch aus dem Praktikum darstellt und noch offene Fragen diskutiert werden. Dabei

stellt jede Gruppe die Ergebnisse aller Gruppen von diesem Versuch vor.

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Zeitplan 6

Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag

1. Woche

9 h Einführung1

Bioinformatik3/

Puffer/Medium

Gr. 1 – 5 Bioinf.

Vorm.

Gr. 6 – 11 Bioinf.

nachm.

9 h

Bioinformatik3 /

Puffer/Medium

Gr. 1 – 5 Bioinf.

Vorm.

Gr. 6 – 11 Bioinf.

nachm.

9 h Vortrag1

Gr. 1-11

V 1A

Gr. 1-4 (ab 15 h)

Vorkultur animpfen

9 h

Gr. 1-4 V 1B

Gr. 5-8 V 1C

Gr. 9-11 V 1D

Gr. 1-4

GST Expression

(V 2A)

2. Woche

9 h

Gr. 1-4 V 1E

Gr. 5-8 V 1B

Gr. 9-11 V 1C

Gr. 9-11 (ab 15 h)

Vorkultur animpfen

9 h

Gr. 1-4 V 1D

Gr. 5-8 V 1E

Gr. 9-11 V 1B

Gr. 9-11

GST Expression

Gr. 5-8 (ab 15 h)

Vorkultur animpfen

9 h

Gr. 1-4 V 1C

Gr. 5-8 V 1D

Gr. 9-11 V 1E

Gr. 5-8

GST Expression

(V 2A)

9 h Vortrag1

Gr. 1-11 V. 2B

3. Woche

9 h Labor

Gr. 1/2 V 2E

Gr. 3/4 V 2C

Gr. 5/6 V 2F

Gr. 7/8 V 2D

Gr. 9/10

Gr. 11

13 h

Gr. 1/2 V 2E Auswert

Gr. 3/4 V 2E

Gr. 5/6 V 2F Auswert

Gr. 7/8 V 2F

Gr. 9/10 V 2C

Gr. 11/12 V 2D

9 h Labor

Gr. 1/2 V 2F

Gr. 3/4 V 2E Auswert

Gr. 5/6 V 2E

Gr. 7/8 V 2F Auswert

Gr. 9/10 V 2D

Gr. 11 V 2C

13 h

Gr. 1/2 V 2F Auswert

Gr. 3/4 V 2D

Gr. 5/6 V 2E Auswert

Gr. 7/8 V 2C

Gr. 9/10 V 2E

Gr. 11 V 2F

9 h Labor

Gr. 1/2 V 2C

Gr. 3/4 V 2F

Gr. 5/6 V 2D

Gr. 7/8 V 2E

Gr. 9/10 V 2E Ausw

Gr. 11 V 2F Auswert

13 h

Gr. 1/2 V 2D

Gr. 3/4 V 2F Auswert

Gr. 5/6 V 2C

Gr. 7/8 V 2E Auswert

Gr. 9/10 V 2F

Gr. 11 V 2E

9 h Labor

Gr. 9/10 V 2F Auswert

Gr. 11 V 2E Auswert

Seminarvorbereitung

Gr. 1-8

12:30 h Labor

Aufräumen

13 h

Abschlussseminar2

Gr. 1 V 2F

Gr. 2 V 2E

Gr. 3 V 2D

Gr. 4 V 2C

Gr. 5 V 2B

Gr. 6 V 2A

Gr. 7 V 1E

Gr. 8 V 1D

Gr. 9 V 1C

Gr. 10/11 V 1A/B 1 Treffpunkt N100 R1.14

2 Gruppe A in N100 R1.14; Gruppe B in N100 B2

3 Beilsteinzentrum

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Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 7

4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls

Das Abfassen eines Praktikumprotokolls beginnt mit dem Aufschreiben aller Versuchsdetails

wie Versuchsdaten und Versuchsbeobachtungen in einem Laborjournal. Protokollieren Sie

alles sehr sorgfältig, vertrauen Sie nicht auf Ihr Gedächtnis! Da das Laborjounal ein

Dokument ist, ist es empfehlenswert, ein fest gebundenes Heft zu benutzen statt eines

Ringbuchs oder einer losen Blattsammlung und die Seiten alle durchzunummerieren. So

können Sie es auf Verlangen vorzeigen oder abgeben.

Alle Eintragungen in das Laborjournal können stichpunktartig knapp gehalten sein, sofern sie

nur eindeutig und vollständig sind. Im Laborjournal – aber auch nur hier und sonst nirgends –

ist auch Laborjargon (LJ) zulässig. Das krasse Gegenteil gilt für das später

niederzuschreibende, eigentliche Protokoll!

Bei der Erstellung des endgültigen Protokolls sind bestimmte formale und inhaltliche

Standards einzuhalten.

Form und Inhalt des Protokolls

Allgemeines

Das Protokoll sollte mit einem Deckblatt beginnen, das Ihnen zur Verfügung gestellt wird. Es

trägt den Namen des Praktikums und der Universität, sowie den des(r) Ver-fassers(in) und

einige zeitliche Angaben.

Strukturelle Übersichtlichkeit und sprachlicher Stil helfen dem Leser des Protokolls, den

Gang ihrer Experimente und Gedankengänge nachzuvollziehen. Unübersicht-lichkeit und

unnütze kleine Fehler lenken vom Inhalt ab. Deshalb fügen Sie Leerzei-len und Abstände ein,

wo es sinnvoll ist. Schreiben Sie Überschriften fett, gegebe-nenfalls in verschiedenen

Schriftgrößen.

Formulieren Sie wissenschaftlich kurz und prägnant und vermeiden Sie umständliche

Darstellungen in Wort und Länge der Sätze.

Gliederung einer Bachelorarbeit bzw. eines Protokolls:

Jedes Protokoll soll aus den folgenden Abschnitten bestehen:

Titelblatt: Hier wird der Titel der Arbeit, die Art der Arbeit, der Name und das Institut,

an dem die Arbeit verfasst wurde, aufgeführt.

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Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 8

Zusammenfassung: Hier wird auf maximal einer Seite das Thema der Arbeit und die

wichtigsten Ergebnisse dargestellt.

Abkürzungsverzeichnis: Hier werden alle verwendeten Abkürzungen aufgeführt

Inhaltsverzeichnis: Angabe der Kapitel mit Seitenangaben

Einleitung: Gibt eine Übersicht über das Thema und leitet zur speziellen Fragestellung

hin.

Motivation: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Welches Problem wurde

untersucht, welche Frage studiert?

▪ Material, Methoden, Versuchsdurchführung: Hier findet sich die Antwort auf die

Frage: Wie wurde die Frage, das Problem bearbeitet?

▪ Ergebnisse: Hier wird die Frage beantwortet: Welche Resultate wurden erzielt?

▪ Diskussion: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Was bedeuten diese Resultate?

▪ Literaturverzeichnis:

▪ Anhang: (wenn nötig)

A. Einleitung

Die Einleitung wird im Präteritum geschrieben. Halten Sie die Einleitung so kurz wie

möglich, aber so informativ wie notwendig. Zur Einleitung gehören auch eventuelle

Formelschemata, also z.B. wie das zu isolierende Enzym ein Edukt in das Produkt

umwandelt. Die Einleitung endet immer mit der kurzen Beschreibung der

Aufgabenstellung auch Motivation genannt.

B. Material, Methoden, Versuchsdurchführung

Unter Material sind aufzählungsartig unter Angabe des vollen Namens, einer

eventuellen Abkürzung, der Bezugsfirma und des Reinheitsgrades die verwendeten

Chemikalien, Biochemikalien und andere Hilfsmittel wie z.B. Platten für die

Dünnschichtchromatographie anzugeben.

Der Teil Methoden wird als einziger im Präsens geschrieben. Methoden müssen

nachvollziehbar und vollständig (reproduzierbar) erläutert werden. Änderungen oder

Varianten müssen klar herausgestellt werden. In dieses Kapitel gehören auch

statistische Auswertungs- und Fit-Methoden und die verwendete Software.

Die Versuchsdurchführung wird in der Vergangenheit geschrieben und beschreibt im

Detail den tatsächlichen Ablauf der Experimente. Halten Sie sich eng an Ihr

Laborjournal und beschreiben Sie, was Sie tatsächlich gemacht haben (nicht etwa, was

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Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 9

man machen könnte). Denken Sie auch im Sinne Ihrer Nachfolger an wichtige Details

wie: Welchen Zentrifugentyp habe ich über welche Zeit mit welchem Rotor bei

welcher Drehzahl benutzt. Sehr hilfreich ist hier auch die Angabe der g-Zahl!

C. Ergebnisse

Der Ergebnisteil wird ebenfalls in der Vergangenheit geschrieben. Stellen Sie all Ihre

Ergebnisse in Text und, soweit möglich und notwendig, auch in Abbildungen und

Tabellen dar. Der Leser muss mühelos Text und Inhalt nachvollziehen können.

Untergliedern Sie gegebenenfalls den Ergebnisteil. Klarheit der Darstellung ist

ungemein wichtig. Durch unklare Aussagen überlassen Sie die Interpretation dem

Leser! Stellen Sie im Text einen Bezug her zu Ihren Abbildungen und Tabellen: Dabei

wechseln Sie beim Schreiben in die Gegenwart!

Abbildungen und Tabellen werden grundsätzlich nummeriert und die Legende, die

selbsterklärend sein soll, mit einer Überschrift versehen.

Grundsätzlich müssen die Achsen von Diagrammen vernünftig skaliert, mit der Größe

beschriftet und mit einer Einheit versehen werden. Unterschiedliche Symbole müssen

erklärt werden. Denken Sie daran, dass die Beschriftungen auch nach Einfügen ins

Dokument noch lesbar sein müssen.

D. Diskussion

Die Diskussion kann, wenn Sie es für sinnvoll halten, mit dem Ergebnisteil

zusammengefasst werden. Auch die Diskussion wird im Präteritum geschrieben.

Interpretieren und diskutieren Sie Ihre Ergebnisse jeweils unter Verweis auf die

entsprechende Textstelle (Abb., Tab.). Lassen Sie sich von der Frage leiten: Wo

können aufgrund der gewählten Methodik Fehler in der Durchführung auftreten?

Dabei ist Denkarbeit erforderlich! Nicht immer können „komische Werte“ einfach auf

fehlerhafte Geräte, fehlerhaftes Material oder mögliche Fehler beim Pipettieren

geschoben werden! Bei der Diskussion ist es elementar wichtig, auf bestehende

Literatur zurückzugreifen und die erzielten Ergebnisse in einen größeren Kontext zu

setzen.

E. Literaturverzeichnis

Sobald Sie im Text Informationen aus der Literatur verwenden, müssen Sie die

entsprechende Literatur zitieren. Im Text nennen Sie dabei nur die Autoren und die

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Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 10

Jahreszahl (z.B. Tampé 2005). Bei mehr als zwei Autoren schreiben Sie „et al.“ hinter

den Erstautor (z.B. Tampé et al. 2006).

Die verwendeten Literaturzitate müssen unter Angabe der erforderlichen Details im

Literaturverzeichnis aufgeführt werden.

Beispiel: BEISMANN-DRIEMEYER, S. und TAMPE, R. (2004): Funktion der

Antigen-Transportmaschinerie TAP im zellulären Immunsystem – Angew. Chemie

116, 4104-4122.

Das Literaturverzeichnis kann alphabetisch nach Erstautor aber auch nach Erscheinen

im Text sortiert werden. Zur Erstellung des Literaturverzeichnisses empfiehlt sich das

Programm Citavi (kostenlos auf der Uni Homepage). Kontrollieren sie das

Literaturverzeichnis auf Fehler, denn nicht immer ist alles richtig abgespeichert. Bei

der Verwendung von Abkürzungen von Zeitschriften, muss die international

anerkannte Liste von „Web of Science“ verwendet werden. Auch da ist wieder zu

unterscheiden ob die Abkürzungen mit oder ohne Punkt enden.

F. Anhang

In manchen Fällen folgt noch ein Anhang, der meistens aus längeren Tabellen mit

Messdaten oder größeren Abbildungen besteht.

Schluss

Versuchen Sie beim Schreiben Ihres Protokolls vollständige und klare Sätze zu formulieren.

Lesen Sie den Text nach Fertigstellung auf Plausibilität, Aufbau und Formulierung sowie auf

Rechtschreibfehler nochmals durch und/oder bitten Sie jemand um Hilfe! Vermeiden Sie

ständige Wiederholungen, das langweilt den Leser.

Abbildungen

Jede Abbildung muss klar und deutlich sein. Die Beschriftung muss leserlich sein. Bei

Diagrammen hat jede Achse einen Titel mit Angabe der untersuchten Größe und Einheit. Jede

Abbildung hat eine logische Nummer und auch eine Überschrift. Wobei auf die Abbildung im

Text verwiesen wird. In der Legende muss soviel Information vorhanden sein, damit die

Abbildung ohne Lesen des Textes verständlich ist. Bei einem Western-Blot muss somit die

Menge an geladenem Protein, die Prozentzahl des SDS-Gels sowie die Antikörper spezifiziert

werde. Bei einer Säulenchromatographie muss das Laufmittel, der mögliche Gradient, die

Säule sowie die Menge an analysiertem Stoff angegeben werden. Auch die

Detektionswelllänge und die Flussrate sind zu nennen.

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Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 11

Bemerkung

Wenn es sinnvoll erscheint, sind Abweichungen von diesen Richtlinien erwünscht, Kreativität

wird nicht bestraft!

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Bioinformatik 12

5 Bioinformatik

Die Bioinformatik ist mittlerweile ein wichtiger Teil der biochemischen Forschung. Mit Hilfe

der Bioinformatik kann gezielt Literatur gesucht werden und DNA- und Proteinsequenzdaten

analysiert und verglichen werden.

In diesem Teil des Praktikums sollen Sie eine Übersicht über die wichtigsten Server und

Programme bekommen, die für die tägliche Arbeit hilfreich sind.

Wichtige Internetadressen für Biochemiker:

www.ncbi.nlm.nih.gov (National Center for Biotechnology informatiom)

www.rcsb.org/pdb (Brookhaven Protein data bank)

www.ebi.ac.uk/services (European Bioinformatics Institute)

http://www.embl.de/services/bioinformatics/index.php (EMBL Heidelberg)

www.expasy.org (ExPASy Proteomics server)

http://isiknowledge.com (web of science)

http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php (webcutter)

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html (Primer Design)

http://www.genebee.msu.ru/clustal/ (ClustalW/phylogenetischer Baum)

http://ezb.uni-regensburg.de/fl.phtml?bibid=UBFM (online Zugriff auf Zeitschriften)

Aufgabe

Literatur:

1. Suchen Sie die Veröffentlichung über TAP von P. Cresswell, die in Nature

veröffentlicht wurde.

2. Wieviele Veröffentlichungen über TAP erschienen in „Journal of Biologcal

Chemistry“?

3. Wie oft wurde folgende Veröffentlichung zitiert:

PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE

UNITED STATES OF AMERICA 98 (13): 7241-7246 JUN 19 2001

4. Suchen Sie verwandte Publikationen.

DNA-Sequenz:

1. Suchen Sie die DNA-Sequenz von humanem TAP1.

2. Bestimmen Sie die Schnittstelle mit dem Restriktionsenzym DraIII.

3. Translatieren Sie die Sequenz und schneiden Sie die Proteinsequenz zurecht, so dass

ein Protein mit 748 Aminosäuren entsteht (N-Terminus: MASSRCPAPR; C-

Terminus: QAPADAPE)

Protein-Sequenz:

1. Bestimmen Sie den pI, Molekulargewicht, Extinktionskoeffizienten und die

Membrantopologie von TAP1.

2. Finden Sie in ABC-Transporter konservierte Sequenzen.

3. Finden Sie zu TAP1 homologe Proteine aus Säugetieren, Fischen und Vögel.

4. Erstellen Sie einen Sequenzvergleich.

5. Erstellen Sie einen phylogenetischen Baum.

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Einführung in Origin 13

6 Einführung in Origin

Diese Anleitung dient dazu die grundlegenden Eigenschaften von Origin kennen zu lernen.

Eine detaillierte Anleitung gibt es als pdf File von OriginLab. Für das Praktikum werden drei

verschiedene Funktionen von Origin benötigt.

1. Arbeiten mit Tabellen (Workbooks in Origin)

Importieren von Daten

Modifizieren von Tabellen

Daten exportieren

2. Erstellen von Graphen

Erstellen verschiedener Graphen

Hinzufügen von Daten in einen Graph

Exportieren von Graphen

3. Kurven fitten

Linearer Fit

Nicht-linearer Fit

Erstellen eigener Gleichungen

Erstellen eines einfachen Graphen

Workbook

Das Workbook stellt die oberste Struktur zur

Organisation der Daten dar. Jedes Workbook

besteht aus mehreren Worksheets und jedes

Worksheet enthält Spalten von Daten. Es gibt

verschiedene Datenspalten wie X. Y, Z yError

etc..

Um zu verstehen wie man mit dem Workbook umgeht, versuche folgendes:

1. Wähle Datei: Neu: Workbook

2. Wähle Datei: Import: Simple ASCII und öffne in \Samples\Curve Fitting die Datei

Gaussian.dat.

3. Das Worksheet bekommt den Namen der Datei und in Sparkline gibt es eine kurze

Übersicht über die Kurvenform. Unter Langname wird angegeben was dargestellt wird

(stellt auch die Achsenbeschriftung dar). Um die Spalte C als FY-Fehler Spalte zu

markieren, mit rechter Maustaste auf den Spaltentitel klicken, Setzen als :Y

Fehlerbalken auswählen.

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Einführung in Origin 14

4. Um die Daten in einem Graphen darzustellen, werden alle Daten markiert: Zeichnen:

Symbol: Punktdiagramm auswählen.

5. Alternativ die Spalten nicht markieren und Zeichnen: Symbol: Punktdiagramm

auswählen. Es erscheint folgendes Fenster, in dem die X- und Y-Daten getrennt

ausgewählt werden können.

6. Um die Darstellung des Graphen zu verändert, muss man auf eine Achse doppel-

klicken.

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Einführung in Origin 15

7. Um ein erstellten Graphen als Template zu benutzen, muss dieses Format gespeichert

werden: Datei: Template Speichern unter.

8. Es gibt zwei Möglichkeiten Graphen zu exportieren:

a) Als Grafikdatei, dabei bietet sich das WMF Format an: Datei: Export

b) Direkt ins Dokument kopieren, wodurch der Graph auch noch verändert werden

kann.

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Einführung in Origin 16

Erstellen eines Linearen Fits

1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

2. Graph erstellen.

3. Linearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Linearer Fit: Dialog öffnen. Hier können

die Fitoptionen eingestellt werden. Bei einem Linearen Fit ist vor allem zu beachten, ob

die Gerade durch den Nullpunkt geht oder nicht.

4. Im Worksheet: FitLinear1 werden die Fitparameter und die Statistik aufgelistet. Aus

dem Fit werden folgende Parameter erhalten Steigung und Schnittpunkt mit der Y-

Achse samt Standardfehler. Zusätzlich wird in der Statistik noch die Qualität des Fits

bewertet durch z.B. den Korrelationskoeffizienten. Wichtig ist das Diagramm mit den

Residuen zu analysieren, denn hier sieht man am besten systematische Abweichungen,

die auf eine falsche Fitfunktion oder Probleme in der Messung schließen lassen. Die

Residuen stellen die Abweichung der Datenpunkte von der Fitfunktion dar.

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Einführung in Origin 17

Erstellen eines Nichtlinearen Fits

1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

2. Graph erstellen.

3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Hier

können unter Kategorie und Funktion die verschiedenen Gleichungen für die

Fitoptionen ausgewählt werden. Hierbei ist vor allem auf die richtige Gleichung und die

Gewichtung der Fehler beim Fitten zu achten.

4. Falls Daten wissentlich aus dem Fitprozess genommen werden können, so werden sie

maskiert: Daten: Datenpunkte maskieren und im Graph anklicken

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Einführung in Origin 18

Erstellen einer eigenen Gleichung

1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

2. Graph erstellen.

3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Eine

Kategorie auswählen und unter Funktion <Neu…> anklicken. Den Funktionsname

und Funktionstyp definieren. Anschließend die Variablen und Parameter definieren. Es

empfiehlt sich auch Konstanten als Parameter zu definieren. Die Funktion wird

eingegeben (Form: y=m*x + 5).

4. Vor dem Fitten Parameter anklicken und definieren, ob es sich um veränderliche

Parameter handelt oder um Konstanten mit festem Wert.

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Einführung in Origin 19

Fitten mit logarithmischen Skalen

Beim Fitten von Inhibitionskurven, bei denen die X-Achse in log10-Skala dargestellt wird,

gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder werden die Konzentrationen auf der X-Achse in log10-

Werte transformiert oder man benutzt eine selber verfasste Gleichung. Die zweite

Möglichkeit erlaubt anschließend die X-Achse in einer sinnvolleren logarithmischen Skala

darzustellen.

Darstellung mit transformierten X-Werten

1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

2. Spalte hinzufügen: Spalte: Spalte hinzufügen

3. Transformation der X-Werte: Spalte: Spaltenwerte errechnen. Zur Transformation der

A(X)-Werte gibt man nun in das geöffnete Dialogfeld ein: log(Col(A)).

4. Erstellen eines Punktdiagramms mit den transformierten X-Werten (C(X2)).

5. Fitten der Daten mit sigmoidaler Funktion: Kategorie Pharmacology; Funktion

Doseresp

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Einführung in Origin 20

Darstellung mit linearer X-Achse

1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten, Langname und Einheiten definieren.

2. Punktdiagramm erstellen.

3. X-Achse in Log10-Darstellung ändern:

4. Die bestehende DoseResp Funktion kopieren (anklicken von f(x), dann duplizieren)

und in folgende Funktion ändern:

y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-(log10(x)))*p)),danach speichern

5. Fitten mit dieser Formel.

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 21

7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern

Theoretischer Teil

Sehr kleine Mengen einer starken Säure oder einer starken Base reichen aus, die

Konzentration der Wasserstoffionen in Wasser im schwach sauren, neutralen oder schwach

alkalischen Gebiet erheblich zu verändern. Der Zusatz eines Tropfens konzentrieter Säure zu

einem Volumen reinen Wassers macht dieses deutlich sauer, beim Zufügen eines Tropfens

konzentrierter Alkalilauge wird die Lösung deutlich basisch. Gleichwohl gibt es Lösungen,

deren Wasserstoffionenkonzentration sich bei Zusatz auch größerer Mengen starker Säure

oder starker Base nur recht wenig ändert. Man bezeichnet solche Lösungen als gepuffert.

Pufferlösungen

Im Stoffwechsel laufen zahlreiche Reaktionen ab, bei denen H+-Ionen freigesetzt oder

verbraucht werden. Andererseits ist ein konstanter pH-Wert im Zytoplasma oder in

bestimmten Körperflüssigkeiten, wie z.B. dem Blut, lebenswichtig. Schon leichte

Abweichungen können zu schweren Krankheitssymptomen führen.

Stoffwechsel bedingte pH-Änderungen müssen also abgepuffert werden. Im Blut wird diese

Funktion von verschiedenen Puffersystemen wahrgenommen.

Allgemein werden Lösungen, deren pH-Wert sich bei Zugabe von Säure oder Lauge nur

wenig verändert, als Pufferlösungen bezeichnet. Sie enthalten ein konjugiertes Säure-Base-

Paar, wobei die Säure OHˉ-Ionen neutralisiert, die Base H+-Ionen.

Pufferlösungen lassen sich herstellen, indem man

▪ schwache Säuren mit ihrem Salz (z.B. Acetatpuffer aus Essigsäure und

Natriumacetat) bzw.

▪ schwache Basen mit ihrem Salz (z.B. Ammoniumpuffer aus Ammoniumchlorid und

Ammoniak) mischt.

Sind beide Spezies in genügend großer Konzentration vorhanden, reagiert der Acetatpuffer

so:

H3O+ + CH3COOˉ CH3COOH + H2O

Pufferung bei Zugabe starker Säure

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 22

Die zugegebene starke Säure reagiert vollständig zu HOAc. Dass der pH-Wert sich dennoch

geringfügig ändert, hat damit zu tun, dass die gebildete Essigsäure wieder zu einem geringen

Anteil dissoziieren kann.

OHˉ + CH3COOH CH3COOˉ + H2O

Pufferung bei Zugabe starker Base

Die Pufferwirkung zeigt sich in der Titrationskurve schwacher Säuren und Basen durch das

Plateau im Bereich des pK-Wertes, ist also der Grund für den geringen Anstieg der

Titrationskurve der Essigsäure bei pH 4 bis 6.

Ähnlich verläuft die Abpufferung starker Säuren und starker Laugen durch den

Ammoniumpuffer:

H3O+ + NH3 NH4+ + H2O

Pufferung bei Zugabe starker Säure

OHˉ + NH4+ NH3 + H2O

Pufferung bei Zugabe starker Base

In dieser Form wird der Ammoniumpuffer allerdings nur in Ausnahmefällen benutzt.

Dagegen sind Derivate des Ammoniaks wie z.B. als Triethanolammoniumpuffer und

Triethylammoniumpuffer häufig in Gebrauch (s. unten).

Puffergleichung

Das Verhalten einer Pufferlösung lässt sich auch quantitativ beschreiben. Ausgehend vom

Massenwirkungsgesetz für die Dissoziation einer Säure ergibt sich für den Acetatpuffer:

+

=S

[H ] [CH COO ]3K

[CH COOH]3

Durch Umformung erhält man:

= S

[CH COOH]3[H ] K

[CH COO ]3

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 23

Durch Logarithmieren:

= S

[CH COOH]3pH pK log

[CH COO ]3

Die Gleichung zeigt, dass der pH-Wert der Pufferlösung vom pKS-Wert der Essig-säure und

vom Verhältnis Essigsäure/Acetat bestimmt wird. In allgemeiner Form ist die Puffergleichung

als Henderson-Hasselbalch-Gleichung bekannt.

-

= S

[ A ]pH pK log

[HA]

Liegt zum Beispiel in einem Acetat-Puffer Essigsäure in einer Konzentration von 0,1 mol/L

und Acetat mit 0,5 mol/L vor, so lässt sich mit Hilfe der Puffergleichung der pH-Wert

bestimmen:

= 0,5

pH 4,8 log = 5,50,1

Liegen Säure und konjugierte Base in gleicher Konzentration vor, so ist [HA]/[Aˉ] = 1 und

die Puffergleichung wird zu pH = pKS. Die Pufferlösung kann bei diesem pH-Wert Zugaben

von Säuren und Basen gleich gut abpuffern Liegt die Säure in zehn-fach höherer

Konzentration vor, so gilt pH = pKS – 1. Der Puffer wirkt dann effektiv gegen die Zugabe von

Basen, kann aber nur noch geringe Mengen Säure abpuffern. Als Faustregel gilt deshalb für

den optimalen Einsatzbereich von Pufferlösungen:

pH = pKS ± 1

Da sich der Pufferbereich in der Titrationskurve deutlich abzeichnet, lässt sich an-hand von

Titrationskurven der pKS-Wert schwacher Säuren oder Basen ermitteln (geringste Steigung

der Kurve).

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 24

Beispiel 1: Phosphatpuffer

Phosphorsäure dissoziiert über drei Stufen:

H3PO4 + H2O H2PO4ˉ + H3O+ pKS1 = 2,0

H2PO4ˉ + H2O HPO42ˉ + H3O

+ pKS2 = 7,2

HPO42ˉ + H2O PO4

3ˉ + H3O+ pKS3 = 12,3

Die pK-Werte machen deutlich, dass die Protonenabgabe nach jeder Stufe schwieriger wird.

H3PO4 ist eine mittelstarke Säure, während H2PO4ˉ eine schwache und HPO42ˉ eine sehr

schwache Säure ist. Entsprechend sind die Plateaus der Titrationskurve verteilt.

Zu Beginn der Titration liegt der pH bei etwa 1,5. Die Lösung enthält fast nur die Spe-zies

H3PO4 und H2PO4ˉ. Durch die Zugabe der Natronlauge werden sukzessive die H3PO4-

Moleküle in H2PO4ˉ-Ionen überführt, bis beim ersten Äquivalenzpunkt (ÄP1) fast nur noch

H2PO4ˉ-Ionen vorliegen. Beim zweiten Äquivalenzpunkt (ÄP2) liegen nur noch HPO42ˉ-Ionen

vor und beim dritten (ÄP3) nur noch PO43ˉ, wobei der dritte Äquivalenzpunkt keine markante

Steigung aufweist, weil er in den pH-Bereich des Titrationsmittels Natronlauge fällt (0,1 M

NaOH hat einen pH-Wert von 13). Das Pla-teau im Bereich des pKS2 basiert auf der

Pufferung durch das konjugierte Säure-Base-Paar H2PO4ˉ/HPO42ˉ. In der Praxis wird der

Phosphatpuffer häufig verwendet, um neutrale pH-Bereiche einzustellen, denn nach pH = pKS

± 1 liegt der Pufferbe-reich zwischen pH 6,2 und 8,2.

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 25

Beispiel 2: Kohlensäurepuffer

Kohlendioxid (CO2) und Wasser sind die mengenmäßig wichtigsten Endprodukte des

Stoffwechsels. In Wasser gelöstes Kohlendioxid reagiert zur zweiprotonigen Kohlen-säure

(1), die in einer Nachfolgereaktion dissoziiert (2).

(1) CO2 + H2O H2CO3 pK = 3,1

(2) H2CO3 + H2O HCO3ˉ + H3O+ pKS1 = 3,3

Gesamtreaktion:

CO2 + 2 H2O HCO3ˉ + H3O+ pK = 6,4

Das Gleichgewicht der ersten Reaktion liegt auf der linken Seite (pK = 3,1). Löst man also

Kohlendioxid in Wasser, so liegt es vorwiegend als CO2 und nur zu einem gerin-gen Teil als

H2CO3 vor.

Reaktion (1) und (2) lassen sich zusammenziehen und die pK-Werte addieren. Das

Gleichgewicht der Gesamtreaktion liegt noch stärker auf der linken Seite: gelöstes

Kohlendioxid reagiert als schwache Säure. Die konjugierte Base ist das Hydrogen-carbonat.

Kohlendioxid und Hydrogencarbonat bilden ein Puffersystem mit einem pH-Optimum bei pH

= 6,4.

-

3=

2

[HCO ]pH 6,4 log

[CO ]

Das Kohlendioxid-Hydrogencarbonat-Puffersystem ist das bedeutendste Puffersystem des

Blutes, das auf einen pH von 7,4 gepuffert ist. Das Konzentrationsverhältnis der

Puffersubstanzen bei pH 7,4 lässt sich somit berechnen:

S

-(pH pK ) 1 3

=

2

[HCO ] 1010 10 =

[CO ] 1

Da die Reaktionskonstante aber temperaturabhängig ist, der pKS der Gesamtreaktion im Blut

bei 37°C 6,1 statt 6,4 bei 25°C beträgt, wird das Konzentrationsverhältnis dann zu:

-1,3 3

=

2

[HCO ] 2010 =

[CO ] 1

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 26

Es liegt also ein Überschuss an Hydrogencarbonat vor, so dass das Puffersystem vor allem

gegen H3O+-Ionen wirkt. Da CO2 ein Gas ist, steht das gelöste CO2 im Gleich-gewicht mit

dem CO2 der Luft in der Lunge. Hier zeigt sich eine Besonderheit dieses Puffersystems. Es

kann nämlich nicht nur H3O+-Ionen am Entstehungsort abpuffern, sondern auch das

Reaktionsprodukt aus dem Gleichgewicht entfernen:

H3O+ + HCO3ˉ → CO2 ↑ + 2 H2O

Der senkrechte Pfeil deutet an, dass das Kohlendioxid die Lösung verlässt und in die

Gasphase geht (das System verlässt). Man spricht deshalb auch von einem offenen

Puffersystem.

Praktischer Teil

1. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) pH 8,0

(HO-CH2-)3C-NH2 + H3O+ (HO-CH2-)3C-NH3

+ + H2O

FgTRIS 121,14

pK 8,1

Menge: 0,5 L

Einwage: ? g Tris

pH einstellen mit HCl

2. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) pH 7,5

(HO-CH2-)3C-NH2 + H3O+ (HO-CH2-)3C-NH3

+ + H2O

FgTRIS 121,14

pK 8,1

Menge: 0,5 L

Einwage: ? g Tris

pH einstellen mit HCl

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 27

3.a Dinatriumhydrogenphosphat/NaCl/KCl

Zunächst muss eine 1 M KCl-Lösung hergestellt werden.

FgKCl 74,55

Menge: 100 mL

Einwage: ? g KCl

Na2HPO4 14,2 g Molarität: ? M

NaCl 81,82 g Molarität: ? M

KCl (1 M) 13,25 mL Molarität: ? M

Auffüllen auf 1000 mL mit Wasser.

FgNaCl 58,44

FgNa2HPO4 141,96

3.b Natriumdihydrogenphosphat/NaCl/KCl

NaH2PO4 x H2O 2,84 g Molarität: ? M

NaCl 13,36 g Molarität: ? M

KCl (1 M) 2,65 mL Molarität: ? M

Auffüllen auf 200 mL mit Wasser.

FgNaH2PO4 x H2O 137,99

3.c 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4

Der 10x PBS-Puffer wird hergestellt, indem ein vorgelegtes Volumen von 1000 mL

Puffer Nr. 3a mit Puffer Nr. 3b auf pH 7,4 eingestellt wird.

4. 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5):

300 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung (Na2HPO4)

500 ml 0,1 ml Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (KH2PO4)

KH2PO4 wird vorgelegt und der pH von 6,5 mit 0,1 M Na2HPO4 eingestellt

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 28

5. 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0

(HOOC-CH2-)2N-CH2-CH2-N(-CH2-COOH)2

EDTA + Mg2+ Mg2+EDTA + 2 H+

FgEDTA 292,24

Menge: 0,4 L

Einwage: ? g EDTA

pH einstellen mit NaOH

6. 50 mM HEPES pH 7,4

4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure

FgHEPES 238,3

pK 7,5

Menge: 0,1 L

Einwage: ? g Hepes

pH einstellen mit NaOH

7. TBS pH 8.0:

50 mM Tris ? g FgTRIS 121,14

150 mM NaCl ? g FgNaCl 58,44

pH 8.0 eiskalt!

Menge: 4 L

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 29

8. Regenerationspuffer 1 (GST Versuch)

0,5 M Tris ? g FgTRIS 121,14

0,5 M NaCl ? g FgNaCl 58,44

pH 8.5

Menge: 0,5 L

Regenerationspuffer 2 (GST Versuch)

0.5 M Tris ? g

0,5 M NaCl ? g

pH 4.5

Menge: 0,5 L

9. Elutionspuffer GST Versuch

TBS (Puffer 8) + 10 mM GSH (Kühlschrank)

Einwage: ? g GSH FgGSH 307,32

pH 8.0 muss neu eingestellt werden, eiskalt

Menge: 200ml; IM KÜHLSCHRANK LANGERN

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Anleitung zum Ansetzen von Puffern 30

10. LB Medium

je Liter:

5g Hefeextrakt

5g NaCl

10g Trypton/Pepton Mischung

Menge: insgesamt 3,6 Liter, aufteilen in:

6 x 250ml Kolben (mit Schikane) mit je 100 ml LB-Medium

6 x 2l Kolben (mit Schikane) mit je 500ml LB-Medium

Autoklavieren!

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Der Peptidtransporter TAP 31

8 Der Peptidtransporter TAP

Der Peptidtransporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt eine

zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort (Abbildung 1). TAP transportiert Peptide, die

vornehmlich durch proteasomale Degradation von endogenen Proteinen erzeugt wurden, vom

Zytosol ins Endoplasmatische Rekikulum. Dort binden diese Peptide an MHC (major

histocompatibility complex) I Moleküle. Peptidbeladene MHC I Moleküle werden an die

Zelloberfläche transportiert, um dort cytotoxischen T-Zellen die antigene Fracht zu

präsentieren. Erkennt eine T-Zelle ein MHC I gebundenes Peptid so führt dies zur

Eliminierung dieser Virus infizierten oder entarteten Zelle.

Abbildung 1: MHC I abhängige Antigenpräsentation. Bei der klassischen MHC I Antigenpräsentation

werden endogene Proteine vornehmlich durch das Proteasom degradiert. Die Peptide werden mit Hilfe von TAP

ins Lumen des ER transportiert und dort auf MHC I Moleküle geladen. Anschließend werden die MHC I-

Peptidkomplexe an der Zelloberfläche cytotoxischen T-Zellen präsentiert. Die Faltung, Assemblierung und

Beladung der MHC I Moleküle wird durch mehrere Chaperone gesteuert.

TAP gehört der Familie der ABC-Transporter an. TAP bildet einen Heterodimer bestehend

aus TAP1 und TAP2 (Abbildung 2). Jede Untereinheit ist aus einer N-terminalen

Transmembrandomäne (TMD) und einer C-terminalen Nukleotidbindungsdomäne, die sich

im Zytosol befindet, aufgebaut. Die TMD von TAP1 besteht aus 10 und von TAP2 aus 9

Transmembranhelizes. Die TMD bildet sowohl die Translokationspore und die

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Der Peptidtransporter TAP 32

Peptidbindungsregion. Die NBD bindet über konservierte Sequenzmotive ATP und treibt

durch die ATP-Hydrolyse den Peptidtransport an.

TAP1

ER Lumen

Zytosol

TAP2

N

N

C C

Peptidbindungsregion

1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1

KerndomäneN-Domäne Kerndomäne N-Domäne

Nukleotid-

bindungs-

domäne

Transmebran-

domäne

TAP1

ER Lumen

Zytosol

TAP2

N

N

C C

Peptidbindungsregion

1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1

KerndomäneN-Domäne Kerndomäne N-Domäne

Nukleotid-

bindungs-

domäne

Transmebran-

domäne

Abbildung 2: Topologiemodell des TAP-Komplexes. TAP besteht aus den zwei Halbtransportern TAP1 und

TAP2, die je aus einer TMD und einer NBD aufgebaut sind. Die sechs C-terminalen Transmembranhelices

bilden die Kerndomäne. Die äußeren Helices sind nicht essentiell für die Transportfunktion, sondern sind an der

Rekrutierung von Tapasin beteiligt. Die Peptidbindungsregion ist gelb dargestellt.

Eine Vorraussetzung für den Peptidtransport ist die Bindung des Peptids an TAP. Im

Gegensatz zum Peptidtransport, der die ATP-Hydrolyse zwingend erfordert, ist die

Peptidbindung ATP-unabhängig. TAP bindet vorzugsweise Peptide mit einer Länge von 8 –

16 Aminosäuren, wobei die höchste Transporteffizienz für 8 – 12 Aminosäuren lange Peptide

erzielt wird. Allerdings werden auch Peptide mit einer Länge bis zu 40 Aminosäuren so wie

sterisch anspruchsvolle Peptide, die Modifikationen an den Seitenketten tragen, von TAP

erkannt und transportiert.

Mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken wurde die Peptidspezifität von TAP im

Detail untersucht. Demnach sind für die Erkennung der Peptide die drei N-terminalen und die

C-terminale Aminosäuren von Bedeutung. Da die Spezifität des C-terminalen Restes sowohl

für das Immunproteasom, TAP und auch MHC I übereinstimmt, geht man von einer

Koevolution dieser drei Faktoren der Antigenpräsentation aus. Die unterschiedliche Spezifität

von MHC I und TAP bzgl. des N-Terminus des Peptids führt dazu, dass im ER-Lumen ein

Trimmen durch Exopeptidasen erfolgt. Der mittlere Bereich des Peptides, welcher

vornehmlich an der T-Zellrezeptorbindung beteiligt ist, kann höchst divergent sein in Bezug

auf MHC I und TAP-Bindung. Dadurch wird gewährleistet, dass eine kleine Menge von

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Der Peptidtransporter TAP 33

Peptidtransportern und MHC I Molekülen eine sehr große Peptiddiversität darstellen kann,

um den Körper vor einem viralen Angriff zu schützen.

Im Rahmen dieses Praktikums sollen die enzymatischen Eigenschaften von TAP, wie z.B. die

Kinetik der Peptidbindung, die ATP-Bindung und der ATP-getriebene Transport

charakterisiert werden. Dazu müssen TAP-haltige Membranen aus Insektenzellen isoliert

werden und die Peptide für die kinetischen Untersuchungen mit Fluorophoren markiert

werden.

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Der Peptidtransporter TAP 34

8.1 Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A)

Humanes TAP, bestehend aus TAP1 und TAP2, wird mit Hilfe des Baculovirus, der die Gene

für TAP1 und TAP2 trägt, in Sf9 Insektenzellen exprimiert. Bei dem Baculovirus handelt es

sich um ein DNA-Virus, der der Familie der Baculoviridae angehört. Dieses Virus befällt

Endothelzellen des Mitteldarms von bestimmten Insekten wie Spodoptera frugiperda. Das

Baculovirusgenom besteht aus einer zirkulären, doppelsträngigen, 130 kb langen DNA. Die

Gene für TAP1 und TAP2 befinden sich auf dem Baculovirusgenom hinter dem Polyhedrin-

und P10-Promotor. Beides sind starke Promotoren, die schon kurz nach der Infektion

angeschaltet werden. Ca. 24 h nach der Infektion ist TAP im Western Blot nachweisbar. Die

Ernte der Zellen erfolgt ca. 48 h nach der Infektion. Längere Expressionszeiträume sind

ungünstig, da proteolytische Degradationsprodukte von TAP auftreten. Die Insektenzellen

werden bei einer Zelldichte von 1.8 * 106 Zellen pro ml mit einer MOI 3-5 (muliplicity of

infection, gibt das Verhältnis von Virus zu Zellen an) infiziert. Die Zellen werden nach 48h

geerntet, einmal mit PBS gewaschen und das Zellpellet bei -20 °C gelagert.

Um biochemische Versuche mit TAP durchführen zu können, werden TAP-haltige

Membranen hergestellt. Dabei werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen, nicht

aufgeschlossene Zellen, Zelltrümmer und Nuclei werden durch Zentrifugation bei niedrigen

g-Zahlen entfernt. Anschließend werden die Membranen durch eine

Ultrazentrifugationsschritt aufkonzentriert und bei -80 °C gelagert.

Material

20 mM Tris/HCl, pH 7,4

1 M DTT

2,5 M Sucroselösung

1×PBS (Phosphate buffered saline)

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4

pH 7,0

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Der Peptidtransporter TAP 35

Protease-Inhibitoren

250 mM Benzamidin in H2O

100 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in Isopropanol

Protokoll

Alle Schritte werden auf Eis oder bei 4°C (Zentrifugationen) durchgeführt.

Das Pellet einer 300 ml Sf9-Insektenzellkultur wird auf Eis aufgetaut und in 20 ml Tris-Puffer

aufgenommen, 1% (v/v) Proteaseinhibitoren und 1 mM DTT werden zugegeben. Die Zellen

werden in einem Dounce-Homogenisator durch Hoch-und Runterziehen (40×) des Pistills

(tight) aufgeschlossen. Die Suspension wird mit 2,5 M Sucroselösung zu einer

Endkonzentration von 250 mM Sucrose versetzt, noch 3x gedouncet und in ein 50 ml

Falconröhrchen überführt. Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer werden mittels

Zentrifugation pelletiert (4 min bei 200×g und 8 min bei 700×g). Der Überstand wird in ein

UZ-Röhrchen überführt und 20 min bei 20.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird

verworfen und das Pellet in 2 ml 1×PBS resuspendiert. 50-100 µl Aliquots werden in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

Protein-Bestimmung: BCA-Assay (Versuch 1A)

Die Konzentration des Gesamtproteins wird mit Hilfe eines Bicinchoninsäure (BCA) Assays

bestimmt. Der sensitive, kolorimetrische Nachweis von Proteinen bei diesem Assay resultiert

aus der Reduktion von Cu2+

zu Cu+

durch die Peptidbindung und bestimmte Aminosäuren.

BCA bildet mit dem reduzierten Kupfer einen Farbkomplex, dessen Absorption bei 584 nm

gemessen wird.

Der BCA-Test wird nach Anleitung des Herstellers (Fa. Pierce) durchgeführt. Die

Standardkurve mit 7 Punkten wird wie folgt zusammenpipettiert:

Verdünnung PBS BSA-Quelle BSA Endkonzentration µg/ml

A 1000 µl 53 µl stock [2 mg/ml] 100 µg/ml

B 100 µl 300 µl Verdünnung A 75 µg/ml

C 375 µl 375 µl Verdünnung A 50 µg/ml

D 375 µl 375 µl Verdünnung C 25 µg/ml

E 375 µl 375 µl Verdünnung D 12,5 µg/ml

F 375 µl 375 µl Verdünnung E 6,25 µg/ml

G 375 µl - 0 µg/ml

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Der Peptidtransporter TAP 36

Die zu messenden Proben werden in verschiedenen Konzentrationen vermessen: 1:10, 1:100,

1:200, 1:500 und 1:1000 verdünnt in PBS. Die Anzahl der einzelnen Messungen des BCA-

Testes wird berechnet und die Färbelösung laut folgender Formel angesetzt (pro Messung

werden 150 µl Färbelösung benötigt). Alle Proben und Standardpunkte werden in Duplikaten

vermessen.

Ansatz der Färbelösung

25 Teile Komponente A

24 Teile Komponente B

1 Teil Komponente C Gesamt 50 Teile

Aufgrund von Pipettierfehlern wird empfohlen, 10 % mehr Färbelösung als benötigt

anzusetzen.

150 µl angesetzte Färbelösung und 150 µl verdünnte Probe werden in einer Mikrotiterplatte

gemischt. Die Platte wird mittels Parafilm vor Verdunstung geschützt und für 30 min bei 37

°C inkubiert. Anschließend werden die Absorptionen am Fluostar bei einer Wellenlänge von

584 nm ermittelt und die Proteinkonzentration berechnet.

Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid (Versuch 1A)

Der Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid dient der Quantifizierung

von TAP in den Membranen. Aufgrund der Tatsache, dass in Membranen gegen einen großen

Hintergrund von Proteinen gearbeitet wird, bietet dieser Assay die Möglichkeit, die Menge an

TAP über die Menge an TAP-spezifisch gebundenem Peptid zu bestimmen. Die Spezifität der

Bindung wird durch einen 400fachen Überschuss an unmarkiertem Kompetitor Peptid

bestimmt.

Material

Peptide

Fluoreszenz Peptid (RRYC(F)KSTEL) C4F 30 µM

Kompetitor Peptid (RRYQKSTEL) R9LQK 3.5 mM

1×PBS (Phosphate buffered saline)

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4

pH 7,0

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Der Peptidtransporter TAP 37

Lyse-Puffer

1xPBS pH 7.0

SDS 1% (w/v)

Platte (Fluoplate)

96-well schwarz, für Fluoreszenz Messungen

Protokoll

1. TAP – Bestimmung mittels Zentrifugationsassay (3fach-Bestimmung)

Tabelle 1

Bindung Kompetitor

TAP1/2 100 µl 100 µl

C4F Peptid [30 µM] 2.5 µl

2.5 µl

Kompetitor Peptid [R9LQK, 3.5 mM] - 8.5 µl

PBS

47.5 µl

39µl

1. zu 150 µl TAP-haltigen Membranen werden 500 µl PBS gegeben.

2. Wie in Tabelle 1 dargestellt, alle Komponenten bis auf TAP-haltige Membranen (wie

in 1 verdünnt) zusammenpipettieren (Die Messung erfolgt in Triplikaten).

3. Durch Zugabe der TAP-haltigen Membranen die Bindung starten.

4. 15 min auf Eis inkubieren.

5. Bindungsansatz durch Zugabe von 1 ml eiskaltem PBS verdünnen und anschließend

sofort bei 14.000 rpm und 4°C für 8 min abzentrifugieren.

6. Pellets in 100 µl eiskaltem PBS resuspendieren und anschließend nochmals mit 900 µl

PBS verdünnen (zügig arbeiten).

7. Zentrifugation bei 14.000 rpm bei 4°C für 8 min.

8. Pellets in 300 µl Lyse-Puffer bei Raumtemperatur resuspendieren und 10 min

inkubieren.

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Der Peptidtransporter TAP 38

9. Jeweils 250 µl der lysierten TAP-haltigen Membranen bzw. 250 µl der Standardreihe

in ein Well der Fluoreszenz-Platte überführen und die Fluoreszenz am ELISA-Reader

vermessen ( λex/em = 485/520 nm)

2. Erstellen der Standardkurve

Tabelle 2

C4F Endkonz. 0 nM 2 nM 4 nM 8 nM 10 nM

Lysis-Puffer 600 µl 596 µl 592 µl 584 µl 580 µl

C4F Peptid (300 nM) 0 4 µl 8 µl 16 µl 20 µl

Auswertung

Bestimmung der TAP-Konzentration:

Anhand der Standardkurve soll die Menge an TAP (Mw TAP1/2: 150 kDa)

bestimmt werden

a. Konzentration in mol/l

b. in Gewichtsprozenten der Gesamtproteinmenge

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Der Peptidtransporter TAP 39

8.2 Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B)

Zur biochemischen Charakterisierung von TAP werden Fluoreszenz-markierte Peptide

verwendet. Die Markierung des Peptides, welches ein Cystein enthält, erfolgt über dessen

nukleophilen Angriff an den mit einer reaktiven Gruppe (z. B. Iodoacetamido, Maleimido)

funktionalisierten Fluorophor. Zur Entfernung freien Farbstoffs und nicht markiertem Peptid

wird im Anschluss an die Reaktion das Reaktionsgemisch über eine „reversed phase high

performance liquid chromatography“ (RP-HPLC) aufgereinigt. Die vereinigten

Elutionsfraktionen werden zur Entfernung des Lösungsmittels lyophyilisiert

(gefriergetrocknet). Die Qualität des aufgereinigten Produkts wird mittels analytischer HPLC

und MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass

spectrometry) verifiziert.

Material

10x PBS pH 6.5

1.37 M NaCl

27 mM KCl

100 mM Na2HPO4

20 mM KH2PO4

Tricinpuffer

100 mM Tricin pH 9.0

PBS/DMF (Dimethylformamid)

PBS pH 6.5

20 % (v/v) DMF

Fluorophor

50 mM in 100 % DMF lösen

Peptid

3.5 mM Peptid in PBS/DMF lösen

RP-HPLC

HPLC Anlage der Firma Jasco

Säule: PerfectSil-300ODS-C18 5 µm Protein & Peptid Säule (4.6 x 250 mm)

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Der Peptidtransporter TAP 40

Äquilibrierung der Säule und Entwicklung eines Elutionsgradienten

Linearer Gradient von 5 auf 100 % Acetonitril (ACN) in 20 min + Waschschritt:

Eluent A: H2O + 0.1 % TFA (trifluoroacetic acid)

Eluent B: ACN + 0.1 % TFA

Flussrate: 1 mL/min

0 – 20 min linearer Gradient 5 – 100 % B (1 mL/min)

20 – 24 min 100 % B (1 mL/min)

24 – 25 min linearer Gradient 100 – 5 % B (1.5 mL/min)

25 – 30 min 5 % B (1.5 mL/min)

Ein alternatives Programm zur Reinigung des Reaktionsgemisches muss anschließend

etabliert werden, um eine optimale Trennung der Substanzen zu gewährleisten.

Protokoll

Zu Beginn des Praktikumsversuches werden sowohl die Peptidsequenz als auch die

chemische Zusammensetzung des Fluorophors bekannt gegeben und der entsprechende

Reaktionsansatz berechnet. Nach Lösen der Edukte werden der frisch angesetzten

Peptidlösung 10 µL und der Fluorophorlösung 1 µL entnommen. Diese werden mit je

400 µL Wasser verdünnt und zur späteren Zuordnung der einzelnen Peaks lichtgeschützt

aufbewahrt. Die verbleibenden Eduktlösungen werden zur Vermeidung von Nebenreaktionen

(Welche?) möglichst schnell gemischt und für ca. 60 min im Dunkeln bei Raumtemperatur

inkubiert. Im Anschluss erfolgt die Reinigung des Reaktionsgemisches mittels RP-HPLC.

Zunächst muss ein geeigneter Elutionsgradient etabliert werden, um das Produkt von den

Edukten zu trennen. Dazu werden pro Lauf 10 µL des Reaktionsansatzes auf die Säule

aufgetragen. Nach der Etablierung eines Gradienten werden mit diesem zusätzlich die Edukte

analysiert, um die Peaks den einzelnen Substanzen zweifelsfrei zuordnen zu können und eine

Quantifizierung der Produktmenge über die Peakflächen zu ermöglichen. Abschließend wird

der Rest des Reaktionsgemisches mit dem etablierten Gradienten aufgetrennt und das

Säuleneluat in 0.5 mL Fraktionen gesammelt. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt,

in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophylisiert. Am nächsten Tag wird das

Peptid in 100 µL Wasser gelöst und dessen Konzentration über die Absorption des

Fluorophors bestimmt. Dazu werden eine 1:10 und 1:100 Verdünnung in Tricin-Puffer pH 9

hergestellt (jeweils 20 µL) und mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrometers die Absorption

gemessen. Zur Verifizierung werden nochmals 20 µL des markierten Peptids mittels HPLC

analysiert und die Masse mittels MALDI-TOF-MS an einem Voyager-DE (PerSeptive

Biosystems) Massenspektrometer bestimmt. Dazu werden 0.5 µL des markierten Peptids mit

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Der Peptidtransporter TAP 41

0.5 µL gesättigter -Cyano-4-hydroxyzimtsäure in Wasser/Acetonitril/TFA (33:67:0.1) auf

dem Probenteller gemischt. Durch Verdunstung bilden sich Kristalle für die MALDI-TOF-

MS (Die Massenbestimmung findet nicht während des Praktikums statt).

Auswertung

Bestimmen Sie die Ausbeute der Markierungsreaktion über zwei verschiedene Ansätze!

a) Integration der Peakflächen von Produkt und Edukten

b) Konzentrationsbestimmung des Produktes über UV/VIS-Spektroskopie

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Der Peptidtransporter TAP 42

8.3 Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP

(Versuch 1C)

Der Peptidtransporter TAP transportiert Peptide vom Zytosol ins Lumen des

Endoplasmatischen Retikulums. Die höchste Transporteffizienz wird für Peptide mit einer

Länge von 8 – 12 Aminosäuren beobachtet. Die Spezifität der Peptide beschränkt sich auf die

drei N-terminalen und den C-terminalen Aminosäurenrest(e). Bevor die Peptide jedoch

transportiert werden, binden sie an TAP.

In diesem Praktikumsversuch soll in einem Bindungssättigungsexperiment mit den zuvor

isolierten TAP-haltigen Membranen die Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP

bestimmt werden. Dazu wird die Peptidbindung an TAP in Abhängigkeit von der

Peptidkonzentration untersucht. Um das Peptid detektieren zu können, wurde es mit dem

Fluorophor Fluoreszein markiert, der sich mit Hilfe eines Fluoreszenzspektometers sehr

empfindlich nachweisen lässt. Als Peptid wurde ein Nonamer (RRYQC(Fluoreszein)STEL)

ausgewählt, da dies der optimalen Peptidlänge für TAP entspricht.

Material

10x PBS pH 7.0

1,37M NaCl

27mM KCl

100mM Na2HPO4

20mM KH2PO4

Bindungspuffer

1x PBS

Peptide

C4F: RRYC(Fluoreszein)KSTEL

R9LQK: RRYQKSTEL

TAP

TAP-haltige Membranen

Zum Absättigen der Filtermembranen

0,3% PEI-Lösung (Poly-ethylenimin)

Solubilisierungspuffer

1xPBS/1% SDS

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Der Peptidtransporter TAP 43

Protokoll Bindungssättigungsexperiment:

Auf einer 96-well Platte werden die TAP-haltigen Membranen, das Fluoreszein-markierte

Peptid (C4F) und das unmarkierte Kompetitorpeptid bei 4°C zusammengegeben und mit

Bindungspuffer auf das gleiche Volumen gebracht. Die Zugabe des 400-fachen molaren

Überschusses von unmarkiertem Kompetitorpeptid (RRYQKSTEL) ermöglicht die

Unterscheidung zwischen unspezifischer Bindung (an Gefäßwände, an die Lipidschicht der

Membranen) und spezifischer Assoziation an TAP.

Durch 20 min Inkubation der Proben auf Eis wird die Einstellung des

Bindungsgleichgewichtes abgewartet. Währenddessen werden Filterplatten mit einem

Porendurchmesser von 1 µm erst mit 200 µL 0,3%iger PEI-Lösung (lädt Filtermembran

positiv) für 10 min inkubiert anschließend abgesaugt. Dann werden die Proben mit 100 µl

Bindungspuffer verdünnt. So bleibt die Menge an Membranen, die in der 96-well Platte

zurückgebliebenen sind möglichst gering. Anschließend können die Proben auf die

vorbereiteten Filterplatten übertragen und ungebundenes Peptid abgesaugt werden. Die

zurückbleibenden Membranen werden dreimal durch Zugabe und Absaugen von 100 µl

kaltem Bindungspuffer gewaschen. Diese Arbeitsschritte sind wegen der einsetzenden

Dissoziation bereits gebundener Peptide sehr zeitkritisch und werden daher mit einer Multi-

Kanal-Pipette durchgeführt. Danach wird die Filterplatte von dem Filtrationsapparat

abgenommen.

Durch Zugabe von 250 µl Solubilisationspuffer (enthält 1% SDS, daher bei

Zimmertemperatur aufbewahren) wird TAP denaturiert (Achtung: Schaumbildung vermeiden)

und die gebundenen Peptide innerhalb von 5 Minuten freigesetzt. Aus den 250 µl Solubilisat

werden 200 µl entnommen und auf eine schwarze Fluoreszenzmicrotiterplatte überführt.

Um die exakte Menge an gebundenem Fluoreszein-Peptid zu quantifizieren, werden

Eichlösungen zubereitet und je 200 µl in die Fluoreszenzmicrotiterplatte pipettiert. Für alle

Proben wird mit einem Elisa-Reader (Ex/Em: 485/520 nm) die Fluoreszenz bestimmt.

Pipettierschemata:

Von allen Konzentrationen werden Triplikatbestimmungen angefertigt.

Das Pipettierschema soll sich anhand folgender Endkonzentrationen von Fluoreszenz-Peptid,

Kompetitor-Peptid (400 x Überschuss, jedoch min. 1µl von der 4,2mM Stocklösung) und

TAP-haltigen Membranen (40 µg Gesamtproteinmenge/“well“) erstellt werden. Das

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Der Peptidtransporter TAP 44

Gesamtvolumen beträgt 50 µl. Die Stocklösung des C4F Peptids beträgt 10 µM. Aus dieser

Stocklösung müssen X weitere Verdünnungen (C4F X nM) angesetzt werden, um die im

Pipettierschema angegebenen C4F Konzentration (3-300 nM) pipettieren zu können.

Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment

Probe C4F

Endkonz.

[nM]

Kom-

petitor

R9LQK

TAP

5mg/ml

[µl]

C4F

X

nM

C4F

X

nM

C4F

X

nM

C4F

X

nM

C4F

X

nM

R9LQK

4,2 mM

Bindung-

spuffer

[µl]

1-3 3 -

4-6 +

7-9 10 -

10-12 +

13-15 30 -

16-18

19-21 60 -

22-24 +

25-27 100 -

28-30 +

31-33 200 -

34-36 +

37-39 300 -

40-42 +

Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment Eichgerade:

Konzentration [nM] 0 0.5 2.5 5 7.5 10

Fluoreszein-Peptid [µl]#

-

3#

15#

30#

45#

60#

Solubilisationspuffer [µl] 600 597 585 570 555 540

# aus Stocklösung: 100 nM

Auswertung

1. Stellen Sie eine Eichbeziehung zwischen der Fluoreszenzintensität im Emissionsmaximum

und der C4F-Peptidkonzentration her.

2. Wie ist der Kd-Wert für das untersuchte Peptid?

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Der Peptidtransporter TAP 45

8.4 Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D)

Als Mitglied der ABC-Transporterfamilie besitzt TAP die Eigenschaft ATP zu hydrolysieren,

um den Transport von Peptiden über die ER-Membran zu energetisieren. Eine Voraussetzung

für die ATP-Hydrolyse ist die ATP-Bindung. Sowohl TAP1 als auch TAP2 besitzen eine

Nukleotidbindungsdomäne (NBD). Beide NBDs bilden zusammen zwei ATP-Bindestellen,

die durch hochkonservierte Motive charaktrisiert sind.

In diesem Versuch wird die Affinität von TAP für verschiedene Nukleotiddi- und

triphosphate mittels Kompetitionsexperimenten bestimmt. Dabei wird über Immunoblotting

die Nukleotid abhängige Kompetition von TAP von ATP-Agarose quantifiziert.

Material

Membran

TAP-haltige Membranen (12,5 mg Gesamtprotein)

Solubilisierung-Puffer (10 ml)

20 mM HEPES pH 7.4

150 mM NaCl

1 mM KCl

5 mM MgCl2

2% NP-40

15% Glycerin

Wasch-Puffer (50 ml)

20 mM HEPES pH 7.4

150 mM NaCl

1 mM KCl

5 mM MgCl2

0.2% NP-40

15% Glycerin

ATP-Agarose (32 mg)

C8-immobilisierte ATP-Agarose

Stocklösungen

200 mM HEPES pH 7,4

1,5 M NaCl

1 M MgCl2

1 M KCl

100% NP-40

86% Glycerin ( = 1,23 g/ml)

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Der Peptidtransporter TAP 46

Protokoll

Wichtig: Alle folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt! Sowohl die Puffer als

auch die Zentrifuge müssen kalt sein.

Solubilisierung:

Zu TAP-haltigen Membranen (12,5 mg Gesamtprotein) wird das gleiche Volumen PBS

gegeben und die Membrane werden auf Eis aufgetaut. Anschließend werden die Membranen

8 min bei 4°C und 14000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 2,5 ml Solubilisierung-Puffer

resuspendiert und mindestens 30 min auf Eis inkubiert (Achtung: Luftblasen vermeiden!).

Anschließend wird der Solubilisierungs-Ansatz 30 min bei 4°C und 80.000 rpm im TLA-110

Rotor (Tisch-Ultrazentrifuge) zentrifugiert.

Vorbereiten der ATP-Agarose:

Während der Zentrifugation wird die ATP-Agarose vorbereitet. Es werden 3,5 mg ATP-

Agarose pro Ansatz benötigt, d.h. insgesamt werden 28 mg auf einer Feinwaage abgewogen.

Die Gesamtmenge an ATP-Agarose wird in H2O aufgenommen und 30 min inkubiert (1 ml

pro 3,5 mg). Die Beads werden dann zweimal mit 4 ml Wasch-Puffer gewaschen (2 min @

200x g, 4°C). Anschließend werden die Beads gleichmäßig auf die verschiedenen Ansätze

verteilt. Dazu werden die Beads in 4 ml Waschpuffer aufgenommen und jeweils 500 µl auf

ein Reaktionsgefäß gegeben (wichtig: immer auf Eis und nie austrocknen lassen).

Vorbereiten der Nukleotide:

Es müssen 8 verschiedene Ansätze mit verschiedenen Nukleotidkozentrationen vorbereitet

werden. Das Gesamtvolumen eines Ansatzes beträgt 300 µl. Von diesen 300 µl sind 250 µl

Solubilisat – der Rest besteht aus Wasch-Puffer und Nukleotid.

Es soll der IC50-Wert für verschiedene Nukleotide bestimmt werden (ATP, ADP, CTP und

GTP) – jeweils eine Gruppe wird einen IC50 Wert bestimmen.

Nachdem die Zentrifugation für das Solubilisat abgeschlossen ist, kann das Solubilisat

abgenommen werden und jeweils 250 µl auf den Nukleotidansatz gegeben werden.

Inzwischen werden die Beads nochmals abzentrifugiert und der Überstand verworfen

(Achtung keine Beads mit abnehmen). Nach 15 min werden die Nukleotidansätze auf die

vorbereiteten Beads gegeben 1 h bei 4°C rotierend inkubiert.

Die Ansätze werden danach 3 mal mit 500 µl Wasch-Puffer gewaschen (jeweils 2 min bei

200x g zentrifugieren). Die Beads werden in 50 µl 3x SDS-Ladepuffer resuspendiert und

20 min bei 65°C inkubiert. Danach werden die Beads bei 21000x g abzentrifugiert. 15 µl des

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Der Peptidtransporter TAP 47

Überstands der Proben und 4 µl vom Marker werden auf das Gel geladen, das Gel gefahren

und TAP durch den Western-Blot sichtbar gemacht.

Folgende Konzentrationen im jeweiligen Ansatz werden benötigt:

Enkonzentration

Nukleotid [µM] 0 3 10 30 100 300 1000 5000

c (Nukleotid)

V (Nucleotid)

V (Wasch-P.)

V(Solubilisat) 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl

V (gesamt) 300 µl

Kleinere Volumina als 1 µl können nicht exakt pipettiert werden. Es sollten nicht mehr als

zwei Vorverdünnungen vom Nukleotid gemacht werden. c - Konzentration; V – Volumen

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen

diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die

Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro

Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem

Molekulargewicht getrennt werden.

Materialien

BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur

30% Acrylamid/Bisacrylamid (Verhältnis 37,5/1))

Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/ HCl, 0,4 % SDS, pH 8,8

Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/ HCl 0,4 % SDS, pH 6,8

10% APS (Ammoniumperoxidsulfat)

TEMED

Lauf-Puffer:

25 mM Tris/HCl

192 mM Glycin

0.1% (w/v) SDS

pH 8.8

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Der Peptidtransporter TAP 48

Protokoll

Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der

Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema

angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend

mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe

Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist,

wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die

Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (eingeschlagen in feuchte Papiere und

Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert.

Pipettierschema für 2 SDS-PAGE Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems:

Trenngel 10% Sammelgel 5%

H2O 3,95 ml 2,7 ml

Acrylamid/Bisacrylamid 3,1 ml 650 µl

Trenngelpuffer 3,95 ml -

Sammelgelpuffer - 1,1 ml

APS 10% 40 µl 30 µl

TEMED 20 µl 10 µl

Immunoblot

Material

SDS-PAGE

Nitrocellulose-Membran (8 x 10 cm)

Filterpapier (4 Stück a 10 x 10 cm)

Transfer-Puffer

25 mM Tris/HCl

192 mM Glycin

0.03% (w/v) SDS

20% (v/v) Methanol

pH 7.5

10x TBS

200 mM Tris

2.5 M NaCl

5% Milch-TBS-T

1x TBS

0,1% Triton X-100

3% Milchpulver

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Der Peptidtransporter TAP 49

ECL1

9 ml H2O

1 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0

100 µl 250 mM Luminol (in DMSO)

44 µl 90 mM Coumarinsäure (in DMSO)

ECL2

9 ml H2O

1 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0

6,4 µl 30% H2O2

Antikörper

1: 20 anti-TAP1 (148.3) in 5% Milch-TBS-T

1:20000 anti-Maus Meeretichperoxidase gekoppelter Antikörper in TBS-T

Protokoll

Nitrocellulosemembran und Filterpapiere und das Gel werden zunächst in Transferpuffer

getränkt. Die Anode und Kathode (untere und obere Elektrodenplatte) des Semi-Dry-Blots

werden vor dem Auflegen der Filterpapiere mit dem Transferpuffer angefeuchtet. Auf zwei

Filterpapiere werden die Membran und anschließend das Gel aufgelegt. Zum Schluss wird

eine weitere Lage von zwei Filterpapieren auf das Gel aufgelegt. Die obere Elektrodenplatte

schließt den Aufbau ab. Achtung! Luftblassen zwischen den einzelnen Schichten des Blots

lassen sich gut durch vorsichtiges Rollen mit einem 50 ml Falcon herausdrücken. Die

Dauer des Elektrotransfers beträgt 90 min bei 100 mA pro Gel. Anschließend werden die

Membranen 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 5% Milch-TBS-T inkubiert. TAP1 wird mit dem

148.3 Hybridomüberstand nachgewiesen. Dabei wird die Membran mit dem Antikörper

mindestens 1 h bei RT (besser über Nacht bei 4°C) inkubiert. Anschließend wird die

Membran 3 x 5 min mit TBS-T gewaschen und 1 h mit dem Ziege-Anti-Maus-HRP-Konjugat

(Fc spezifisch), bei RT inkubiert. Schließlich werden die Membranen 3 x 5 min mit TBS-T

gewaschen und mit ECL1- und ECL2-Lösung 1 min inkubiert. Abschließend werden die

Membranen in einem Lumi-Imager (Roche) ausgewertet und die Daten mit dem

Computerprogramm „Origin“ mit einer sigmoidalen Kurve gefittet.

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Der Peptidtransporter TAP 50

Gleichung:

)*( 50101 nXLogIC

BABY

A: maximales Signal

B: Hintergrund

IC50: Halbmaximale Verdrängung

X: Logarithmus zur Basis 10 der ATP Konzentration

n: Hill-Koeffizient

Auswertung

Bestimmen Sie den IC50 Wert für die Nukleotide.

Im Protokoll müssen der Western-Blot, eine Tabelle mit den quantifizierten Banden und der

Graph mit dem Fit dargestellt werden.

Molekulargewichte des Markers:

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Der Peptidtransporter TAP 51

8.5 Peptidtransportassay (Versuch 1E)

Der in vitro Peptidtransportassay basiert auf der Glykosylierung des transportierten Peptids

im Lumen des Endoplasmatischen Reticulums (ER), sowie dessen spezifische Bindung an

Concanavalin A-Sepharose und anschließender Trennung von nicht transportiertem Peptid.

Der Transport wird in Abhängigkeit von der ATP-Konzentration (0.1-10 mM), Peptid-

Konzentration (0.1-2 µM), Temperatur (4-40°C), Kationen und pH (pH 5-9) untersucht.

Durch Ermittlung der Fluoreszenz im ELISA-Reader wird der Peptidtransport quantifiziert.

Material

Peptid: RRYQNSTCL (NST-f)

1×PBS (Phosphate buffered saline)

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4

pH 7,0

Stopp-Puffer 1xPBS

10 mM EDTA (pH 8,0)

Lyse-Puffer

50 mM Tris/HCl, pH 7.5

150 mM NaCl

5 mM KCl

1 mM CaCl2

1 mM MnCl2

1% NP-40

Elutionspuffer

Lyse-Puffer

200 mM Methyl α-D-Mannopyranoside

(15 ml Lyse-Puffer versetzt mit 582.6 mg Methyl α -D-Mannopyranoside)

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Der Peptidtransporter TAP 52

Gruppe 1, 2, 6: ATP-Konz. ( 0; 0,1; 0,2; 0,3; 1; 3; 6; 10 mM)

Gruppe 4, 5: Peptid-Konz. (0.1; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2 µM)

Gruppe 3, 7: Temperatur (4, 12, 24, 32, 40 °C)

Gruppe 8, 9: pH (pH 5: MES-Puffer; pH 6: Na-Phosphatpuffer; pH 7: HEPES-Puffer;

pH 8: Tris-Puffer; pH 9: CHES-Puffer)

Gruppe 10, 11: Kationen (statt 5 mM MgCl2 im Puffer: NiCl2, CuCl2, MnCl2, CaCl2)

Protokoll

Das Pipettierschema für den Transportassay sieht folgender Weise aus:

Transport Negativ Kontrolle

Membranen 20 µl 20 µl

ATP [30mM] 5 µl -

MgCl2 [100 mM] 2.5 µl 2,5 µl

1x PBS 17.5 µl 22,5 µl

NST-f peptid [10 µM] 5 µl 5 µl

Der Reaktionsansatz wird bis auf das Peptid in 1,5 ml Reaktionsgefäße vorgelegt (auf Eis!).

Je nach untersuchtem Parameter bietet es sich an, einen Mastermix anzusetzen. Der Transport

wird durch Zugabe vom NST-f Peptid gestartet und erfolgt für 3 min bei 32 °C. Anschließend

wird durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Stopp-Puffer der Transport gestoppt. Nach

Zentrifugation für 8 min bei 14000 rpm und 4°C wird der Überstand verworfen und das Pellet

in zunächst 100 µl Lyse-Puffer resuspendiert und mit weiteren 800 µl versetzt. Die

Reaktionsansätze werden nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur für 8 min

bei 14000 rpm zentrifugiert. In der Zwischenzeit werden ConA-beads (50%ige Suspension

(w/v)) in ein kleines Falcon überführt und 2 x mit Lysepuffer gewaschen (2 min @ 1000 x g).

Der Überstand der lysierten Membranen wird zu 50 µl gewaschenen ConA-beads pipettiert

und 1 h bei 4°C bzw. 30 min bei RT überkopf rotiert. Die Reaktionsansätze werden für 2 min

bei 1000 rpm und 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die ConA-beads werden

zweimal mit je 1 ml Lyse-Puffer gewaschen, mit 300 µl Elutionspuffer versetzt und 30 min

bei RT inkubiert. Die beads werden für 2 min bei 1000 rpm pelletiert, 250 µl der Elution in

eine schwarze Microtiterplatte pipettiert und im ELISA-Reader quantifiziert

(λex/em=485/520 nm).

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Glutathion-S-Transferase 53

9 Glutathion-S-Transferase

Zellen sehen sich einer ständigen Konfrontation von toxischen Substanzen ausgesetzt, die

endogen produziert oder aus der Umgebung aufgenommen werden. Zur Abwehr dieser

Toxine haben sich Abwehrmechanismen entwickelt wie zum Beispiel das sofortige

Ausschleusen von Zytostatika durch entsprechende Pumpen oder die Transformation der

Zytostatika mit anschließender Extrusion. Bei der Biotransformation wird die Detoxifizierung

in drei Phasen untergliedert (Abb. 2.1): In Phase I und II werden die zumeist hydrophoben

toxischen Substanzen in wasserlösliche Metabolite mit geringerer Toxizität umgewandelt, die

dann in Phase III durch spezielle Transportsysteme aus der Zelle ausgeschleust werden. In

Phase I werden die Zytostatika vornehmlich durch das Cytochrom P450 System oxidiert.

Phase II Enzyme katalysieren im Folgenden die Konjugation von wasserlöslichen Substraten

an die aktivierten Toxine. Meistens geschieht dies mittels Kopplung von Glutathion durch

verschiedene Glutathion-S-Transferasen (GST).

Abb.: 2.1: Schematische Darstellung der Detoxifizierung von Benzopyren: Benzopyren diffundiert durch die

Membran, wo es in mehreren Schritten zum Epoxid oxidiert wird. Nach der Aktivierung wird das Toxin durch

GST mit Glutathion markiert, wodurch es wasserlöslicher wird und von verschiedenen Transportsystemen als

Substart erkannt wird (entnommen aus Sheehan et al. 2001).

GSTs stellen dimere Enzyme dar, die hauptsächlich im Zytosol vorkommen. Es werden aber

mit geringerer Häufigkeit mikrosomale GSTs gefunden. Die GSTs bilden sowohl Homo- als

auch Heterodimer. Neben ihrer detoxifizierenden Eigenschaft sind GSTs auch noch an

anderen Reaktionen wie zB. Isomerisierung von Retinolsäure und der Prostaglandinsynthese

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Glutathion-S-Transferase 54

beteiligt oder fungieren als Peroxidasen. Zudem nehmen GSTs durch die Bindung an eine

Vielzahl verschiedener zellulärer Komponenten regulatorische Funktionen ein.

Wie schon erwähnt, bilden die GSTs dimere Enzyme, wobei jede Untereinheit ein

katalytisches Zentrum trägt (Abb. 2.2). Trotz zweier katalytischer Zentren konnte keine

Kooperativität festgestellt werden. Zur Addition oder Substitution muss die Thiolgruppe des

Glutathions in seiner anionischen Form vorliegen. Zur Stabilisierung des Thiolatanions des

Glutathions findet man im katalytischen Zentrum eine Base, die je nach Klasse von GST ein

Tyrosin oder Serin sein kann.

Humane GSTs werden in die vier Klassen Alpha, Mu, Pi und Theta eingeteilt. Neuerdings

wurden auch noch die Klassen Omega und Kappa definiert. Weitere Klassen werden in

Invertebraten gefunden.

Abbildung 2.2: Struktur der Glutathion-S-Transferase: A) Kristallstruktur der murinen Glutathion-S-Transferase

in Komplex mit 4-Hydroxynon-2-enal in einer Untereinheit und Glutathion in der anderen Untereinheit (PDB

Code: 1B48). B) Modellierte Struktur des Fusionsproteins GST-eGFP.

Schistosomen sind Helminthen, die die parasitische Krankheit Schistosomiasis (Bilharziose)

verursachen, an der weltweit mehr als 275 Millionen Menschen erkrankt sind. Die GSTs von

Schistosoma japonicum wurde detailliert untersucht, da angenommen wird, dass diese

A B

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Glutathion-S-Transferase 55

Enzyme an der Resistenz gegen Praziquantel, das meist benutzte Medikament gegen diese

Krankheit, beteiligt sind.

Im Praktikum arbeiten wir mit der 26 kDa Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma

japonicum (SJ26). Dieses 218 Aminosäure umfassende Protein ist über einen kurzen Linker

mit einem eGFP (enhanced green fluorescence protein) am C-Terminus verbunden (Abb.

2.2). Dieses Fusionsprotein umfasst 486 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 55,7

kDa. In der modellierten Struktur bildet sowohl das GST wie auch das GFP einen Dimer. Die

Fluoreszenz von eGFP vereinfacht die Detektion des Proteins und dient zur Charakterisierung

der Substratbindung über fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Literatur:

Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A.; 2001; Structure, function and evolution of

glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of

ancient enzyme superfamily. Biochem. J.; 360; p. 1 - 16

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Glutathion-S-Transferase 56

9.1 Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A)

Für die Überexpression werden kompetente BL21(DE3) Zellen mit dem Plasmid pEGGsH6

(Abb. 2.3) transformiert. N-terminal des GST-eGFP-Gens befindet sich ein TAC-Promotor.

Dieser kann durch Zugabe von IPTG (Isopropyl--D-thiogalactopyranosid) induziert werden,

wodurch es zu einer Überexpression von GST-eGFP kommt.

Abbildung 2.3: Vektorkarte des Expressionsvektors pEGGsH6. Die Expression steht unter dem starken IPTG

induzierbaren T7-Polymerase abhängigen TAC-Promotor. GST ist über einen Linker, der eine Thrombin- und

TEV (tobacco etch virus) Schnittstelle enthält, mit eGFP verbunden, das am Ende einen His6-Tag trägt. Als

weitere offene Leseraster findet man das Gen für die -Lactamase (bla) und den Lac-Repressor (lacIq).

E. coli hat eine optimale Wachstumsrate bei einer Temperatur von 37°C und einer

Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm. Nach Erreichen einer optischen Dichte (OD600) von

0,8 in LBAmp-Medium (Selektionsmarker Ampicillin) werden die Zellen mit IPTG induziert.

Die eigentliche Proteinexpression nach Induktion erfolgt bei 28°C, da bei dieser Temperatur

eine höhere Ausbeute an korrekt gefaltetem Protein und weniger Abbauprodukte zu erwarten

sind. Die Zellen werden für 5 h kultiviert und anschließend durch Zentrifugation geerntet.

Ansetzen der Medien und der Vorkultur

Materialien

Autoklavierter 250 ml Erlenmeyerkolben

Autoklaviertes LB-Medium

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Glutathion-S-Transferase 57

Autoklavierte Zahnstocher

Ampicilin [100 mg/ml]

Schüttler für die Zellkultur, Temperatur 37°C und 28°C

Medienzusammensetzung:

LB (Luria Betani)-Medium 5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

10 g Trypton/Pepton Mischung

Ad 1 l H2O, autoklavieren

Das Antibiotikum Ampicillin wird in einer Endkonzentration von 100 µg/ml zu dem

abgekühlten Medium gegeben.

Protokoll

Sterile Bedingungen Alle Arbeiten werden an der Flamme ausgeführt!

Alle geöffneten Gefäße und Deckel sollten in

unmittelbarer Nähe der Flamme liegen! Zahnstocher

nicht mit der Hand berühren!

Am Abend wird der autoklavierte 250 ml Erlenmeyerkolben unter sterilen Bedingungen mit

50 ml Ampicillin-haltigem LB-Medium gefüllt, mit Hilfe eines Zahnstochers (Zahnstocher

mit abgeflammter Pinzette anfassen) in dem vorbereiteten Medium angeimpft und über Nacht

bei 37°C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm inkubiert.

Proteinexpression in E. coli

Materialien

Autoklavierte 2 l Kolben mit 500 ml LB-Medium

Ampicillin [100 mg/ml]

IPTG Stammlösung [1 M]

50 ml Übernachtkultur

Sterile Pipetten 1 und 10 ml

Photometer, Fluoreszenzküvetten und Absorptionsküvetten

Fluoreszenzspektrometer

500 ml Zentrifugenbecher

Sorvall Zentrifuge

50 ml Falcons

Pufferzusammensetzung

100 ml 1x PBS, pH 7,4

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Glutathion-S-Transferase 58

Protokoll

Am Morgen werden 500 ml LB-Medium mit der vorbereiteten Übernachtkultur angeimpft.

Hierzu wird dem autoklavierten LB-Medium Ampicillin in einer Endkonzentration von

100 µg/ml unter sterilen Bedingungen zugegeben. Das Medium wird mit dem gesamten

Inhalt der Übernachtkultur (V = 50ml) angeimpft. Die Kulturen werden bei 37°C und

180 rpm inkubiert. In Zeitabständen von 20 min wird eine Probe von der Kultur entnommen

und im Photometer bei einer OD von 600 nm vermessen. Die Genexpression wird bei

Erreichen einer OD600 von 0,7 bis 0,8 mit IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM

induziert. Vor der Induktion wird zusätzlich zur OD600 Bestimmung die GFP-Fluoreszenz (Ex

= 470 nm; Em = 511 nm) gemessen. Nach der Induktion werden jede Stunde die optische

Dichte sowie die GFP-Fluoreszenz einer 1:10 Verdünnung (in LB-Medium) gemessen. Nach

5 Stunden Inkubation bei 28°C und 180 rpm werden die Zellen durch Zentrifugation

(6.000x g, 20 min, 4°C) geerntet (Sorvall Zentrifuge, GS-3 Rotor). Die Pellets (Überstand

nach Zentrifugation vollständig entfernen) werden in 1x PBS (40 ml) resuspendiert, in 50 ml

Falcon-Röhrchen überführt und für 20 min bei 6.000x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand

wird verworfen und die Zellen bei -20 °C gelagert.

Auswertung

Das Wachstumsverhalten der Kulturen vor und nach Induktion ist in einem Diagramm (OD600

gegen Zeit) festzuhalten. Ebenso wird ab dem Zeitpunkt der Induktion die Emission bei 511

nm im Diagramm mit angegeben (zweite y-Achse). Diese Kurven sollen im Protokoll

diskutiert werden.

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Glutathion-S-Transferase 59

9.2 Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B)

Um mit GST-eGFP biochemische Experimente durchführen zu können, ist es wichtig das

überexprimierte Protein aus E. coli Zellen zu isolieren. Hierzu werden die Zellen zunächst mit

Ultraschall aufgeschlossen. GST-eGFP wird über die Glutathionagarose (GSH-Agarose)

gereinigt, wobei das Glutathion über seine Cysteinseitenkette mit einem 12-atomigen Spacer

an die Agarose gebunden ist. Zuerst wird GST-eGFP an die GSH-Agarose gebunden, im

Anschluss folgen mehrere Waschschritte, wodurch niederaffin-assoziierte Proteine abgetrennt

werden. Die Elution findet mit 10 mM reduziertem Glutathion statt. Das Gluthation wird

durch eine Gelfiltration entfernt, da das Glutathion mit den funktionalen Assays interferiert.

WICHTIG: Es wird zwar bei Raumtemperatur gearbeitet, aber es werden nur kalte

Lösungen verwendet und das Protein wird immer auf Eis gelagert.

Reinigung mittels GSH-Agarose

Materialien:

E. coli Zellpellet mit GST-eGFP

PMSF [200 mM]

Stab-Ultraschall

Zentrifuge (Sorvall), Zentrifugatinosröhrchen (Rotor: A8.24)

Equilibrations/Wasch Puffer

Elutions Puffer

Gravity-flow Column (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen)

Konzentrator (Centriprep, molecular weight cut off (MWCO) 30 kDa)

Pufferzusammensetzung

1 l TBS pH 8,0 (filtriert durch 0,22 µm Filter): 50 mMTris

150 mMNaCl

pH 8,0, Filtrieren

25 ml Elutions Puffer: TBS + 10 mM red.GSH

pH 8,0 (Erneute pH Einstellung!)

50 ml Regenerationspuffer 1 0,5 M Tris

0,5 M NaCl;

pH 8,5

50 ml Regenerationspuffer 2 0,5 M Tris

0,5 M NaCl;

pH 4,5

10% NaN3

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Glutathion-S-Transferase 60

Protokoll

Die vorbereiteten Zellpellets werden aufgetaut (Gesamtvolumen mit TBS-Puffer auf 25 ml

auffüllen, damit die Zentrifugationsröhrchen vollständig gefüllt sind) und mit dem

Protesaseinhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in einer Endkonzentration von 1 mM

versetzt. Die Zellen werden im Eisbad 7 min beschallt (outputcontrol 5, duty cycle 50).

Anschließend werden die Zelltrümmer und unaufgeschlossene Zellen durch Zentrifugation

entfernt (A8.24 Rotor, 20 min, 20.000 rpm, 4°C). Die Reinigung des Proteins aus dem

Zelllysat erfolgt mittels GSH-Agarose. Dazu wird eine Gravity-flow Column vorbereitet. Es

werden 2 ml GSH-Agarose auf die Säule gepackt (gut resuspendieren vor der Entnahme) und

der Aufbewahrungspuffer entfernt (niemals trocken laufen lassen!). Die Säule wird mit

20 ml TBS equilibriert. 20 ml des Zelllysats werden auf die Säule gegeben und diese für

20 min im Kühlraum im Überkopfrotor inkubiert. Anschließend wird der Durchfluss

gesammelt und die Säule dreimal mit je 20 ml TBS gewaschen. Das Säulenmaterial, welches

GST-eGFP gebunden hat, wird mit 4 ml Elutionspuffer resuspendiert und anschließend

fraktionierend (5 Fraktionen mit je ca. 750 µl) eluiert. Anschließend wird für eine zweite

Reinigung das Säulenmaterial mit 20 ml TBS gewaschen und der Durchfluss der ersten

Reinigung nochmals an die Säule gebunden und wie erwähnt gewaschen und eluiert.

Regeneration der GSH-Agarose

Die GSH-Agarose kann bis zu fünfmal wieder verwendet werden ohne an Proteinausbeute

oder -reinheit zu verlieren. Zwischen jeder Verwendung muss die GSH-Agarose regeneriert

werden.

10 ml Regenerationspuffer 1 (0,5 M Tris; 0,5 M NaCl; pH 8,5)

10 ml H2O (milliQ)

10 ml Regenerationspuffer 2 (0,5 M Tris; 0,5 M NaCl; pH 4,5)

10 ml H2O (milliQ)

Zur Lagerung der GSH-Agarose werden 5 ml H2O (milliQ) mit 0,05 % NaN3 dazugegeben,

Lagerung bei 4°C.

Nach einer zweiten Aufreinigung werden die entsprechenden Eluate vereinigt und für eine

anschließende Gelfiltration mittels CentriPrep aufkonzentriert. Die Eluate werden in das

große Gefäß des Konzentrators gegeben und bei 1000x g für 10 min zentrifugiert (wichtig:

Deckel des Konzentrators und der Zentrifuge weglassen!). Da das aufkonzentrierte Protein

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Glutathion-S-Transferase 61

ein maximales Volumen von ca. 750 µl für eine folgende Umpufferung haben sollte, kann

dieser Vorgang bis zum gewünschten Volumen wiederholt werden.

WICHTIG: Nach zwei Reinigungen wird die regenerierte GSH-Agarose dem Betreuer

übergeben.

Während dieses Versuchs ist es wichtig, Proben für eine folgende Bradford-

Proteinkonzentrationsbestimmung und eine SDS-PAGE aufzuheben. Vom Lysat, dem

Flowthrough (FT), allen Waschschritten (W1-W3), von der vereinigten Elution (EL)

und des aufkonzentrierten Proteins (Konz) werden Aliquots (1/50) entnommen. Von den

Proben wird die Absorption bei 488 nm gemessen und der Rest bei -20°C gelagert.

Umpufferung mittels Gelfiltration

Materialien

Aufkonzentriertes Eluat von der GSH-Agarose-Aufreinigung

Gravity Flow Säule (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen)

5 g Sephadex G 25 (Sepharose)

25 ml Becherglas

TBS

20% Ethanol mit MEK vergällt

Nanodrop

Flüssiger Stickstoff

5 g Säulenmaterial werden mit H2O zum Quellen in einem Becherglas vermischt. Nach

30 min wird der Überstand dekantiert (entfernen von kaputtem Säulenmaterial). Daraufhin

wird zweimal mit Wasser aufgefüllt, gewartet bis sich das Material gesetzt hat und wieder der

Überstand dekantiert. Mit dem Material wird die Gravity Flow Säule beladen (am besten in

einem Schritt). Die Säule sollte nachdem sich das Material gesetzt hat ca. 15 ml beinhalten.

Nachdem die Säule mit 50 ml TBS equilibriert wurde, wird das konzentrierte GST-eGFP auf

die Säule aufgetragen (langsam, Material darf nicht aufgeschlemmt werden). Dabei ist

wichtig, dass fast keine Flüssigkeit mehr über dem Säulenbett steht. Die Proteinfraktion sollte

langsam in das Säulenmaterial hineinlaufen. Eluiert wird mittels TBS, das Eluat wird

fraktionierend in 1,5 ml Eppendorf Gefäßen gesammelt (Fraktionsgröße 0,5 ml). Das Protein

kann visuell auf der Säule verfolgt werden, so dass nicht alles fraktioniert werden muss. Die

entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und die Konzentration über die Absorption von

eGFP bei 488 nm mittels Nanodrop bestimmt (ε488=61.000/M*cm). Zusätzlich wird auch die

eGFP-Konzentration im Zelllysat und Durchfluss bestimmt. Nach der Elution wird die Säule

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Glutathion-S-Transferase 62

zuerst mit 30 ml H2O und anschließend mit 30 ml 20% Ethanol gewaschen. Die Lagerung

erfolgt in 20% Ethanol. Falls die Konzentration unter 10 µM liegt, wird das Protein nochmals

ankonzentriert. Zuletzt wird das Protein aliquotiert (Aliqouts zwischen 50 µl und 500 µl),

schockgefrostet und bei -80°C gelagert (Ein Aliquot wird für eine SDS-PAGE verwendet).

Protein-Bestimmung: Bradford-Assay

Um die Prorteinkonzentration im Zelllysat, Durchfluß und umgepufferter Fraktion zu

bestimmen wird ein Bradford-Test durchgeführt. Hierfür wird eine Standardkurve mit

6 Punkten wie folgt pipettiert:

A [1 mg/ml] B [500 µg/ml] C [250 µg/ml] D [125 µg/ml]

E

[62,5 µg/ml]

F

[0 µg/ml]

H2O 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 100 µl

BSA 50 µl

[2 mg/ml]

50 µl

[1 mg/ml]

50 µl

[500 µg/ml]

50 µl

[250 µg/ml]

50 µl

[125 µg/ml] -

Zunächst wird H2O in alle beschriftete Eppendorfgefäße vorgelegt. Im Anschluss wird in die

erste Probe BSA [2 mg/ml] pipettiert (gut mischen). 50 µl dieser Lösung werden in die

nächste Verdünnungsstufe pipettiert, mit einer neuen Pipettenspitze gemischt und wieder

50 µl in die nächste Verdünnungsstufe (usw.). 10 µl des jeweiligen Standards werden in eine

Mikrotiterplatte vorgelegt. Das Protein wird 1:10, 1:20 und 1:50 in H2O verdünnt

(Gesamtvolumen ca. 50 µl). Im Anschluss werden 10 µl jeder Verdünnung in die

Mikrotiterplatte pipettiert (alle Messpunkte werden in Dreifachbestimmung durchgeführt).

300 µl Bradfordreagenz werden zügig zu allen Proben zugegeben. Nach 10 min Inkubation

bei RT werden die Proben bei 595 nm im Fluostar vermessen.

Auswertung

Die Eichgerade mit Gleichung und Bestimmtheitsmaß werden in einem Diagramm dargestellt

und daraus die Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen berechnet, mit der der

Konzentration an GST-eGFP verglichen und die Anreicherung von GST-eGFP bestimmt.

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Glutathion-S-Transferase 63

9.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C)

Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen

diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die

Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro

Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem

Molekulargewicht getrennt werden.

Materialien

30 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1)

Tris-HCl [1,5 M], SDS [0,4%] pH 8,8

Tris-HCl [0,5 M], SDS [0,4%] pH 6,8

APS (Ammoniumperoxodisulfat) [10%]

TEMED [99%, p.a.]

BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur

Protokoll

Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der

Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema

angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend

mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe

Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist,

wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die

Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (einschlagen in feuchte Papiere und

Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert.

Pipettierschema für 2 SDS-Page Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems:

Sammelgel 5% Trenngel 12%

Acrylamid/Bisacrylamid 650 µl 3,76 ml

Tris/SDS pH 8,8 [1,5 M] - 2,82 ml

Tris/SDS pH 6,8 [0,5 M] 1,1 ml -

H2O 2,7 ml 2,82 ml

APS [10%] 30 µl 40 µl

TEMED 10 µl 20 µl

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Glutathion-S-Transferase 64

Um überprüfen zu können, ob GST-eGFP in der Expression vorhanden ist, wird eine SDS-

PAGE durchgeführt.

Materialien

Proteinproben in SDS-Ladepuffer (10-fach)

SDS-PAGE Standard

Spannungsgeber

Laufpuffer für SDS-PAGE (10-fach)

Coomassie-Färbelösung

Coomassie-Entfärbelösung

Zusammensetzung der Puffer und Lösungen:

Laufpuffer für SDS-Page (10-fach)

250 mM Tris-HCl

1,92 M Glycin

Einstellung des pH-Wertes auf 8,3

1% SDS

Coomassie-Färbelösung

0,25% (w/v) Coomassie R Brilliant Blue in

Coomassie-Entfärbelösung lösen

Coomassie-Entfärbelösung

50% H2O

40% Ethanol

10% Eisessig

SDS-PAGE-Ladepuffer

500 mM Tris-HCl, pH 8,0

44 % (v/v) Glycerin

15 % (w/v) SDS

0,5 mg/ml Bromphenolblau

1 M DTT

Probenvorbereitung

Probe Marker Lysat FT W1 W2 W3 Eluat Konzentrat Umgepuffert

Volumen [µl] -

Um die Reinigung mittels SDS-PAGE sinnvoll darzustellen, werden entsprechende Aliquots

der einzelnen Schritte aufgetragen. Damit aber ein gleichmäßiges Laufverhalten erzielt wird,

sollen in alle Taschen 15 µl aufgetragen werden. Deswegen werden die Volumina mit TBS

ergänzt. Zudem empfiehlt es sich immer die doppelte Menge anzusetzen, um

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Glutathion-S-Transferase 65

Pipettiertverluste auszugleichen. Nachdem die Proben mit Ladepuffer versetzt wurden,

werden sie für 10 min bei 95 °C inkubiert.

Protokoll

Die Gelelektrophorese-Kammern werden nach Herstellerangabe zusammengebaut und mit

Laufpuffer (1-fach) gefüllt. Je 20 µl der denaturierten Proteinproben werden auf das SDS-

Gele aufgetragen. Als Standard werden 5 µl eines Proteinmarkers mit auf das Gel

aufgetragen, mit dessen Hilfe das Molekulargewicht von GST-eGFP identifiziert wird. Die

Trennung der Proteine erfolgt bei 150 V. Nach der Gelelektrophorese werden die Gele in

Coomassie-Färbelösung für 20 min bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln gefärbt.

Anschließend wird das nicht gebundene Coomassie durch Entfärbelösung weggewaschen, so

dass die Proteinbanden sichtbar werden. Anschließend wird das Gel gewässert und zur

Dokumentation gescannt.

Auswertung

Das SDS-Gel soll sinnvoll beschriftet dargestellt werden und die Bande des GST-eGFP soll

identifiziert werden.

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Glutathion-S-Transferase 66

9.4 Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D)

Materialien

Aufgereinigts GST-eGFP

Superdex 200-Säule (PrepGrade, V = 24 ml)

TBS pH 8,0 (filtriert und frisch entgast durch Ultraschall (20 min im Ultraschallbad))

H2O (milliQ, entgast)

Äkta System (Prime)

Lösung für die Eichgerade

Aceton

Protokoll

Für die Gelfiltration wird eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200, Säulenvolumen 24 ml) mit

filtriertem TBS bei einem Fluss von 1,0 ml/min equilibriert. Anschließend werden 200 µg

GST-eGFP injiziert und das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von 280 nm

aufgezeichnet. Für die Eichgerade werden β-Amylase (200 kDa), Albumin (66 kDa) und die

Carboanhydrase (29 kDa) verwendet. Alle 3 Komponenten werden in einer Lösung

bereitgestellt (200 µg/ml). Zur Bestimmung des Totvolumens wird Bluedextran (2000 kDa)

gesondert injiziert (200 µg/ml).

Um die Qualität der Säule (der Säulenpackung) zu bestimmen, wird ein Effizienztest

durchgeführt (Bestimmung der theoretischen Böden und Peaksymmetrie). Dazu wird in die

Säule 200 µl Aceton (0,4 %) mit einer linearen Flussrate von 1,0 ml/min injiziert. Die

theoretischen Böden und die Peaksymmetrie werden mit den folgenden Formeln berechnet:

L

1000

W

V54,5

m

N2

h

e

a

bAs

N/m: Anzahl der theoretischen Böden pro Meter

Ve: Elutionsvolumen in ml

Wh: Peakbreite bei halber Höhe in ml

L: Gelbetthöhe in mm

As: Peaksymmetrie

a/b: linker/rechter Abstand zur Senkrechten des Maximums des Acetonpeaks bei 10% der

Gesamthöhe

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Glutathion-S-Transferase 67

Auswertung

Chromatogramme der Gelfiltrationsläufe erstellen und diskutieren

Kalibrierungsgerade aus dem Chromatogramm des Eichlaufs erstellen

Berechnung des Molekulargewichtes von GST-eGFP

Berechnung der theoretischen Böden und der Peaksymmetrie der Säule

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Glutathion-S-Transferase 68

9.5 Enzymkinetik (Versuch 2E)

In diesem Versuchsteil soll die Enzymkinetik von GST-eGFP in Abhängigkeit von

Glutathion, 1-Chloro-2,4-Dinitrochlorobenzol und Inhibitoren analysiert werden, um somit

Km und vmax zu bestimmen.

GST-eGFP katalysiert die nukleophile Substitution von 1-Chloro-2,4-dinitrobenzol an

reduziertes Glutathion Dabei entsteht S-(2,4-Dinitrobenzyl)-Glutathion (Abb. 2.4), das

photometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm nachweisbar ist.

Abbildung 2.4: Reaktionsgleichung der durch GST-eGFP katalysierten Reaktion. Nukleophile Substitution von

1-Chloro-2,4-Dinitrobenzol an reduziertes Glutathion. Es entsteht S-(2,4-Dinitrobenzyl)-Glutathion.

Materialien

Aufgereinigtes GST-eGFP

Phosphatpuffer (pH 6,5):

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Glutathion-S-Transferase 69

200 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung (Na2HPO4) werden vorgelegt und

der pH von 6,5 mit 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (KH2PO4) eingestellt

(ca. 350 ml)

TBS-Puffer pH 7,5 (beim Versuch mit dem Inhibitor Triphenylzinnchloride

Glutathione (GSH)

1-Chloro-2,4-dinitrobenzol (CDNB)

S-Methyl-Glutathion

Triphenylzinnchloride

Absorptionsküvetten aus PMMA

Absorptionsspektrometer mit Messschlitten

Protokoll

GST-eGFP: 2,5 µM Stammlösung in Phosphatpuffer

CDNB (M=202,55 g/mol): 100 mM Stammlösung in reinem Ethanol, zum Lösen für

5 min ins Ultraschallbad stellen (daraus weitere Verdünnungen ansetzten). Die Lösung

muss vor Licht geschützt werden.

GSH (307,33 g/mol): 300 mM Stammlösung in Phosphatpuffer

S-Methyl-GSH (321,35 g/mol): 10 mM Stammlösung in Phosphatpuffer

Triphenylzinnclorid (385,45 g/mol): 10 mM Stammlösung in reinem Ethanol (daraus

weitere Verdünnungen in Ethanol ansetzen)

WICHTIG: Zuvor berechnen wieviel der Reagenzien angesetzt werden muss!

Da das Absorptionsspektrometer über einen Messschlitten verfügt, können sechs Messungen

gleichzeitig durchgeführt werden. Für jede verwendete Küvette muss vorher eine Leer-

Messung (nur Puffer) durchgeführt werden, die Positionen sollten anschließend nicht mehr

vertauscht werden. Das Gesamtvolumen beträgt 1 ml. Die unterschiedlichen Ansätze werden

bis auf CDNB in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgemischt und mit dem entsprechenden

Puffer (Phosphatpuffer bzw. TBS) aufgefüllt (GST-eGFP (Endkonzentration immer 25 nM)

und GSH, S-Methyl-GSH oder Triphenylzinnchlorid(Konzentration entsprechend der

Ansätze). Zum Starten wird die Mischung in die Küvette gegeben, in der die entsprechenden

Konzentrationen an CDNB in absolutem Ethanol vorgelegt sind. Die Messung muss sofort

gestartet werden, da CDNB auch nichtenzymatisch mit GSH reagiert. Eine gute

Durchmischung ist wichtig, da CDNB in Wasser schwerlöslich ist und ausfallen kann. Die

Messung erfolgt im Absorptionsspektrometer bei einer Wellenlänge von 340 nm. Die

Messung findet über 10 min statt, der datapitch (minimale Zeit zwischen 2 Messungen)

beträgt 2,5 s. Der Versuch wird bei Raumtemperatur durchgeführt.

Um zu überprüfen, ob ein nichtenzymatischer Umsatz stattfindet, misst jede Gruppe eine

Probe mit den höchsten eingesetzten CDNB und GSH Konzentrationen. Ist die Absorption bei

340 nm konstant, oder der Anstieg im Vergleich mit den anderen Messungen sehr gering,

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Glutathion-S-Transferase 70

kann angenommen werden, dass der nichtenzymatische Umsatz an CDNB mit GSH

vernachlässigt werden kann.

Gruppe 1 und 4:

Apparente Km- und vmax-Bestimmung von GSH, durch vier Messungen mit je

unterschiedlichen Konzentrationen von CDNB. Dadurch die Bestimmung von Km- und vmax-

für CDNB.

CDNB 2 mM; 1 mM; 0,5 mM, 0,25 mM

GSH 10 mM; 3 mM; 1 mM; 0,3 mM; 0,1mM; 0,03 mM

Gruppe 2 und 5:

Apparente Km- und vmax-Bestimmung von CDNB, durch vier Messungen mit je

unterschiedlichen Konzentrationen von GSH. Dadurch die Bestimmung von Km- und vmax-für

GSH.

CDNB 1 mM; 0,75 mM; 0,5 mM; 0,25 mM; 0,1 mM; 0,05 mM

GSH 1 mM, 0,45 mM, 0,15 mM, 0,05 mM

Gruppe 3 und 7:

Km- und vmax-Bestimmung von GSH, bei konstanter CDNB Konzentration und vier

unterschiedlichen Konzentrationen von S-Methyl-GSH.

CDNB 1 mM

GSH 10 mM; 3 mM; 1 mM; 0,3 mM; 0,1 mM; 0,03 mM

S-Methyl-GSH 1 mM; 0,5 mM; 0,1 mM; 0 mM

Gruppe 6 und 8:

Km- und vmax-Bestimmung von GSH, bei konstanter CDNB Konzentration und fünf

unterschiedlichen Konzentrationen von Triphenylzinnchloride. Proben dieses Ansatzes

werden alle in TBS angesetzt.

CDNB 1 mM

GSH 10 mM; 3 mM; 1 mM; 0,3 mM; 0,1 mM; 0,03 mM

Triphenyltinchloride 100 µM; 10 µM; 1 µM; 0,1 µM; 0 µM

WICHTIG: Alle Triphenylzinnchloridhaltigen Abfälle werden als Schwermetallabfall

getrennt gesammelt.

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Glutathion-S-Transferase 71

Auswertung

Bei der Messung werden ASCI Dateien erhalten, welche in Spalten dargestellt werden

müssen. Die Daten werden anschließend im linearen Bereich mittels Origin gefittet, dabei

entspricht die Steigung der Absorption bei 340 nm pro Zeiteinheit. Die Absorption kann über

das Lambert-Beersche Gesetz in Umsatz von CDNB durch GST-eGFP umgerechnet werden

(mol CDNB pro min und mol GST-eGFP). Der Extinktionskoeffizient ε340 von S-(2,4-

Dinitrobenzyl)-Glutathion beträgt 9,6*103 M-1cm-1. Um nun eine Kinetik untersuchen zu

können, muss der Umsatz gegen die Substratkonzentration aufgetragen werden und ein Fit

durchgeführt werden. Mittels der Michaelis-Menten-Gleichung werden die apparenten Km-

und vmax-Werte bestimmt. Alternativ kann eine Auswertung auch mittels Lineweaver-Burk

erfolgen. Das bietet sich immer dann an, wenn keine sättigenden Substratkonzentrationen

erreicht werden können.

Bei den Messungen ohne Inhibitor, soll zusätzlich zu dem apparenten Km von GSH (Gruppe 1

und 4) bzw. CDNB (Gruppe 2 und 5) auch der wahre Km und vmax von CDNB (Gruppe 1 und

4) bzw. GSH (Gruppe 2 und 5) bestimmt werden. Dazu wird 1/vmax gegen 1/c an in der

Messung konstantem Edukt aufgetragen. Das Diagramm besteht somit aus 4 Punkten welche

linear gefittet werden müssen. Der Schnittpunkt mit der x-Achse entspricht dem – 1/Km-Wert

für CDNB (Gruppe 1 und 4) bzw. GSH (Gruppe 2 und 5) und der Schnittpunkt mit der y-

Achse entspricht 1/vmax für unendliche Substratkonzentrationen.

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Glutathion-S-Transferase 72

9.6 FRET-Messung (Versuch 2F)

Die Methode fluorescence resonance energy transfer (FRET) erlaubt es Distanzen oder

Veränderungen in Biomolekülen zu beschreiben. eGFP als Donor- und GSHAtto565 als

Akzeptorfluorophor können als FRET-Paar verwendet werden, um die Dissoziationskonstante

(Kd) zu bestimmen. Dazu werden zu einer konstanten Proteinkonzentration (GST-eGFP als

Donor) unterschiedliche Konzentrationen an Substrat (GSHAtto565 als Akzeptor) gegeben und

die Abnahme der Donoremission gemessen. Bei dieser Bestimmung müssen zusätzlich zwei

Kontrollexperimente durchgeführt werden. So muss die Donoremission bzgl. des

Verdünnungseffektes und andererseits. die direkte Fluoreszenzanregung des Akzeptors unter

den gegebenen Bedingungen bestimmt werden.

Materialien

TBS-T (1x TBS, 0,05% (v/v) Tween-20), pH 7,5

Aufgereinigtes GST-eGFP

GSHAtto565 (100 µM Stock)

GSHS-Methyl (1 mM Stock)

Fluoreszenzquarzküvette (Fassungsvolumen 1 ml; mit Rührfisch)

Fluoreszenzspektrometer

Protokoll

Im Versuch werden 1 ml GST-eGFP (10 nM in TBS-T) vorgelegt und mit verschiedenen

Mengen an GSHAtto565 titriert, so dass die unten erwähnten Endkonzentrationen erreicht

werden. Um Pipettierfehler zu vermeiden ist darauf zu achten, dass eine ausreichende Menge

an Proteinlösung in TBS-T verdünnt wird, um mehrere Experimente aus einem Ansatz

durchzuführen. Neben der Messung von GST-eGFP mit GSHAtto565, werden für die

beschriebenen Kontrollen GST-eGFP mit GSHS-Methyl und TBS-T Puffer ohne Protein mit

GSHAtto565 gemessen. Die Extinktionswellenlänge beträgt 450 nm, die Emission wird von 470

bis 650 m gemessen. Die Blende („slit“) des Exitationssmonochromators werden auf 5 nm

und des Emissionsmonochromators auf 10 nm eingestellt. Die Messungen werden jeweils bei

Raumtemperatur durchgeführt. Folgende GSHAtto565 Endkonzentrationen werden verwendet,

wobei die Ausgangskonzentration von GSHAtto565 10 und 100 µM betragen. Bei der

Kontrollmessungen mit steigenden GSHS-Methyl Konzentrationen ist darauf zu achten, dass

gleiche Volumina wie mit GSHAtto565 pipettiert werden, da diese Kontrolle dazu dient, die

Änderung der Donorfluoreszenz auf Grund der Verdünnung zu bestimmen. Bitte benötigte

Messungen für Versuch 2F beachten und mit durchführen (Skript bis zum Ende lesen!!!).

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Glutathion-S-Transferase 73

Endkonzentration GSHAtto565 bzw. GSHS-Methyl [µM]

0 µM; 0,01 µM; 0,025 µM; 0,05 µM; 0,1 µM; 0,15 µM; 0,2µM; 0,3 µM; 0,4 µM; 0,5 µM

Auswertung

Es werden drei Diagramme (eines für GST-eGFP*GSHAtto565, GST-eGFP*GSHS-Methyl, Puffer*

GSHAtto565) erstellt, in denen jeweils die entsprechenden Emissionspektren eines

Experimentes in Abhängigkeit der GSH Konzentration dargestellt werden. Für die

Bestimmung der Dissoziationskonstante Kd ist die Emission von GST-eGFP bei 511 nm

ausschlaggebend. Dabei wird die Abnahme der Emission bei 511 nm gegen die GSH

Konzentration aufgetragen. Für die weitere Korrektur muss die Fluoreszenzdifferenz

(Fluoreszenz) berechnet werden, gefolgt von der Korrektur bezüglich der

Fluoreszenzänderungen durch Verdünnung (GST-eGFP*GSHS-Methyl) und der geringen direkt

angeregten Fluoreszenz von GSHAtto565 (Puffer* GSHAtto565).

ΔFluoreszenz = Fluoreszenzmax- Fluoreszenz(GSH abhängig) für alle drei Messreihen

ΔFluoreszenz GST-eGFP mit GSH-Atto korrigiert

= ΔFluoreszenz (GST-eGFP mit GSHAtto565)

– ΔFluoreszenz (GST-eGFP mit GSHS-Methyl)

+ ΔFluoreszenz (Puffer mit GSHAtto565)

Die Daten werden mit folgenden Gleichungen gefittet und die Ergebnisse verglichen:

DF =DFmax ×L0

Kd + L0

(Gleichung 1)

0

00

2

00d00d

maxR2

LR4)LRK()LRK(FF

(Gleichung 2)

L0 = Ausgangskonzentration Ligand [GSH-ATTO565]

R0 = Ausgangskonzentration Rezeptor [GST-eGFP]

ΔFmax = ΔF bei Rezeptorsättigung

Der Kd Wert ist zu ermitteln und die Ergebnisse (auch aus den Emissionsdiagrammen) sollen

diskutiert werden.

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Glutathion-S-Transferase 74

Distanzberechnung mittels FRET zwischen Glutathionbindungsstelle und C-terminalen

GFP (Versuch 2F)

Der strahlungslose Übergang des angeregten Zustandes des Donorfluorophors auf den

Akzeptorfluorophor ist ein relativ langsamer Übergang, wobei die Effizienz des Übergangs

von vielen Faktoren, wie der Entfernung des FRET Paars zueinander (R), der

Quantenausbeute des Donors (QD), der Überlappung von Emissionsspektrum des Donors und

Absorptionsspektrum des Akzeptors (JDA) und die Orientierung der Übergangsdipole der

Fluorophore zueinander (K2) abhängt. Um die Distanz korrekt bestimmen zu können müssen

immer alle Donormoleküle ein FRET Paar mit einem Akzeptor bilden. In unserem Fall heißt

das, dass unter einer sättigenden Ligandenkonzentration gearbeitet werden muss. Die

Einstellungen am Fluoreszenzspektrometer sind die gleichen wie bei den vorhergehenden

Messungen, so dass manche Spektren direkt übernommen werden können (solange die

Einstellungen am Spektrometer identisch sind).

Zur Bestimmung der Distanz eines FRET Paares muss zuerst die FRET Effizienz (E) aus dem

Verhältnis der korrigierten Emissionsspektren des Donors in Abwesenheit (ID) und in

Gegenwart des Akzeptors (IDA) bestimmt werden.

Materialien

TBS-T, pH 7,5

Aufgereinigtes GST-eGFP

GSHATTO565 (100 µM Stock)

S-Methyl-GSH (1 mM Stock)

Fluoreszenzquarzküvette (Fassungsvolumen 1 ml; mit Rührfisch)

Fluoreszenzspektrometer

Absorptionsspektrometer

Protokoll

Die korrigierten Spektren werden wie folgt aufgenommen:

ID: (Emissionsspektrum von 10 nM GST-eGFP mit 500 nM GSHS-Methyl)

- (Emissionsspektrum von 500 nM GSHS-Methyl)

IDA: (Emissionsspektrum: 10 nM GST-eGFP mit 500 nM GSHATTO565)

- (Emissionsspektrum von 500 nM GSHS-Methyl)

- (Emissionsspektrum von 500 nM GSHATTO565)

Mittels des Verhältnisses der integrierten, korrigierten Emissionsspektren (Integration von

495 bis 540 nm) wird nach Gleichung 1 die FRET Effizienz bestimmt.

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Glutathion-S-Transferase 75

)I

I(1E

D

DA (Gleichung 1)

Über die FRET Effizienz kann die Entfernung (R) eines bestimmten Donor/Akzeptor Paares

wie folgt berechnet werden:

06

1

R)1E

1(R (Gleichung 2)

R0 stellt den Försterradius dar und gibt die Entfernung eines FRET Paares an, bei der die

FRET Effizienz 50% beträgt. R0 hängt von den spektralen Eigenschaften des Donor- und

Akzeptorfluorophors ab und wird folgendermaßen berechnet:

61

DAD

42

0 )JQnK(211,0R Einheit (Å) (Gleichung 3)

QD = Quantenausbeute Donor (eGFP = 0,6)

K2 stellt den Orientierungsfaktor dar und nimmt für schnell, frei rotierende Fluorophore einen

Wert von 2/3 an. QD ist die Quantenausbeute des Donors in Abwesenheit des Akzeptors, n ist

der refraktive Index des Mediums (1.4 für proteinhaltige wässrige Lösungen) und JDA ist das

Überlappintegral, das den Grad der Resonanz zwischen Donor- und Akzeptordipol

widerspiegelt. JDA wird durch Integration der überlappenden Fläche des Emissionsspektrums

des Donors und des Absorptionsspektrums des Akzeptors bestimmt. Dafür werden das

Emissions- und Absorptionsspektrum normalisiert (der höchste Wert entspricht eins).

JDA(l) =FD(l) ×eA × AA(l) × l 4 dlò

FD(l)dlò Einheit (M-1 cm-1 nm4) (Gleichung 4)

FD = normalisierte Donorfluoreszenz

AA = normalisierte Akzeptorabsorption

εA = Extinktionskoeffizient von ATTO565 (ε563 = 120.000 M-1 cm-1)

FD gibt die normalisierte Donoremissionsintensität bei einer Wellenlänge und A den

Absorptionskoeffizienten des Akzeptors bei dieser Wellenlänge an, was dem Produkt aus

normalisierter Absorption und Extinktionskoeffizient beim Absorptionsmaximum entspricht.

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Glutathion-S-Transferase 76

Zur Bestimmung des Überlappintegrals werden folgende Spektren aufgenommen:

Korrigiertes Emissionsspektrum des Donors (Ex: 450 nm; Em: 490 – 650 nm):

FD: (Emissionsspektrum von 10 nM GST-eGFP)

– (Emissionsspektrum TBS-T Puffer)

Korrigiertes Absorptionsspektrum des Akzeptors (450 – 650 nm):

AA: (Absorptionsspektrum von 1 µM GSHAtto565)

– (Absorptionsspektrum von 1µM GSHS-Methyl)

Spektrale Eigenschaften von enhanced eGFP:

489 = 61.000 M-1cm-1; 280 = 21.980 M-1cm-1; QD = 0,6

Auswertung

Zur Berechnung der FRET-Effizienz werden die korrigierten Emissionsspektren ID

und IDA mittels dem Programm Excel über den angegebenen Bereich integriert und

damit die FRET-Effizienz bestimmt.

Um die Distanz R zu berechnen, muss zuerst der Försterradius des FRET Paares

bestimmt werden. Dafür wird das Überlappintegral ermittelt. Dazu werden die

korrigierten, normalisierten Spektren in einem Excel-Tabellenblatt eingetragen und

über den angegebenen Bereich integriert. Mit Hilfe der spektralen Parameter von

Atto565 und eGFP wird das Überlappintergral berechnet.