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Praktikum „Zelluläre Biochemie“ am Institut für Biochemie Goethe-Universität Frankfurt am Main Max-von-Laue Str. 9 60438 Frankfurt am Main Gruppe A: 2. 19.12.2013 Gruppe B: 13. 30.01.2014

Praktikum „Zelluläre Biochemie“...Praktikum „Zelluläre Biochemie“ am Institut für Biochemie Goethe-Universität Frankfurt am Main Max-von-Laue Str. 9 60438 Frankfurt am

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  • Praktikum „Zelluläre Biochemie“

    am Institut für Biochemie

    Goethe-Universität Frankfurt am Main

    Max-von-Laue Str. 9

    60438 Frankfurt am Main

    Gruppe A: 2. – 19.12.2013

    Gruppe B: 13. – 30.01.2014

  • 2

    Inhaltsverzeichnis

    1 Allgemeines ------------------------------------------------------------------------------- 3

    2 Abfallentsorgung ------------------------------------------------------------------------ 5

    3 Zeitplan ----------------------------------------------------------------------------------- 5

    4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls ---------------------------------- 7

    5 Bioinformatik --------------------------------------------------------------------------- 12

    6 Einführung in Origin ------------------------------------------------------------------ 13

    7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern ---------------------------------------------- 21

    8 Der Peptidtransporter TAP ---------------------------------------------------------- 31

    8.1 Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A) ------------------------------------- 34

    8.2 Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B) --------------------------- 39

    8.3 Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP (Versuch 1C) ---------- 42

    8.4 Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D) ------------------------------------ 45

    8.5 Peptidtransportassay (Versuch 1E) -------------------------------------------------------------------- 51

    9 Glutathion-S-Transferase ------------------------------------------------------------ 53

    9.1 Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A) ------------------------------------------------------- 56

    9.2 Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B) -------------------------------------------------------------- 59

    9.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Versuch 2C) ------------------------------------------------ 63

    9.4 Molekulargewichtsbestimmung mit Gelfiltration (Versuch 2D)---------------------------------- 66

    9.5 Enzymkinetik (Versuch 2E) ----------------------------------------------------------------------------- 68

    9.6 FRET-Messung (Versuch 2F) --------------------------------------------------------------------------- 72

  • Allgemeines 3

    1 Allgemeines

    Das Biochemische Praktikum im Rahmen des Praktikums „Zelluläre Biochemie“ dauert 3

    Wochen und läuft für alle Gruppen jeweils von Montag bis Donnerstag ab 9.00 Uhr s.t.

    (Ausnahmen siehe Zeitplan). Freitag ist jeweils „Riedberg-Tag“ und ist für Vorlesungen

    reserviert.

    Für die Gruppen A1 – A10 findet das Praktikum vom 2.12. bis 19.12.13 und für die Gruppen

    B1 – B11 vom 13.01. bis 30.01.14 im Institut für Biochemie statt.

    Vorbereitungs- und Kontrollseminare finden nach Bedarf statt und werden zeitlich günstig in

    das Praktikum eingepasst.

    Von den Praktikumsteilnehmern wird erwartet, dass sie sich anhand der Skripte auf der

    Biochemie Homepage gut auf das Praktikum vorbereiten.

    Nach dem Ende des Praktikums liefert jede Gruppe (A1,.....B1,....) ein ausgedrucktes

    Gruppenprotokoll getrennt nach Teilversuchen bei den Versuchsbetreuern (TAP 1A–1E und

    GST 2A-2E) ab (Deadline: 28.02.14). Jedes Protokoll ist mit einem Deckblatt zu versehen,

    auf dem der Teilversuch, die Gruppe und die Teilnehmer vermerkt sind, sowie die

    Emailadresse des Verfassers. Die korrigierten Protokolle werden am 21.03.14 persönlich

    von den Studenten abgeholt. Endgültige Abgabe der verbesserten Endversion beim Betreuer:

    4.04.14. Bei ungenügender Ausarbeitung muss der Praktikumsteil wiederholt werden. Erst die

    verbesserte Endversion wird vom Betreuer abgezeichnet und dann bei Dr. Abele archiviert.

    Der Protokollaufbau richtet sich nach dem einer Publikation: a. Einleitung, b. Material und

    Methoden, c. Ergebnisse, d. Diskussion. Der Teil Material und Methoden darf sehr kurz sein

    oder weggelassen werden, muss aber im Falle von Abweichungen vom Skript dringend

    detailliert geschrieben werden.

    Am letzten Praktikumstag findet eine Präsentation der Ergebnisse statt. Die Powerpoint-

    Präsentation umfasst eine Einleitung, in der der Versuch dargestellt wird. Anschließend

    werden die Ergebnisse vorgestellt und kritisch diskutiert. Bei Versuchen, bei denen

    unterschiedliche Eigenschaften der Proteine untersucht wurden, werden die Ergebnisse aller

    Gruppen dargestellt.

  • Allgemeines 4

    Als Abschlussprüfung findet ein ca. 30 minütiges Einzelkolloquium in der Woche vom 17.

    – 21.02.14 statt. Die Termine werden vor den Weihnachtsferien bekanntgegeben.

    Praktikumsleitung Prof. Robert Tampé

    PD. Dr. Rupert Abele

    Betreuer Andreas Blees

    Markus Braner

    Hanna Fischbach

    Karl Gatterdam

    Volker Gatterdam

    Milan Gerovac

    Elisa Hain

    Irina Jan

    Kristin Kiosze

    Alina Kollmannsperger

    Anne Nöll

    Elina Nürenberg

    Tina Puth

    Katrin Schanner

    Sabine Schmidt

    Michael Urban

    Agnes Wycisk

  • Abfallentsorgung 5

    2 Abfallentsorgung

    Zu Beginn der Laborarbeit erfolgt eine Unterweisung in die Laborarbeit. Um den anfallenden

    Abfall sachgerecht zu entsorgen, gibt es einen Entsorgungsplan:

    Abfallart Entsorgung Ort

    Wässrige Säuren und Laugen Kanalisation (nach

    Neutralisation)

    Waschbecken

    Organische Lösungsmittel z.B.

    Acetonitril (ohne Feststoffe, Ether und

    Schwermetalle)

    Weißer 5 L Kanister Abzug Raum 1

    Schwermetalle (z.B. Cu, Ni, Fe, Pb, Cd,

    Hg)

    Schwarzer 10 L Kanister Abzug

    Glasbruch Spezialbehälter Unter Waschbecken in Raum 1

    Acrylamid (polymerisiert) Hausmül Mülleimer

    Mikrobiell verunreinigt autoklavieren Autoklaviertüten in weißen

    Ständern (voll? weiße Tonne) +

    Autoklav Hausmüll

    Pipetten ab 2 ml Desinfektion in Speziallösung weiße runde Behälter auf dem

    Boden

    Leergut (Glas) Ausgespült oder ausgedampft Lösungsmittellager

    Skalpelle, Kanülen, scharfe Gegenstände

    (auch mikrobiell verunreinigt)

    Gelbe Behälter

    autoklavieren

    Autoklav

    3 Zeitplan

    Das Praktikum besteht aus zwei großen Blöcken. Zuerst findet am Montag eine allgemeine

    Einleitung statt (Treffpunkt Biozentrum N100 R1.14 um 9 h). Am Montag und Dienstag

    wird das Internet als Werkzeug für biochemische Studien vorgestellt und grundlegende

    Methoden des Laboralltags durchgeführt. Gruppe 1 – 5 sind morgens an den Computern und

    nachmittags im Labor und Gruppe 6 – 11 umgekehrt. Daran schließen sich Experimente mit

    dem Peptidtransporter TAP an (Versuch 1). In der zweiten Hälfte des Praktikums werden Sie

    biochemische Studien mit dem Fusionsprotein bestehend aus der Gluthationtransferase und

    GFP durchführen (Versuch 2). Am letzten Tag findet ein Seminar statt, in dem jede Gruppe

    einen Versuch aus dem Praktikum darstellt und noch offene Fragen diskutiert werden. Dabei

    stellt jede Gruppe die Ergebnisse aller Gruppen von diesem Versuch vor.

  • Zeitplan 6

    Montag Dienstag Mittwoch Donnerstag

    1. Woche

    9 h Einführung1

    Bioinformatik3/

    Puffer/Medium

    Gr. 1 – 5 Bioinf.

    Vorm.

    Gr. 6 – 11 Bioinf.

    nachm.

    9 h

    Bioinformatik3 /

    Puffer/Medium

    Gr. 1 – 5 Bioinf.

    Vorm.

    Gr. 6 – 11 Bioinf.

    nachm.

    9 h Vortrag1

    Gr. 1-11

    V 1A

    Gr. 1-4 (ab 15 h)

    Vorkultur animpfen

    9 h

    Gr. 1-4 V 1B

    Gr. 5-8 V 1C

    Gr. 9-11 V 1D

    Gr. 1-4

    GST Expression

    (V 2A)

    2. Woche

    9 h

    Gr. 1-4 V 1E

    Gr. 5-8 V 1B

    Gr. 9-11 V 1C

    Gr. 9-11 (ab 15 h)

    Vorkultur animpfen

    9 h

    Gr. 1-4 V 1D

    Gr. 5-8 V 1E

    Gr. 9-11 V 1B

    Gr. 9-11

    GST Expression

    Gr. 5-8 (ab 15 h)

    Vorkultur animpfen

    9 h

    Gr. 1-4 V 1C

    Gr. 5-8 V 1D

    Gr. 9-11 V 1E

    Gr. 5-8

    GST Expression

    (V 2A)

    9 h Vortrag1

    Gr. 1-11 V. 2B

    3. Woche

    9 h Labor

    Gr. 1/2 V 2E

    Gr. 3/4 V 2C

    Gr. 5/6 V 2F

    Gr. 7/8 V 2D

    Gr. 9/10

    Gr. 11

    13 h

    Gr. 1/2 V 2E Auswert

    Gr. 3/4 V 2E

    Gr. 5/6 V 2F Auswert

    Gr. 7/8 V 2F

    Gr. 9/10 V 2C

    Gr. 11/12 V 2D

    9 h Labor

    Gr. 1/2 V 2F

    Gr. 3/4 V 2E Auswert

    Gr. 5/6 V 2E

    Gr. 7/8 V 2F Auswert

    Gr. 9/10 V 2D

    Gr. 11 V 2C

    13 h

    Gr. 1/2 V 2F Auswert

    Gr. 3/4 V 2D

    Gr. 5/6 V 2E Auswert

    Gr. 7/8 V 2C

    Gr. 9/10 V 2E

    Gr. 11 V 2F

    9 h Labor

    Gr. 1/2 V 2C

    Gr. 3/4 V 2F

    Gr. 5/6 V 2D

    Gr. 7/8 V 2E

    Gr. 9/10 V 2E Ausw

    Gr. 11 V 2F Auswert

    13 h

    Gr. 1/2 V 2D

    Gr. 3/4 V 2F Auswert

    Gr. 5/6 V 2C

    Gr. 7/8 V 2E Auswert

    Gr. 9/10 V 2F

    Gr. 11 V 2E

    9 h Labor

    Gr. 9/10 V 2F Auswert

    Gr. 11 V 2E Auswert

    Seminarvorbereitung

    Gr. 1-8

    12:30 h Labor

    Aufräumen

    13 h

    Abschlussseminar2

    Gr. 1 V 2F

    Gr. 2 V 2E

    Gr. 3 V 2D

    Gr. 4 V 2C

    Gr. 5 V 2B

    Gr. 6 V 2A

    Gr. 7 V 1E

    Gr. 8 V 1D

    Gr. 9 V 1C

    Gr. 10/11 V 1A/B 1 Treffpunkt N100 R1.14

    2 Gruppe A in N100 R1.14; Gruppe B in N100 B2

    3 Beilsteinzentrum

  • Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 7

    4 Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls

    Das Abfassen eines Praktikumprotokolls beginnt mit dem Aufschreiben aller Versuchsdetails

    wie Versuchsdaten und Versuchsbeobachtungen in einem Laborjournal. Protokollieren Sie

    alles sehr sorgfältig, vertrauen Sie nicht auf Ihr Gedächtnis! Da das Laborjounal ein

    Dokument ist, ist es empfehlenswert, ein fest gebundenes Heft zu benutzen statt eines

    Ringbuchs oder einer losen Blattsammlung und die Seiten alle durchzunummerieren. So

    können Sie es auf Verlangen vorzeigen oder abgeben.

    Alle Eintragungen in das Laborjournal können stichpunktartig knapp gehalten sein, sofern sie

    nur eindeutig und vollständig sind. Im Laborjournal – aber auch nur hier und sonst nirgends –

    ist auch Laborjargon (LJ) zulässig. Das krasse Gegenteil gilt für das später

    niederzuschreibende, eigentliche Protokoll!

    Bei der Erstellung des endgültigen Protokolls sind bestimmte formale und inhaltliche

    Standards einzuhalten.

    Form und Inhalt des Protokolls

    Allgemeines

    Das Protokoll sollte mit einem Deckblatt beginnen, das Ihnen zur Verfügung gestellt wird. Es

    trägt den Namen des Praktikums und der Universität, sowie den des(r) Ver-fassers(in) und

    einige zeitliche Angaben.

    Strukturelle Übersichtlichkeit und sprachlicher Stil helfen dem Leser des Protokolls, den

    Gang ihrer Experimente und Gedankengänge nachzuvollziehen. Unübersicht-lichkeit und

    unnütze kleine Fehler lenken vom Inhalt ab. Deshalb fügen Sie Leerzei-len und Abstände ein,

    wo es sinnvoll ist. Schreiben Sie Überschriften fett, gegebe-nenfalls in verschiedenen

    Schriftgrößen.

    Formulieren Sie wissenschaftlich kurz und prägnant und vermeiden Sie umständliche

    Darstellungen in Wort und Länge der Sätze.

    Gliederung einer Bachelorarbeit bzw. eines Protokolls:

    Jedes Protokoll soll aus den folgenden Abschnitten bestehen:

    Titelblatt: Hier wird der Titel der Arbeit, die Art der Arbeit, der Name und das Institut,

    an dem die Arbeit verfasst wurde, aufgeführt.

  • Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 8

    Zusammenfassung: Hier wird auf maximal einer Seite das Thema der Arbeit und die

    wichtigsten Ergebnisse dargestellt.

    Abkürzungsverzeichnis: Hier werden alle verwendeten Abkürzungen aufgeführt

    Inhaltsverzeichnis: Angabe der Kapitel mit Seitenangaben

    Einleitung: Gibt eine Übersicht über das Thema und leitet zur speziellen Fragestellung

    hin.

    Motivation: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Welches Problem wurde

    untersucht, welche Frage studiert?

    ▪ Material, Methoden, Versuchsdurchführung: Hier findet sich die Antwort auf die

    Frage: Wie wurde die Frage, das Problem bearbeitet?

    ▪ Ergebnisse: Hier wird die Frage beantwortet: Welche Resultate wurden erzielt?

    ▪ Diskussion: Hier findet sich die Antwort auf die Frage: Was bedeuten diese Resultate?

    ▪ Literaturverzeichnis:

    ▪ Anhang: (wenn nötig)

    A. Einleitung

    Die Einleitung wird im Präteritum geschrieben. Halten Sie die Einleitung so kurz wie

    möglich, aber so informativ wie notwendig. Zur Einleitung gehören auch eventuelle

    Formelschemata, also z.B. wie das zu isolierende Enzym ein Edukt in das Produkt

    umwandelt. Die Einleitung endet immer mit der kurzen Beschreibung der

    Aufgabenstellung auch Motivation genannt.

    B. Material, Methoden, Versuchsdurchführung

    Unter Material sind aufzählungsartig unter Angabe des vollen Namens, einer

    eventuellen Abkürzung, der Bezugsfirma und des Reinheitsgrades die verwendeten

    Chemikalien, Biochemikalien und andere Hilfsmittel wie z.B. Platten für die

    Dünnschichtchromatographie anzugeben.

    Der Teil Methoden wird als einziger im Präsens geschrieben. Methoden müssen

    nachvollziehbar und vollständig (reproduzierbar) erläutert werden. Änderungen oder

    Varianten müssen klar herausgestellt werden. In dieses Kapitel gehören auch

    statistische Auswertungs- und Fit-Methoden und die verwendete Software.

    Die Versuchsdurchführung wird in der Vergangenheit geschrieben und beschreibt im

    Detail den tatsächlichen Ablauf der Experimente. Halten Sie sich eng an Ihr

    Laborjournal und beschreiben Sie, was Sie tatsächlich gemacht haben (nicht etwa, was

  • Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 9

    man machen könnte). Denken Sie auch im Sinne Ihrer Nachfolger an wichtige Details

    wie: Welchen Zentrifugentyp habe ich über welche Zeit mit welchem Rotor bei

    welcher Drehzahl benutzt. Sehr hilfreich ist hier auch die Angabe der g-Zahl!

    C. Ergebnisse

    Der Ergebnisteil wird ebenfalls in der Vergangenheit geschrieben. Stellen Sie all Ihre

    Ergebnisse in Text und, soweit möglich und notwendig, auch in Abbildungen und

    Tabellen dar. Der Leser muss mühelos Text und Inhalt nachvollziehen können.

    Untergliedern Sie gegebenenfalls den Ergebnisteil. Klarheit der Darstellung ist

    ungemein wichtig. Durch unklare Aussagen überlassen Sie die Interpretation dem

    Leser! Stellen Sie im Text einen Bezug her zu Ihren Abbildungen und Tabellen: Dabei

    wechseln Sie beim Schreiben in die Gegenwart!

    Abbildungen und Tabellen werden grundsätzlich nummeriert und die Legende, die

    selbsterklärend sein soll, mit einer Überschrift versehen.

    Grundsätzlich müssen die Achsen von Diagrammen vernünftig skaliert, mit der Größe

    beschriftet und mit einer Einheit versehen werden. Unterschiedliche Symbole müssen

    erklärt werden. Denken Sie daran, dass die Beschriftungen auch nach Einfügen ins

    Dokument noch lesbar sein müssen.

    D. Diskussion

    Die Diskussion kann, wenn Sie es für sinnvoll halten, mit dem Ergebnisteil

    zusammengefasst werden. Auch die Diskussion wird im Präteritum geschrieben.

    Interpretieren und diskutieren Sie Ihre Ergebnisse jeweils unter Verweis auf die

    entsprechende Textstelle (Abb., Tab.). Lassen Sie sich von der Frage leiten: Wo

    können aufgrund der gewählten Methodik Fehler in der Durchführung auftreten?

    Dabei ist Denkarbeit erforderlich! Nicht immer können „komische Werte“ einfach auf

    fehlerhafte Geräte, fehlerhaftes Material oder mögliche Fehler beim Pipettieren

    geschoben werden! Bei der Diskussion ist es elementar wichtig, auf bestehende

    Literatur zurückzugreifen und die erzielten Ergebnisse in einen größeren Kontext zu

    setzen.

    E. Literaturverzeichnis

    Sobald Sie im Text Informationen aus der Literatur verwenden, müssen Sie die

    entsprechende Literatur zitieren. Im Text nennen Sie dabei nur die Autoren und die

  • Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 10

    Jahreszahl (z.B. Tampé 2005). Bei mehr als zwei Autoren schreiben Sie „et al.“ hinter

    den Erstautor (z.B. Tampé et al. 2006).

    Die verwendeten Literaturzitate müssen unter Angabe der erforderlichen Details im

    Literaturverzeichnis aufgeführt werden.

    Beispiel: BEISMANN-DRIEMEYER, S. und TAMPE, R. (2004): Funktion der

    Antigen-Transportmaschinerie TAP im zellulären Immunsystem – Angew. Chemie

    116, 4104-4122.

    Das Literaturverzeichnis kann alphabetisch nach Erstautor aber auch nach Erscheinen

    im Text sortiert werden. Zur Erstellung des Literaturverzeichnisses empfiehlt sich das

    Programm Citavi (kostenlos auf der Uni Homepage). Kontrollieren sie das

    Literaturverzeichnis auf Fehler, denn nicht immer ist alles richtig abgespeichert. Bei

    der Verwendung von Abkürzungen von Zeitschriften, muss die international

    anerkannte Liste von „Web of Science“ verwendet werden. Auch da ist wieder zu

    unterscheiden ob die Abkürzungen mit oder ohne Punkt enden.

    F. Anhang

    In manchen Fällen folgt noch ein Anhang, der meistens aus längeren Tabellen mit

    Messdaten oder größeren Abbildungen besteht.

    Schluss

    Versuchen Sie beim Schreiben Ihres Protokolls vollständige und klare Sätze zu formulieren.

    Lesen Sie den Text nach Fertigstellung auf Plausibilität, Aufbau und Formulierung sowie auf

    Rechtschreibfehler nochmals durch und/oder bitten Sie jemand um Hilfe! Vermeiden Sie

    ständige Wiederholungen, das langweilt den Leser.

    Abbildungen

    Jede Abbildung muss klar und deutlich sein. Die Beschriftung muss leserlich sein. Bei

    Diagrammen hat jede Achse einen Titel mit Angabe der untersuchten Größe und Einheit. Jede

    Abbildung hat eine logische Nummer und auch eine Überschrift. Wobei auf die Abbildung im

    Text verwiesen wird. In der Legende muss soviel Information vorhanden sein, damit die

    Abbildung ohne Lesen des Textes verständlich ist. Bei einem Western-Blot muss somit die

    Menge an geladenem Protein, die Prozentzahl des SDS-Gels sowie die Antikörper spezifiziert

    werde. Bei einer Säulenchromatographie muss das Laufmittel, der mögliche Gradient, die

    Säule sowie die Menge an analysiertem Stoff angegeben werden. Auch die

    Detektionswelllänge und die Flussrate sind zu nennen.

  • Hilfe zur Erstellung eines Praktikumprotokolls 11

    Bemerkung

    Wenn es sinnvoll erscheint, sind Abweichungen von diesen Richtlinien erwünscht, Kreativität

    wird nicht bestraft!

  • Bioinformatik 12

    5 Bioinformatik

    Die Bioinformatik ist mittlerweile ein wichtiger Teil der biochemischen Forschung. Mit Hilfe

    der Bioinformatik kann gezielt Literatur gesucht werden und DNA- und Proteinsequenzdaten

    analysiert und verglichen werden.

    In diesem Teil des Praktikums sollen Sie eine Übersicht über die wichtigsten Server und

    Programme bekommen, die für die tägliche Arbeit hilfreich sind.

    Wichtige Internetadressen für Biochemiker:

    www.ncbi.nlm.nih.gov (National Center for Biotechnology informatiom)

    www.rcsb.org/pdb (Brookhaven Protein data bank)

    www.ebi.ac.uk/services (European Bioinformatics Institute)

    http://www.embl.de/services/bioinformatics/index.php (EMBL Heidelberg)

    www.expasy.org (ExPASy Proteomics server)

    http://isiknowledge.com (web of science)

    http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php (webcutter)

    http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html (Primer Design)

    http://www.genebee.msu.ru/clustal/ (ClustalW/phylogenetischer Baum)

    http://ezb.uni-regensburg.de/fl.phtml?bibid=UBFM (online Zugriff auf Zeitschriften)

    Aufgabe

    Literatur:

    1. Suchen Sie die Veröffentlichung über TAP von P. Cresswell, die in Nature veröffentlicht wurde.

    2. Wieviele Veröffentlichungen über TAP erschienen in „Journal of Biologcal Chemistry“?

    3. Wie oft wurde folgende Veröffentlichung zitiert: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE

    UNITED STATES OF AMERICA 98 (13): 7241-7246 JUN 19 2001

    4. Suchen Sie verwandte Publikationen.

    DNA-Sequenz:

    1. Suchen Sie die DNA-Sequenz von humanem TAP1. 2. Bestimmen Sie die Schnittstelle mit dem Restriktionsenzym DraIII. 3. Translatieren Sie die Sequenz und schneiden Sie die Proteinsequenz zurecht, so dass

    ein Protein mit 748 Aminosäuren entsteht (N-Terminus: MASSRCPAPR; C-

    Terminus: QAPADAPE)

    Protein-Sequenz:

    1. Bestimmen Sie den pI, Molekulargewicht, Extinktionskoeffizienten und die Membrantopologie von TAP1.

    2. Finden Sie in ABC-Transporter konservierte Sequenzen. 3. Finden Sie zu TAP1 homologe Proteine aus Säugetieren, Fischen und Vögel. 4. Erstellen Sie einen Sequenzvergleich. 5. Erstellen Sie einen phylogenetischen Baum.

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ebi.ac.uk/services/http://www.embl.de/services/bioinformatics/index.phphttp://www.expasy.org/http://isiknowledge.com/http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.phphttp://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.htmlhttp://www.genebee.msu.ru/clustal/http://ezb.uni-regensburg.de/fl.phtml?bibid=UBFM

  • Einführung in Origin 13

    6 Einführung in Origin

    Diese Anleitung dient dazu die grundlegenden Eigenschaften von Origin kennen zu lernen.

    Eine detaillierte Anleitung gibt es als pdf File von OriginLab. Für das Praktikum werden drei

    verschiedene Funktionen von Origin benötigt.

    1. Arbeiten mit Tabellen (Workbooks in Origin)

    Importieren von Daten

    Modifizieren von Tabellen

    Daten exportieren

    2. Erstellen von Graphen

    Erstellen verschiedener Graphen

    Hinzufügen von Daten in einen Graph

    Exportieren von Graphen

    3. Kurven fitten

    Linearer Fit

    Nicht-linearer Fit

    Erstellen eigener Gleichungen

    Erstellen eines einfachen Graphen

    Workbook

    Das Workbook stellt die oberste Struktur zur

    Organisation der Daten dar. Jedes Workbook

    besteht aus mehreren Worksheets und jedes

    Worksheet enthält Spalten von Daten. Es gibt

    verschiedene Datenspalten wie X. Y, Z yError

    etc..

    Um zu verstehen wie man mit dem Workbook umgeht, versuche folgendes:

    1. Wähle Datei: Neu: Workbook

    2. Wähle Datei: Import: Simple ASCII und öffne in \Samples\Curve Fitting die Datei

    Gaussian.dat.

    3. Das Worksheet bekommt den Namen der Datei und in Sparkline gibt es eine kurze

    Übersicht über die Kurvenform. Unter Langname wird angegeben was dargestellt wird

    (stellt auch die Achsenbeschriftung dar). Um die Spalte C als FY-Fehler Spalte zu

    markieren, mit rechter Maustaste auf den Spaltentitel klicken, Setzen als :Y

    Fehlerbalken auswählen.

  • Einführung in Origin 14

    4. Um die Daten in einem Graphen darzustellen, werden alle Daten markiert: Zeichnen:

    Symbol: Punktdiagramm auswählen.

    5. Alternativ die Spalten nicht markieren und Zeichnen: Symbol: Punktdiagramm

    auswählen. Es erscheint folgendes Fenster, in dem die X- und Y-Daten getrennt

    ausgewählt werden können.

    6. Um die Darstellung des Graphen zu verändert, muss man auf eine Achse doppel-

    klicken.

  • Einführung in Origin 15

    7. Um ein erstellten Graphen als Template zu benutzen, muss dieses Format gespeichert

    werden: Datei: Template Speichern unter.

    8. Es gibt zwei Möglichkeiten Graphen zu exportieren:

    a) Als Grafikdatei, dabei bietet sich das WMF Format an: Datei: Export

    b) Direkt ins Dokument kopieren, wodurch der Graph auch noch verändert werden

    kann.

  • Einführung in Origin 16

    Erstellen eines Linearen Fits

    1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

    2. Graph erstellen.

    3. Linearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Linearer Fit: Dialog öffnen. Hier können

    die Fitoptionen eingestellt werden. Bei einem Linearen Fit ist vor allem zu beachten, ob

    die Gerade durch den Nullpunkt geht oder nicht.

    4. Im Worksheet: FitLinear1 werden die Fitparameter und die Statistik aufgelistet. Aus

    dem Fit werden folgende Parameter erhalten Steigung und Schnittpunkt mit der Y-

    Achse samt Standardfehler. Zusätzlich wird in der Statistik noch die Qualität des Fits

    bewertet durch z.B. den Korrelationskoeffizienten. Wichtig ist das Diagramm mit den

    Residuen zu analysieren, denn hier sieht man am besten systematische Abweichungen,

    die auf eine falsche Fitfunktion oder Probleme in der Messung schließen lassen. Die

    Residuen stellen die Abweichung der Datenpunkte von der Fitfunktion dar.

  • Einführung in Origin 17

    Erstellen eines Nichtlinearen Fits

    1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

    2. Graph erstellen.

    3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Hier

    können unter Kategorie und Funktion die verschiedenen Gleichungen für die

    Fitoptionen ausgewählt werden. Hierbei ist vor allem auf die richtige Gleichung und die

    Gewichtung der Fehler beim Fitten zu achten.

    4. Falls Daten wissentlich aus dem Fitprozess genommen werden können, so werden sie

    maskiert: Daten: Datenpunkte maskieren und im Graph anklicken

  • Einführung in Origin 18

    Erstellen einer eigenen Gleichung

    1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

    2. Graph erstellen.

    3. Nichtlinearer Fit erstellen: Analyse: Anpassen: Nichtlinearer Fit: Dialog öffnen. Eine

    Kategorie auswählen und unter Funktion anklicken. Den Funktionsname

    und Funktionstyp definieren. Anschließend die Variablen und Parameter definieren. Es

    empfiehlt sich auch Konstanten als Parameter zu definieren. Die Funktion wird

    eingegeben (Form: y=m*x + 5).

    4. Vor dem Fitten Parameter anklicken und definieren, ob es sich um veränderliche

    Parameter handelt oder um Konstanten mit festem Wert.

  • Einführung in Origin 19

    Fitten mit logarithmischen Skalen

    Beim Fitten von Inhibitionskurven, bei denen die X-Achse in log10-Skala dargestellt wird,

    gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder werden die Konzentrationen auf der X-Achse in log10-

    Werte transformiert oder man benutzt eine selber verfasste Gleichung. Die zweite

    Möglichkeit erlaubt anschließend die X-Achse in einer sinnvolleren logarithmischen Skala

    darzustellen.

    Darstellung mit transformierten X-Werten

    1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten und Langname und Einheiten definieren.

    2. Spalte hinzufügen: Spalte: Spalte hinzufügen

    3. Transformation der X-Werte: Spalte: Spaltenwerte errechnen. Zur Transformation der

    A(X)-Werte gibt man nun in das geöffnete Dialogfeld ein: log(Col(A)).

    4. Erstellen eines Punktdiagramms mit den transformierten X-Werten (C(X2)).

    5. Fitten der Daten mit sigmoidaler Funktion: Kategorie Pharmacology; Funktion

    Doseresp

  • Einführung in Origin 20

    Darstellung mit linearer X-Achse

    1. Daten in Worksheet kopieren. Spalten, Langname und Einheiten definieren.

    2. Punktdiagramm erstellen.

    3. X-Achse in Log10-Darstellung ändern:

    4. Die bestehende DoseResp Funktion kopieren (anklicken von f(x), dann duplizieren)

    und in folgende Funktion ändern:

    y = A1 + (A2-A1)/(1 + 10^((LOGx0-(log10(x)))*p)),danach speichern

    5. Fitten mit dieser Formel.

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 21

    7 Anleitung zum Ansetzen von Puffern

    Theoretischer Teil

    Sehr kleine Mengen einer starken Säure oder einer starken Base reichen aus, die

    Konzentration der Wasserstoffionen in Wasser im schwach sauren, neutralen oder schwach

    alkalischen Gebiet erheblich zu verändern. Der Zusatz eines Tropfens konzentrieter Säure zu

    einem Volumen reinen Wassers macht dieses deutlich sauer, beim Zufügen eines Tropfens

    konzentrierter Alkalilauge wird die Lösung deutlich basisch. Gleichwohl gibt es Lösungen,

    deren Wasserstoffionenkonzentration sich bei Zusatz auch größerer Mengen starker Säure

    oder starker Base nur recht wenig ändert. Man bezeichnet solche Lösungen als gepuffert.

    Pufferlösungen

    Im Stoffwechsel laufen zahlreiche Reaktionen ab, bei denen H+-Ionen freigesetzt oder

    verbraucht werden. Andererseits ist ein konstanter pH-Wert im Zytoplasma oder in

    bestimmten Körperflüssigkeiten, wie z.B. dem Blut, lebenswichtig. Schon leichte

    Abweichungen können zu schweren Krankheitssymptomen führen.

    Stoffwechsel bedingte pH-Änderungen müssen also abgepuffert werden. Im Blut wird diese

    Funktion von verschiedenen Puffersystemen wahrgenommen.

    Allgemein werden Lösungen, deren pH-Wert sich bei Zugabe von Säure oder Lauge nur

    wenig verändert, als Pufferlösungen bezeichnet. Sie enthalten ein konjugiertes Säure-Base-

    Paar, wobei die Säure OHˉ-Ionen neutralisiert, die Base H+-Ionen.

    Pufferlösungen lassen sich herstellen, indem man

    ▪ schwache Säuren mit ihrem Salz (z.B. Acetatpuffer aus Essigsäure und

    Natriumacetat) bzw.

    ▪ schwache Basen mit ihrem Salz (z.B. Ammoniumpuffer aus Ammoniumchlorid und

    Ammoniak) mischt.

    Sind beide Spezies in genügend großer Konzentration vorhanden, reagiert der Acetatpuffer

    so:

    H3O+ + CH3COOˉ CH3COOH + H2O

    Pufferung bei Zugabe starker Säure

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 22

    Die zugegebene starke Säure reagiert vollständig zu HOAc. Dass der pH-Wert sich dennoch

    geringfügig ändert, hat damit zu tun, dass die gebildete Essigsäure wieder zu einem geringen

    Anteil dissoziieren kann.

    OHˉ + CH3COOH CH3COOˉ + H2O

    Pufferung bei Zugabe starker Base

    Die Pufferwirkung zeigt sich in der Titrationskurve schwacher Säuren und Basen durch das

    Plateau im Bereich des pK-Wertes, ist also der Grund für den geringen Anstieg der

    Titrationskurve der Essigsäure bei pH 4 bis 6.

    Ähnlich verläuft die Abpufferung starker Säuren und starker Laugen durch den

    Ammoniumpuffer:

    H3O+ + NH3 NH4+ + H2O

    Pufferung bei Zugabe starker Säure

    OHˉ + NH4+ NH3 + H2O

    Pufferung bei Zugabe starker Base

    In dieser Form wird der Ammoniumpuffer allerdings nur in Ausnahmefällen benutzt.

    Dagegen sind Derivate des Ammoniaks wie z.B. als Triethanolammoniumpuffer und

    Triethylammoniumpuffer häufig in Gebrauch (s. unten).

    Puffergleichung

    Das Verhalten einer Pufferlösung lässt sich auch quantitativ beschreiben. Ausgehend vom

    Massenwirkungsgesetz für die Dissoziation einer Säure ergibt sich für den Acetatpuffer:

    +

    =S

    [H ] [CH COO ]3K

    [CH COOH]3

    Durch Umformung erhält man:

    = S

    [CH COOH]3[H ] K

    [CH COO ]3

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 23

    Durch Logarithmieren:

    = S

    [CH COOH]3pH pK log

    [CH COO ]3

    Die Gleichung zeigt, dass der pH-Wert der Pufferlösung vom pKS-Wert der Essig-säure und

    vom Verhältnis Essigsäure/Acetat bestimmt wird. In allgemeiner Form ist die Puffergleichung

    als Henderson-Hasselbalch-Gleichung bekannt.

    -

    = S

    [ A ]pH pK log

    [HA]

    Liegt zum Beispiel in einem Acetat-Puffer Essigsäure in einer Konzentration von 0,1 mol/L

    und Acetat mit 0,5 mol/L vor, so lässt sich mit Hilfe der Puffergleichung der pH-Wert

    bestimmen:

    = 0,5

    pH 4,8 log = 5,50,1

    Liegen Säure und konjugierte Base in gleicher Konzentration vor, so ist [HA]/[Aˉ] = 1 und

    die Puffergleichung wird zu pH = pKS. Die Pufferlösung kann bei diesem pH-Wert Zugaben

    von Säuren und Basen gleich gut abpuffern Liegt die Säure in zehn-fach höherer

    Konzentration vor, so gilt pH = pKS – 1. Der Puffer wirkt dann effektiv gegen die Zugabe von

    Basen, kann aber nur noch geringe Mengen Säure abpuffern. Als Faustregel gilt deshalb für

    den optimalen Einsatzbereich von Pufferlösungen:

    pH = pKS ± 1

    Da sich der Pufferbereich in der Titrationskurve deutlich abzeichnet, lässt sich an-hand von

    Titrationskurven der pKS-Wert schwacher Säuren oder Basen ermitteln (geringste Steigung

    der Kurve).

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 24

    Beispiel 1: Phosphatpuffer

    Phosphorsäure dissoziiert über drei Stufen:

    H3PO4 + H2O H2PO4ˉ + H3O+ pKS1 = 2,0

    H2PO4ˉ + H2O HPO42ˉ + H3O

    + pKS2 = 7,2

    HPO42ˉ + H2O PO4

    3ˉ + H3O+ pKS3 = 12,3

    Die pK-Werte machen deutlich, dass die Protonenabgabe nach jeder Stufe schwieriger wird.

    H3PO4 ist eine mittelstarke Säure, während H2PO4ˉ eine schwache und HPO42ˉ eine sehr

    schwache Säure ist. Entsprechend sind die Plateaus der Titrationskurve verteilt.

    Zu Beginn der Titration liegt der pH bei etwa 1,5. Die Lösung enthält fast nur die Spe-zies

    H3PO4 und H2PO4ˉ. Durch die Zugabe der Natronlauge werden sukzessive die H3PO4-

    Moleküle in H2PO4ˉ-Ionen überführt, bis beim ersten Äquivalenzpunkt (ÄP1) fast nur noch

    H2PO4ˉ-Ionen vorliegen. Beim zweiten Äquivalenzpunkt (ÄP2) liegen nur noch HPO42ˉ-Ionen

    vor und beim dritten (ÄP3) nur noch PO43ˉ, wobei der dritte Äquivalenzpunkt keine markante

    Steigung aufweist, weil er in den pH-Bereich des Titrationsmittels Natronlauge fällt (0,1 M

    NaOH hat einen pH-Wert von 13). Das Pla-teau im Bereich des pKS2 basiert auf der

    Pufferung durch das konjugierte Säure-Base-Paar H2PO4ˉ/HPO42ˉ. In der Praxis wird der

    Phosphatpuffer häufig verwendet, um neutrale pH-Bereiche einzustellen, denn nach pH = pKS

    ± 1 liegt der Pufferbe-reich zwischen pH 6,2 und 8,2.

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 25

    Beispiel 2: Kohlensäurepuffer

    Kohlendioxid (CO2) und Wasser sind die mengenmäßig wichtigsten Endprodukte des

    Stoffwechsels. In Wasser gelöstes Kohlendioxid reagiert zur zweiprotonigen Kohlen-säure

    (1), die in einer Nachfolgereaktion dissoziiert (2).

    (1) CO2 + H2O H2CO3 pK = 3,1

    (2) H2CO3 + H2O HCO3ˉ + H3O+ pKS1 = 3,3

    Gesamtreaktion:

    CO2 + 2 H2O HCO3ˉ + H3O+ pK = 6,4

    Das Gleichgewicht der ersten Reaktion liegt auf der linken Seite (pK = 3,1). Löst man also

    Kohlendioxid in Wasser, so liegt es vorwiegend als CO2 und nur zu einem gerin-gen Teil als

    H2CO3 vor.

    Reaktion (1) und (2) lassen sich zusammenziehen und die pK-Werte addieren. Das

    Gleichgewicht der Gesamtreaktion liegt noch stärker auf der linken Seite: gelöstes

    Kohlendioxid reagiert als schwache Säure. Die konjugierte Base ist das Hydrogen-carbonat.

    Kohlendioxid und Hydrogencarbonat bilden ein Puffersystem mit einem pH-Optimum bei pH

    = 6,4.

    -

    3=

    2

    [HCO ]pH 6,4 log

    [CO ]

    Das Kohlendioxid-Hydrogencarbonat-Puffersystem ist das bedeutendste Puffersystem des

    Blutes, das auf einen pH von 7,4 gepuffert ist. Das Konzentrationsverhältnis der

    Puffersubstanzen bei pH 7,4 lässt sich somit berechnen:

    S

    -(pH pK ) 1 3

    =

    2

    [HCO ] 1010 10 =

    [CO ] 1

    Da die Reaktionskonstante aber temperaturabhängig ist, der pKS der Gesamtreaktion im Blut

    bei 37°C 6,1 statt 6,4 bei 25°C beträgt, wird das Konzentrationsverhältnis dann zu:

    -1,3 3

    =

    2

    [HCO ] 2010 =

    [CO ] 1

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 26

    Es liegt also ein Überschuss an Hydrogencarbonat vor, so dass das Puffersystem vor allem

    gegen H3O+-Ionen wirkt. Da CO2 ein Gas ist, steht das gelöste CO2 im Gleich-gewicht mit

    dem CO2 der Luft in der Lunge. Hier zeigt sich eine Besonderheit dieses Puffersystems. Es

    kann nämlich nicht nur H3O+-Ionen am Entstehungsort abpuffern, sondern auch das

    Reaktionsprodukt aus dem Gleichgewicht entfernen:

    H3O+ + HCO3ˉ → CO2 ↑ + 2 H2O

    Der senkrechte Pfeil deutet an, dass das Kohlendioxid die Lösung verlässt und in die

    Gasphase geht (das System verlässt). Man spricht deshalb auch von einem offenen

    Puffersystem.

    Praktischer Teil

    1. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) pH 8,0

    (HO-CH2-)3C-NH2 + H3O+ (HO-CH2-)3C-NH3

    + + H2O

    FgTRIS 121,14

    pK 8,1

    Menge: 0,5 L

    Einwage: ? g Tris

    pH einstellen mit HCl

    2. 1 M Tris-hydroxymethyl-aminomethan (TRIS) pH 7,5

    (HO-CH2-)3C-NH2 + H3O+ (HO-CH2-)3C-NH3

    + + H2O

    FgTRIS 121,14

    pK 8,1

    Menge: 0,5 L

    Einwage: ? g Tris

    pH einstellen mit HCl

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 27

    3.a Dinatriumhydrogenphosphat/NaCl/KCl

    Zunächst muss eine 1 M KCl-Lösung hergestellt werden.

    FgKCl 74,55

    Menge: 100 mL

    Einwage: ? g KCl

    Na2HPO4 14,2 g Molarität: ? M

    NaCl 81,82 g Molarität: ? M

    KCl (1 M) 13,25 mL Molarität: ? M

    Auffüllen auf 1000 mL mit Wasser.

    FgNaCl 58,44

    FgNa2HPO4 141,96

    3.b Natriumdihydrogenphosphat/NaCl/KCl

    NaH2PO4 x H2O 2,84 g Molarität: ? M

    NaCl 13,36 g Molarität: ? M

    KCl (1 M) 2,65 mL Molarität: ? M

    Auffüllen auf 200 mL mit Wasser.

    FgNaH2PO4 x H2O 137,99

    3.c 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4

    Der 10x PBS-Puffer wird hergestellt, indem ein vorgelegtes Volumen von 1000 mL

    Puffer Nr. 3a mit Puffer Nr. 3b auf pH 7,4 eingestellt wird.

    4. 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5):

    300 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung (Na2HPO4)

    500 ml 0,1 ml Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (KH2PO4)

    KH2PO4 wird vorgelegt und der pH von 6,5 mit 0,1 M Na2HPO4 eingestellt

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 28

    5. 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0

    (HOOC-CH2-)2N-CH2-CH2-N(-CH2-COOH)2

    EDTA + Mg2+ Mg2+EDTA + 2 H+

    FgEDTA 292,24

    Menge: 0,4 L

    Einwage: ? g EDTA

    pH einstellen mit NaOH

    6. 50 mM HEPES pH 7,4

    4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure

    FgHEPES 238,3

    pK 7,5

    Menge: 0,1 L

    Einwage: ? g Hepes

    pH einstellen mit NaOH

    7. TBS pH 8.0:

    50 mM Tris ? g FgTRIS 121,14

    150 mM NaCl ? g FgNaCl 58,44

    pH 8.0 eiskalt!

    Menge: 4 L

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 29

    8. Regenerationspuffer 1 (GST Versuch)

    0,5 M Tris ? g FgTRIS 121,14

    0,5 M NaCl ? g FgNaCl 58,44

    pH 8.5

    Menge: 0,5 L

    Regenerationspuffer 2 (GST Versuch)

    0.5 M Tris ? g

    0,5 M NaCl ? g

    pH 4.5

    Menge: 0,5 L

    9. Elutionspuffer GST Versuch

    TBS (Puffer 8) + 10 mM GSH (Kühlschrank)

    Einwage: ? g GSH FgGSH 307,32

    pH 8.0 muss neu eingestellt werden, eiskalt

    Menge: 200ml; IM KÜHLSCHRANK LANGERN

  • Anleitung zum Ansetzen von Puffern 30

    10. LB Medium

    je Liter:

    5g Hefeextrakt

    5g NaCl

    10g Trypton/Pepton Mischung

    Menge: insgesamt 3,6 Liter, aufteilen in:

    6 x 250ml Kolben (mit Schikane) mit je 100 ml LB-Medium

    6 x 2l Kolben (mit Schikane) mit je 500ml LB-Medium

    Autoklavieren!

  • Der Peptidtransporter TAP 31

    8 Der Peptidtransporter TAP

    Der Peptidtransporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt eine

    zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort (Abbildung 1). TAP transportiert Peptide, die

    vornehmlich durch proteasomale Degradation von endogenen Proteinen erzeugt wurden, vom

    Zytosol ins Endoplasmatische Rekikulum. Dort binden diese Peptide an MHC (major

    histocompatibility complex) I Moleküle. Peptidbeladene MHC I Moleküle werden an die

    Zelloberfläche transportiert, um dort cytotoxischen T-Zellen die antigene Fracht zu

    präsentieren. Erkennt eine T-Zelle ein MHC I gebundenes Peptid so führt dies zur

    Eliminierung dieser Virus infizierten oder entarteten Zelle.

    Abbildung 1: MHC I abhängige Antigenpräsentation. Bei der klassischen MHC I Antigenpräsentation

    werden endogene Proteine vornehmlich durch das Proteasom degradiert. Die Peptide werden mit Hilfe von TAP

    ins Lumen des ER transportiert und dort auf MHC I Moleküle geladen. Anschließend werden die MHC I-

    Peptidkomplexe an der Zelloberfläche cytotoxischen T-Zellen präsentiert. Die Faltung, Assemblierung und

    Beladung der MHC I Moleküle wird durch mehrere Chaperone gesteuert.

    TAP gehört der Familie der ABC-Transporter an. TAP bildet einen Heterodimer bestehend

    aus TAP1 und TAP2 (Abbildung 2). Jede Untereinheit ist aus einer N-terminalen

    Transmembrandomäne (TMD) und einer C-terminalen Nukleotidbindungsdomäne, die sich

    im Zytosol befindet, aufgebaut. Die TMD von TAP1 besteht aus 10 und von TAP2 aus 9

    Transmembranhelizes. Die TMD bildet sowohl die Translokationspore und die

  • Der Peptidtransporter TAP 32

    Peptidbindungsregion. Die NBD bindet über konservierte Sequenzmotive ATP und treibt

    durch die ATP-Hydrolyse den Peptidtransport an.

    TAP1

    ER Lumen

    Zytosol

    TAP2

    N

    N

    C C

    Peptidbindungsregion

    1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1

    KerndomäneN-Domäne Kerndomäne N-Domäne

    Nukleotid-

    bindungs-

    domäne

    Transmebran-

    domäne

    TAP1

    ER Lumen

    Zytosol

    TAP2

    N

    N

    C C

    Peptidbindungsregion

    1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1

    KerndomäneN-Domäne Kerndomäne N-Domäne

    Nukleotid-

    bindungs-

    domäne

    Transmebran-

    domäne

    Abbildung 2: Topologiemodell des TAP-Komplexes. TAP besteht aus den zwei Halbtransportern TAP1 und

    TAP2, die je aus einer TMD und einer NBD aufgebaut sind. Die sechs C-terminalen Transmembranhelices

    bilden die Kerndomäne. Die äußeren Helices sind nicht essentiell für die Transportfunktion, sondern sind an der

    Rekrutierung von Tapasin beteiligt. Die Peptidbindungsregion ist gelb dargestellt.

    Eine Vorraussetzung für den Peptidtransport ist die Bindung des Peptids an TAP. Im

    Gegensatz zum Peptidtransport, der die ATP-Hydrolyse zwingend erfordert, ist die

    Peptidbindung ATP-unabhängig. TAP bindet vorzugsweise Peptide mit einer Länge von 8 –

    16 Aminosäuren, wobei die höchste Transporteffizienz für 8 – 12 Aminosäuren lange Peptide

    erzielt wird. Allerdings werden auch Peptide mit einer Länge bis zu 40 Aminosäuren so wie

    sterisch anspruchsvolle Peptide, die Modifikationen an den Seitenketten tragen, von TAP

    erkannt und transportiert.

    Mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken wurde die Peptidspezifität von TAP im

    Detail untersucht. Demnach sind für die Erkennung der Peptide die drei N-terminalen und die

    C-terminale Aminosäuren von Bedeutung. Da die Spezifität des C-terminalen Restes sowohl

    für das Immunproteasom, TAP und auch MHC I übereinstimmt, geht man von einer

    Koevolution dieser drei Faktoren der Antigenpräsentation aus. Die unterschiedliche Spezifität

    von MHC I und TAP bzgl. des N-Terminus des Peptids führt dazu, dass im ER-Lumen ein

    Trimmen durch Exopeptidasen erfolgt. Der mittlere Bereich des Peptides, welcher

    vornehmlich an der T-Zellrezeptorbindung beteiligt ist, kann höchst divergent sein in Bezug

    auf MHC I und TAP-Bindung. Dadurch wird gewährleistet, dass eine kleine Menge von

  • Der Peptidtransporter TAP 33

    Peptidtransportern und MHC I Molekülen eine sehr große Peptiddiversität darstellen kann,

    um den Körper vor einem viralen Angriff zu schützen.

    Im Rahmen dieses Praktikums sollen die enzymatischen Eigenschaften von TAP, wie z.B. die

    Kinetik der Peptidbindung, die ATP-Bindung und der ATP-getriebene Transport

    charakterisiert werden. Dazu müssen TAP-haltige Membranen aus Insektenzellen isoliert

    werden und die Peptide für die kinetischen Untersuchungen mit Fluorophoren markiert

    werden.

  • Der Peptidtransporter TAP 34

    8.1 Membranpräparation aus Sf9-Insektenzellen (Versuch 1 A)

    Humanes TAP, bestehend aus TAP1 und TAP2, wird mit Hilfe des Baculovirus, der die Gene

    für TAP1 und TAP2 trägt, in Sf9 Insektenzellen exprimiert. Bei dem Baculovirus handelt es

    sich um ein DNA-Virus, der der Familie der Baculoviridae angehört. Dieses Virus befällt

    Endothelzellen des Mitteldarms von bestimmten Insekten wie Spodoptera frugiperda. Das

    Baculovirusgenom besteht aus einer zirkulären, doppelsträngigen, 130 kb langen DNA. Die

    Gene für TAP1 und TAP2 befinden sich auf dem Baculovirusgenom hinter dem Polyhedrin-

    und P10-Promotor. Beides sind starke Promotoren, die schon kurz nach der Infektion

    angeschaltet werden. Ca. 24 h nach der Infektion ist TAP im Western Blot nachweisbar. Die

    Ernte der Zellen erfolgt ca. 48 h nach der Infektion. Längere Expressionszeiträume sind

    ungünstig, da proteolytische Degradationsprodukte von TAP auftreten. Die Insektenzellen

    werden bei einer Zelldichte von 1.8 * 106 Zellen pro ml mit einer MOI 3-5 (muliplicity of

    infection, gibt das Verhältnis von Virus zu Zellen an) infiziert. Die Zellen werden nach 48h

    geerntet, einmal mit PBS gewaschen und das Zellpellet bei -20 °C gelagert.

    Um biochemische Versuche mit TAP durchführen zu können, werden TAP-haltige

    Membranen hergestellt. Dabei werden die Zellen mechanisch aufgeschlossen, nicht

    aufgeschlossene Zellen, Zelltrümmer und Nuclei werden durch Zentrifugation bei niedrigen

    g-Zahlen entfernt. Anschließend werden die Membranen durch eine

    Ultrazentrifugationsschritt aufkonzentriert und bei -80 °C gelagert.

    Material

    20 mM Tris/HCl, pH 7,4

    1 M DTT

    2,5 M Sucroselösung

    1×PBS (Phosphate buffered saline)

    137 mM NaCl

    2,7 mM KCl

    10 mM Na2HPO4

    2 mM KH2PO4

    pH 7,0

  • Der Peptidtransporter TAP 35

    Protease-Inhibitoren

    250 mM Benzamidin in H2O

    100 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in Isopropanol

    Protokoll

    Alle Schritte werden auf Eis oder bei 4°C (Zentrifugationen) durchgeführt.

    Das Pellet einer 300 ml Sf9-Insektenzellkultur wird auf Eis aufgetaut und in 20 ml Tris-Puffer

    aufgenommen, 1% (v/v) Proteaseinhibitoren und 1 mM DTT werden zugegeben. Die Zellen

    werden in einem Dounce-Homogenisator durch Hoch-und Runterziehen (40×) des Pistills

    (tight) aufgeschlossen. Die Suspension wird mit 2,5 M Sucroselösung zu einer

    Endkonzentration von 250 mM Sucrose versetzt, noch 3x gedouncet und in ein 50 ml

    Falconröhrchen überführt. Nicht aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer werden mittels

    Zentrifugation pelletiert (4 min bei 200×g und 8 min bei 700×g). Der Überstand wird in ein

    UZ-Röhrchen überführt und 20 min bei 20.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird

    verworfen und das Pellet in 2 ml 1×PBS resuspendiert. 50-100 µl Aliquots werden in

    flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

    Protein-Bestimmung: BCA-Assay (Versuch 1A)

    Die Konzentration des Gesamtproteins wird mit Hilfe eines Bicinchoninsäure (BCA) Assays

    bestimmt. Der sensitive, kolorimetrische Nachweis von Proteinen bei diesem Assay resultiert

    aus der Reduktion von Cu2+

    zu Cu+

    durch die Peptidbindung und bestimmte Aminosäuren.

    BCA bildet mit dem reduzierten Kupfer einen Farbkomplex, dessen Absorption bei 584 nm

    gemessen wird.

    Der BCA-Test wird nach Anleitung des Herstellers (Fa. Pierce) durchgeführt. Die

    Standardkurve mit 7 Punkten wird wie folgt zusammenpipettiert:

    Verdünnung PBS BSA-Quelle BSA Endkonzentration µg/ml

    A 1000 µl 53 µl stock [2 mg/ml] 100 µg/ml

    B 100 µl 300 µl Verdünnung A 75 µg/ml

    C 375 µl 375 µl Verdünnung A 50 µg/ml

    D 375 µl 375 µl Verdünnung C 25 µg/ml

    E 375 µl 375 µl Verdünnung D 12,5 µg/ml

    F 375 µl 375 µl Verdünnung E 6,25 µg/ml

    G 375 µl - 0 µg/ml

  • Der Peptidtransporter TAP 36

    Die zu messenden Proben werden in verschiedenen Konzentrationen vermessen: 1:10, 1:100,

    1:200, 1:500 und 1:1000 verdünnt in PBS. Die Anzahl der einzelnen Messungen des BCA-

    Testes wird berechnet und die Färbelösung laut folgender Formel angesetzt (pro Messung

    werden 150 µl Färbelösung benötigt). Alle Proben und Standardpunkte werden in Duplikaten

    vermessen.

    Ansatz der Färbelösung

    25 Teile Komponente A

    24 Teile Komponente B

    1 Teil Komponente C Gesamt 50 Teile

    Aufgrund von Pipettierfehlern wird empfohlen, 10 % mehr Färbelösung als benötigt

    anzusetzen.

    150 µl angesetzte Färbelösung und 150 µl verdünnte Probe werden in einer Mikrotiterplatte

    gemischt. Die Platte wird mittels Parafilm vor Verdunstung geschützt und für 30 min bei 37

    °C inkubiert. Anschließend werden die Absorptionen am Fluostar bei einer Wellenlänge von

    584 nm ermittelt und die Proteinkonzentration berechnet.

    Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid (Versuch 1A)

    Der Peptid-Bindungsassay mittels Fluorescein-markiertem Peptid dient der Quantifizierung

    von TAP in den Membranen. Aufgrund der Tatsache, dass in Membranen gegen einen großen

    Hintergrund von Proteinen gearbeitet wird, bietet dieser Assay die Möglichkeit, die Menge an

    TAP über die Menge an TAP-spezifisch gebundenem Peptid zu bestimmen. Die Spezifität der

    Bindung wird durch einen 400fachen Überschuss an unmarkiertem Kompetitor Peptid

    bestimmt.

    Material

    Peptide

    Fluoreszenz Peptid (RRYC(F)KSTEL) C4F 30 µM

    Kompetitor Peptid (RRYQKSTEL) R9LQK 3.5 mM

    1×PBS (Phosphate buffered saline)

    137 mM NaCl

    2,7 mM KCl

    10 mM Na2HPO4

    2 mM KH2PO4

    pH 7,0

  • Der Peptidtransporter TAP 37

    Lyse-Puffer

    1xPBS pH 7.0

    SDS 1% (w/v)

    Platte (Fluoplate)

    96-well schwarz, für Fluoreszenz Messungen

    Protokoll

    1. TAP – Bestimmung mittels Zentrifugationsassay (3fach-Bestimmung)

    Tabelle 1

    Bindung Kompetitor

    TAP1/2 100 µl 100 µl

    C4F Peptid [30 µM] 2.5 µl

    2.5 µl

    Kompetitor Peptid [R9LQK, 3.5 mM] - 8.5 µl

    PBS

    47.5 µl

    39µl

    1. zu 150 µl TAP-haltigen Membranen werden 500 µl PBS gegeben.

    2. Wie in Tabelle 1 dargestellt, alle Komponenten bis auf TAP-haltige Membranen (wie

    in 1 verdünnt) zusammenpipettieren (Die Messung erfolgt in Triplikaten).

    3. Durch Zugabe der TAP-haltigen Membranen die Bindung starten.

    4. 15 min auf Eis inkubieren.

    5. Bindungsansatz durch Zugabe von 1 ml eiskaltem PBS verdünnen und anschließend

    sofort bei 14.000 rpm und 4°C für 8 min abzentrifugieren.

    6. Pellets in 100 µl eiskaltem PBS resuspendieren und anschließend nochmals mit 900 µl

    PBS verdünnen (zügig arbeiten).

    7. Zentrifugation bei 14.000 rpm bei 4°C für 8 min.

    8. Pellets in 300 µl Lyse-Puffer bei Raumtemperatur resuspendieren und 10 min

    inkubieren.

  • Der Peptidtransporter TAP 38

    9. Jeweils 250 µl der lysierten TAP-haltigen Membranen bzw. 250 µl der Standardreihe

    in ein Well der Fluoreszenz-Platte überführen und die Fluoreszenz am ELISA-Reader

    vermessen ( λex/em = 485/520 nm)

    2. Erstellen der Standardkurve

    Tabelle 2

    C4F Endkonz. 0 nM 2 nM 4 nM 8 nM 10 nM

    Lysis-Puffer 600 µl 596 µl 592 µl 584 µl 580 µl

    C4F Peptid (300 nM) 0 4 µl 8 µl 16 µl 20 µl

    Auswertung

    Bestimmung der TAP-Konzentration:

    Anhand der Standardkurve soll die Menge an TAP (Mw TAP1/2: 150 kDa)

    bestimmt werden

    a. Konzentration in mol/l

    b. in Gewichtsprozenten der Gesamtproteinmenge

  • Der Peptidtransporter TAP 39

    8.2 Markierung von Peptiden mit Fluoreszenzfarbstoffen (Versuch 1B)

    Zur biochemischen Charakterisierung von TAP werden Fluoreszenz-markierte Peptide

    verwendet. Die Markierung des Peptides, welches ein Cystein enthält, erfolgt über dessen

    nukleophilen Angriff an den mit einer reaktiven Gruppe (z. B. Iodoacetamido, Maleimido)

    funktionalisierten Fluorophor. Zur Entfernung freien Farbstoffs und nicht markiertem Peptid

    wird im Anschluss an die Reaktion das Reaktionsgemisch über eine „reversed phase high

    performance liquid chromatography“ (RP-HPLC) aufgereinigt. Die vereinigten

    Elutionsfraktionen werden zur Entfernung des Lösungsmittels lyophyilisiert

    (gefriergetrocknet). Die Qualität des aufgereinigten Produkts wird mittels analytischer HPLC

    und MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass

    spectrometry) verifiziert.

    Material

    10x PBS pH 6.5

    1.37 M NaCl

    27 mM KCl

    100 mM Na2HPO4

    20 mM KH2PO4

    Tricinpuffer

    100 mM Tricin pH 9.0

    PBS/DMF (Dimethylformamid)

    PBS pH 6.5

    20 % (v/v) DMF

    Fluorophor

    50 mM in 100 % DMF lösen

    Peptid

    3.5 mM Peptid in PBS/DMF lösen

    RP-HPLC

    HPLC Anlage der Firma Jasco

    Säule: PerfectSil-300ODS-C18 5 µm Protein & Peptid Säule (4.6 x 250 mm)

  • Der Peptidtransporter TAP 40

    Äquilibrierung der Säule und Entwicklung eines Elutionsgradienten

    Linearer Gradient von 5 auf 100 % Acetonitril (ACN) in 20 min + Waschschritt:

    Eluent A: H2O + 0.1 % TFA (trifluoroacetic acid)

    Eluent B: ACN + 0.1 % TFA

    Flussrate: 1 mL/min

    0 – 20 min linearer Gradient 5 – 100 % B (1 mL/min)

    20 – 24 min 100 % B (1 mL/min)

    24 – 25 min linearer Gradient 100 – 5 % B (1.5 mL/min)

    25 – 30 min 5 % B (1.5 mL/min)

    Ein alternatives Programm zur Reinigung des Reaktionsgemisches muss anschließend

    etabliert werden, um eine optimale Trennung der Substanzen zu gewährleisten.

    Protokoll

    Zu Beginn des Praktikumsversuches werden sowohl die Peptidsequenz als auch die

    chemische Zusammensetzung des Fluorophors bekannt gegeben und der entsprechende

    Reaktionsansatz berechnet. Nach Lösen der Edukte werden der frisch angesetzten

    Peptidlösung 10 µL und der Fluorophorlösung 1 µL entnommen. Diese werden mit je

    400 µL Wasser verdünnt und zur späteren Zuordnung der einzelnen Peaks lichtgeschützt

    aufbewahrt. Die verbleibenden Eduktlösungen werden zur Vermeidung von Nebenreaktionen

    (Welche?) möglichst schnell gemischt und für ca. 60 min im Dunkeln bei Raumtemperatur

    inkubiert. Im Anschluss erfolgt die Reinigung des Reaktionsgemisches mittels RP-HPLC.

    Zunächst muss ein geeigneter Elutionsgradient etabliert werden, um das Produkt von den

    Edukten zu trennen. Dazu werden pro Lauf 10 µL des Reaktionsansatzes auf die Säule

    aufgetragen. Nach der Etablierung eines Gradienten werden mit diesem zusätzlich die Edukte

    analysiert, um die Peaks den einzelnen Substanzen zweifelsfrei zuordnen zu können und eine

    Quantifizierung der Produktmenge über die Peakflächen zu ermöglichen. Abschließend wird

    der Rest des Reaktionsgemisches mit dem etablierten Gradienten aufgetrennt und das

    Säuleneluat in 0.5 mL Fraktionen gesammelt. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt,

    in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophylisiert. Am nächsten Tag wird das

    Peptid in 100 µL Wasser gelöst und dessen Konzentration über die Absorption des

    Fluorophors bestimmt. Dazu werden eine 1:10 und 1:100 Verdünnung in Tricin-Puffer pH 9

    hergestellt (jeweils 20 µL) und mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrometers die Absorption

    gemessen. Zur Verifizierung werden nochmals 20 µL des markierten Peptids mittels HPLC

    analysiert und die Masse mittels MALDI-TOF-MS an einem Voyager-DE (PerSeptive

    Biosystems) Massenspektrometer bestimmt. Dazu werden 0.5 µL des markierten Peptids mit

  • Der Peptidtransporter TAP 41

    0.5 µL gesättigter -Cyano-4-hydroxyzimtsäure in Wasser/Acetonitril/TFA (33:67:0.1) auf

    dem Probenteller gemischt. Durch Verdunstung bilden sich Kristalle für die MALDI-TOF-

    MS (Die Massenbestimmung findet nicht während des Praktikums statt).

    Auswertung

    Bestimmen Sie die Ausbeute der Markierungsreaktion über zwei verschiedene Ansätze!

    a) Integration der Peakflächen von Produkt und Edukten

    b) Konzentrationsbestimmung des Produktes über UV/VIS-Spektroskopie

  • Der Peptidtransporter TAP 42

    8.3 Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP (Versuch 1C)

    Der Peptidtransporter TAP transportiert Peptide vom Zytosol ins Lumen des

    Endoplasmatischen Retikulums. Die höchste Transporteffizienz wird für Peptide mit einer

    Länge von 8 – 12 Aminosäuren beobachtet. Die Spezifität der Peptide beschränkt sich auf die

    drei N-terminalen und den C-terminalen Aminosäurenrest(e). Bevor die Peptide jedoch

    transportiert werden, binden sie an TAP.

    In diesem Praktikumsversuch soll in einem Bindungssättigungsexperiment mit den zuvor

    isolierten TAP-haltigen Membranen die Bindungsaffinität (KD-Wert) eines Peptids zu TAP

    bestimmt werden. Dazu wird die Peptidbindung an TAP in Abhängigkeit von der

    Peptidkonzentration untersucht. Um das Peptid detektieren zu können, wurde es mit dem

    Fluorophor Fluoreszein markiert, der sich mit Hilfe eines Fluoreszenzspektometers sehr

    empfindlich nachweisen lässt. Als Peptid wurde ein Nonamer (RRYQC(Fluoreszein)STEL)

    ausgewählt, da dies der optimalen Peptidlänge für TAP entspricht.

    Material

    10x PBS pH 7.0

    1,37M NaCl

    27mM KCl

    100mM Na2HPO4

    20mM KH2PO4

    Bindungspuffer

    1x PBS

    Peptide

    C4F: RRYC(Fluoreszein)KSTEL

    R9LQK: RRYQKSTEL

    TAP

    TAP-haltige Membranen

    Zum Absättigen der Filtermembranen

    0,3% PEI-Lösung (Poly-ethylenimin)

    Solubilisierungspuffer

    1xPBS/1% SDS

  • Der Peptidtransporter TAP 43

    Protokoll Bindungssättigungsexperiment:

    Auf einer 96-well Platte werden die TAP-haltigen Membranen, das Fluoreszein-markierte

    Peptid (C4F) und das unmarkierte Kompetitorpeptid bei 4°C zusammengegeben und mit

    Bindungspuffer auf das gleiche Volumen gebracht. Die Zugabe des 400-fachen molaren

    Überschusses von unmarkiertem Kompetitorpeptid (RRYQKSTEL) ermöglicht die

    Unterscheidung zwischen unspezifischer Bindung (an Gefäßwände, an die Lipidschicht der

    Membranen) und spezifischer Assoziation an TAP.

    Durch 20 min Inkubation der Proben auf Eis wird die Einstellung des

    Bindungsgleichgewichtes abgewartet. Währenddessen werden Filterplatten mit einem

    Porendurchmesser von 1 µm erst mit 200 µL 0,3%iger PEI-Lösung (lädt Filtermembran

    positiv) für 10 min inkubiert anschließend abgesaugt. Dann werden die Proben mit 100 µl

    Bindungspuffer verdünnt. So bleibt die Menge an Membranen, die in der 96-well Platte

    zurückgebliebenen sind möglichst gering. Anschließend können die Proben auf die

    vorbereiteten Filterplatten übertragen und ungebundenes Peptid abgesaugt werden. Die

    zurückbleibenden Membranen werden dreimal durch Zugabe und Absaugen von 100 µl

    kaltem Bindungspuffer gewaschen. Diese Arbeitsschritte sind wegen der einsetzenden

    Dissoziation bereits gebundener Peptide sehr zeitkritisch und werden daher mit einer Multi-

    Kanal-Pipette durchgeführt. Danach wird die Filterplatte von dem Filtrationsapparat

    abgenommen.

    Durch Zugabe von 250 µl Solubilisationspuffer (enthält 1% SDS, daher bei

    Zimmertemperatur aufbewahren) wird TAP denaturiert (Achtung: Schaumbildung vermeiden)

    und die gebundenen Peptide innerhalb von 5 Minuten freigesetzt. Aus den 250 µl Solubilisat

    werden 200 µl entnommen und auf eine schwarze Fluoreszenzmicrotiterplatte überführt.

    Um die exakte Menge an gebundenem Fluoreszein-Peptid zu quantifizieren, werden

    Eichlösungen zubereitet und je 200 µl in die Fluoreszenzmicrotiterplatte pipettiert. Für alle

    Proben wird mit einem Elisa-Reader (Ex/Em: 485/520 nm) die Fluoreszenz bestimmt.

    Pipettierschemata:

    Von allen Konzentrationen werden Triplikatbestimmungen angefertigt.

    Das Pipettierschema soll sich anhand folgender Endkonzentrationen von Fluoreszenz-Peptid,

    Kompetitor-Peptid (400 x Überschuss, jedoch min. 1µl von der 4,2mM Stocklösung) und

    TAP-haltigen Membranen (40 µg Gesamtproteinmenge/“well“) erstellt werden. Das

  • Der Peptidtransporter TAP 44

    Gesamtvolumen beträgt 50 µl. Die Stocklösung des C4F Peptids beträgt 10 µM. Aus dieser

    Stocklösung müssen X weitere Verdünnungen (C4F X nM) angesetzt werden, um die im

    Pipettierschema angegebenen C4F Konzentration (3-300 nM) pipettieren zu können.

    Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment

    Probe C4F

    Endkonz.

    [nM]

    Kom-

    petitor

    R9LQK

    TAP

    5mg/ml

    [µl]

    C4F

    X

    nM

    C4F

    X

    nM

    C4F

    X

    nM

    C4F

    X

    nM

    C4F

    X

    nM

    R9LQK

    4,2 mM

    Bindung-

    spuffer

    [µl]

    1-3 3 -

    4-6 +

    7-9 10 -

    10-12 +

    13-15 30 -

    16-18

    19-21 60 -

    22-24 +

    25-27 100 -

    28-30 +

    31-33 200 -

    34-36 +

    37-39 300 -

    40-42 +

    Pipettierschema Bindungssättigungsexperiment Eichgerade:

    Konzentration [nM] 0 0.5 2.5 5 7.5 10

    Fluoreszein-Peptid [µl]#

    -

    3#

    15#

    30#

    45#

    60#

    Solubilisationspuffer [µl] 600 597 585 570 555 540

    # aus Stocklösung: 100 nM

    Auswertung

    1. Stellen Sie eine Eichbeziehung zwischen der Fluoreszenzintensität im Emissionsmaximum

    und der C4F-Peptidkonzentration her.

    2. Wie ist der Kd-Wert für das untersuchte Peptid?

  • Der Peptidtransporter TAP 45

    8.4 Untersuchung der Nukleotidbindung von TAP (Versuch 1D)

    Als Mitglied der ABC-Transporterfamilie besitzt TAP die Eigenschaft ATP zu hydrolysieren,

    um den Transport von Peptiden über die ER-Membran zu energetisieren. Eine Voraussetzung

    für die ATP-Hydrolyse ist die ATP-Bindung. Sowohl TAP1 als auch TAP2 besitzen eine

    Nukleotidbindungsdomäne (NBD). Beide NBDs bilden zusammen zwei ATP-Bindestellen,

    die durch hochkonservierte Motive charaktrisiert sind.

    In diesem Versuch wird die Affinität von TAP für verschiedene Nukleotiddi- und

    triphosphate mittels Kompetitionsexperimenten bestimmt. Dabei wird über Immunoblotting

    die Nukleotid abhängige Kompetition von TAP von ATP-Agarose quantifiziert.

    Material

    Membran

    TAP-haltige Membranen (12,5 mg Gesamtprotein)

    Solubilisierung-Puffer (10 ml)

    20 mM HEPES pH 7.4

    150 mM NaCl

    1 mM KCl

    5 mM MgCl2

    2% NP-40

    15% Glycerin

    Wasch-Puffer (50 ml)

    20 mM HEPES pH 7.4

    150 mM NaCl

    1 mM KCl

    5 mM MgCl2

    0.2% NP-40

    15% Glycerin

    ATP-Agarose (32 mg)

    C8-immobilisierte ATP-Agarose

    Stocklösungen

    200 mM HEPES pH 7,4

    1,5 M NaCl

    1 M MgCl2

    1 M KCl

    100% NP-40

    86% Glycerin ( = 1,23 g/ml)

  • Der Peptidtransporter TAP 46

    Protokoll

    Wichtig: Alle folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt! Sowohl die Puffer als

    auch die Zentrifuge müssen kalt sein.

    Solubilisierung:

    Zu TAP-haltigen Membranen (12,5 mg Gesamtprotein) wird das gleiche Volumen PBS

    gegeben und die Membrane werden auf Eis aufgetaut. Anschließend werden die Membranen

    8 min bei 4°C und 14000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wird in 2,5 ml Solubilisierung-Puffer

    resuspendiert und mindestens 30 min auf Eis inkubiert (Achtung: Luftblasen vermeiden!).

    Anschließend wird der Solubilisierungs-Ansatz 30 min bei 4°C und 80.000 rpm im TLA-110

    Rotor (Tisch-Ultrazentrifuge) zentrifugiert.

    Vorbereiten der ATP-Agarose:

    Während der Zentrifugation wird die ATP-Agarose vorbereitet. Es werden 3,5 mg ATP-

    Agarose pro Ansatz benötigt, d.h. insgesamt werden 28 mg auf einer Feinwaage abgewogen.

    Die Gesamtmenge an ATP-Agarose wird in H2O aufgenommen und 30 min inkubiert (1 ml

    pro 3,5 mg). Die Beads werden dann zweimal mit 4 ml Wasch-Puffer gewaschen (2 min @

    200x g, 4°C). Anschließend werden die Beads gleichmäßig auf die verschiedenen Ansätze

    verteilt. Dazu werden die Beads in 4 ml Waschpuffer aufgenommen und jeweils 500 µl auf

    ein Reaktionsgefäß gegeben (wichtig: immer auf Eis und nie austrocknen lassen).

    Vorbereiten der Nukleotide:

    Es müssen 8 verschiedene Ansätze mit verschiedenen Nukleotidkozentrationen vorbereitet

    werden. Das Gesamtvolumen eines Ansatzes beträgt 300 µl. Von diesen 300 µl sind 250 µl

    Solubilisat – der Rest besteht aus Wasch-Puffer und Nukleotid.

    Es soll der IC50-Wert für verschiedene Nukleotide bestimmt werden (ATP, ADP, CTP und

    GTP) – jeweils eine Gruppe wird einen IC50 Wert bestimmen.

    Nachdem die Zentrifugation für das Solubilisat abgeschlossen ist, kann das Solubilisat

    abgenommen werden und jeweils 250 µl auf den Nukleotidansatz gegeben werden.

    Inzwischen werden die Beads nochmals abzentrifugiert und der Überstand verworfen

    (Achtung keine Beads mit abnehmen). Nach 15 min werden die Nukleotidansätze auf die

    vorbereiteten Beads gegeben 1 h bei 4°C rotierend inkubiert.

    Die Ansätze werden danach 3 mal mit 500 µl Wasch-Puffer gewaschen (jeweils 2 min bei

    200x g zentrifugieren). Die Beads werden in 50 µl 3x SDS-Ladepuffer resuspendiert und

    20 min bei 65°C inkubiert. Danach werden die Beads bei 21000x g abzentrifugiert. 15 µl des

  • Der Peptidtransporter TAP 47

    Überstands der Proben und 4 µl vom Marker werden auf das Gel geladen, das Gel gefahren

    und TAP durch den Western-Blot sichtbar gemacht.

    Folgende Konzentrationen im jeweiligen Ansatz werden benötigt:

    Enkonzentration

    Nukleotid [µM] 0 3 10 30 100 300 1000 5000

    c (Nukleotid)

    V (Nucleotid)

    V (Wasch-P.)

    V(Solubilisat) 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl

    V (gesamt) 300 µl

    Kleinere Volumina als 1 µl können nicht exakt pipettiert werden. Es sollten nicht mehr als

    zwei Vorverdünnungen vom Nukleotid gemacht werden. c - Konzentration; V – Volumen

    SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Der elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen dienen

    diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele. SDS ist ein anionisches Detergenz, das die

    Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass Komplexe mit konstanter negativer Ladung pro

    Masseneinheit entstehen. So können Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrem

    Molekulargewicht getrennt werden.

    Materialien

    BioRad-System SDS-PAGE Gießapparatur

    30% Acrylamid/Bisacrylamid (Verhältnis 37,5/1))

    Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/ HCl, 0,4 % SDS, pH 8,8

    Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/ HCl 0,4 % SDS, pH 6,8

    10% APS (Ammoniumperoxidsulfat)

    TEMED

    Lauf-Puffer:

    25 mM Tris/HCl

    192 mM Glycin

    0.1% (w/v) SDS

    pH 8.8

  • Der Peptidtransporter TAP 48

    Protokoll

    Zur Vorbereitung der SDS-Gele werden die Gießkammern entsprechend der

    Herstellerangaben vorbereitet. Zuerst wird die Lösung des Trenngels laut Pipettierschema

    angesetzt, in die beiden Gießkammern bis zu 2/3 der Gesamthöhe pipettiert und anschließend

    mit 1 ml Ethanol überschichtet, um alle Luftblasen zu entfernen und eine scharfe

    Abschlusskante des Trenngels zu erreichen. Nachdem das Gel vollständig polymerisiert ist,

    wird das Ethanol entfernt, die vorbereitete Sammelgellösung aufgetragen und die

    Probenkämme eingefügt. Die fertigen Gele werden (eingeschlagen in feuchte Papiere und

    Lagerung in einer kleinen Plastiktüte) über Nacht im Kühlschrank gelagert.

    Pipettierschema für 2 SDS-PAGE Gele 7*8,5 cm des Biorad-Systems:

    Trenngel 10% Sammelgel 5%

    H2O 3,95 ml 2,7 ml

    Acrylamid/Bisacrylamid 3,1 ml 650 µl

    Trenngelpuffer 3,95 ml -

    Sammelgelpuffer - 1,1 ml

    APS 10% 40 µl 30 µl

    TEMED 20 µl 10 µl

    Immunoblot

    Material

    SDS-PAGE

    Nitrocellulose-Membran (8 x 10 cm)

    Filterpapier (4 Stück a 10 x 10 cm)

    Transfer-Puffer

    25 mM Tris/HCl

    192 mM Glycin

    0.03% (w/v) SDS

    20% (v/v) Methanol

    pH 7.5

    10x TBS

    200 mM Tris

    2.5 M NaCl

    5% Milch-TBS-T

    1x TBS

    0,1% Triton X-100

    3% Milchpulver

  • Der Peptidtransporter TAP 49

    ECL1

    9 ml H2O

    1 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0

    100 µl 250 mM Luminol (in DMSO)

    44 µl 90 mM Coumarinsäure (in DMSO)

    ECL2

    9 ml H2O

    1 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0

    6,4 µl 30% H2O2

    Antikörper

    1: 20 anti-TAP1 (148.3) in 5% Milch-TBS-T

    1:20000 anti-Maus Meeretichperoxidase gekoppelter Antikörper in TBS-T

    Protokoll

    Nitrocellulosemembran und Filterpapiere und das Gel werden zunächst in Transferpuffer

    getränkt. Die Anode und Kathode (untere und obere Elektrodenplatte) des Semi-Dry-Blots

    werden vor dem Auflegen der Filterpapiere mit dem Transferpuffer angefeuchtet. Auf zwei

    Filterpapiere werden die Membran und anschließend das Gel aufgelegt. Zum Schluss wird

    eine weitere Lage von zwei Filterpapieren auf das Gel aufgelegt. Die obere Elektrodenplatte

    schließt den Aufbau ab. Achtung! Luftblassen zwischen den einzelnen Schichten des Blots

    lassen sich gut durch vorsichtiges Rollen mit einem 50 ml Falcon herausdrücken. Die

    Dauer des Elektrotransfers beträgt 90 min bei 100 mA pro Gel. Anschließend werden die

    Membranen 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 5% Milch-TBS-T inkubiert. TAP1 wird mit dem

    148.3 Hybridomüberstand nachgewiesen. Dabei wird die Membran mit dem Antikörper

    mindestens 1 h bei RT (besser über Nacht bei 4°C) inkubiert. Anschließend wird die

    Membran 3 x 5 min mit TBS-T gewaschen und 1 h mit dem Ziege-Anti-Maus-HRP-Konjugat

    (Fc spezifisch), bei RT inkubiert. Schließlich werden die Membranen 3 x 5 min mit TBS-T

    gewaschen und mit ECL1- und ECL2-Lösung 1 min inkubiert. Abschließend werden die

    Membranen in einem Lumi-Imager (Roche) ausgewertet und die Daten mit dem

    Computerprogramm „Origin“ mit einer sigmoidalen Kurve gefittet.

  • Der Peptidtransporter TAP 50

    Gleichung:

    )*( 50101 nXLogICBA

    BY

    A: maximales Signal

    B: Hintergrund

    IC50: Halbmaximale Verdrängung

    X: Logarithmus zur Basis 10 der ATP Konzentration

    n: Hill-Koeffizient

    Auswertung

    Bestimmen Sie den IC50 Wert für die Nukleotide.

    Im Protokoll müssen der Western-Blot, eine Tabelle mit den quantifizierten Banden und der

    Graph mit dem Fit dargestellt werden.

    Molekulargewichte des Markers:

  • Der Peptidtransporter TAP 51

    8.5 Peptidtransportassay (Versuch 1E)

    Der in vitro Peptidtransportassay basiert auf der Glykosylierung des transportierten Peptids

    im Lumen des Endoplasmatischen Reticulums (ER), sowie dessen spezifische Bindung an

    Concanavalin A-Sepharose und anschließender Trennung von nicht transportiertem Peptid.

    Der Transport wird in Abhängigkeit von der ATP-Konzentration (0.1-10 mM), Peptid-

    Konzentration (0.1-2 µM), Temperatur (4-40°C), Kationen und pH (pH 5-9) untersucht.

    Durch Ermittlung der Fluoreszenz im ELISA-Reader wird der Peptidtransport quantifiziert.

    Material

    Peptid: RRYQNSTCL (NST-f)

    1×PBS (Phosphate buffered saline)

    137 mM NaCl

    2,7 mM KCl

    10 mM Na2HPO4

    2 mM KH2PO4

    pH 7,0

    Stopp-Puffer 1xPBS

    10 mM EDTA (pH 8,0)

    Lyse-Puffer

    50 mM Tris/HCl, pH 7.5

    150 mM NaCl

    5 mM KCl

    1 mM CaCl2

    1 mM MnCl2

    1% NP-40

    Elutionspuffer

    Lyse-Puffer

    200 mM Methyl α-D-Mannopyranoside

    (15 ml Lyse-Puffer versetzt mit 582.6 mg Methyl α -D-Mannopyranoside)

  • Der Peptidtransporter TAP 52

    Gruppe 1, 2, 6: ATP-Konz. ( 0; 0,1; 0,2; 0,3; 1; 3; 6; 10 mM)

    Gruppe 4, 5: Peptid-Konz. (0.1; 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2 µM)

    Gruppe 3, 7: Temperatur (4, 12, 24, 32, 40 °C)

    Gruppe 8, 9: pH (pH 5: MES-Puffer; pH 6: Na-Phosphatpuffer; pH 7: HEPES-Puffer;

    pH 8: Tris-Puffer; pH 9: CHES-Puffer)

    Gruppe 10, 11: Kationen (statt 5 mM MgCl2 im Puffer: NiCl2, CuCl2, MnCl2, CaCl2)

    Protokoll

    Das Pipettierschema für den Transportassay sieht folgender Weise aus:

    Transport Negativ Kontrolle

    Membranen 20 µl 20 µl

    ATP [30mM] 5 µl -

    MgCl2 [100 mM] 2.5 µl 2,5 µl

    1x PBS 17.5 µl 22,5 µl

    NST-f peptid [10 µM] 5 µl 5 µl

    Der Reaktionsansatz wird bis auf das Peptid in 1,5 ml Reaktionsgefäße vorgelegt (auf Eis!).

    Je nach untersuchtem Parameter bietet es sich an, einen Mastermix anzusetzen. Der Transport

    wird durch Zugabe vom NST-f Peptid gestartet und erfolgt für 3 min bei 32 °C. Anschließend

    wird durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Stopp-Puffer der Transport gestoppt. Nach

    Zentrifugation für 8 min bei 14000 rpm und 4°C wird der Überstand verworfen und das Pellet

    in zunächst 100 µl Lyse-Puffer resuspendiert und mit weiteren 800 µl versetzt. Die

    Reaktionsansätze werden nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur für 8 min

    bei 14000 rpm zentrifugiert. In der Zwischenzeit werden ConA-beads (50%ige Suspension

    (w/v)) in ein kleines Falcon überführt und 2 x mit Lysepuffer gewaschen (2 min @ 1000 x g).

    Der Überstand der lysierten Membranen wird zu 50 µl gewaschenen ConA-beads pipettiert

    und 1 h bei 4°C bzw. 30 min bei RT überkopf rotiert. Die Reaktionsansätze werden für 2 min

    bei 1000 rpm und 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die ConA-beads werden

    zweimal mit je 1 ml Lyse-Puffer gewaschen, mit 300 µl Elutionspuffer versetzt und 30 min

    bei RT inkubiert. Die beads werden für 2 min bei 1000 rpm pelletiert, 250 µl der Elution in

    eine schwarze Microtiterplatte pipettiert und im ELISA-Reader quantifiziert

    (λex/em=485/520 nm).

  • Glutathion-S-Transferase 53

    9 Glutathion-S-Transferase

    Zellen sehen sich einer ständigen Konfrontation von toxischen Substanzen ausgesetzt, die

    endogen produziert oder aus der Umgebung aufgenommen werden. Zur Abwehr dieser

    Toxine haben sich Abwehrmechanismen entwickelt wie zum Beispiel das sofortige

    Ausschleusen von Zytostatika durch entsprechende Pumpen oder die Transformation der

    Zytostatika mit anschließender Extrusion. Bei der Biotransformation wird die Detoxifizierung

    in drei Phasen untergliedert (Abb. 2.1): In Phase I und II werden die zumeist hydrophoben

    toxischen Substanzen in wasserlösliche Metabolite mit geringerer Toxizität umgewandelt, die

    dann in Phase III durch spezielle Transportsysteme aus der Zelle ausgeschleust werden. In

    Phase I werden die Zytostatika vornehmlich durch das Cytochrom P450 System oxidiert.

    Phase II Enzyme katalysieren im Folgenden die Konjugation von wasserlöslichen Substraten

    an die aktivierten Toxine. Meistens geschieht dies mittels Kopplung von Glutathion durch

    verschiedene Glutathion-S-Transferasen (GST).

    Abb.: 2.1: Schematische Darstellung der Detoxifizierung von Benzopyren: Benzopyren diffundiert durch die

    Membran, wo es in mehreren Schritten zum Epoxid oxidiert wird. Nach der Aktivierung wird das Toxin durch

    GST mit Glutathion markiert, wodurch es wasserlöslicher wird und von verschiedenen Transportsystemen als

    Substart erkannt wird (entnommen aus Sheehan et al. 2001).

    GSTs stellen dimere Enzyme dar, die hauptsächlich im Zytosol vorkommen. Es werden aber

    mit geringerer Häufigkeit mikrosomale GSTs gefunden. Die GSTs bilden sowohl Homo- als

    auch Heterodimer. Neben ihrer detoxifizierenden Eigenschaft sind GSTs auch noch an

    anderen Reaktionen wie zB. Isomerisierung von Retinolsäure und der Prostaglandinsynthese

  • Glutathion-S-Transferase 54

    beteiligt oder fungieren als Peroxidasen. Zudem nehmen GSTs durch die Bindung an eine

    Vielzahl verschiedener zellulärer Komponenten regulatorische Funktionen ein.

    Wie schon erwähnt, bilden die GSTs dimere Enzyme, wobei jede Untereinheit ein

    katalytisches Zentrum trägt (Abb. 2.2). Trotz zweier katalytischer Zentren konnte keine

    Kooperativität festgestellt werden. Zur Addition oder Substitution muss die Thiolgruppe des

    Glutathions in seiner anionischen Form vorliegen. Zur Stabilisierung des Thiolatanions des

    Glutathions findet man im katalytischen Zentrum eine Base, die je nach Klasse von GST ein

    Tyrosin oder Serin sein kann.

    Humane GSTs werden in die vier Klassen Alpha, Mu, Pi und Theta eingeteilt. Neuerdings

    wurden auch noch die Klassen Omega und Kappa definiert. Weitere Klassen werden in

    Invertebraten gefunden.

    Abbildung 2.2: Struktur der Glutathion-S-Transferase: A) Kristallstruktur der murinen Glutathion-S-Transferase

    in Komplex mit 4-Hydroxynon-2-enal in einer Untereinheit und Glutathion in der anderen Untereinheit (PDB

    Code: 1B48). B) Modellierte Struktur des Fusionsproteins GST-eGFP.

    Schistosomen sind Helminthen, die die parasitische Krankheit Schistosomiasis (Bilharziose)

    verursachen, an der weltweit mehr als 275 Millionen Menschen erkrankt sind. Die GSTs von

    Schistosoma japonicum wurde detailliert untersucht, da angenommen wird, dass diese

    A B

  • Glutathion-S-Transferase 55

    Enzyme an der Resistenz gegen Praziquantel, das meist benutzte Medikament gegen diese

    Krankheit, beteiligt sind.

    Im Praktikum arbeiten wir mit der 26 kDa Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma

    japonicum (SJ26). Dieses 218 Aminosäure umfassende Protein ist über einen kurzen Linker

    mit einem eGFP (enhanced green fluorescence protein) am C-Terminus verbunden (Abb.

    2.2). Dieses Fusionsprotein umfasst 486 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 55,7

    kDa. In der modellierten Struktur bildet sowohl das GST wie auch das GFP einen Dimer. Die

    Fluoreszenz von eGFP vereinfacht die Detektion des Proteins und dient zur Charakterisierung

    der Substratbindung über fluorescence resonance energy transfer (FRET).

    Literatur:

    Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A.; 2001; Structure, function and evolution of

    glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of

    ancient enzyme superfamily. Biochem. J.; 360; p. 1 - 16

  • Glutathion-S-Transferase 56

    9.1 Überexpression von GST-eGFP (Versuch 2A)

    Für die Überexpression werden kompetente BL21(DE3) Zellen mit dem Plasmid pEGGsH6

    (Abb. 2.3) transformiert. N-terminal des GST-eGFP-Gens befindet sich ein TAC-Promotor.

    Dieser kann durch Zugabe von IPTG (Isopropyl--D-thiogalactopyranosid) induziert werden,

    wodurch es zu einer Überexpression von GST-eGFP kommt.

    Abbildung 2.3: Vektorkarte des Expressionsvektors pEGGsH6. Die Expression steht unter dem starken IPTG

    induzierbaren T7-Polymerase abhängigen TAC-Promotor. GST ist über einen Linker, der eine Thrombin- und

    TEV (tobacco etch virus) Schnittstelle enthält, mit eGFP verbunden, das am Ende einen His6-Tag trägt. Als

    weitere offene Leseraster findet man das Gen für die -Lactamase (bla) und den Lac-Repressor (lacIq).

    E. coli hat eine optimale Wachstumsrate bei einer Temperatur von 37°C und einer

    Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm. Nach Erreichen einer optischen Dichte (OD600) von

    0,8 in LBAmp-Medium (Selektionsmarker Ampicillin) werden die Zellen mit IPTG induziert.

    Die eigentliche Proteinexpression nach Induktion erfolgt bei 28°C, da bei dieser Temperatur

    eine höhere Ausbeute an korrekt gefaltetem Protein und weniger Abbauprodukte zu erwarten

    sind. Die Zellen werden für 5 h kultiviert und anschließend durch Zentrifugation geerntet.

    Ansetzen der Medien und der Vorkultur

    Materialien

    Autoklavierter 250 ml Erlenmeyerkolben

    Autoklaviertes LB-Medium

  • Glutathion-S-Transferase 57

    Autoklavierte Zahnstocher

    Ampicilin [100 mg/ml]

    Schüttler für die Zellkultur, Temperatur 37°C und 28°C

    Medienzusammensetzung:

    LB (Luria Betani)-Medium 5 g Hefeextrakt

    5 g NaCl

    10 g Trypton/Pepton Mischung

    Ad 1 l H2O, autoklavieren

    Das Antibiotikum Ampicillin wird in einer Endkonzentration von 100 µg/ml zu dem

    abgekühlten Medium gegeben.

    Protokoll

    Sterile Bedingungen Alle Arbeiten werden an der Flamme ausgeführt!

    Alle geöffneten Gefäße und Deckel sollten in

    unmittelbarer Nähe der Flamme liegen! Zahnstocher

    nicht mit der Hand berühren!

    Am Abend wird der autoklavierte 250 ml Erlenmeyerkolben unter sterilen Bedingungen mit

    50 ml Ampicillin-haltigem LB-Medium gefüllt, mit Hilfe eines Zahnstochers (Zahnstocher

    mit abgeflammter Pinzette anfassen) in dem vorbereiteten Medium angeimpft und über Nacht

    bei 37°C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 180 rpm inkubiert.

    Proteinexpression in E. coli

    Materialien

    Autoklavierte 2 l Kolben mit 500 ml LB-Medium

    Ampicillin [100 mg/ml]

    IPTG Stammlösung [1 M]

    50 ml Übernachtkultur

    Sterile Pipetten 1 und 10 ml

    Photometer, Fluoreszenzküvetten und Absorptionsküvetten

    Fluoreszenzspektrometer

    500 ml Zentrifugenbecher

    Sorvall Zentrifuge

    50 ml Falcons

    Pufferzusammensetzung

    100 ml 1x PBS, pH 7,4

  • Glutathion-S-Transferase 58

    Protokoll

    Am Morgen werden 500 ml LB-Medium mit der vorbereiteten Übernachtkultur angeimpft.

    Hierzu wird dem autoklavierten LB-Medium Ampicillin in einer Endkonzentration von

    100 µg/ml unter sterilen Bedingungen zugegeben. Das Medium wird mit dem gesamten

    Inhalt der Übernachtkultur (V = 50ml) angeimpft. Die Kulturen werden bei 37°C und

    180 rpm inkubiert. In Zeitabständen von 20 min wird eine Probe von der Kultur entnommen

    und im Photometer bei einer OD von 600 nm vermessen. Die Genexpression wird bei

    Erreichen einer OD600 von 0,7 bis 0,8 mit IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM

    induziert. Vor der Induktion wird zusätzlich zur OD600 Bestimmung die GFP-Fluoreszenz (Ex

    = 470 nm; Em = 511 nm) gemessen. Nach der Induktion werden jede Stunde die optische

    Dichte sowie die GFP-Fluoreszenz einer 1:10 Verdünnung (in LB-Medium) gemessen. Nach

    5 Stunden Inkubation bei 28°C und 180 rpm werden die Zellen durch Zentrifugation

    (6.000x g, 20 min, 4°C) geerntet (Sorvall Zentrifuge, GS-3 Rotor). Die Pellets (Überstand

    nach Zentrifugation vollständig entfernen) werden in 1x PBS (40 ml) resuspendiert, in 50 ml

    Falcon-Röhrchen überführt und für 20 min bei 6.000x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand

    wird verworfen und die Zellen bei -20 °C gelagert.

    Auswertung

    Das Wachstumsverhalten der Kulturen vor und nach Induktion ist in einem Diagramm (OD600

    gegen Zeit) festzuhalten. Ebenso wird ab dem Zeitpunkt der Induktion die Emission bei 511

    nm im Diagramm mit angegeben (zweite y-Achse). Diese Kurven sollen im Protokoll

    diskutiert werden.

  • Glutathion-S-Transferase 59

    9.2 Reinigung von GST-eGFP (Versuch 2B)

    Um mit GST-eGFP biochemische Experimente durchführen zu können, ist es wichtig das

    überexprimierte Protein aus E. coli Zellen zu isolieren. Hierzu werden die Zellen zunächst mit

    Ultraschall aufgeschlossen. GST-eGFP wird über die Glutathionagarose (GSH-Agarose)

    gereinigt, wobei das Glutathion über seine Cysteinseitenkette mit einem 12-atomigen Spacer

    an die Agarose gebunden ist. Zuerst wird GST-eGFP an die GSH-Agarose gebunden, im

    Anschluss folgen mehrere Waschschritte, wodurch niederaffin-assoziierte Proteine abgetrennt

    werden. Die Elution findet mit 10 mM reduziertem Glutathion statt. Das Gluthation wird

    durch eine Gelfiltration entfernt, da das Glutathion mit den funktionalen Assays interferiert.

    WICHTIG: Es wird zwar bei Raumtemperatur gearbeitet, aber es werden nur kalte

    Lösungen verwendet und das Protein wird immer auf Eis gelagert.

    Reinigung mittels GSH-Agarose

    Materialien:

    E. coli Zellpellet mit GST-eGFP

    PMSF [200 mM]

    Stab-Ultraschall

    Zentrifuge (Sorvall), Zentrifugatinosröhrchen (Rotor: A8.24)

    Equilibrations/Wasch Puffer

    Elutions Puffer

    Gravity-flow Column (Biorad, 20 ml Fassungsvolumen)

    Konzentrator (Centriprep, molecular weight cut off (MWCO) 30 kDa)

    Pufferzusammensetzung

    1 l TBS pH 8,0 (filtriert durch 0,22 µm Filter): 50 mMTris 150 mMNaCl

    pH 8,0, Filtrieren

    25 ml Elutions Puffer: TBS + 10 mM red.GS