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Praktikum der Analytischen Chemie II INSTITUT FÜR ANALYTISCHE CHEMIE, CHEMO- UND BIOSENSORIK Für Studierende der Chemie im 5. Semester

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Praktikum derAnalytischen Chemie II

INSTITUT FÜRANALYTISCHE CHEMIE, CHEMO- UND BIOSENSORIK

Für Studierende der Chemieim 5. Semester

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Prof. Dr. O. Wolfbeis, Dr. A. Dürkop

Praktikum Analytische Chemie II für Studierende der Chemie (BSc.) 5.Sem

WS 2010/2011

Organisationsplan

Die Versuche 1 und 2 finden jeweils für alle vier Gruppen einer Woche gemeinsam im Praktikumsraum CH 12.0.08 statt. Eingang und Garderobe CH 12.0.08b. 1 Chromogene Komplexierung Einführungskolloquium am Montag (Ch 12.0.21, 16 Uhr, Bitte dazu Kapitel über Fluoreszenz, AAS und AES aus Vorlesungsskript lernen)

Versuchsdurchführung Fluoreszenz am Dienstag, AES am Mittwoch

2 Enzymatische Analyse Einführungskolloquium am Montag Versuchsdurchführung am Dienstag und Mittwoch Die Versuche 3 und 4 finden jeweils für alle vier Gruppen einer Woche gemeinsam im Praktikumsraum CH 12.0.21 statt. Die zugehörige Garderobe befindet sich schräg gegenüber im Raum CH 12.0.11!

3 Ionenselektive Elektroden am Dienstag und Mittwoch 4 Wasserbestimmung nach Karl Fischer nur am Mittwoch

Demgegenüber bearbeiten den Versuch

5 Atomabsorptionsspektrometrie im Raum CH 32.01.44

jeweils 2 Gruppen einer Woche am Dienstag, 2 Gruppen einer Woche am Mittwoch. Der Versuch 6 findet für alle vier Gruppen einer Woche gemeinsam statt: 6 Kernspektroskopie am Dienstag und Mittwoch im Raum CH 32.01.44

In der Organischen Chemie bearbeiten je 2 Gruppen die Versuche

7 Hochdruckflüssigkeits – Chromatographie im Raum CH 32.1.06 8 Gas – Chromatographie im Raum CH 22.1.41

meistens am Mittwoch und manchmal am Dienstag.

Alle Versuchsnachmittage beginnen um 13:00 h, wenn nicht etwas anderes mit dem Betreuer verabredet wird. Den genauen Terminplan aller Gruppen für die verschiedenen Versuche finden Sie auf der nächsten Seite abgedruckt!

Alle Rechte vorbehalten

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-1 Sven Kochmann

Bestimmung des Gehalts von Aluminium in Papier mittels

Fluoreszenzspektroskopie in der Mikrotiterplatte und

Atomspektroskopie (ICP-OES)

Einführung Der Rohstoff für Papier ist pflanzliche Cellulose (Zellstoff). Daher erhielt man das Papier früher aus geklopfter Baumwolle oder Leinen. Diese Pflanzenprodukte nannte man „Haderlumpen“ (von althochdeutsch der hader = Lumpen). Aus diesen Hadern stellt man sehr stabiles Papier her, da die Celluloseketten im Material sehr lang sind. Ein nicht geringer Teil des Leinens aus Altkleidersammlungen wird deshalb noch heute zur Herstellung hochwertigen Papiers verwendet.

Als das verfügbare Leinen nicht mehr zur Papierherstellung ausreichte, wurde die Cellulose aus Holz, und neuerdings auch aus Stroh, gewonnen. Da die Cellulose in Stroh oder Holz noch über Etherbindungen und H-Brücken an Lignin (lat. lignum, Holz) gebunden ist, werden zur Abtrennung vom Lignin diverse Aufschlussverfahren (Sulfitverfahren, Sulfatverfahren, ASAM-Verfahren, Acetosolv-Verfahren) verwendet. Die beiden erstgenannten Verfahren bringen Nachteile wie schwefelhaltige Abwässer (Sulfite und Sulfate) und schwefelhaltige Abluft (SO2 und Mercaptane) mit sich. Trotzdem werden > 80 % der hergestellten Cellulose mit einem dieser beiden Verfahren erzeugt. Außerdem muß die entstandene, durch Huminsäuren (Beschreibung im übernächsten Absatz) noch braune Rohcellulose gebleicht werden.

Zur Bleichung wurde früher Chlorkalk (CaOCl) und Chlordioxid (ClO2) verwendet. Das führt zu hohem Chloridgehalt (= Salzfracht) im Abwasser. Weiterhin entstehen durch Oxidation von Huminsären in der Rohcellulose auch gemischte Chloralkane und (aus Bromverunreinigungen im Chlorkalk) Chlorbromalkane, die im Verdacht stehen cancerogen zu sein. Deshalb wird heute neben Ozon vor allem alkalisches Wasserstoffperoxid zum Bleichen verwendet. Hierbei entstehen keine Salze, die das Abwasser belasten und nur wenige toxikologisch bedenkliche Nebenprodukte. Huminsäuren sind ein schokoladenbraunes, staubartiges Pulver, wenig wasserlöslich, löslich in alkalischer wässriger Lösung und unter Rotfärbung in konz. Salpetersäure. Sie haben Molmassen von meist 20 000 – 50 000 g/mol und einen Schmelzbereich >300 °C. Sie sind ein Heteropolykondensat aus einem polycyclischen Kern und locker gebundenen Polysacchariden, Proteinen, einfachen Phenolen und chelatisierten Metallionen, die über Carboxyl- und Carbonylgruppen an den Kern gebunden sind. Der Kern besitzt zumeist aromatischen Charakter. Die Huminsäuren sind stark sauer (Hydroxy- u. Polyhydroxycarbonsäuren) und liegen überwiegend als Salze vor. Aluminium im Papier Papier auf der Basis von reiner Cellulose ist sehr saugfähig und kann deshalb nicht mit Tinte beschrieben werden. Deshalb setzt man für Schreibpapier und Offsetdruckpapier sog. geleimtes

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-2 Sven Kochmann

Papier ein, das viele Aluminiumverbindungen enthält. Die Leimsubstanzen sind hydophobisierende Harzsäuren (aus Baumharz), wie z.B. die Abietinsäure.

Mit diesen Säuren macht man das Papier so wasserabweisend, dass die Tinte noch einzieht, aber nicht mehr verläuft. Die Harzsäuren sind jedoch so hydrophob, dass sie auf der Cellulose mit ihren vielen OH-Gruppen nur schlecht haften. Deshalb gibt man Lösungen der Natriumsalze der Harzsäuren und Kaliumalaun zur Cellulose und fixiert die Harzsäuren durch Komplexierung mit der Carboxylgruppe an Aluminiumionen, welche ihrerseits über die OH-Gruppen an der Cellulosefaser gebunden sind. Dies ist in folgender Zeichnung schematisch dargestellt:

Diese nun im Papier enthaltenen Aluminiumverbindungen sind eine Hauptursache für das Büchersterben in Bibliotheken, besonders bei älteren Bänden. Da die Aluminiumsalze als Alaun eingetragen werden, kann sich in feuchter Luft durch Hydrolyse Schwefelsäure bilden. Dies kann man oft an einem säuerlichen Geruch alter Bücher feststellen.

KAl(SO4)2 + 3 H2O → Al(OH)3 + KHSO4 + H2SO4 Diese Reaktion ist autokatalytisch und kann somit nicht mehr gestoppt werden, wenn sie einmal begonnen hat. Zusätzlich sind die gebildeten Alaunkristalle sehr scharfkantig, was die Bücher bei Gebrauch im Laufe der Zeit mechanisch weiter zerstört. Darüber hinaus können Schimmelpilze am Büchersterben beteiligt sein, wenn sie sich von Papier ernähren (wie gewisse Aspergillus- und Penicilinum-Gattungen). Bestimmung von Aluminium Für die Bestimmung von Aluminium sind in Abhängigkeit von der Probenmatrix viele Verfahren in Gebrauch:

1) Farblacke: Aluminium bildet unter (streng) zu kontrollierenden Versuchsbedingungen wie pH, Temperatur, Element- und Reagenzkonzentrationen sog. Farblacke. Bekanntestes Beispiel

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-3 Sven Kochmann

hierfür ist Aluminon (s. Strukturformelformel unten), dessen Name schon auf die fast ausschließliche Verwendung als Aluminiumnachweisreagenz hindeutet. Es bildet mit Aluminium einen schwerlöslichen roten Farblack, der leicht optisch bestimmt werden kann (Abs. max bei 530 nm). Anstelle von Aluminon werden aber auch Chromazurol, Eriochromcyanin und 8-Hydroxychinolin (Oxin) verwendet. Die Bildung von Farblacken wird allerdings durch zahlreiche Kationen, allen voran Fe2+/3+ und Cu2+, gestört. Diese müssen daher vorher, oft mühsam, entfernt werden.

2) Polarographie:

Meist wird Al3+ als Farbstoff mit Solochromviolett bei -0,2 V gegen die gesättigte Kalomelelektrode reduziert. Dabei tritt bei Anwesenheit von Al3+ eine zweite Stufe bei -0,4 V auf, die der Al3+-Konzentration direkt proportional ist. Die Halbstufenpotentiale bei pH 5,6 betragen -0,34 V und -0,53 V. Kritisch ist eine genaue pH-Kontrolle und die Tatsache, dass wiederum zahlreiche Kationen stören.

3) Atomspektroskopie:

Eine wesentlich empfindlichere Bestimmung ermöglicht die Atomspektroskopie. a) Atomabsorptionsspektroskopie: Für die Bestimmung von Al3+ verwendet man ein N2O/C2H2-Brenngasgemisch und die Linie Al 309,27 nm. Diese Bestimmung ist um den Faktor 10 und mehr empfindlicher als die Bestimmung mit den Farblacken. Bis auf Si und Ti ist die Methode weitgehend störungsfrei, es sollte jedoch derselbe Gehalt an Fe in Proben- und Kalibrierlösungen enthalten sein. b) Atomemissionsspektroskopie: Hier können je nach Einfluss von störenden Emissionslinien in der Probe enthaltener Begleitelemente folgende Emissionslinien des Aluminiums Verwendung finden: 236,705 nm; 237,313 nm; 308,215 nm und 396,125 nm. Mit AES können Nachweisgrenzen im Bereich von ng/g Probenmaterial erreicht werden. Eine detailliertere Beschreibung der AES finden Sie im letzten Kapitel dieser Einleitung.

H4NOOC

HO O

COONH4

OH

COONH4

Aluminon

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-4 Sven Kochmann

Bestimmung von Aluminium mit Morin

Morin (3,5,7,2’,4’-Pentahydroxyflavon) ist ein schwach gelbbraunes Pulver (Schmp. 300°C). Es ist kaum löslich in Wasser, jedoch leicht löslich in wässrigen Alkalihydroxidlösungen und organischen Lösungsmitteln, außer in Essigsäure. Die pKs-Werte des Morins betragen -1, 4.8, 7, 9, und 13. Morin wird von den Polyhydroxiflavonen mit am häufigsten als analytisches, insbesondere als fluoreszenzspektroskopisches Reagens eingesetzt. Die Tabelle zeigt hierzu einige Daten zur Bestimmung verschiedener Kationen:

Metallion(en) Al3+ B3+ Be2+ Ga3+ Th4+ Zr4+, Hf4+ Ln3+

pH bzw. Lösungsmittel

pH 3 verd. HCl

pH 12,5

pH 2,7 pH 12 verd. HCl

pH 2,5

Wellenlänge Anregungsmaximum

440 nm 365 nm 460 nm 400 nm 365 nm 450 nm 400 nm

Wellenlänge Emissionsmaximum

525 nm 490 nm 540 nm 445 nm 405 nm 502 nm 500 nm

Morin selbst zeigt in wäßriger Lösung im Bereich von pH 4–9 eine schwach grüne Eigenfluoreszenz. Diese wird durch Komplexierung mit Metallionen erheblich verstärkt. Die Komplexbildungskonstante des 1:1 Al3+-Morinkomplexes beträgt 3·106 mol/L. Oft werden zur Maskierung von Störionen bei fluorimetrischer Bestimmung EDTA und Diethylen-triaminpentaessigsäure (DTPA) zugesetzt. Die intensiv gefärbten Komplexe mit Ga3+, In3+, Th4+, Zr4+ und U6+ können zwar zur photometrischen Bestimmung diese Elemente verwendet werden, die fluorimetrische Bestimmung ist jedoch wesentlich empfindlicher. Fluoreszenzdetektion in der Mikrotiterplatte

Die Mikrotiterplatte (MTP) hat in den letzten zehn Jahren die Küvette für Photometrie- und Fluoreszenzmessungen im Bereich des sichtbaren Spektrums des Lichts (λ > 340 nm) in der Routineanalytik in Chemie, Biologie und Medizin immer mehr verdrängt. Mikrotiterplatten bestehen normalerweise aus Kunststoffen wie PP, PS oder Polycarbonat (es gibt auch Platten aus Quarzglas). Sie sind in transparenter oder in schwarzer Ausführung erhältlich (Was ist der Vorteil einer schwarzen gegenüber einer transparenten Mikrotiterplatte bei Fluoreszenzmessungen?). In einen ca. 1 cm hohen Träger aus Kunststoff (ca. 13 x 9 cm) sind in regelmäßigen Abständen zylindrische Vertiefungen (sog. Wells) mit entweder flachem, V- oder U-förmigem Boden eingespritzt. Es gibt auch schwarze Platten mit transparenten Flachböden. Die Platten werden mit 6,

O

O

HO

OH

OHHO

OH

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-5 Sven Kochmann

12, 24, 48, 96, 384, 1536 und 3456 Wells pro Platte angeboten, wobei die 96 Well Platten mit einem Flüssigkeitsvolumen von bis zu 300 µL/Well am gebräuchlichsten sind.

Links: Zwei 96 Well Mikrotiterplatten. Rechts: Schema einer MTP..

96-Well Platten bieten einen guten Kompromiss zwischen geringem Reagenzienverbrauch (300 µL Volumen/Well gegenüber 3 mL in einer 1 cm Küvette) und einer Volumendosierung mit möglichst geringem Fehler. Ein weiterer Vorteil ist die Zeitersparnis bei den Messungen, da man nur 1-2 Minuten für 96 Messungen braucht. Außerdem kann man in 96-Well Platten von jeder Kalibrier- oder Probenlösung immer acht Parallelmessungen machen und bekommt damit genügend Messwerte für eine aussagefähige statistische Auswertung.

Die Mikrotiterplattentechnologie erforderte natürlich auch den Bau einer neuen Generation von Detektionsgeräten. Der Aufbau eines solchen Geräts ist im folgenden Bild schematisch dargestellt.

Mikrotiterplattexy-Tisch

xy

x Lichtquelle(Xe-Blitz)

PMT

Filterräder

Lichtleiter

Lichtleiter

Mikroplattenlesegeräte sind also prinzipiell ähnlich aufgebaut, wie Sie es in der Vorlesung Analytik I für Photometer und Fluorimeter schon kennen gelernt haben. Das Licht einer Xenonblitzlampe wird im Gerät meist durch Lichtleiter zum Messkopf hin und von diesem zum Detektor (Photomultiplier, Photodiode) geführt. Allerdings wird zur Wellenlängenselektion in MTP-Photometern und MTP-Fluorimetern aus Kostengründen meist auf Monochromatoren verzichtet. Diese werden durch Interferenzfilter zur Absorptionsmessung bzw. durch Anregungs- und Emissionsfilter zur Fluoreszenzmessung in Filterrädern mit 4-8 Positionen (Wellenlängen) ersetzt.

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-6 Sven Kochmann

Es sind Filter in Halbwertsbreiten zwischen 2 und 30 nm erhältlich. Die verschiedenen Spalten (Nr. 1-12) und Reihen (A-H) einer 96 Well Platte werden durch einen thermostatisierbaren x,y-Tisch unter den Messkopf gefahren. Das Anregungslicht wird meist von oben in die Lösung gestrahlt und die Fluoreszenz auch nach oben hin ausgelesen. Höherwertige Geräte bieten auch Anregung und Detektion von unten am Boden der Mikrotiterplatte an. Man erreicht dadurch einen geringeren Abstand zwischen Lesekopf und Lösung und eine empfindlichere Detektion bei stark streuenden Lösungen wie z.B. bei mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Zellsuspensionen. Dafür werden MTPn mit flachem Boden verwendet. Noch teurere Geräte bieten auch die Kombination von Photometer und Fluorimeter (z.T. sogar Fluoreszenzabklingzeitmessung) in einem Gerät.

ICP-OES: Ein Überblick Die ICP Emissionsspektrometrie (auch ICP-OES, Inductively coupled plasma optical emission spectrometry) ist eine der wichtigsten Techniken der instrumentellen Elementanalytik, die für die Bestimmung von ca. 70 Elementen in einer Vielzahl von Matrices genutzt werden kann. Dank ihrer Vielseitigkeit und Produktivität hat sie eine weite Verbreitung in den Analysenlaboratorien gefunden und trägt vielfach bei der Routineanalytik von Elementen die Grundlast.

Herzstück eines ICP Emissionsspektrometers ist das Plasma, ein viele tausend Kelvin heißes "Gas". Es ist so heiß, dass Atome und Ionen aus der zu analysierenden Probe entstehen. Die sehr hohen Temperaturen im Plasma zerstören die Probe vollständig, so dass das Messergebnis in der Regel nicht durch die Bindungsform des zu analysierenden Elements beeinflusst wird (Abwesenheit von chemischen Störungen). Im Plasma werden die Atome und Ionen zur Lichtemission angeregt. Nach spektraler Zerlegung des emittierten Lichtes mit einer Optik werden in der ICP OES generell die Wellenlängen zur Identifikation der zu bestimmenden Elemente benutzt, während die Intensitäten als Maß der Konzentration dienen. Da im Plasma alle Elemente gleichzeitig zur Strahlungsemission angeregt werden, können diese zeitgleich oder sehr schnell nacheinander bestimmt werden.

Üblicherweise werden flüssige Proben analysiert. Daneben werden auch Feststoffe und (seltener) Gase analysiert. Für die Bestimmung eines Elementes muss keine hierfür spezifische Ausrüstung, wie z. B. eine Lampe in der Atomabsorptionsspektrometrie beschafft zu werden. In der Regel benötigt man neben einer Bezugslösung dieses zu analysierenden Elementes nur noch etwas Zeit für die Methodenentwicklung. So kann eine bestehende Analysenmethode leicht um ein weiteres zu bestimmendes Element erweitert werden. Die ICP OES ist also sehr flexibel.

Die ICP OES besitzt einen sehr großen Arbeitsbereich, der typischerweise bis zu sechs Größenordnungen umfasst und der je nach Element und Analysenlinie Konzentrationen vom sub-µg/L- bis hin zum g/L-Bereich umfasst. Deswegen können oft zeitaufwendige Verdünnungsschritte entfallen, was den Analysendurchsatz steigert. Besonders in der Umweltanalytik decken sich die Arbeitsbereiche für viele Elemente mit den typischerweise in den Proben erwarteten Gehalten. Die ICP Emissionsspektrometrie ist daher eine empfohlene Analysentechnik in den Deutschen Einheitsverfahren (DIN) zu Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchungen und den Normen vieler europäischer Staaten. Darüber hinaus wird die ICP OES in einer breiten Palette von weiteren Anwendungen eingesetzt, von denen die Metallurgie und die Elementanalyse von organischen Substanzen einen weiteren wichtigen Stellenwert haben. ICP-OES: Aufbau und Funktionsweise

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-7 Sven Kochmann

Ein ICP-OES besteht im Wesentlichen aus einer Probenzuführung (Pumpe und Zerstäuber), dem Generator, einer Plasmafackel, der Optik und einem ausgefeilten Kühlungssystem. Das Probenzuführungssystem besteht meist aus einer Schlauchpumpe, einem Cross-Flow-Zerstäuber und einer Zerstäuberkammer. Die Komponenten sind leicht demontierbar, um Einzelteile reinigen oder austauschen zu können. Die Schlauchpumpe führt die Probenlösung zum Zerstäuber. Der Zerstäuber überführt die Flüssigkeit in ein Aerosol, das dann mit einem Trägergasstrom in das Plasma befördert wird. Meist werden pneumatische Zerstäuber verwendet. Dabei strömt der Trägergasstrom über das Schlauchende mit der Probenlösung und aufgrund einer sich ausbildenden Unterdruckzone, werden kleinste Tröpfchen der Lösung mitgerissen. Es ist das gleiche Prinzip, nach dem auch Pumpzerstäuber (z. B. in Deos oder Haarsprayflaschen) funktionieren. Zünden des Plasmas Zur Plasmazündung werden zunächst das Probeneinführungssystem und die Fackel mit Argon gespült, da Gase wie Stickstoff oder Sauerstoff das Plasma durch Entzug von Energie gar nicht erst entstehen lassen. Dann wird ein elektrisches Hochfrequenzfeld mittels eines Hochfrequenz-generators angelegt. Dieses Hochfrequenzfeld baut ein Magnet-Wechselfeld auf. Mit einem Zündfunken (in der Regel ein Hochspannungsfunke oder Tesla-Funke) werden Ladungsträger (Elektronen und Argon-Ionen) erzeugt. Diese Ladungsträger werden dann beschleunigt und es bildet sich das Plasma, in das schließlich das Probenaerosol eingetragen wird. Der Hochfrequenzgenerator mit ca. 1 kW Leistung liefert die Energie für die Aufrechterhaltung des Plasmas. Das Wechselfeld wird im Falle des ICP mit einer Induktionsspule ähnlich wie in einem Transformator übertragen. Die Primärwindung wäre demnach die Induktionsspule, die Sekundärwindung ein Strom, der das Plasma bildet. Bevor mit der Analyse begonnen werden kann, muss nach dem Zünden des Plasmas die Einbrennzeit (ca. 15-20 min.) abgewartet werden. Diese Zeit ist erforderlich, um ein stabiles Messignal zu erhalten. Plasma Ein Plasma ist ein ionisiertes Gas. Neben den Aggregatzuständen Feststoff, Flüssigkeit und Gas wird es bisweilen als "vierter" Aggregatzustand bezeichnet. Die Aggregatzustände unterscheiden sich durch das Maß an Ordnung auf molekularer oder atomarer Ebene, wobei bei einem Phasenübergang immer ein qualitativer Sprung beobachtet wird. Bei der Temperaturerhöhung und insbesondere bei jedem Phasenübergang nimmt die Beweglichkeit der Teilchen zueinander deutlich zu und die Ordnung ab. Somit weist das Plasma innerhalb dieser Skala das höchste Maß an Entropie auf; in ihm tritt eine unabhängige Bewegung von Elektronen und Ionen auf.

Man spricht davon, dass das Plasma "brennt". Wie kann das Edelgas Argon brennen? Die Überführung des Argongases in das Plasma ist ein Wechsel des Aggregatzustandes. Es ist also ein rein physikalischer Vorgang, im Gegensatz zu einer chemischen Umsetzung beim Verbrennen eines Gases in Gegenwart von Sauerstoff. Dennoch hat sich die "Verbrennungs-Terminologie" eingebürgert: Man spricht vom "Brennen" des Plasmas in einer "Fackel". Obwohl nicht ganz korrekt, hat sich dieser Jargon etabliert.

Im analytisch genutzten Plasma wird zumeist Argon als Gas zur Erzeugung des Plasmas verwendet. Hier bewegen sich positiv geladene Argon-Ionen und negativ geladene Elektronen gegenläufig. Die Bewegung der Ladungsträger (Ar+ und e-) folgt der Beschleunigung, die durch ein

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-8 Sven Kochmann

angelegtes elektromagnetisches Wechselfeld entsteht. Neutrale Teilchen werden durch Kollisionen mit den geladenen Teilchen ebenfalls beschleunigt.

Die Form des Plasmas ist ein Toroid, das sich aufgrund der Fackelgeometrie, der Gasströmungen und der Energieübertragung bildet. Diese "umgekehrte Herzform" ist besonders geeignet, einen Gasstrom, der die zum Aerosol zerstäubte Probenlösung enthält, in das Plasma zu "injizieren". Das Aerosol beladene Trägergas bildet dann den sog. Analytkanal. Die mittlere Verweilzeit der Probe im Plasma liegt bei wenigen Millisekunden. Die Temperatur im Plasma ist nicht überall gleich (s. Abb. oben). In dem Bereich, in den die Energie von der Spule eingekoppelt wird, ist das Plasma mit 10 000 K am heißesten. In die Mitte des sich ergebenden Plasmarings wird das Aerosolbeladene Trägergas eingebracht. Es nimmt Energie auf, und es besteht ein Temperaturgefälle von außen nach innen. Das Trägergas, das den Analytkanal bildet, nimmt die Energie auf und erreicht sein Temperaturmaximum erst hinter dem Plasmaring. Von dort aus wird die Energie des erhitzten Trägergases nach außen abgestrahlt und nimmt wieder ab.

Die Einkopplung der Leistung in das Plasma erfolgt mit einer Spule, in der das Plasma brennt. Aufgrund des Skin-Effekts sind die Ladungsträger in einem hochfrequenten Wechselfeld außen anzutreffen, d. h. der das Plasma erhaltende Sekundärstrom dehnt sich in Richtung Spule aus. Um die beiden Stromkreise (primärer in der Induktionsspule, sekundärer im Plasmakern) zu trennen, wird die Induktionsspule durch ein Quarzrohr vor dem Plasma geschützt. Das Rohr muss seinerseits durch einen Argongasstrom gekühlt werden. Dieses Rohr wird als äußeres Rohr bezeichnet. Dieses äußere Rohr endet direkt oberhalb der Induktionsspule. Den beschriebenen äußeren Gasstrom bezeichnet man wegen seiner Wirkung als Kühlgas. Da dieses Gas aber auch das Plasma selbst aufrecht erhält, wird es häufig auch als Plasmagas bezeichnet. Das Kühl- bzw. Plasmagas strömt tangential in die Fackel an dem äußeren Rohr entlang, um dieses so effizient wie möglich zu kühlen. Typische Plasmagasströme liegen bei 15 L/min. Die Probe wird nach Zerstäuben im innersten Rohr bis kurz vor das Plasma herangeführt. Dieses Rohr wird auch als Injektorrohr bezeichnet. Das innere Gas bezeichnet man als Trägergas oder Zerstäubergas. Typische Trägergasströmungen liegen bei 0,6 bis 1 L/min. Die Geschwindigkeit des Trägergasstroms bestimmt, wie schnell das Aersol durch das Plasma getragen wird. Grundsätzlich ist ein möglichst niedriger Trägergasstrom anzustreben. Zwischen beiden Rohren befindet sich das mittlere Rohr. Ihm fallen zwei Aufgaben zu: Es sorgt dafür, dass der äußere Gasstrom, das Plasmagas, möglichst bis kurz vor das Plasma tangential

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-9 Sven Kochmann

geführt wird zum anderen bietet es die Möglichkeit, einen weiteren Gasstrom einzubringen: den mittleren oder Hilfsgasstrom. Seine Aufgabe besteht darin, das Plasma ggf. von der Injektorspitze wegzudrücken um deren Überhitzung und das Auskristallisieren von gelösten Stoffen in der Probe zu verhindern. Dies gelingt mit speziellen Fackelkonstruktionen, bei denen das mittlere Rohr kurz vor dem Bereich, wo das Plasma brennt, aufgeweitet ist (sog. "Tulpenform", s. Abb unten). Diese Aufweitung bewirkt, dass der Kühlgasstrom unmittelbar vor dem Plasma beschleunigt wird und an das äußere Rohr herangeführt wird, was zu einer noch intensiveren Kühlung führt. Alle drei genannten Rohre sind konzentrisch zueinander angeordnet sind und die Fackel muss mittig in der Induktionsspule stehen.

Schematischer Aufbau einer Plasmafackel im ICP-OES.

Anregung zur Emission von elektromagnetischer Strahlung Im Plasma wird die Energie auf die Probe in mehreren Stufen übertragen. Zunächst verdampft das Lösungsmittel. Der verbleibende Feststoff schmilzt und verdampft dann. Die Moleküle des entstehenden Gases werden zunächst in Atome dissoziiert. Bei genügend hoher Energiezufuhr können dann Elektronen durch Kollisionen mit freien Elektronen aus der Elektronenhülle herausgerissen werden. Bei den im ICP typischen Temperaturen von 6000 bis 10000 K liegen die Metalle in der Regel als Ionen vor, die Nichtmetalle und Metalloide sind dagegen nur zum Teil ionisiert. Weitere Energie wird verwendet, um ein äußeres Elektron in ein höheres Orbital zu heben (Anregung). Das Plasma kann aus zwei geometrischen Richtungen (aus der "Perspektive" des Spektrometers) beobachtet werden: quer bzw. radial und längs bzw. axial. Die axiale Beobachtung (siehe oben) ist konstruktiv aufwendiger, liefert jedoch Nachweisgrenzen, die um einen Faktor 10 niedriger sind.

Der Aufenthalt im angeregten Zustand dauert nur 10-8 s, dann springt das Elektron auf ein energetisch niedrigeres Orbital. Dabei wird die aufgenommene Energie als elektromagnetische Strahlung vorwiegend im ultravioletten (190 bis 380 nm) und z. T. im sichtbaren Wellenbereich (380 bis 800 nm) abgestrahlt. Da die Emission aus dem angeregten Zustand erfolgt, gibt es mehrere "Startpunkte", von denen die Elektronen zurückfallen können. Darüber hinaus gibt es dann noch eine Reihe von "Zwischenaufenthaltspunkten", die die Möglichkeiten des Zurückspringens deutlich erhöhen. Daher sind Spektren in der OES deutlich linienreicher als beispielsweise in der AAS, da dort die Übergänge ausschließlich vom Grundzustand ausgehen. Beispiele für besonders linienreiche Elemente sind: Ce mit 5 250 Linien, Fe mit 4 400 Linien, W mit 3 800 Linien, Mo mit 3 400 Linien und Cr mit 3 000 Linien. Der Linienreichtum hat sowohl Vor- als auch Nachteile: Der Vorteil besteht darin, dass es eine große Auswahl an potentiellen Analysenlinien gibt; der Nachteil, dass die vielen Linien der Matrixbestandteile zu spektralen Störungen führen können.

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-10 Sven Kochmann

Die möglichen Energieniveaus der Orbitale sind in einem Termschema (s. Abb. unten) aufgetragen. Hier kennzeichnet die Ordinate die Energiedifferenz zum Grundzustand des Atoms. Die möglichen Orbitale werden durch kleine waagerechte Striche angedeutet. Die Lage der Striche in Bezug auf die Abszisse hat keine Aussagekraft. Sie wird so gewählt, dass die Übergänge zueinander durch Pfeile möglichst ohne Kreuzungen aufgezeichnet werden können. Termschema des Magnesiums. Die Energie nimmt von unten nach oben zu, und zwar im unteren Bereich für das Atom. Wird soviel Energie zugeführt, dass das Elektron die Elektronenhülle verlässt, entsteht ein Ion. Für dieses beginnt eine neue Energieskala. Strahlengang, Optik und Registrierung Die emittierte Strahlung wird durch ein Quarzglasfenster in einem Ar-gekühlten Interface in die Optik des Spektrometers eingekoppelt. Hier finden zur Wellenlängenselektion Monochromatoren in Aufstellungen nach Paschen-Runge oder Czerny-Turner Verwendung oder Echelle-Opitken. Die Registrierung der Photonen erfolgt entweder über Photomultiplier Tubes (PMT) oder über CCD-Arrays. Das Signal wird dann von der Gerätesoftware weiterverarbeitet.

Die Spektrometrie ist ein quantitatives Bestimmungsverfahren, das die von einer Probe ausgehende Lichtemission für eine Konzentrationsbestimmung nutzt (Quantitative Analyse). Im Gegensatz hierzu wird die qualitative Analyse mittels der Spektren als Spektroskopie bezeichnet. In der ICP Emissionsspektrometrie besteht in der Regel ein linearer Zusammenhang zwischen Intensität und Konzentration über 4 bis 6 Dekaden. Da die Intensitäts-Konzentrations-Funktion (Kalibriegerade) von einer Reihe von Einflussgrößen abhängt, die z. T. unbekannt sind, wird diese vor Beginn der Analyse ermittelt.

Da alle Atome und Ionen alle gleichzeitig Licht emittieren, ist die ICP OES eine Multielementtechnik par excellence. Alle Ergebnisse für die zu messenden Elemente werden in einem Arbeitsgang für eine Probe erhalten. Im Gegensatz hierzu ist die elementorientierte Arbeitsweise zu nennen, bei der alle Proben auf ein Element untersucht werden. Dann findet ein Wechsel zum nächsten Element statt (wie in der AAS). Warum die "Linie" ein "Peak" ist Da die Emission aus den Übergängen zwischen Orbitalen stammt, könnte man wegen der diskreten Natur der Orbitale erwarten, dass deren Wellenlängenausdehnung vernachlässigbar klein ist (Linie).

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-11 Sven Kochmann

Tatsächlich wird ein Peak mit deutlich an- und absteigenden Flanken beobachtet. So liegt die mit Spektrometern gemessene Breite von 1-8 pm. Diese Verbreiterung hat mehrere Ursachen, die z. T. "natürlich" sind, z. T. auf der Messung bzw. der Optik beruhen.

Die natürliche Linienbreite ist die Breite des Übergangs in einem Atom, ohne dass Fremdeinflüsse wirken. Nach Heisenberg ergibt sich eine Verbreiterung durch die Unschärfe auf der Ebene der Elementarteilchen. Durch die Bewegung der Atome und Ionen mit hoher Geschwindigkeit im Plasma macht sich deren Bewegung relativ zum Detektor (Doppler-Effekt) bemerkbar. Die Relativgeschwindigkeit zum Detektor führt zu einer Frequenz- (und damit auch zu einer Wellenlängen-) Verschiebung. Da die Bewegung der Teilchen statistisch verteilt ist, resultiert eine Gaußförmige-Verteilung der Emissionslinie als "natürliche Form". Eine weitere Ursache der Verbreiterung der Linie hängt mit dem Auflösungsvermögen der dispergieren Optik zusammen. Die Optik des Spektrometers führt in der Regel dazu, dass eine recht schmale Linienbreite (von wenigen pm) zu der gemessenen Halbwertsbreite (typischerweise 10 pm) vergrößert wird.

Benötigte Reagenzien und Lösungen für je eine Gruppe von 8 Studierenden

1) Morin-Stammlösung (eine Stammlösung für je 2 Studenten !) - Herstellung aus Morin Monohydrat (M(Morin) = 302,2 g/mol)

Hergestellt werden soll eine Lösung mit dem Volumen V = 100 mL. Morin-Stoffmengenkonzentration: c(Morin) = 1·10

-3 mol/L.

Einwaage bitte selbst berechnen und vom Assistenten überprüfen lassen. Das Morin wird auf der Analysenwaage in einem Wägeschiffchen genau eingewogen

und in einen 100 mL Meßkolben überführt. Dann wird das Schiffchen mit einigen ml von insgesamt 85 mL Ethanol gespült, um das

gesamte Morin in den Meßkolben zu überführen. In den Kolben werden das restliche Ethanol sowie 10 mL Methanol gegeben (warum?) und mit bidest. Wasser auf 100 mL gefüllt. Es wird geschüttelt bis zur sichtbaren, vollständigen Auflösung des Morins.

2) Alaun-Stammlösung (eine Stammlösung für je 4 Studenten !) - Herstellung aus Kalium-Aluminiumsulfat Dodecahydrat (KAl(SO4)2·12 H2O) (M(Alaun) =

474,39 g/mol) Hergestellt werden soll eine Lösung mit dem Volumen V = 1000 mL.

Alaun-Stoffmengenkonzentration: c(Alaun) = 1·10-3

mol/L. Einwaage bitte selbst berechnen und vom Assistenten überprüfen lassen.

Das KAl(SO4)2·12 H2O wird auf der Analysenwaage in ein Becherglas eingewogen und in einen 1000 mL Meßkolben gespült.

Dann wird mit bidest. Wasser auf 1000 mL gefüllt. Es wird geschüttelt bis zur sichtbaren, vollständigen Auflösung des Alauns.

3) Essigsäure 100% p.A, Ammoniumacetat p.A., Ethanol 99%, Methanol HSL stehen aus Bereitgestellte Geräte

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-12 Sven Kochmann

pro 4er Gruppe: je 8 Porzellantiegel mit Deckel und Untersetzer, 8 Bechergläser 100 mL, 8 Plastiktrichter (5cm), 22 Messkolben 100 mL, 1 Meßkolben 1000 mL Sonstiges: transparente Mikrotiterplatten Greiner 650101, Ofen, Trockenschrank, 2 Mikro-

pipetten (100µL), Vollpipetten 1, 5, 10, 20 und 50 mL, Peleusball, Pasteur-pipetten, Pipettenspitzen gelb (Fisher 9409001), 20 Pipettierschalen, Indikator-papier, Schere, Plastikwägeschiffchen (mind. 25), Tiegelzange, Wärmeschutz-handschuhe, 1-2 Mikrotiterplattenreader mit angeschlossenem Steuercomputer Dreifuß mit Keramikplatte oder Asbestnetz

Durchführung der Bestimmungen Der Ofen werden morgens vor Beginn des Versuchs einschaltet und auf 960°C vorgeheizt! Tag 1: Papierveraschung Vorbesprechung zum gesamten Versuch mit dem Assistenten - Danach: Jede(r) Studierende einer 4er-Gruppe wählt eine der zur Verfügung stehenden

Papiersorten und nimmt von der gewählten Papiersorte zwei Proben (A und B): a) Putzpapier, je ca. 100 mg b) Toilettenpapier, je ca. 250 mg c) Umweltschutzpapier, je ca. 100 mg d) Kaffeefilterpapier, je ca.500 mg

- Jeder Student wiegt beide Proben auf der Analysenwaage genau ab (Masse muss genau bekannt sein) und zerschneidet sie in so kleine Teile, dass die Papierschnipsel jeder Probe in je einen Tiegel passen. Der dann gefüllte Tiegel wird mit dem Deckel verschlossen.

- Die Tiegel der Gruppen werden nun mit der Tiegelzange auf einen Untersetzer in den Ofen gestellt, der Ofen geschlossen und über Nacht verascht.

Bitte Probenbelegung im Ofen auf Plan bzw. Zettel notieren!

Die Beschriftungen auf den Tiegeln überstehen das Veraschen nicht!

Tag 2: Aufarbeitung und Fluoreszenzmessung in der Mikrotiterplatte

- Am nächsten Tag werden die Tiegel aus dem Ofen entnommen und zum können Abkühlen kurz an Ihrem Laborplatz abgestellt.

- Die Gruppen wiegen nun 11 x (500±2) mg NH4Ac (11 x pro 4er Gruppe) auf der Oberschalenwaage in den Wägeschiffchen ab.

- Nach Abkühlen auf handwarm werden die Deckel der Tiegel geöffnet, und in jeden Tiegel je 500 mg NH4Ac gegeben (Warum?), so dass die Asche vom NH4Ac bedeckt ist. Die Tiegel werden mit dem Deckel wieder verschlossen. Die Asche wird nun 30 min. bei 140°C im Trockenschrank aufgeschlossen.

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-13 Sven Kochmann

- Inzwischen sollen die Gruppen eine Verdünnungsreihe für sechs Kalibrierlösungen mit bekannten Stoffmengenkonzentrationen von Al3+ berechnen (bitte Rücksprache mit dem Saalassistenten halten): Zur Beachtung:

Jede Kalibrierlösung wird immer durch Verdünnung der Alaun-Stammlösung mit bidest. Wasser hergestellt.

Jede Kalibrierlösung wird immer mit 1 mL Eisessig und 500 mg NH4Ac versetzt und auf 100 mL aufgefüllt.

Die Kalibrierlösungen sollen nach allen Verdünnungsschritten einen Konzentrations-bereich von c(Al3+) im Well von 5-250 µmol/L abdecken (3 Lösungen von 5-50 µmol/L und 3 Lösungen von 100-250 µmol/L).

Das Gesamtvolumen an Lösung pro Well ist während der Messung immer 200 µL. Es sollen immer 100 µL Morinlösung zu der zu vermessenden Lösung zugegeben

werden. Welche Konzentrationen müssen Ihre Kalibrierlösungen im Meßkolben vor der Messung

nun haben? Es muss eine Blanklösung hergestellt werden (Was enthält diese?). In der Blanklösung

müssen auch 500 mg NH4Ac/100 mL und 1 mL Eisessig enthalten sein (Warum?). Hinweis: Berechnen Sie bitte die notwendigen Verdünnungen vor dem Versuch, so dass Sie während des Versuches nicht unnötig Zeit verlieren.

- Nach Ablauf der 30 min. im Trockenschrank entnimmt man die Tiegel, stellt sie auf den Dreifuß zum Abkühlen und wartet, bis sie nur mehr handwarm sind. Man gibt mit einer Pipette einige mL bidest. Wasser zu der Schmelze im Tiegel und rührt im Tiegel mit dem Spatel auch am Boden gut durch. Bitte auch evtl. vorhandene Rückstände von den Tiegelwänden abkratzen und in die im Tiegel befindliche Lösung geben. Dann spült man die gelöste Schmelze durch ein angefeuchtetes Blauband-Filterpapier in einen 100 mL Meßkolben und spült auch den Spatel mit bidest. Wasser über dem Filterpapier ab. Der Tiegel wird weitere drei Male gespült und die Spüllösungen filtriert. Man gibt noch 1 mL Eisessig zum Filtrat und füllt mit bidest. Wasser bis zur Markierung auf.

- Nach der Demonstration des Pipettierens mit der Automatikpipette durch den Saalassistenten wird nacheinander spaltenweise (je 8er Spalten) nach untenstehendem Schema in die Mikrotiterplatte pipettiert (Bitte für jede Lösung eine neue Pipettierschale verwenden!) 1) Al3+-Kalibrierlösung, Blanklösung bzw. entsprechende Probenlösung (für jede 8er-Reihe

eine neue Spitze verwenden! 2) 100 µL Morinlösung (für jeden Pipettiervorgang eine neue Spitze verwenden!)

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-14 Sven Kochmann

- Dann wird die Mikrotiterplatte in den Plattenhalter des MTP-Readers eingelegt (Well A1 befindet sich links oben) und die Messung mit „Start Measurement“ initialisiert. Man erhält nach dem Ende der Messungen ein Excelfile mit je einem Fluoreszenzintensitäts-wert pro Well und den eingestellten Geräteparametern. Dieses File speichert sich jede Gruppe auf einem eigenen USB-Stick zur Auswertung ab. Bitte hinterlegen Sie zur Sicherheit auch eine Kopie (Dateiname: Gr_Ihre Gruppennummer) Ihrer Datei im Verzeichnis C:\ANCII auf dem Meßcomputer.

Bitte die Probenlösungen für die Bestimmung mit ICP-OES am

nächsten Tag aufheben!

Tag 3: Bestimmung von Aluminium mit ICP-OES

Dieser Teil des Versuches wird im Raum CH 32.01.09 (nähe Massenspektrometrie) durchgeführt. - Kleine Vorbesprechung mit dem Assistenten - Start und Kalibrierung des Gerätes - Messung der Probenlösungen in 4er Gruppen Auswertung und Protokollführung - Geben Sie die Papierart und die Einwaagen der Proben A und B an. - Geben Sie die Einwaagen und die Konzentrationen für die Alaun- und Morinstammlösung an. - Fertigen Sie eine Verdünnungstabelle für die Kalibrierlösungen an und geben Sie für jede

Lösung das entnommene Volumen VSt. aus der Stammlösung, die Konzentration cKal(Al3+) der Kalibrierlösung selbst, und die später resultierende Konzentration cWell(Al3+) im Well an.

- Berechnen Sie den Mittelwert FU (Untergrund) der Blankmessungen. Dieser Wert wird von

jedem Intensitätsmesswert der Kalibrier- und Probenlösungen abgezogen. Für die gegen den Untergrund korrigierten Messwerte berechnen Sie pro Spalte jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung. Sie müssen dazu in Excel die Funktion „STABW (Startwert:Endwert)“ verwenden. Eventuelle Ausreißer (max. 2 pro Spalte) sind an dieser Stelle zu eliminieren (bitte deutlich markieren!).

- Erstellen Sie aus diesen Werten eine Kalibriergerade (cWell(Al3+) gegen die entsprechenden

Fluoreszenzintensitäten) mit Fehlerbereichen (Standardabweichung). Konstruieren Sie zusätzlich eine Gerade mit maximaler und minimaler Steigung. Geben Sie die Geradengleichungen aller drei Geraden auf drei gültige Ziffern genau an.

- Aus der Kalibriergeraden selbst berechnen Sie die Stoffmengenkonzentration cWell(Al3+) für ihre

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Axel Dürkop Chromogene Komplexierung Seite 1-15 Sven Kochmann

Probelösungen mit Standardabweichung und daraus den Massenanteil w(Al3+) mit Standardabweichung im Papier. Beachten Sie zur Berechnung der Standardabweichung, dass Sie eine Kalibriergerade folgender Form erhalten haben:

)(· 30

++= AlcmFF WellI Lösen Sie nun nach cWell(Al3+) auf und beachten Sie hier die unterschiedlichen Regeln zur Fehlerfortpflanzung bei Summen und Produkten. Zur Berechnung von σ(cWell(Al3+))brauchen Sie auch die Standardabweichungen σ(F0) und σ(m); σ(FI) wurde schon ermittelt! Geben Sie die Herleitung der ihrer Fehlerberechnung zugrunde liegenden Formel und die Werte für F0, σ(F0) und m, σ(m), die Sie in der Berechnung verwendet haben, an.

- Berechnen Sie die Nachweisgrenze (LOD) Ihrer Al3+-Bestimmung (Einheit nicht vergessen!).

- Berechnen Sie aus den Ergebnissen der ICP-Bestimmung ebenfalls den Massenanteil mit Standardabweichung im Papier.

- Geben Sie die Ergebnisse beider Bestimmungen übersichtlich und vergleichbar in einer Tabelle

an und interpretieren Sie sie: Welche Methode liefert vermutlich den „wahreren“ Wert? Welche Methode ist reproduzierbarer? Welche Methode versagt unter Umständen sogar? Wo liegen die möglichen Fehlerquellen/Ursachen?

Fragen Bitte beantworten Sie im Protokoll zusätzlich noch folgende Fragen. 1) Um eine Stammlösung herzustellen, lösen Sie Morin in 85 mL Ethanol und 10 mL Methanol.

Warum? 2) Warum wird für den Aluminiumaufschluss NH4Ac benutzt und nicht z.B. KOH wie Sie es beim

alkalischen Sturz einsetzen? Was spricht gegen KAc oder NH4OH? 3) Welche Komponenten enthält die Blanklösung und welche nicht? Warum? 4) Welche Vor- und Nachteile haben Mikrotiterplatten? Welche Vorteile haben schwarze bei

Fluoreszenzmessungen bzw. weiße Platten bei Chemolumineszenzmessungen? 5) Unter Umständen versagt bei Ihnen eine der beiden Bestimmungsmethoden. Wie könnten Sie

die entsprechende Methode bzw. deren Durchführung verbessern? 6) Warum werden in einigen Fällen zwei verschiedene Bestimmungsmethoden durchgeführt,

obwohl oft eine die „schöneren“ bzw. „besseren“ Ergebnisse liefert? 7) Was ist der Unterschied zwischen Spektroskopie und Spektrometrie?

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-0

Enzymatische Bestimmung von Alkohol, Glucose und Dextrinen in Bier und anderen Getränken.

Themenbereiche für die Vorbereitung auf das Einführungskolloquium.

1. Enzyme: Klassifizierung und EC-Nomenklatur (6 Gruppen); Enzymaktivitäten (spezifische und molare Aktivität) und ihre Einheiten; Stöchiometrische Rechnungen mit Enzymaktivitäten. Enzyme, die im Manuskript erwähnt und im Experiment benutzt werden:

-Amylase: 1.4--D-Glucan-glucano-hydrolase, EC 3.2.1.1 ß-Amylase: 1.4--D-Glucan-malto-hydrolase, E.C. 3.2.1.2 Amyloglucosidase (AMS): 1.4-(1.6)--D-Glucan-gluco-hydrolase, EC 3.2.1.3 Maltase: -D-Glucosid-glucohydrolase, E.C. 3.2.1.20. Hexokinase (HK): ATP-D-Hexose-6-phosphotransferase EC 2.7.1.1 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH): D-Glucose-6-phosphat- NADP+-1-oxidoreductase EC 1.1.1.49 Alkoholdehydrogenase (ADH): Alkohol-NAD+-oxidoreduktase (E.C. 1.1.1.1)

2. Das Monosaccharid Glucose, das Polysaccharid Stärke und die Amylasen: Typen, Strukturen, Reaktionen, Produkte der enzymatisch katalysierte Hydrolyse. Guter Review: S. Richardson, L. Gorton; Analytica Chimica Acta, 497 (2003) 27 -65 Characterisation of the substituent distribution in starch and cellulose derivatives. Abstract: Derivatised polysaccharides are polymers from renewable sources of great importance in a whole range of different industries. However, only until recently have their characterisation been hampered by the lack of suitable instrumental methods or rather combination of suitable instrumentation. This review gives details on the state-of-the-art on polysaccharide analysis, especially focussing on starch and cellulose derivatives and the use of specific hydrolysing enzymes facilitating their analysis.

3. Der Bierbrauprozess: Ablauf, Stammwürze, Extraktwert, Bilanzgleichung und Vergärungsformel

4. Das Prinzip der enzymatischen Bestimmung von Glucose und Dextrin: Die beteiligten Enzyme und die entscheidenden Schritte beim Ablauf der Bestimmung; Strukturen der beteiligten Edukte und Produkte

5. Das Coenzym NAD+ (NADP+) und seine Wirkungsweise als Oxidationsmittel: Reaktionsmechanismus (Hydridacceptor); UV-Spektren von NAD+ und NADH; molarer Absorptionskoeffizient ε(NADH).

6. Das Prinzip der enzymatischen Bestimmung von Ethanol: Beteiligte Substanzen und Enzyme; die Abfangreaktion; Strukturen der Edukte u. Produkte.

7. Die Puffersubstanzen und die Herstellung der benötigten Puffer: Citronensäure (Struktur), Herstellung von Citrat-Puffern; Triethanolamin (Struktur), Herstellung von Triethanolamin-Puffern; Diphosphorsäure und Glycin (Strukturen) als Puffersubstanzen; Berechnung von pH-Werten bei Titrationen; Henderson-Hasselbalch-Gl.

8. Alternative Methoden zur Bestimmung von Ethanol.

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-1

Informationen über Amylasen, ihre Substrate und ihre Wirkungsweise.

Das Polysaccharid Stärke ist das Reservekohlenhydrat von Pflanzen und Tieren. Pro Jahr entstehen ca. 45*106 to dieses nachwachsenden Rohstoffes, dessen Bedeutung als Ausgangsprodukt für chemische Synthesen stetig zunimmt. Stärke ist ausschließlich aus dem Monosaccharid D-Glucose aufgebaut und enthält -1.4- und -1.6-glykosidisch verknüpfte D-Glucopyranose-Einheiten.

Man unterscheidet drei Typen von Stärke: Amylose, Amylopektin Glykogen. Die drei genannten Typen unterscheiden sich

- in der Häufigkeit von Kettenverzweigungen über -1.6-glykosidische Bindungen

- in den mittleren molaren Massen.

Pflanzliche Stärke: Hauptbestandteil (w ≈ 80 %) ist das Amylopektin. Amylopektion ist über -1.6-glykosidische Bindungen stark verzweigt (sog. Clusterstruktur) mit teilweise recht kurzen (15 – 25 Einheiten) Verzweigungsketten. Mit molaren Massen zwischen 107 und 109 g/mol ist das Amylopektin eines der größten natürlichen Moleküle. Nebenbestandteil (w ≈ 20 %) ist die völlig unverzweigte (Helixstruktur) Amylose. Ihre molare Masse liegt deutlich niedriger zwischen 105 und 106 g/mol.

Tierische Stärke: die in Leber und Muskel gespeicherte Stärke nennt man Glykogen. Glykogen hat noch mehr -1.6- Verzweigungsstellen als das Amylopektin und ist mit molaren Massen bis zu 2107 g/mol ähnlich hoch molekular.

Verdauung von Stärke: Die mit der Nahrung zugeführte Stärke wird unter enzymatischer Katalyse durch verschiedene Hydrolasen (Amylasen) hydrolysiert. Amylasen kommen in allen Verdauungssekreten und auch in den Darmbakterien vor. Im Speichel und im Pankreassekret kommt hauptsächlich die sog. -Amylase vor.

Bei der katalytischen Wirkung der -Amylase sind zwei Aspekte bemerkenswert:

1. Die Hydrolyse erfolgt an den -1.4-glykosidischen Verknüpfungsstellen der Hauptkette.

2. Bei der unverzweigten Amylose führt die Hydrolyse nicht zur Glucose sondern zum Disaccharid Maltose (→ 4-O-(-D- Glucopyranosyl)-D-glucopyranose). Bei der Hydrolyse von verzweigtem Amylopektin und Glykogen wird zusätzlich das Disaccharid Isomaltose (→ 6-O-(-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose) gebildet. Außerdem werden Maltotriose und verschiedene -1.6 verzweigte Oligosaccharide mit 6 - 7 Glucoseeinheiten gebildet. Man bezeichnet solche Oligosaccharide als -Dextrine.

Die genannten Oligosaccharide entstehen durch Angriff der -Amylase in der Kettenmitte! Die -1-6-Verknüpfungsstellen können nicht angegriffen werden. Der systematische Name des Enzyms gibt die Wirkungsweise des Enzyms und die Namen der bei der Hydrolyse gebildeten Produkte (Glucane) an: 1.4--D-Glucan-glucano-hydrolase, EC 3.2.1.1

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-2

Beim Bierbrauprozeß hat die im Gerstenmalz und in Bakterien vorkommende ß-Amylase eine wichtige Bedeutung. Bei ihrer katalytischen Wirkung sind zwei Aspekte wichtig:

1. Wie die -Amylase ist die ß-Amylase spezifisch für -D-1.4-glucosidische Bindungen.

2. Anders als -Amylase spaltet ß-Amylase vom nicht-reduzierenden Ende der Substrat-(seiten)ketten her Maltoseeinheiten ab, bis eine -1-6-Verzweigungsstelle in der Kette die katalytische Wirksamkeit beendet. Zurück bleiben wieder verschiedene -Dextrine. Im systematischen Namen des Enzyms kommt die Wirkungsweise der ß-Amylase dadurch zum Ausdruck, dass der Name der bei der Hydrolyse gebildeten Maltose genannt wird:

1.4--D-Glucan-malto-hydrolase, E.C. 3.2.1.2

Unter der katalytischen Wirkung von - und ß-Amylase entstehen die Hydrolyseprodukte (Iso)Maltose, Maltotriose und -Dextrine. Sie stehen im weiteren Verlauf des hydrolytischen Abbaus als Substrate für weitere, besondere Glykosidasen und Amylasen zur Verfügung. Diese Hydrolasen können auch niedermolekulare -1.6-verzweigte Oligosaccharide verarbeiten. Sie kommen in Bakterien (Darmbakterien), aber auch im Gerstenmalz vor.

Eine dieser besonderen Amylasen ist die im Test verwendete Amyloglucosidase. Sie hat eine geringere Wirkungsspezifität als die - und ß-Amylase und katalysiert nicht nur die Hydrolyse von -1.4- sondern auch die Hydrolyse von -1.6-glucosidischen Bindungen. Mit Hilfe der Amyloglucosidase können die Verzweigungsstellen in Dextrinen überwunden werden. Dabei erfolgt die Hydrolyse vom nicht reduzierenden Ende der Ketten her und immer unter Bildung von Glucose. Der systematische Name dieses Enzyms lautet demnach:

1.4-(1.6)--D-Glucan-gluco-hydrolase, EC 3.2.1.3

Man darf den hydrolytischen Abbau der Stärke bei der Verdauung und beim Bierbrauprozess (Herstellung der Maische) nicht mit dem phosphorolytischen Abbau der Stärke bei den in Zellen ablaufenden Stoffwechselvorgängen verwechseln. Beim phosphorolytischen Abbau wird nicht Glucose (oder Maltose) sondern Glucose-1-phosphat (G-1-P) gebildet. Auch bei dieser durch eine Transferase (Phosporylase) katalysierten Reaktion können die -1.6-glu-cosidischen Verzweigungen in der Stärke nur mit Hilfe einer besonderen Phosporylase, die -1.6-glucosidische Bindungen spalten kann ("debranching enzyme"), überwunden werden.

Informationen zum Bierbrauprozess.

Erst bei der Keimung der Gerstenkörner werden die für den Bierbrauprozess benötigten Enzyme im Keim gebildet. Das gebildete Malz wird dann eingeweicht (Maische). Damit die - und ß-Amylasen im Keim ihr Substrat Stärke im Zellinneren des Gerstenkorns überhaupt erreichen können, sind im Malz auch solche Enzyme enthalten, die die Zellwände im Inneren der Gerstenkörner durchlässig machen können. Dafür ist die Hydrolyse von ß-glycosidischen Bindungen in den Zellwandpolysacchariden nötig. Solche ß-glycosidischen Bindungen kommen auch in der Cellulose vor und deshalb bezeichnet man die für die Hydrolyse solcher Bindungen zuständigen Hydrolasen mit dem Sammelnamen Cellulasen.

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-3

Während des Maischvorganges wird die im Malz vorhandene Stärke so weit abgebaut, wie es die Wirkungsspezifität der Amylasen, besonders aber die vom Braumeister bestimmten äußeren Rahmenbedingungen des Maischvorganges (Dauer, Temperatur) zulassen. Schon während des Maischvorganges wird ein großer Teil der beim Abbau der Malzstärke zunächst entstehenden Maltose weiter zu Glucose hydrolysiert. An diesem Abbau ist eine weitere Glycosidase beteiligt, die im Malz und auch in Hefen vorkommt. Es ist die Maltase, die auch -Glucosidase genannt wird. Gemäß der von ihr katalysierten Reaktion lautet ihr systematischer Name: -D-Glucosid-glucohydrolase, E.C. 3.2.1.20.

Die beim Maischvorgang entstandenen wasserlöslichen Dextrine, die gebildete Glucose und die Rest-Maltose gelangen nach Klärung der Maische durch Filtration in die sog. Würze.

Bekannt ist der Ausdruck "Stammwürze" (StW) eines Bieres. Damit ist ein Massenanteil gemeint:

(NfBWü)

(NfBWü)(Würze)

mStWü w

m

Massenanteil aller nicht flüchtigen Bestandteile in der Würze: w(NfBWü). Die Stammwürze liegt bei einer Würze zur Herstellung von Vollbier bei ca. 10 – 12 % und wird zu ca. 2/3 (ca. 8%) durch den Gehalt an Glucose, Maltose und Dextrinen bestimmt.

Nach Zusatz der Hefe zur Würze wird ein kleiner Teil der Glucose zunächst zur Vermehrung der Hefezellen verbraucht. Dieses aerobe Wachstum der Hefezellen läuft aber nur ab, wenn in der Würze gelöster Sauerstoff vorhanden ist. Wenn der Sauerstoff verbraucht ist, schalten die Hefezellen auf anaeroben Stoffwechsel um. Dann wird Energie (ATP) durch Vergärung der restlichen Glucose zum Ethanol gewonnen. Diese Reaktion wird vom Hefe-Enzym Pyruvat-Decarboxylase katalysiert. Ergänzen Sie in der folgenden Reaktionsgleichung der Vergärung die stöchiometrischen Faktoren, so dass die Gleichung nach Stöchiometrie und Ladung ausgeglichen ist (Auswertung S. 13 Nr. 1):

Glucose + 2 ADP3- + ? H2PO4- ? Ethanol + ? CO2 + 2 ATP4- + ? H2O

Im Bier bleiben: unvergorene Glucose, Maltose u. Dextrine. Sie bestimmen zu ca. 2/3 den sog. "Extraktwert" (EW) des Bieres. Auch damit ist ein Massenanteil gemeint:

(NfBBi)

(NfBBi)(Bier)

mEW w

m

Massenanteil der nicht flüchtigen Bestandteile im Bier: w(NfBBi). Extraktwerte von Bier liegen im Bereich 3 – 5 %. Extraktwerte können leicht experimentell bestimmt werden.

Aus "Extraktwert" und Ethanolgehalt kann auf die "Stammwürze" des Bieres zurückgerech-net werden. Die Berechnung beruht auf der Massenbilanz der Vergärung. In ihr kommt zum Ausdruck, dass Ethanol bei der Vergärung aus Glucose gebildet wird.

(NfBWü) (NfBBi) (Glucose vergoren) (NfBBi) (Alkohol)m m m m F m F = ?

Wenn man annimmt, dass sich die Dichten von Würze und Bier nicht sehr unterscheiden (d.h. m(Würze) ≈ m(Bier) ), wird obige Massenbilanz zur Bilanz der Massenanteile:

(NfBWü) (NfBBi) (Glucose vergoren) (NfBBi) (Alkohol)w w w w F w oder:

(Glucose vergoren) (Alkohol)StWü EW w EW F w

Der Faktor F wird mit Hilfe der Stoffmengenbilanz der alkoholischen Gärung berechnet. (s. Auswertung).

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-4

Enzymatische Bestimmung von Dextrinen und Glucose.

Prinzip der Bestimmung

Für die Bestimmung werden drei gekoppelte, enzymatisch katalysierte Reaktionen benutzt:

1. Die Dextrine (und die Rest-Maltose) werden unter Katalyse der Amyloglucosidase (AGS) bei pH 4,6 vollständig zu Glucose hydrolysiert. Die Hydrolyse erfolgt nur in der Dextrin-Probe; in der Glucose-Probe entfällt der Schritt.

2. Die durch Hydrolyse gebildete Glucose und zusätzlich die im Originalgetränk von vorn-herein vorhandene Glucose wird mit Adenosin-5-triphosphat (ATP) unter der katalytischen Wirkung des Enzyms Hexokinase (HK; systematischer Name: ATP-D-Hexose-6-phospho-transferase EC 2.7.1.1) bei pH 7,6 zu Glucose-6-phosphat (G-6-P) phosphoryliert. In der Glucose-Probe wird hier nur die von vornherein vorhandene Glucose erfasst.

3. Das entstandene G-6-P wird unter der Katalyse des Enzyms Glucose-6-phosphat-dehydro-genase (G-6-PDH; systematischer Name: D-Glucose-6-phosphat-NADP+-1-oxidoreductase EC 1.1.1.49) zu Gluconat-6-phosphat dehydriert. Das Coenzym Nicotinamid-adenin-di-nucleotidphosphat (NADP+) dient dabei als Oxidationsmittel (Struktur und Wirkungsweise von NADP+ vgl. Ethanolbestimmung). Es entsteht eine äquivalente Stoffmenge NADPH, die durch Messung der Absorbanz bei 340 nm bestimmt wird.

(1) Dextrin + (z-1) H2O AGS z Glucose

(2) Glucose + ATP H K G-6-P + ADP

(3) G-6-P + NADP+ G-6-PDH Gluconat-6-phosphat + NADPH + H+

Die Dextrin- bzw. Glucose-Bestimmung ist nur exakt, wenn zwei Bedingungen erfüllt sind:

1. Die Hydrolyse von Dextrin (und Restmaltose) muss vollständig verlaufen. Dies muss in Hinsicht auf Inkubationszeit und -temperatur sowie auf die eingesetzte Enzymmenge der Amyloglucosidase (AGS) vorher überprüft worden sein.

2. Die Hexokinase weist nur eine sehr geringe Substratspezifität, denn dieses Enzym katalysiert auch die Phosphorylierung vieler anderer Zucker. Deshalb ist die Redoxreaktion (3) unter folgenden Gesichtpunkten entscheidend wichtig:

- Ein schwach basischer pH-Wert von 7,6 stellt sicher, dass das in der Phosphor-ylierungsreaktion (2) gebildete G-6-P quantitativ in Gluconat-6-phosphat überführt wird und damit die gebildete NADPH-Stoffmenge der vorliegenden Glucose-Stoffmenge äquivalent ist.

- Das Enzym G-6-PDH muss eine so hohe Substrat-Spezifität für Glucose haben, dass von den eventuell gebildeten anderen Zuckerphosphaten ausschließlich das G-6-P dehydriert wird. Diese hohe Spezifität ist bei der G-6-PDH gewährleistet.

H2O

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-5

Herstellung der Lösungen. (Nur nötig wenn ausreichende Mengen nicht mehr vorhanden sind. Die angegebenen Werte reichen für vier 2er-Gruppen).

1) Citrat-Puffer: Soll-Citrat-Konz: 50 mmol/L; Soll-pH: 4,6; Soll-Volumen: 100 mL Berechnen Sie (pKa1 = 3,1; pKa2 = 4,8; pKa3 = 6,4), welche Einwaagen zur Herstellung des Puffers aus Citronensäure Monohydrat und TrinatriumcitratDihydrat benötigt werden. CitronensäureMonohydrat (Mr = 210): mg ( mmol) TrinatriumcitratDihydrat (Mr = 294): mg ( mmol) mit bidest. Wasser zu ca. 90 mL lösen. pH-Wert überprüfen, bei Bedarf nachstellen, im Messkolben zu 100 mL auffüllen.

2) Amyloglucosidase AGS (Aspergillus niger) (35 U/mL); (wird gestellt) Fluka 10115; Pulver, lyophilisiert (70 U/mg); 1 g 30.- €. Ca. 2,5 mg des Enzyms (175 U) durch Zugabe von 5 mL Citratpuffer 1) lösen. Lösung im Kühlschrank aufbewahren; sie ist dann bei 4 °C ca. 4 Wochen haltbar.

3) Triethanolamin-Puffer: Soll-Konz:. 0,3 mol/L ; Soll-pH: 7,6 ; c(Mg2+) = 4 mmol/L. 5,6 g (30 mmol) Triethanolamin-Hydrochlorid und 100 mg MgSO47 H2O in ca. 80 mL bidest. Wasser lösen (Becherglas). Berechnen (pKa1 = 7,8) und messen Sie den pH-Wert. Berechnen Sie dann, welches Volumen einer 1 mol/L NaOH zur Einstellung des gewün-schten pH-Wertes benötigt wird. Kontrollieren Sie das Ergebnis der Berechnung indem Sie das benötigte NaOH-Volumen bei der Pufferherstellung messen (Bürette). Mit bidest. Wasser im 100 mL-Messkolben auffüllen.

4) NADP-Lösung (32 mmol/L; 25 mg/mL); Achtung sehr teuer !!! (wird gestellt) ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phospat Di-Na-Salz; M = 787,4 g/mol. Fluka 93205, 98%; 1 g 277 €. Lösung nur herstellen, wenn Lsg 6) nicht mehr ausreichend vorhanden ist.

50 mg NaDP-Na2 durch Zugabe von 2 mL bidest. Wasser im Schnappdeckelglas auflösen. Die gesamte Lösung wird zur Herstellung von Lösung 6) benötigt.

5) ATP-Lösung (91mmol/L; 50 mg/mL) Achtung: teuer! (wird gestellt) Adenosin-5´-triphosphat Di-Na-Salz hydrat; M = 551,1 g/mol. Fluka 02055, 98%, 1 g 29.- €. Lösung nur herstellen, wenn Lsg 6) nicht mehr ausreichend vorhanden ist.

200 mg ATP-Na2H2 und 200 mg NaHCO3 durch Zugabe von 4 mL bidest. Wasser im Schnappdeckelglas lösen. Die gesamte Lösung wird zur Herstellung von Lösung 6) benötigt.

6) NADP / ATP-Reagenz (NADP 0,76 mg/mL und ATP 3,0 mg/mL ) Die 2 mL der NADP-Lösung 4) und die 4 mL der ATP-Lösung 5) werden mit insgesamt 60 mL Triethanolaminpuffer 3) aufgenommen und vermischt.

7) Gemisch Hexokinase (HK) / Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH); Roche 127825; Suspension in 3,2 mol/L Ammoniumsulfat, 5 mL 100.- €. 1 mL enthält 2 mg HK (170 U/mg) und 1 mg G6P-DH (170 U/mg); Die käufliche Suspension kann im Test ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt werden. (20 µL, ca. 7 U HK und 3 U G6PDH pro Bestimmung).

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-6

Probenvorbereitung und Durchführung

Jede 2er-Gruppe bestimmt den Extraktwert und den Glucose- und Dextrin-Gehalt in zwei Getränken (Nr.1 und Nr. 2). Zum Vergleich der Ergebnisse sollen alle Gruppen dieselben Getränke verwenden. Die Verdünnungen müssen aber gesondert angesetzt werden! Weil anschließend auch der Ethanol-Gehalt der Getränke bestimmt werden soll, kommen für die Untersuchungen nur alkoholhaltige Getränkearten in Frage.

Wenn CO2-haltige Getränke untersucht werden sollen, müssen sie vorher entgast werden. Wenn in der entgasten Probe im Anschluss auch Ethanol bestimmt werden soll, muss eine "sanfte" Entgasungsmethode gewählt werden; nähere Hinweise: s. Akoholbestimmung.

Die beiden Getränke werden nacheinander analysiert. Jede Analyse dauert ca. 1/2 Std. Für die Analyse eines Getränkes sind maximal drei Bestimmungs-Proben erforderlich: 1. Blind-Probe; wenn bei der Analyse des Getränkes Nr. 1 die Absorbanz der Blind-Probe

relativ konstant ist, braucht für das Getränk Nr. 2 keine Blind-Probe angesetzt zu werden. 2. Getränk Nr. 1 (bzw. Nr. 2) Glucose-Probe; 3. Getränk Nr. 1 (bzw. Nr. 2) Dextrin-Probe. Für eine 2er-Gruppe fallen also für beide Getränke maximal 6 Bestimmungs-Proben an. (Reste von Reagenz-Lösungen in den Kühlschrank stellen).

Bei jeder photometrischen Bestimmung sollte die Änderung der Absorbanz nicht größer sein als ∆A ≈ 1 (warum?). Da der Glucose- und Dextrin-Gehalt (und ebenso der Alkohol-Gehalt) in den Getränken sehr unterschiedlich sein können, müssen die Getränke unterschiedlich verdünnt werden. Für den Vorverdünnungsfaktor liegen folgende Erfahrungswerte vor:

1. Verschiedene Biersorten. Glucose-Bestimmung: - Alle alkoholhaltigen Biere: unverdünnt einsetzen; - Alkoholfreie Biere: Glucose-Gehalt kann unterschiedlich sein;

unverdünnt einsetzen bzw. 1:5 verdünnen (d.h. Verdünnungsfaktor 0,2). - Malz-Bier: 1:100 verdünnen (d.h. Verdünnungsfaktor 0,01); Dextrin-Bestimmung: - Alle Biere: 1:100 verdünnt einsetzen; - Malzbier: 1:200 verdünnt einsetzen.

2. Verschiedene Weinsorten. Glucose-Bestimmung: - Herbe Weiss- und Rotweine: 1:10 verdünnen (d.h. Verdünnungsfaktor 0,1); - Liebliche Weiss- und Rotweine 1:100 verdünnen (d.h. Verdünnungsfaktor 0,01). Dextrin-Bestimmung: Alle Weine mit der gleichen Verdünnung wie bei der Glucose-Bestimmung einsetzen.

Die Dextrin-Probe wird in einer mit Deckel verschließbaren Quarzküvette angesetzt. Der Deckel wird zusätzlich mit Parafilm abgedeckt und fixiert. Die Küvette wird für die Inkubation mit Hilfe einer geeigneten Halterung in ein Wasserbad gesetzt.

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-7

Lösungen (mL) Lsg. Nr. Blind-Probe Glucose-Probe Dextrin-Probe

Dextrin-Probe in einer verschließbaren Einwegküvette ansetzen.

Verdünnte Probenlsg. Dextrin --- --- 0,1 mL

AGS-Lösung 2 --- --- 0,2 mL

Dextrin-Probe mit dem Küvetten-Rührer mischen, wie beschrieben verschließen und im Wasserbad bei 55 - 60oC 15 min. inkubieren;

Glucose- und Blind-Probe (Anm 1) ohne Inkubation in den Küvetten zusammenmischen.

Wasser 0,1 mL --- ---

Citratpuffer 1) 1 0,2 mL 0,2 mL ----

Verdünnte Probenlsg Glucose --- 0,1 mL ---

NADP/ATP-Reagenz 6 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Mit Küvettenrührer mischen in der Reihenfolge: Blind-, Glucose-, Dextrin-Probe (warum?) Die Messungen mit Dextrin-Probe beginnen. Die anderen Küvetten beiseite stellen.

Zweite Messung mit Glucose-Probe, zuletzt Blind-Probe; parallele Messungen sind möglich.

Einzelschritte jeder Messung: 1) Küvette in Gerät einsetzen → Absorbanz 1A (gegen Luft-Küvette) messen. Notieren!

2) In der jeweiligen Küvette die Reaktion starten durch Zugabe von:

HK / GGP-DH 7 0,02 mL 0,02 mL 0,02 mL

3) Sofort mit Küvettenrührer mischen und Uhr starten. Absorbanzänderungen verfolgen und in geeigneten Abständen Messwerte notieren. Bei Bedarf Progresskurve zeichnen.

4) Nach 10-15 min kommen die Reaktionen nahezu zum Stillstand. Man bestimmt einen vorläufigen Absorbanz-Endwert A2, stellt die Küvette beiseite und kann dann schon mit dem Start der Reaktion in der nächsten Probe beginnen.

5) Der endgültige Absorbanz-Endwert A2 der jeweiligen Probe kann dann nach längerer Zeit bestimmt werden → Absorbanz 2A .

Die Änderungen der Absorbanzen A2 - A1 sollten nicht größer als 1 sein, aber auch nicht kleiner als 0,1. Anderenfalls muß anders vorverdünnt werden.

Wenn der Blindwert konstante Absorbanz zeigt, kann er auch für das zweite Getränk verwendet werden.

1) Die Zugabe von Citratpuffer erfolgt, um den Blindwert und die Glucoseprobe in Hinsicht auf pH und

Volumen der Dextrinprobe anzugleichen. Eigentlich müssten Blindwert und Glucoseprobe genau wie

die Dextrinprobe mit Citratpuffer und AGS-Lösung versetzt und inkubiert werden. Das unterbleibt

hier nur aus Kostengründen in der Annahme, dass der dadurch verursachte Fehler gering ist.

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Auswertung (Eine PDF-Vorlage für die Auswertung des Glucosegehalts wird Ihnen ausge-händigt. Dem Protokoll sind 2 ausgefüllte Ausdrucke dieser Vorlage – eine je Getränk – beizufügen.

Grundlegendes Vorgehen bei der Berechnung des Glucose- und Dextringehaltes

1) Ermittlung der Absorbanzänderungen mit der Absorbanzänderung der Blind-Probe:

Glucosebestimmung: 2 1 2 1 G G G B BA A A A A (G ≡ Glucose, B ≡ Blindwert)

Dextrinbestimmung: 2 1 2 1 D D D B BA A A A A (D ≡ Dextrin, B ≡ Blindwert)

2) Die Berechnung der Glucose-Konzentrationen erfolgt auf der stöchiometrischen Grundlage:

(Glucose) (NADPH)n n (Glucose) (NADPH)c c

In der Dextrin-Probe wird auch die unvergorene Glucose miterfasst (Gesamtglucose). Es gilt für die Stoffmengen-Konzentration der Glucose in der Dextrin- bzw. der Glucose-Testlösung:

Test Test(Glu) (Glu)A

A d c cd

( gesTest (Glu)c bzw. G

Test (Glu)c )

3) Für die Berechnung des Dextringehaltes muss zunächst die Differenz zwischen der Stoff-mengen-Konzentration der Gesamt-Glucose und der freien Glucose gebildet werden:

D ges GTest Test Test(Glu) (Glu) (Glu)c c c

4) Berechnung der Massen-Konzentrationen von Glucose in der Glucose-Testlösung GTest (Glu)

und von Dextrin in der Dextrin-Testlösung DTest (Dex) . Dabei ist zu beachten, dass bei der

Dextrinhydrolyse pro Mol gebildeter Glucose ein Mol Wasser aufgenommen wird:

G GTest Test(Glu) (Glu) (Glu)= c M D D

2Test Test(Dex) (Glu (Glu-H O))= c M

5) Berechnung der Massen-Konzentrationen von Glucose und von Dextrin in der eingesetzten Probenlösung Pr und im ursprünglichen Original-Getränk Getränk. Dabei müssen beide Verdünnungen, die die Probe vom Originalgetränk bis zur Testlösung erfahren hat, durch den Proben-Verdünnungs-Faktor und den VorverdünnungsFaktor berücksichtigt werden.

6) Berechnung der Massenanteile von Glucose und Dextrin und des "Extraktwertes" unter der Annahme, dass der "Extraktwert" zu 2/3 durch Glucose und Dextrin bestimmt wird.

Anmerkung: Für richtige Ergebnisse des Tests ist es entscheidend, dass ausreichend NADP+ und ATP vorhanden sind, um die zu bestimmende Glucose vollständig umzuwandeln. Die hohen Preise der benutzten (Co)Enzyme verbieten es, diese Substanzen im Praktikum im zwar sicheren, aber hohen und teuren Überschuss einzusetzen. Man kann den beschriebenen Test dadurch validieren, dass man die Reaktion durch Glucosezugabe neu startet und berechnet, ob die nach dem Neustart bestimmte Änderung der Absorption der zugesetzten Glucosestoffmenge entspricht.

Unterschiedliche Verdünnungsfaktoren bei der Bestimmung von Dextrin und Glucose beachten!

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-9

Enzymatische Bestimmung von Ethanol

Prinzip der Bestimmung

Die enzymatische Bestimmung von Ethanol in Getränken (und auch im Blut) beruht auf dem pH-abhängigen Redoxgleichgewicht (4):

(4) CH3-CH2-OH + NAD+ ADH CH3-CHO + NADH + H+

Die Geschwindigkeit der Einstellung dieses Gleichgewichtes wird durch das Enzym mit dem gebräuchlichen Namen Alkoholdehydrogenase (ADH) katalysiert. Als Oxidationsmittel benutzt die ADH das Coenzym Nicotinamid-adenin-dinucleotid (übliche Abkürzung NAD+; Bemerkungen zur Abkürzung s. u.). Deshalb lautet der systematische Name der ADH:

Alkohol-NAD+-oxidoreduktase (E.C. 1.1.1.1).

Bei der Oxidation (Dehydrierung) von Ethanol zu Acetaldehyd wird das NAD+ unter Bildung von Protonen zu einer dem Ethanol äquivalenten Stoffmenge NADH reduziert. Das gebildete NADH hat wegen seiner Molekülstruktur (s. u.) im Gegensatz zum NAD+ ein Absorptionsmaximum im langwelligen UV-Bereich bei 340 nm. Wegen des relativ großen Absorptionskoeffizienten kann NADH gut photometrisch bestimmt werden.

Die für das Coenzym gebräuchliche Abkürzung NAD+ muss an Hand der Strukturformel (vgl. Auswertung 5) umsichtig interpretiert werden. Sie zeigt zunächst zweierlei:

- Bei der Verbindung NAD+ handelt es sich um ein quartäres Pyridiniumkation mit einer vom pH-Wert unabhängigen Permanentladung. Pyridiniumkationen können als Oxidati-onsmittel wirken, weil sie in 4-Stellung Hydridionen anlagern können. Dabei geht die kationische Pyridiniumstruktur verloren. Aus Sicht der reaktionsmechanistischen organi-schen Chemie ist die Hydrid-Anlagerung und das dabei gebildete Reaktionsprodukt NADH ein sehr interessanter und wichtiger Fall (vgl. Auswertung 2).

- Der Ladungszustand des Moleküls NAD+ ist pH-abhängig, denn die Verbindung enthält relativ saure (Diphosphorsäure) und auch basische (Amine) Gruppen. Mit dem hochge-stellten + in der Abkürzung NAD+ kann - muss aber nicht - die Ladung des Moleküls ge-meint sein, denn die ist vom pH-Wert abhängig. Das + Zeichen soll klar machen, dass das Coenzym als wichtigste chemische Gruppierung ein Pyridiniumkation enthält.

Das Gleichgewicht der Reaktion liegt stark auf Seiten der Edukte: pH = 7 K´ = 810-12 mol/L. Für die Bestimmung des Ethanols muss für einen vollständigen Ablauf der Reaktion gesorgt werden. Das gelingt durch die Wahl eines leicht basischen pH-Wertes und zusätzlich durch eine Abfangreaktion, mit der der gebildete Acetaldehyd in das Semicarbazon überführt wird. Weil diese Abfangreaktion langsam abläuft, ist diese Art der Ethanol-Bestimmung in analytischen Labors nicht beliebt. Hier wird sie nur gewählt, weil sie relativ preiswert ist. Außerdem ist jede photometrische Methode immer dann recht ungenau, wenn der Blindwert hoch ist. Genau das kann aber bei Abfangreaktionen geschehen, die mit organischen Hilfs-reagentien (hier Semicarbazid) arbeiten, denn die Reagentien oder die enthaltenen Verunrei-nigungen oder die entstehenden Produkte können bei 340 nm Eigenabsorption zeigen.

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Herstellung der Lösungen. (Nur nötig wenn ausreichende Mengen nicht mehr vorhanden sind. Die angegebenen Werte reichen für vier 2er-Gruppen).

1) Diphosphatpuffer (75 mmol/L, pH 8,7), Semicarbazid (75 mmol/L), Glycin (21 mmol/L)

Diphosphat: Fluka 71514 Semicarbazid Hydrochlorid pa: Fluka 84938

3,35 g Na4P2O710 H2O (tetra-Natriumdiphosphat Decahydrat), 836 mg Semicarbazid-Hydrochlorid und 158 mg Glycin werden in ca. 80 mL Wasser gelöst, mit ca. 5 mL 1 mol/L NaOH auf pH 8,7 eingestellt und mit bidest. Wasser auf 100 mL aufgefüllt.

2) NAD-Lösung (neutrales Zwitterion) (24 mmol/L) (wird gestellt) ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid; M = 663,4 g/mol; Fluka 43410 1 g 26.- €

40 mg NAD mit 2,5 mL bidest. Wasser im Schnappdeckelglas auflösen.

3) Alkoholdehydrogenase (aus Hefe), ADH-Lösung (wird gestellt)

Roche 102717 spez. Akt. 400 U/mg ; (170 mg Lyophilisat enthält 100 mg Protein); 45.- €.

25 mg Lyophilisat (15 mg Protein, 6.000 U) in einem konischen Eppendorfgefäß mit 0,5 mL bidest. Wasser lösen.

Probenvorbereitung und Durchführung

Jede 2er-Gruppe bestimmt den Ethanol-Gehalt in zwei Getränken (Nr. 1 und. Nr 2). Zum Vergleich der Ergebnisse sollen alle Gruppen dieselben Getränke verwenden. Die Verdünnungen müssen aber gesondert angesetzt werden, weil die Fehlermöglichkeiten groß sind. Die beiden Getränke Nr. 1 und. Nr 2 werden nacheinander analysiert. Jede Analyse dauert ca. 1 Std. Für jedes der beiden Getränke werden maximal drei Proben benötigt, davon zwei Proben mit unterschiedlichen Verdünnungen: 1. Blindprobe; wenn sich bei der Analyse des Getränkes Nr. 1 die Absorbanz der

Blindprobe als relativ konstant erweist, braucht die Blindprobe für das Getränk Nr. 2 nicht noch einmal angesetzt zu werden

2. Ethanolprobe Getränk Nr. 1 (bzw. Nr. 2) mit der 1. Verdünnung; 3. Ethanolprobe Getränk Nr. 1 (bzw. Nr. 2) mit der 2. Verdünnung.

Für eine 2er-Gruppen fallen für beide Getränke also maximal 6 Bestimmungen an.

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-11

Vorsichtsmaßnahmen bei der Pipettierung; Entgasung: Wegen der Flüchtigkeit von Ethanol und wegen der benötigten hohen Vorverdünnungen, können Pipettierfehler stark ins Gewicht fallen. Deshalb müssen einige Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden:

- Wenn CO2-haltige Getränke untersucht werden, besteht die Gefahr, dass sich beim Pipettieren in der Pipette Bläschen bilden und ein Teil des pipettierten Volumens wieder verloren geht. Erproben Sie vorher, ob das der Fall ist. Wenn ja, müssen die Getränke vorher etwas entgast werden. Bei der Entgasung darf sich der Ethanol-Gehalt natürlich nicht verändern. Man muss also "sanfte" Entgasungs-methoden anwenden (Rühren mittels Magnetrührer) und während der Entgasung die Oberfläche klein halten, damit kein Ethanol verdunstet (Entgasung im Messzylinder).

- Bei den Pipettiervorgängen die alkoholhaltigen Lösungen vorsichtig ansaugen.

- Bei der Herstellung der Verdünnungen muss fast das gesamte Wasservolumen im Messkolben vorgelegt werden. Das entgaste, alkoholhaltige Getränk lässt man dann aus der Pipette direkt auf die Wasseroberfläche einlaufen, damit der Ethanol beim Auslaufen der Pipette nicht verdunstet. Dann wird endgültig auf das Endvolumen aufgefüllt und durch Schütteln gut gemischt!!!

In Hinsicht auf die Verdünnungen liegen folgende Erfahrungswerte vor:

1. Verschiedene Biersorten.

- Biere mit Ethanolgehalten von ca. 5 % in zwei Verdünnungen einsetzen: 1. Verdünnung: 1:1000 (Vorverdünnungsfaktor 0,001); 2. Verdünnung: 1:2000 (Vorverdünnungsfaktor 0,0005). Wegen der hier sehr stark ins Gewicht fallenden Pipettierfehler bei der Abmessung kleiner Volumina, muss sehr sorgfältig gearbeitet werden: es müssen 1 mL- bzw. 0,5 mL Vollpipetten und 1 L-Messkolben benutzt werden.

- Biere mit Ethanolgehalten < 5 % mit zwei entsprechend geringeren Verdünnungen einsetzen.

- Alkoholfreie Biere sind nur fast alkoholfrei; sie müssen nur leicht verdünnt werden:

1. Verdünnung: 1:50 (Vorverdünnungsfaktor 0,02); 2. Verdünnung: 1:100 (Vorverdünnungsfaktor 0,01);

2. Verschiedene Weinsorten.

- Weine mit relativ niedrigem Ethanolgehalt (ca. 10 %) können wie normale Biere 1:1000 und

1:2000 verdünnt eingesetzt werden;

- Weine oder Brände mit relativ hohem Ethanolgehalt müssen entsprechend in zwei Stufen

noch höher verdünnt werden:

1. Verdünnung: 1:5000 (Vorverdünnungsfaktor 0,0002); 2. Verdünnung: 1:10000 (Vorverdünnungsfaktor 0,0001);

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-12

An Hand folgender Tabelle werden die Lösungen in Küvetten zusammengemischt.

Lösungen (ml) Lsg. Nr. Blindwert Ethanol-Probe 1 Ethanol-Probe 2

Alle Bestimmungen in verschließbaren Einwegküvetten ansetzen.

Diphosphatpuffer 1 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL

NAD 2 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

Wasser 0,2 mL --- ---

Verdünnte Ethanol-Proben --- 0,2 mL 0,2 mL

Mit dem Küvettenrührer mischen; Reihenfolge Blind-, Nr. 1-, Nr. 2-Probe

Absorbanzen von Blindwert und Testwerten gegen Luft-Küvette bei 340 nm messen: 1A .

ADH 3 0,02 mL 0,02 mL 0,02 mL

Mischen, Küvetten verschließen, mit Parafilm versiegeln. 25 min bei 37 °C inkubieren.

Absorbanzen von Test- und Blindwerten gegen Luft-Küvette bei 340 nm messen: 2A

Auswertung (Eine PDF-Vorlage für die Auswertung des Alkoholgehalts wird Ihnen ausge-händigt. Dem Protokoll sind 2 ausgefüllte Ausdrucke dieser Vorlage – eine je Getränk – beizufügen.

Grundlegendes Vorgehen bei der Berechnung des Alkoholgehaltes

1) Aus den Änderungen der Absorbanzen wird die Stoffmengenkonzentration des Ethanols in der Testlösung berechnet und in die jeweiligen Massenkonzentrationen umgerechnet. Das erste Ergebnis der Auswertung ist wie bei der Glucose-Dextrin-Bestimmung die jeweilige Massenkonzentration von Ethanol in den beiden unterschiedlich verdünnten Getränke-proben. Wenn beide Werte ähnlich sind (kein Ausreißer), können sie gemittelt werden. Wenn sich beide Werte stark unterscheiden, müssen die beiden Werte der anderen 2er-Gruppen zu Hilfe genommen werden, um zu entscheiden, welcher Wert als Ausreißer zu betrachten ist.

2) Die Angaben von Alkoholgehalten in Getränken erfolgt meist als sog. "Volumenprozente"; bei Blutalkoholgehalten spricht man nur von "Promillen". Dabei bleibt unklar, ob mit diesen Angaben "Volumenkonzentrationen" oder "Volumenanteile" gemeint sind. In verdünnten Ethanol-Lösungen sind die Werte dieser beiden dimensionslosen Gehaltsgrößen fast gleich. In der Annahme, dass Volumenkonzentration gemeint ist, wird auf darauf umgerechnet.

3) Es folgt die Berechnung des Massenanteils von Ethanol. Er wird benötigt, um mit dem bei der Glucose-Dextrin-Bestimmung berechneten "Extraktwert" (bzw. mit dem experimentell ermittelten "Extraktwert") die Stammwürze des Bieres zu berechnen.

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Weitere Punkte im Rahmen der Auswertung; Abgabe im Protokoll.

1) Beschreiben Sie die Berechnungen und Ergebnisse (pH, Einwaagen, Benötigtes Volumen an Titrationslösung) bei der Herstellung der Pufferlösungen.

2) Formulieren Sie die Reaktionsgleichung der alkoholischen Gärung und die Stoffmengen-bilanz von Glucose und Ethanol. Berechnen Sie dann den Faktor F in der Massenbilanz (bzw. Bilanz der Massenanteile, sog. Vergärungsformel):

(NfBWü) (NfBBi) (Glucose vergoren) (NfBBi) (Alkohol)w w w w F w oder:

(Glucose vergoren) (Alkohol)StWü EW w EW F w

3) Füllen Sie unter Verwendung des Faktors F die PDF-Vorlagen vollständig mit Werten aus und fügen Sie sie der Auswertung bei (2 x Ethanolbestimmung; 2 x Glucose-/Dextrin-Bestimmung).

4a) Machen Sie mit Hilfe von Strukturformeln klar, warum und auf welche Weise NAD+ (bzw. NADP+) als Oxidationsmittel (Hydridionenacceptor) wirken kann. Nach welchem Reaktionsmechanismus verläuft die Redoxreaktion? Wie kann die Gleichgewichtslage des Redoxgleichgewichtes beeinflusst werden? b) Welches Produkt (Strukturformel) entsteht bei der Oxidation von G-6-P? c) Wie und warum unterscheiden sich die Absorptionsspektren von NAD+ und von NADH?

5) Im Test wird pro Küvette 1 mg des Enzyms ADH (spezifische Aktivität: zspez = 400 U/mg ) eingesetzt. Jeder Testansatz wird 15 min inkubiert. Welche Stoffmenge und welche Masse Ethanol könnte mit der verwendeten Enzymmenge in dieser Zeit katalytisch oxidiert werden, vorausgesetzt, es wäre während der ganzen Zeit eine ausreichend große Menge des Oxidationsmittels NAD+ vorhanden? Führen Sie eine saubere stöchiometrische Rechnung mit Größengleichungen durch und gehen Sie dabei von der Definitionsgleichung der spezifische Aktivität zspez aus.

6) Zur Bestimmung von Blutalkoholwerten wird in der forensischen Analytik zur Absicherung zusätzlich zur hier durchgeführten ADH-Methode die Gaschromatographie als instrumentelle Methode herangezogen. Was ist gemeint, wenn es heißt, dass die ADH-Methode gegenüber der Gaschromatographie den Vorteil hat, eine "Absolutbestimmung" zu sein? Gibt es noch andere Absolutbestimmungsmethoden?

7) Kann bei der beschriebenen Glucose-Dextrin-Bestimmung für Wein auch ein eventueller, vorheriger (vor der Vergärung) oder nachträglicher Zusatz von Rohrzucker miterfasst werden? Wie müsste man die Bestimmung erweitern, um auch solche Zusätze zu erkennen?

8) Geben sie Strukturformeln und Reaktionsgleichungen an für folgende im Versuch genutzten Substanzen bzw. Reaktionen: Trietanolaminhydrochlorid und die korrespondierende Base; Semicarbazid und die Abfangreaktion mit dem gebildeten Acetaldehyd.

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R. Robelek Enzymatische Bestimmung von Glucose und Ethanol 2-14

9) Ist die beschriebene Ethanolbestimmung für Ethanol spezifisch oder werden auch andere Alkohole (Methanol, Propanole, Butanole, Glycerin, Ethylenglygol), die in Lebensmitteln, Getränken und anderen Produkten vorkommen können, im Test miterfasst? Die Beantwortung dieser Frage läuft darauf hinaus, eine Aussage über die Substratspezifität der Alkoholdehydrogenase zu machen und damit Frage zu beantworten: Kann die ADH auch die Oxidation anderer Alkohole katalysieren und wenn ja mit welcher spezifischen Aktivität? Literatur Angaben: D. Schomburg. D. Stephan (Eds), Enzyme Handbook, Bd 9; Springer 1993 (86 VK/8700 S369-9).

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Th. Hirsch Ionenselektive Elektroden 3-1

Ionenselektive Elektroden

1. Herstellung von K+-selektiven Membranen und coated-wire Elektroden

Es sind zwei Lösungen vorzubereiten. Lösung 1 enthält den Membranbildner PVC. Man wiegt 270 mg PVC in ein Reagenzglas ein, gibt einen Rührfisch hinzu und spannt das Reagenzglas über dem Magnetrührer ein. Durch Zugabe von THF mittels Pasteurpipette unter gleichzeitigem schnellem Rühren löst man das PVC.

Hinweis: Die Membran lässt sich nur dann bilden, wenn die Menge an THF gering und die Lösung zähflüssig ist. PVC löst sich aber nicht sehr leicht in THF, d.h. ist die Menge an THF zu gering erhält man einen unlöslichen Klumpen an PVC der in der Lösung schwimmt und keine Tendenzen verspürt sich aufzulösen. Ist die Menge an THF zu groß muss man lange warten bis die entsprechende Menge an Lösungsmittel verdampft ist um eine Membran erhalten zu können.

Lösung 2 enthält den Ionophor zusammen mit dem Weichmacher. Es werden mit einer Eppendorfpipette 520 μL Dibutylsebacat in ein Reagenzglas pipettiert und anschließend mit einer Hamiltonspritze 50 μL einer Valinomycinlösung (in Methanol: 80 mg·mL-1) hinzugegeben. Aufgrund der hohen Toxizität von Valinomycin ist vor dem Hantieren mit Valinomycin unbedingt das Sicherheitsdatenblatt zur Kenntnis zu nehmen. Zum Pipettieren sind Handschuhe zu tragen und es ist unter dem Abzug zu arbeiten.

Ist die Lösung 1 homogen und klar, so überführt man sie unter Zurückhalten des Rührfisches in das Reagenzglas mit Lösung 2. Die vereinigte Lösung (= Beschichtungslösung) lässt man für mindestens 30 Minuten rühren.

Um eine coated-wire Elektrode herzustellen beschichtet man das Ende (ca. 3 cm) eines mechanisch gereinigten Kupferdrahtes mit einem dünnen Polymer-Film, indem man den Draht immer wieder in die Beschichtungslösung taucht, ihn herauszieht und unter Drehen das Polymer in einer gleichmäßig dicken Schicht auf dem Draht antrocknen lässt. Sobald der Film mit bloßem Auge deutlich zu erkennen ist, bildet man durch weiteres Eintauchen und Herausziehen eine tropfenförmige Kugel am unteren Ende des Kupferdrahtes. Die fertige coated-wire Elektrode lässt man daraufhin unter demAbzug mindestens vier Stunden lang trocknen. Anschließend wird die Elektrode für mindestens sechs Stunden in einer KCl-Lösung (10-2 mol·L-1) äquilibriert.

Um die Membranelektrode herzustellen benutzt man den verbliebenen Rest der Beschichtungslösung und gießt diesen, wiederum unter Rückhaltung des Rührfisches, in ein kleines planares Glasschälchen, sodass sich ein gleichmäßiger Film bildet. Das Schälchen wird zum restlosen Verdampfen des THFs für mindestens vier Stunden bei 55 °C aufbewahrt. Danach wird die entstandene Membran vorsichtig aus dem Schälchen gehoben und äquilibriert diese ebenfalls für mindestens sechs Stunden in einer KCl-Lösung (10-2 mol·L-1).

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Th. Hirsch Ionenselektive Elektroden 3-2

2. Pufferverstärker

2.1 Aufbau und Test des Pufferverstärkers

Pufferverstärker haben einen Spannungsverstärkungskoeffizienten von 1, besitzen jedoch einen hohen Eingangswiderstand sowie einen niedrigen Ausgangswiderstand. Der Pufferverstärker erlaubt es, die Spannung von hochohmigen Spannungsquellen (z. B. ionenselektiven Elektroden) zu messen. Da die Benutzung eines handelsüblichen Voltmeters zur Signalmessung von hochohmigen Spannungsquellen einen typischen Fehler darstellt, und die Herstellung eines Pufferverstärkers nur wenig Zeit beansprucht, ist der Aufbau eines solchen Verstärkers ein Teil dieser Praktikumsaufgabe.

Abb. 1. Pufferverstärker und Beschreibung des Operationsverstärkers TL081 CP.

Mit Hilfe des Schemas in Abbildung 1 sind die entsprechenden Fassungskontakte des Sockels mit eingesetztem Operationsverstärker mit den Anschlüssen des Eingangs, des Ausgangs und der Versorgungsspannung am Gehäuse des Pufferverstärkers zu verbinden. Ebenso sind die entsprechenden Lötpunkte für die Rückkopplung mit einem Draht zu kontaktieren. Zusätzlich sind an der Innenseite des Gehäuses jeweils von den Buchsen der Spannungsversorgung je ein 100 nF Kondensator mit der mittleren Buchse (Erde) zu verbinden.

Nachdem man das Gehäuse geschlossen hat prüft man mit Hilfe des Oszilloskops ob die Schaltung funktioniert. Schließen Sie hierzu am Eingang des Pufferverstärkers einen Funktionsgenerator und am Ausgang ein Oszilloskop an. Verbinden Sie den Pufferverstärker mit dem Netzteil und vergewissern Sie sich, dass keine parasitäre Oszillation vorliegt. Als letztes überprüft man den Verstärkungsfaktor der Schaltung. Dazu verbindet man den Eingang mit einer Batterie und misst am Ausgang mit dem Voltmeter die Spannung.

2.2 Bestimmung der Eingangsimpedanz

Die Eingangsimpedanz eines Voltmeters und anderer Geräte zur Spannungsmessung liegt im

Normalfall im Bereich zwischen 106 (übliches Voltmeter oder Oszilloskop) und ca. 1016 (spezielles elektrometrisches Voltmeter). Die einfachste Methode zur Bestimmung des Eingangswiderstands, die auch für sehr große Eingangswiderstände verwendbar ist, ist die

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Th. Hirsch Ionenselektive Elektroden 3-3

Relaxationsmethode. Dabei schließt man einen Kondensator bekannter Kapazität an das zu überprüfende Messgerät an (Abbildung 2). Anschließend lädt man den Kondensator auf, und misst die zeitliche Spannungsänderung des Kondensators. Sie verläuft nach der Gleichung (I), wobei V0 die Anfangsspannung auf dem Kondensator, V(t) diese Spannung zum Zeitpunkt t, CK seine Kapazität, CE die Eingangskapazität des Messgerätes und RE der gesuchte Eingangswiderstand ist. Die typischen Werte für CE liegen zwischen 15 pF (Kondensator ohne Kabel direkt am Eingang) und 100 pF (falls der Kondensator am Eingang mit einem ca. 1 m langen Koaxialkabel verbunden ist). Falls CK >> CE ist, kann man den Einfluss der Eingangskapazität vernachlässigen.

)(

exp)( 0EKE CCR

tVtV (I)

Abb. 2. Bestimmung der Eingangsimpedanz des Voltmeters mittels der Relaxationsmethode.

Es ist die Eingangsimpedanz des Voltmeters als auch des Pufferverstärkers zu messen. Der Kondensator wird durch kurzfristiges Anlegen der Spannungsquelle (Batterie, 1.5 V) geladen. Man wählt aus den vorhandenen Kondensatoren verschiedener Kapazität einen aus, bei dem die zeitliche Spannungsänderung einige Minuten benötigt um den gemessenen Spannungswert zu halbieren. Nachdem man den Kondensator nochmals aufgeladen hat, misst man die Kinetik der Abnahme der Spannung innerhalb von 20 Minuten.

Anmerkung: Falls es nicht gelingt, dass die oben genannte Bedingung für den Abfall der Spannung eintritt (dies kann bei einem großen Eingangswiderstand der Fall sein), führt man die Bestimmung der Kinetik während eines Zeitraumes von 20 Minuten (zuerst ohne Kondensator, danach mit einem Kondensator von ca. 100 pF) durch.

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Th. Hirsch Ionenselektive Elektroden 3-4

3. Untersuchung von K+-selektiven Elektroden

3.1. Bestimmung der Nachweisgrenze und der Steigung von K+- selektiven Elektroden

Als Nachweisgrenze bei der ionenselektiven Messtechnik galt bis vor einiger Zeit diejenige Ionenkonzentration, bei der das Messsignal doppelt so groß wie das Hintergrundrauschen ist. Vor einiger Zeit wurde durch die IUPAC eine neue Methode vorgeschlagen:

In den Auftragung der Abhängigkeit der Potentialänderung () gegen den Logarithmus der Konzentration c der gemessenen Ionenart werden zwei Geraden eingezeichnet. Die eine Gerade verbindet die Messwerte kleiner Konzentrationen und verläuft nahezu parallel zur (log c)-Achse. Die zweite Gerade verbindet die Messwerte des linearen Steigungsteils des Graphen. Die Projektion des Schnittpunkts dieser zwei Geraden auf die (log c)-Achse wird als Nachweisgrenze definiert (Abbildung 3).

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

-60

0

60

120

180 O hne S törion

Nachweissgrenze

/

mV

lg (c / (m ol/L))

Abb. 3. Ermittlung der Nachweisgrenze.

Vor dem Versuch wird die coated-wire-Elektroden bzw. die Membranscheibe ca. 10 Sekunden mit destilliertem Wasser gespült.

Die coated-wire Elektrode kann dann sofort verwendet werden. Es ist lediglich darauf zu achten, dass das Drahtende möglichst nicht mit der Glaswandung der Zelle, oder sonstigen Gegenständen in Berührung kommt, um eine mögliche Beschädigung zu vermeiden. Zudem sollte die Elektrode immer in eine Lösung tauchen, um nicht einzutrocknen. Die coated-wire Elektrode wird am

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Th. Hirsch Ionenselektive Elektroden 3-5

Eingang des Pufferverstärkers angeschlossen. Der Ausgang wird mit dem Voltmeter verbunden. Das Potential wird gegen eine Ag/AgCl-Elektrode gemessen.

Die Membranelektrode wird zwischen zwei Teflonkammern eingespannt. Die beiden Kammern sollten immer gleichmäßig gefüllt bleiben, um ein Reißen der hauchdünnen Membran in Folge eines Druckunterschiedes zu verhindern. In beide Kammern wird je eine Ag/AgCl-Elektrode getaucht. Diejenige Kammer, deren Elektrode mit dem Eingang des Pufferverstärkers verbunden ist, dient als Messkammer, in ihr werden die unterschiedlichen Lösungen der Reihe nach vermessen. Die zweite Kammer ist die Referenzkammer, sie enthält in allen Versuchen eine KCl-Lösung der Konzentration 10-2 mol·L-1.

Für die Versuche zur Bestimmung der Nachweisgrenze stellt man eine Verdünnungsreihe von Kaliumchlorid-Lösungen folgender Konzentrationen her: 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 und 10-8 mol·L-1. Die höchste Konzentration ist durch Einwaage von KCl in einen 50 mL Messkolben und Auffüllen mit bidestilliertem Wasser herzustellen. Alle weiteren Lösungen einer Reihe werden durch Verdünnung aus der jeweils um eine Größenordnung höher konzentrierten Lösung hergestellt. Die Lösungen mit c = 10-7 und 10-8 mol·L-1 sind erst unmittelbar vor ihrer Verwendung herzustellen, da bei längerer Aufbewahrung, die Gefahr besteht, dass deren Konzentration durch das Herauslösen von K+-Ionen aus der Glaswand des Kolbens verfälscht werden kann.

Um die Abhängigkeit des Potentialunterschiedes von der Elektrolytkonzentration zu messen füllt man zuerst die Messzelle mit reinem Wasser und bestimmt das Potential. Anschließend wird das Wasser gegen eine KCl-Lösung der Konzentration 10-8 mol·L-1 ausgetauscht und das Potential notiert. Analog dazu werden KCl-Lösungen in aufsteigender Konzentration von 10-7 mol·L-1 bis 100 mol·L-1 vermessen.

Der Versuch ist sowohl mit der coated-wire-Elektrode als auch mit der Membran durchzuführen.

3.2 Bestimmung des Selektivitätskoeffizienten der K+-selektiven Elektroden

Die Methoden zur Bestimmung der Selektivitätskoeffizenten der Elektroden basieren auf der halb-empirischen NIKOLSKI-EISENMANN-Gleichung. Für zwei einwertige Kationen lässt sich diese darstellen als

= S log (cA + KA/B cB ) (II)

wobei cA die Konzentration des Messions A+, cB des Störions B+, S die Steigung der Elektrodenfunktion und KA/B der sog. Selektivitätskoeffizient bezüglich des Störions ist.

KA/B ist > 0 und beschreibt den Einfluss des Störions B+ auf das Elektrodenpotential. Je kleiner KA/B ist, desto geringer ist dieser Einfluss. Für 0 < KA/B < 1 ist der Einfluss des Störions schwächer als der des Messions; für KA/B > 1 ist der Einfluss des Störions stärker als der des Messions.

Alle angeführten Methoden zur Bestimmung des Koeffizienten der Elektrodenselektivität sind nur Näherungen, und die Selektivitätskoeffizienten sind nur unter bestimmten Bedingungen konstant. So kann z. B. eine Änderung der Ionenstärke zur Änderung des Selektivitätskoeffizienten führen.

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Die experimentellen Bestimmungsmethoden für den Selektivitätskoeffizienten gliedern sich in zwei Gruppen:

Methode der getrennten Lösungen (separate solution method, SSM): Eine Messreihe wird mit Lösungen des reinen Messions durchgeführt, eine andere mit

Lösungen des reinen Fremdions. Aus (II) folgt für cA = 0: BSSM = S log (KA/B cB ).

Für cB = 0 erhält man: ASSM = S log cA .

Aus diesen beiden Gleichungen folgt für cA = cB: log KA/B = ( BSSM - A

SSM ) / S

Die Methode der gemischten Lösungen (fixed interference method, FIM): Die Messungen erfolgen mit Lösungen, die Mess- und Störionen gleichzeitig enthalten. Bei der Untersuchung von Elektroden mit niedriger Selektivität wird bevorzugt diese Methode

verwendet. Es wird die Abhängigkeit des Elektrodenpotentials vom Logarithmus der Konzentration des Messions (cA) bei konstanter Störionen-Konzentration (cB) gemessen. Bei

geringer cA - Konzentration wird das Potential durch cB bestimmt: BFIM = S log (KA/B cB ) =

konst. Bei hoher cA - Konzentration wird das Potential durch cA bestimmt: AFIM = S log cA

. Diese beiden Abhängigkeiten sind linear, der Schnittpunkt der beiden Geraden entspricht der Konzentration cK, wobei KA/B = cK / cB (Abbildung 4).

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

0

60

120

180

240 CB = konst

cK

/ m

V

lg (c / (mol/L))

Abb. 4. Bestimmung des Selektivitätskoeffizienten nach der Methode der gemischten Lösungen.

Es sollen die K+/Na+ - Selektivitätskoeffizienten der Membran sowie der coated-wire Elektrode ermittelt werden.

Für die Membran verwendet man zum einen die Methode der getrennten Lösungen. Hierzu stellt man NaCl-Lösungen mit den Konzentrationen 10-4, 10-3, 10-2 und 10-1 mol·L-1 analog der Vorschrift in 3.1 her und misst das Potential dieser Lösungen erneut gegen eine KCl-Lösung mit c = 10-2 mol·L-1.

Des Weiteren sollen die K+/Na+ - Selektivitätskoeffizienten der Membran und der coated-wire Elektrode unter Verwendung der Methode der gemischten Lösungen ermittelt werden. Hierzu

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stellt man sich eine Verdünnungsreihe von KCl-Lösungen (10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, 100 mol·L-

1) her, welche zusätzlich konstant Na+-Ionen in einer Konzentration von 10-2 mol·L-1 enthalten. Dies ist am einfachsten dadurch zu realisieren, indem man genauso vorgeht wie bei der Verdünnungsreihe die ausschließlich KCl enthält, nur dass man zum Auffüllen an Stelle von bidestilliertem Wasser eine NaCl-Lösung (c = 10-2 mol·L-1) verwendet.

4. Bestimmung von K+ - Konzentrationen in Mineralwasser

Bei der Benutzung von ionenselektiven Elektroden mit einer recht hohen Selektivität kann man die Messung der Ionenkonzentration direkt durchführen. Hierzu wird eine Kalibrierkurve benötigt, die die Abhängigkeit des Potentials von der Ionenkonzentration (möglichst in der verwendeten Matrix) darstellt.

Bei der Analyse von komplexen Lösungen mit höheren Störionenkonzentrationen wird die Methode der Standardzugabe verwendet. Bei bekannter Elektroden-Steilheit wird eine Standardzugabe des Messions mit bekannter Konzentration benutzt. Bei einer Zugabe, die die

unbekannte Konzentration cx der Lösung um einen bekannten Wert c verändert, ändert sich das Elektroden-Potential um

x

x

ccc

S

log)( . (III)

Daraus kann man dann cx bestimmen:

110)(

Sx

cc

Bedenken Sie, dass durch Zugabe des Standards die Konzentration der Probe cx auch geändert wird. Wie gehen Sie vor?

Für die genaue Bestimmung, soll c so groß sein, dass ca. 20 - 30 mV beträgt.

Für diesen Versuch kann jede Praktikumsgruppe ein Mineralwasser mit angegebenem K+-Gehalt mitbringen. Alternativ stehen im Praktikumslabor verschiedene Mineralwässer zur Verfügung. Man füllt ca. 150 mL der Probe in ein Becherglas und entgast das Wasser im Exsikkator.

Bestimmen Sie die K+-Konzentration durch direkte Messung und Vergleich mit der Eichkurve aus Versuch 3.1, sowie mit der Methode der Standardzugabe unter Verwendung der Steigung dieser Eichkurve. Führen Sie alle Messungen mit jeweils neuen Proben fünfmal durch.

Für die Messungen kann man entweder die Membran oder die coated-wire Elektrode benutzen.

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5. Auswertung

Bestimmung der Eingangsimpedanzen von Voltmeter und Pufferverstärker:

Es sind die Messwerte in der Form ln( V(t) / V0 ) gegen t graphisch aufzutragen. Aus der Steigung bestimmt man den Eingangswiderstand für den Pufferverstärker und für das Voltmeter.

Auftragung der Potentialunterschiede () sämtlicher Messreihen für die coated-wire Elektrode (2x) und der ionenselektiven Membran (3x):

o Bestimmung der Nachweisgrenzen.

o Ermittlung der Steigungen.

o Ermittlung der Selektivitätskoeffizienten.

o Vergleich der Selektivitätskoeffizienten nach unterschiedlicher Methoden.

Ermitteln Sie die K+-Konzentration des Mineralwassers und vergleichen Sie den Wert mit dem auf dem Etikett angegebenen und versuchen Sie etwaige Abweichungen zu erklären. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Messwerte sowie die Standardabweichung der Mittelwerte für die Massenkonzentration von Kalium in der Probe.

6. Fragen und Aufgaben

Die folgende Struktur des Valinomycin zeigt, dass es aus verschiedenen Aminosäuren aufgebaut ist. Welche sind dies?

Welche Transportmechanismen gibt es bei Ionophoren? Welcher liegt bei Valinomycin vor? Wie wird K+ mit Valinomycin komplexiert?

Warum ist Valinomycin so giftig?

Weshalb braucht man zum Messen des Potentials von ionenselektiven Elektroden ein hochohmiges Voltmeter (Elektrometer)?

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6.1 Fakultative Aufgaben

Wie hängt der relative Messfehler vom Eingangswiderstand des Voltmeters und vom Innenwiderstand der Elektrode ab? Wie hoch ist dieser Messfehler bei der pH-Messung mit

einem üblichen Voltmeter (Eingangswiderstand 1 M) und mit einem elektrometrischen

Voltmeter (Eingangswiderstand 1000 G), wenn der innere Widerstand der pH-Elektrode

1 G ist?

Finden Sie selber heraus, wie im obengenannten Problemfall aus den beiden gemessenen Steigungen (mit und ohne externen Kondensator) der Wert des Eingangswiderstands ermittelt werden kann.

Das Elektrodenpotential ist nicht durch die Ionenkonzentrationen, sondern durch die Ionenaktivitäten definiert. Misst eine ionenselektive Elektrode für K+ wirklich die Aktivität von K+? Einen Widerspruch finden in: P. W. Atkins. Physikalische Chemie, Kapitel 11.1.b: Mittlere Aktivitätskoeffizienten. Und dazu die finale Frage: Was haben Sie denn bei diesem Versuch gemessen: K+-Aktivität oder K+-Konzentration? Oder etwas ganz anderes?

7. Literatur

[1] D. Voet, J. G. Voet: Biochemie, Kapitel 18.c. Ionophore.1992.

[2] K. Camman, H. Galster. Das Arbeiten mit ionenselektiven Elektroden. Springer 1996.

8. Organisatorisches

Praktikumsraum: CH12.0.21

Termine: jeweils Dienstag ab 13:00 und Mittwoch ab 13:00 Uhr, nach Gruppenplan

Protokollabgabe: CH13.4.12 oder per e-Mail ([email protected])

Betreuung:

Praktische Durchführung: Frau Rosmarie Walter (CH13.4.25)

Theorie und Protokolle: Dr. Thomas Hirsch (CH13.4.12, Tel: 943-5712)

________________

Der Praktikumsversuch „Ionenselektive Elektroden“ wurde ursprünglich von Prof. Dr. Vladimir Mirsky (HS Lausitz) konzipiert und von Dr. Thomas Hirsch überarbeitet.

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-1

Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer

1. Einsatzgebiete

Die Bestimmung geringer Mengen Wasser ist in fast allen Gebieten der Industrie von Bedeutung:

In der pharmazeutischen Industrie wird der Wassergehalt von Tabletten bestimmt, da Tabletten bei zu hohem Wasseranteil kleben oder bei zu niedrigem Wasseranteil leicht bröckeln.

In der chemischen Industrie ist der Wassergehalt nicht nur bei den hochreinen Lösemitteln ein wesentlicher Qualitätsfaktor, sondern in allen Bereichen der Produktionskontrolle, sowie der Eingangs- und Endprüfung.

Im Lebensmittelbereich wird der Wassergehalt z.B. in der Butter und in den Teigwaren bestimmt, da es durch Erhöhungen zu Problemen mit der mikrobiologischen Beschaffenheit kommt.

In der Mineralölindustrie entscheidet der Wassergehalt über die Verwendbarkeit der Öle.

Eine Auflistung verschiedener Methoden, die zur Bestimmung des Wassergehalts eingesetzt werden, sowie deren Vor- und Nachteile, findet sich im Anhang.

Die Methode der Wasserbestimmung nach KARL FISCHER ist besonders empfindlich und zeichnet sich durch ihre sehr hohe Selektivität aus.

2. Prinzip der Wasserbestimmung durch Karl-Fischer-Titration

Die Wasserbestimmung nach KARL FISCHER basiert auf der Beobachtung, dass Iod und Schwefeldioxid nur in Anwesenheit von Wasser zu Iodid und Sulfat reagieren ("BUNSEN-REAKTION"). Die erste Vermutung über die Stöchiometrie dieser Reaktion war, dass ein Mol Iod mit zwei Mol Wasser reagiert:

I2 + SO2 + 2 H2O SO42- + 2 I- + 4 H+ (I)

Das Wasser entstammt dabei der zu untersuchenden Substanz, die in wasserfreiem Methanol gelöst wird. Eine Voraussetzung für quantitativen Umsatz ist, dass das Gleichgewicht der Reaktion stark nach rechts verschoben ist. Deswegen sollten die hierbei entstehenden Protonen von einer geeigneten Base abgefangen werden. Auch sollte sich Schwefeldioxid im verwendeten Lösungsmittel in ausreichender Menge lösen und dessen Dampfdruck gering halten. Das hierfür früher häufig verwendete Pyridin erfüllte beide Funktionen, ist aber wegen seiner Toxizität und der Geruchsbelästigung in modernen Karl-Fischer-Reagenzien durch andere Stoffe ersetzt worden.

Die Karl-Fischer-Titration kann volumetrisch sowie auch coulometrisch durchgeführt werden. Beim volumetrischen Verfahren titriert man die Lösung mit der Probe durch Zugabe von - meistens

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-2

methanolischer - Iod-Lösung. Beim coulometrischen Verfahren wird Iod elektrochemisch direkt in der Titrationszelle hergestellt.

Die weitere Untersuchung dieser Reaktion zeigte, dass in Anwesenheit von Pyridin (oder anderen organischen Basen) und Methanol (typisches Lösungsmittel für dieses Verfahren) ein Mol Iod mit nur einem Mol Wasser reagiert.

H2O + I2 + SO2 + 3 C5H5N + CH3OH 2 C5H5NH+I- + C5H5NH+CH3OSO3- (II)

Aus der pH-Abhängigkeit der Reaktionskonstanten leiteten VERHOEF und BARENDRECHT die Erkenntnis ab, dass nicht das Schwefeldioxid als reaktive Komponente fungiert sondern das Monomethylsulfit-Ion, welches aus Schwefeldioxid und Methanol entsteht:

SO2 + 2 CH3OH CH3OH2+ + -SO3CH3 (III)

Pyridin ist damit kein Reaktionspartner mehr, sondern dient lediglich als Puffersubstanz um das Gleichgewicht der Reaktion (III) weitgehend nach rechts zu verschieben. Es kann durch andere geeignete Basen ersetzt werden.

Die elektrochemische Erzeugung des Iods beschreibt folgendes Reaktionsschema:

Anode (Generatorelektrode, Platin): 2 I- - 2 e- I2 (IV)

Kathode (Hilfselektrode, Platin): 2 H+ + 2 e- H2 (V)

Zwischen Titrationsstrom I, Titrationszeit t und Ladung Q gilt der Zusammenhang: Q = It

Die Menge des elektrochemisch produzierten und dann mit Wasser und Schwefeldioxid umgesetzen Iods lässt sich aus der Ladung Q nach dem FARADAYschem Gesetz berechnen:

M

zFmQ (1)

wobei m die Masse des verbrauchten Wassers ist, M die molare Masse von Wasser, F die Faraday'sche Konstante und z der stöchiometrische Koeffizient (die Zahl der pro H2O-Molekül ausgetauschten Elektronen).

Bemerkung: Heute verwenden viele Firmen neue Reagenzien für die Karl-Fischer Titration, geben aber keine Information über deren Zusammensetzung. Deswegen können sich die stöchiometrischen Koeffizienten deutlich von denen in Gleichung II unterscheiden.

Den Endpunkt bestimmt man mit einer Indikatorelektrode, an der die Reaktion (IV) in Gegenrichtung läuft. Wenn noch Wasser in der Zelle vorhanden ist, wird das gesamte Iod, das auf der Generatorelektrode produziert wird, in der Reaktion (I) verbraucht. Damit verbunden ist eine relativ hohe Potentialdifferenz zwischen den Indikatorelektroden. Befindet sich kein Wasser mehr in der Zelle, steigt die Iod-Konzentration an. In Anwesenheit von Iod wird die Elektrodenpolarisierung und deswegen der Widerstand der Messkette (erste Indikatorelektrode -

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-3

Elektrolyt - zweite Indikatorelektrode) kleiner, was man als Abnahme der Potentialdifferenz einfach detektieren kann.

Selbstverständlich sollte die Reaktion an der Indikatorelektrode nur eine vernachlässigbare Menge von Iod verbrauchen. Dies lässt sich einfach regulieren, da die Geschwindigkeit beider Reaktionen durch den jeweils angelegten Strom bestimmt wird.

3. Versuchsaufbau

Für die coulometrische KF-Titration ist ein weit größerer technischer Aufwand erforderlich als für die Volumetrie. Es ist deshalb verständlich, dass diese Arbeitstechnik erst in den letzten Jahren praktische Bedeutung erlangt hat. Voraussetzung war die Verfügbarkeit von kommerziell hergestellten Geräten, denn Eigenkonstruktionen sind schwierig und die Zuverlässigkeit der Technik ist unbedingte Voraussetzungen für eine problemlose Anwendung.

E. Scholz, Springer-Verlag, 1984[1]

3.1 Titriergefäss und Elektronik

Unser Gerät für die coulometrische Karl-Fischer-Titration ist aber sehr einfach. Es besteht aus einer elektrochemischen Zelle, einem Magnetrührer und der Elektronik. Die kommerziellen Geräte (Metrohm, Toledo, u.a.) werden über einen Computer bzw. eingebauten Mikroprozessor gesteuert und bieten ein benutzerfreundliches Interface mit vielen Möglichkeiten für Versuchsprogrammierung und Datenbearbeitung. Das elektronische Herz unseres Gerätes ist viel einfacher und beinhaltet nur die wirklich notwendigen Komponenten.

Abb. 1. Die Messzelle. Abb. 2. Elektrodensystem.

Die Zelle (Abbildung 1) hat zwei Paare von Platin-Elektroden. Das größere Elektrodenpaar wird zur Herstellung von Iod benutzt, das kleinere dient zur Indikation von dessen Anwesenheit. Die

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-4

Elektronik besteht aus zwei Konstantstromquellen, die erste (mit einer Stromstärke von 50 mA) versorgt die Generatorelektrode, die zweite (mit einer Stromstärke von ca. 1 – 50 μA) die Indikatorelektrode (Abbildung 2).

Die Quelle für den konstanten, aber sehr geringen Strom der Indikatorelektroden erzeugt man am einfachsten durch die serielle Verknüpfung einer Spannungsquelle (Batterie, 1.5 V) mit einem Widerstand. Für die Generatorlelektroden, die einen höheren und stabileren Stromfluss benötigen (Drift oder Abweichungen bewirken eine fehlerbehaftete Wasserbestimmung), verwenden wir die integrierte Schaltung LM317 (Abbildung 3). Dieses Bauelement stabilisiert je nach Schaltung Strom oder Spannung.

Abb. 3. Integrierte Schaltung LM 317 als Konstantstromquelle.

Als erstes gilt es zu überprüfen, wie gut diese Schaltung den Strom stabilisiert. Für diesen Test werden am Ausgang der Stromquelle seriell ein Widerstand und ein Strommessgerät angeschlossen. Nacheinander wird der Strom verschiedener Widerstände (0 und ca. 20, 40, 60, 80, 100 Ohm) gemessen und die Abhängigkeit des Stromes vom Widerstand in ein Diagramm gezeichnet.

3.2. Aufbau des coulometrischen Karl-Fischer-Titrators

Titriergefäß mit dem Halter an der Stativstange befestigen

Rührstäbchen ins Titriergefäß legen

Alle Schliffe mit Schliffmanschetten abdichten

Indikatorelektrode in die linke Schlifföffnung stecken, Elektrodenkabel anschrauben und mit der Schaltung verbinden

Generatorelektrode in die mittlere Schlifföffnung stecken, Elektrodenkabel anschrauben und mit der Schaltung verbinden

Septum in die Schraubkappe legen und diese am Titriergefäß aufschrauben.

Titriergefäß mit ca. 80-100 mL Karl-Fischer-Reagenz füllen

Letzte Schlifföffnung mit Glasstopfen schließen

Die Indikatorelektroden mit einem x-t-Schreiber verbinden

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-5

WICHTIG: Bei der Handhabung aller Reagenzien, Glassgeräte und Standardlösungen ist zu berücksichtigen, dass Wasser aus der Luft eingeschleppt und die Ergebnisse verfälschen kann. Deswegen alle Reagenzien nur für minimale Zeit öffnen, die Hände, Handschuhe, Labortisch, usw. unbedingt trocken halten, keine offenen Gefäße mit Wasser in die Nähe bringen, Wasserhähne im Labor während der Versuchdurchführung nicht benutzen.

4. Versuchsdurchführung

Ziel des Versuches ist es, den Wassergehalt von Ethanol vor und nach einer Trocknung zu bestimmen. Die Trocknung erfolgt dynamisch über ein Molekularsieb. Dazu lässt man ca. 100 mL Ethanol (> 98% v/v) über eine vorbereitete Säule laufen, die mit getrocknetem Molekularsieb befüllt ist. Der getrocknete Ethanol wird in einem Glasgefäß auf welchem die Säule direkt aufgesetzt wurde und das mit einem Trockenrohr und einem Septum bestückt ist, aufgefangen. Der Ethanol wird unmittelbar vor der Messung mit einer Spritze durch das Septum entnommen.

Um Zeit zu sparen, soll die Trocknung des Ethanols zu Beginn des Versuches gestartet werden. Es ist dabei sehr sorgfältig zu arbeiten, um kein zusätzliches Wasser in die Probe einzuschleppen. Gleiches gilt für die Probenentnahme.

Man kann erwarten, dass der Wasseranteil im feuchten Ethanol bei ca. 5% liegt. Schätzen Sie mit Hilfe des FARADAYschen Gesetz ab, wie hoch das Volumen der Probenzugabe sein sollte, um eine Reaktionszeit von einigen Minuten zu bekommen.

Schalten Sie nun das Gerät ein und stellen Sie mit dem Potentiometer den Strom durch die Indikatorelektroden so, dass das Potential auf dem Papierschreiber ca. 300 mV beträgt. Die Papiervorschubgeschwindigkeit sollte ca. 1 cm/min sein (für eine schnelle Antwort, wenn die zugegebene Wassermenge gering ist, kann man auch größere Geschwindigkeiten einstellen). Notieren Sie sich sämtliche Schreibereinstellungen, die Sie für die Auswertung benötigen am besten direkt auf das Schreiberpapier. Protokollieren Sie auch alle eventuellen Änderungen dieser Einstellungen während des Versuchs.

Nach einer gewissen Zeit, wenn das ganze Wasser in der Zelle verbraucht ist, wird das Potential fallen (Abbildung 4). Von diesem Moment an ist die Zelle wasserfrei.

Abb. 4. Titrationsverlauf und Bestimmung der Titrationszeit einer Probe.

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-6

Nun gibt man 4.0 mg Wasser aus der Standardlösung ( =5 mg/mL) mit einer Spritze durch das Septum zu. Iod wird sofort verbraucht, das Potential an den Indikatorelektroden steigt. Wenn das Potential wieder fällt, ist alles Wasser verbraucht. Später ermittelt man die Zeit zwischen dem Moment, als die Zelle wasserfrei war, und dem Beginn der erneuten Potentialerniedrigung (Abbildung 4).

Jetzt erfolgt eine weitere Zugabe von 3.0 mg Wasser. Anschließend führt man die Messung mit genau 2.0, 1.0 und 0.5 mg Wasser durch.

Die Endpunkte der Titrationen bestimmt man durch Extrapolation des Potentialverlaufs (Abbildung 4). Der Anfang der Iodakkumulierung ist etwas früher als dieser Punkt, weil jedoch der Zeitablesefehler für alle Titrationen ähnlich ist, hat das keinen Einfluss auf die gemessene Dauer der Titrationen.

Sofort nach der Kalibrierung sollte man die Proben mit Ethanol messen. In diesem Fall macht man vier Zugaben von jeweils gleicher Menge an Probe (ungetrocknetes Ethanol) und registriert die Titrationszeit für jede Zugabe.

Analog erfolgen die Messungen mit dem über der Säule getrockneten Ethanol. Die Wassermenge nach der Trocknung kann um den Faktor 100 - 1000 geringer sein, deswegen soll man das Probenvolumen auf 1 mL bzw. 10 mL vergrößern, falls kein Wasser detektiert wird. Sollte auch bei der Zugabe von 10 mL kein Wasser detektiert werden, ermittelt man die Obergrenze für den Wassergehalt mittels Fehlerabschätzung. Vorsicht: Falls man irrtümlich eine zu große Menge Wasser in die Zelle einbringt, muss man

entweder warten bis das Wasser verbraucht wird, oder die Lösung in der Zelle austauschen. Beides ist sehr zeitaufwendig. Informieren Sie den Assistenten.

Das Karl-Fischer-Reagenz ist giftig.

5. Auswertung

Im Protokoll sind folgende Punkte zu bearbeiten, sowie die Fragen und Aufgaben aus Punkt 6 schriftlich zu bearbeiten:

Beschreiben Sie kurz das Prinzip der coulometrischen Karl-Fischer-Titration, den Aufbau des Gerätes und die Durchführung der Messungen.

Prüfen Sie an Hand des Strom-Widerstand-Diagramms, ob die Konstantstromquelle für die Generatorelektrode wirklich konstanten Strom liefert.

Erstellen sie ein Kalibrier-Diagramm, das die Wassermasse als Funktion der Titrierzeit wiedergibt. Die Ausgleichsgerade ist mit dem FARADAYschen Gesetz zu vergleichen. Wie hoch ist die Ausbeute der elektrochemischen Reaktion?

Stellen Sie die Messergebnisse für Ethanol in einer Tabelle dar und ermitteln Sie durch einen Q-Test Ausreißer-Werte (mit 90%-Ausreißerwahrscheinlichkeit; für die Verteilung der Messwerte ist eine GAUSSsche Normalverteilung anzunehmen1). Danach ist der Mittelwert und die Standardabweichung der Messwerte sowie die Standardabweichung der

1 Für vier Messungen und eine 90%-Ausreißerwahrscheinlichkeit ist der Q-Wert: 0.76.

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-7

Mittelwerte für Masse, Massenkonzentration und Volumenkonzentration des Wassers in der Probe für nicht getrocknetes und getrocknetes Ethanol zu berechnen.

6. Fragen und Aufgaben

1. Formulieren Sie drei Voraussetzungen für eine chemische Reaktion, die in einem Titrationsverfahren angewendet wird.

2. Ergänzen Sie in der Abbildung 4 den Konzentrationsverlauf von Wasser und Iod.

3. Wie könnte der Aufbau eines elektrochemischen Karl-Fischer Titrators mit optischer Detektion aussehen? Diskutieren Sie bitte Vor- und Nachteile.

4. Wegen des Verbrauchs an Iod an der Indikatorelektrode bekommt man einen systematischen Fehler. Schätzen Sie diesen Fehler ab und versuchen Sie die Gerade für das FARADAYsche Gesetz im Kalibrierdiagramm zu korrigieren.

5. Welche Substanzen können an Stelle von Pyridin in der Karl-Fischer-Lösung verwendet werden.

7. Literatur

[1] Methoden der Feuchtegehaltsbestimmung. Mettler-Toledo GmbH. Applikationsbroschüre. Internet: www.mt.com

[2] E. Scholz. Karl-Fischer-Titration. Methoden zur Wasserbestimmung. Springer-Verlag, Berlin, 1984.

[3] Eberius, E. Wasserbestimmung mit Karl-Fischer-Lösung, Verlag Chemie, Weinheim 1958 (Standardwerk, leider vergriffen).

[4] Wieland, G. Wasserbestimmung durch Karl-Fischer-Titration. Theorie und Praxis. GIT-Verlag, Darmstadt 1985.

8. Organisatorisches

Praktikumsraum: CH12.0.21

Termine: jeweils Mittwoch, 13:00 Uhr, nach Gruppenplan

Protokollabgabe: CH13.4.12 oder per e-Mail ([email protected])

Betreuung:

Praktische Durchführung: Frau Rosmarie Walter (CH13.4.25)

Theorie und Protokolle: Dr. Thomas Hirsch (CH13.4.12, Tel: 943-5712)

________________

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-8

Der Praktikumsversuch „Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer“ wurde ursprünglich von Prof. Dr. Vladimir Mirsky (HS Lausitz) konzipiert und von Dr. Thomas Hirsch überarbeitet.

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-9

9. Anhang

8.1 Methoden zur Wasserbestimmung

Zur Bestimmung des Wassergehaltes werden verschiedenste Messtechniken physikalischer und chemischer Art eingesetzt:[1]

Verfahren

Ver

fahr

enst

yp

Messprinzip

typi

sche

r M

essb

erei

ch

typi

sche

M

essg

enau

igke

it

sele

ktiv

für

W

asse

r

Trockenschrank TG Erwärmung durch Konvektion Massenbestimmung vor und nach Trocknung

0,5–100% 0,1–0,5% nein

Infrarottrocknung TG Erwärmung durch Absorption von IR-Strahlung Kontinuierliche Bestimmung der Masse während Trocknung

0,5–99% 0,1–0,5% nein

Halogentrocknung TG Erwärmung durch IR-Strahlung mit Halogenstrahler Kontinuierliche Bestimmung der Masse während Trocknung

0,5–99% 0,1–0,5% nein

Mikrowellentrocknung TG Erwärmung durch Absorption von Mikrowellen Massebestimmung vor und nach Trocknung

2–99% 0,1–0,5% nein

Destillation T Meist azeotrope Destillation mit unlöslichen Lösungsmitteln Meist volumetrische Erfassung des Wassergehaltes

3–70% 1% ja

Karl-Fischer-Titrationen

coulometrisch EC Elektrochemische Produktion von Iod, welches äquivalent mit dem Wasser umgesetzt wird Indikation durch Spannungsmessung bei konstantem Strom

ppm ja

volumetrisch C Titration von Wasser mit einer Iodlösung Indikation mittels Spannungsmessung bei konstantem Strom

1–100% 0,05–0,5% ja

Ca-Carbidverfahren C Volumen/Druckmessung von entstehendem Azetylen

1–100% 0,1–0,5% ja

Infrarotspektroskopie SP Messung der Absorption/Reflexion einer IR-Strahlung

1–80% 0,3–1% ja

Mikrowellenspektroskopie SP Messung der Absorption/Reflexion einer Mikrowellenstrahlung

2–70% 0,3–1% ja

NMR-Spektroskopie SP Messung der kernmagnetischen Resonanz (Spin) 0–15% 0,1% ja

Gaschromatographie CR Auftrennung in einer Chromatographiesäule 0,1–1% 0,01% ja

Detektion der Fraktionen mittels Wärmeleitfähigkeit

1–5% 0,1%

Konduktometrie EL Messung der Leitfähigkeit >3% 0,5–1% nein

Refraktometrie OP Messung des Brechungsindexes 0–50% 0,5–1% nein

Dichtemessung PH Messung der Dichte 2–98% 0,5–1% nein

TG = Thermogravimetrisch T = Thermisch EC = Elektrochemisch C = Chemisch SP = Spektroskopisch

CR = Chromatographisch

EL = Elektrisch OP = Optisch PH = Physikalisch

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Th. Hirsch Coulometrische Wasserbestimmung nach Karl Fischer 4-10

Stärken und Schwächen der einzelnen Methoden[1]:

Verfahren Stärken Schwächen

Trockenschrank Referenzverfahren Mehrere Proben sind gleichzeitig bestimmbar Einwaage großer Probenmengen möglich

Typische Bestimmungsdauer im Stundenbereich, Zersetzung der Probe ist möglich Substanzen, die nebst dem Wasser verdampfen Aufwendige Handhabung mit Fehlermöglichkeiten

Infrarottrocknung Typische Messdauer 5 .. 15 Min. Einwaage großer Probenmengen möglich Einfache Handhabung, Einfachheit der Methode Kompakte Probenlösung

Zersetzung der Probe ist möglich Substanzen, die nebst dem Wasser verdampfen

Halogentrocknung Schnell, typische Messdauer 2 .. 10 Min. Einwaage großer Probenmengen möglich Einfache Handhabung, Einfachheit der Methode Vielseitig einsetzbar, kompakte Problemlösung

Zersetzung der Probe ist möglich Substanzen, die nebst dem Wasser verdampfen

Mikrowellentrocknung Schnell, typische Bestimmungsdauer 2 .. 5 Min. Einwaage großer Probenmengen möglich

Zersetzung der Probe ist möglich. Für Stoffe mit geringer Feuchte problematisch. Mäßige Temperaturkontrolle

Destillation Kostengünstig Lösungsmittel oft notwendig (Ökologie), Mäßige Resultatgenauigkeit

Karl-Fischer- Titrationen:

coulometrisch Genaues Referenzverfahren. Für Spurenanalytik geeignet, Wasserdetektionen

Arbeitstechnik ist der jeweiligen Probe anzupassen

volumetrisch Genaues Referenzverfahren, Wasserdetektionen

Arbeitstechnik ist der jeweiligen Probe anzupassen

Ca-Carbidverfahren Kostengünstig Entstehung explosiongefährlicher Stoffe. Fachpersonal ist notwendig

Infrarotspektroskopie Kürzeste Messzeit, kontinuierliche Messungen

Substanzspezifische Kalibrierung notwendig

Auch für Mehrkomponentenanalyse (Proteine)

Nur zur Messung der Oberflächenfeuchte. Abhängigkeit von Materialbeschaffenheit. Abhängig von Temperatur, Körnung

Mikrowellenspektroskopie Kürzeste Messzeit. Kontinuierliche Messungen möglich.

Substanzspezifische Kalibrierung notwendig. Störeinflüsse sind Schüttdichte, Körnung

NMR-Spektroskopie Kurze Messzeit Eine Mehrkomponentenanalyse möglich Strukturbestimmung

Kalibrierung ist notwendig Hoher apparativer Aufwand, Fachpersonal, teuer Nur kleine Probenmengen messbar Nicht zur Feuchte gehörende Wasserstoffatome werden auch erfasst

Gaschromatographie Geeignet für Multikomponentenanalyse Fachpersonal ist notwendig, teuer

Konduktometrie Schnellmethode, mobiler Einsatz Substanzspezifische Kalibrierung ist notwendig

Refraktometrie Schnellmethode, geringer Aufwand, mobil Nur geeignet für überschaubare Substanzen

Dichtemessung Schnellmethode, geringer Aufwand, mobil Nur geeignet für überschaubare Substanzen

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Bestimmung von Chrom mittels Atomabsorptionsspektrometrie

Einführung

Chrom, Elementsymbol Cr, gehört zu den Übergangselementen und kommt in verschiedenenWertigkeitsstufen vor. Die biologisch aktive Form, und die am häufigsten natürlich vorkom-mende, ist das dreiwertige, nicht toxisch wirkende Chrom Cr(III). Chrom ist ein essentiellesSpurenelement und wird hauptsächlich über Urin ausgeschieden. Es wird eine tägliche Aufnah-me von 25 µg bis 35 µg empfohlen. Zur alimentären Versorgung eignen sich Käse, Innereien wiez.B. Leber, Brot, Eier und Blattgemüse.Cr(VI)-Verbindungen sind äußerst giftig. Sie sind mutagen und schädigen die DNS. Eine Ge-fährdung für den Menschen entsteht hauptsächlich beim Einatmen von chromhaltigen Stäuben.Wichtigstes Verwendungsgebiet von Chrom(VI)-Verbindungen war und ist die Galvanotechnik.Chromtrioxid-Lösungen dienen der Passivierung von Zink, Aluminium, Cadmium und Messing.Darüber hinaus wurde es zum Beizen und Ätzen von Metallen und in Holzschutzmitteln einge-setzt.Reines, nullwertiges Chrom ist ein silbrig glänzendes, hartes aber auch sprödes Metall und istinfolge seiner Unlöslichkeit unschädlich.

Bestimmung von Cr(III) mittels Atomabsorptionsspektrometrie

Für die Bestimmung von Cr(III) verwendet man die Acetylen/Lachgas-Flamme und die LinieCr 357,9 nm. Störende Interferenzen ergeben sich durch die Linien Fe 358,1 nm und Nb 358,0 nm.Eine Untergrundkorrektur ist nicht notwendig. Als Verdünnungslösung wird 1%ige (m/m)Salpetersäurelösung und als Ionisationspuffer 0,1%ige (m/m) Kaliumchloridlösung verwendet.Die Ermittlung der Konzentration des Chroms der Messlösung erfolgt mithilfe des Standard-Verfahrens und des Standard-Additons-Verfahrens.

Grundlagen der Atomabsorptionsspektrometrie (AAS)

AbsorptionDurch Energiezufuhr in Form von Strahlung können freie Atome in Zustände höherer Energieüberführt werden. Die Elektronen der äußeren Schale werden dabei auf höhere Energieniveausgehoben, das Atom befindet sich in einem angeregten Zustand. Von einem Atom im Grundzu-stand können nur ganz bestimmte Energiebeträge aufgenommen werden.

Quantitative Analyse in der AASGrundlage für die quantitative Auswertung in der Absorptionsspektrometrie bildet das Lambert-Beer´sche-Gesetz. Es besagt, dass die Extinktion E der durchstrahlten Schichtdicke d und derKonzentration c des absorbierenden Stoffes proportional ist. Der molare Extinktionskoeffizi-ent ε ist spezifisch für das jeweilige Element und bei konstanten äußeren Bedingungen eine

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konzentrationsunabhängige Stoffkonstante.

E = logI0

I= ε · c · d (1)

wobeiI0 = Strahlungsintensität vor AbsorptionI = Strahlungsintensität nach Absorptionε = molarer Extinktionskoeffizientc = molare Konzentrationd = durchstrahlte SchicktdickeDas Gesetzt gilt strenggenommen nur für monochromatische Strahlung und für ideal verdünnteLösungen. In nicht idealen Lösungen ist ε nicht mehr konzentrationsunabhängig.Überträgt man diese allgemein gültige Formel auf die AAS, erhält man folgenden Zusammen-hang:

E = logI0

I= k ·N0 · l (2)

wobeik = AbsorptionskoeffizientN0 = Anzahl der Atome im Absorptionsvolumenl = durchstrahlte SchichtdickeWerden in den Atomdampf der Probe Emissionslinien des gleichen Elements eingestrahlt, soerfolgt eine Resonanzabsorption. Diese hat eine Schwächung der eingestrahlten Energie zurFolge, die als Extinktion gemessen wird und proportional zur Konzentration des Analytenist. Die zur Resonanzabsorption benötigten freien Atome werden auf thermischen Weg in derFlamme erzeugt. Dabei stellt sich ein Gleichgewicht zwischen der Anzahl der angeregten AtomeN und der Atome im Grundzustand N0 ein. Bei den in der AAS verwendeten Temperaturenvon weniger als 3000 K ist dieses Gleichgewicht in erster Näherung vollständig auf der Seiteder Atome im Grundzustand.

NachweisgrenzeDie Beurteilung von Messwerten bei sehr niedrigen Gehalten des Analyten ist problematisch,da die Präzision der Messwerte gering ist. Für verschiedene Anwendungen sind unterschiedlicheBerechnungsgrundlagen normativ gegeben. So ist die Nachweisgrenze gemäß

- IUPAC die Konzentration des Analyten, die ein Signal entsprechend 3 mal dem Grund-rauschen (3σ-Kriterium) der Leerwertprobe (Blindwert) ergibt.

- DIN 32645 jener Gehalt an Analyt in einer Probe, der in der Messung den kritischen Wertder Messgröße, hier die kritische Extinktion Ek gerade überschritten hat.

ErfassungsgrenzeDie Erfassungsgrenze ist der kleinste Gehalt eines Analyten in einer Probe, bei dem mit einervorgegebenen Sicherheit P, meist P = 95%, ein Nachweis möglich ist. Die Berechnung erfolgtaus dem 95%-Prognosebereich der Kalibriergeraden.

BestimmungsgrenzeDie Bestimmungsgrenze ist die kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einerbestimmten Präzision bestimmt werden kann. Im Bereich zwischen der Nachweisgrenze und derBestimmungsgrenze ist der Nachweis zwar positiv, aber eine quantitative Angabe unzulässig.Die Bestimmungsgrenze entspricht grob dem Dreifachen der Nachweisgrenze.

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Komponenten eines AA-SpektrometersDen grundlegenden Aufbau skizziert folgende Abbildung: Als Strahlungsquelle dient eine Hohl-

kathodenlampe (HKL). In der Flamme werden Atome im Grundzustand erzeugt und die abge-schwächte Strahlung der HKL wird in einen Monochromator geleitet. Der Detektor registriertdann die Abschwächung der Analysenlinie und über einen Verstärker werden die Signale aneine Anzeigevorrichtung (PC) geleitet.

Hohlkathodenlampen (HKL)Sie bestehen aus einem Glaszylinder, in dem die Kathode und die Anode unter Neon oder Argoneingeschmolzen sind. Die Kathode besitzt die Form eines Hohlzylinders und besteht aus demzu bestimmenden Element oder ist mit diesem gefüllt. Legt man eine Spannung von einigenhundert Volt an, wird zwischen den Elektroden eine Glimmentladung gezündet und es entstehtein Strom positiver Gasionen (Neon oder Argon), der aus der Kathode Atome herausschlägtund zur Emission anregt. Die Lampe sendet also die charakteristische Strahlung des Elementsaus.

Atomisierung in der FlammeDie Probe wird in eine flüssige Form überführt und über einen Zerstäuber angesaugt, der sie infeinste Tröpfchen zerstäubt. Dieses Aerosol wird gegen die sogenannte Prallkugel geschleudert,wodurch es in noch kleinere Tröpfchen umgewandelt wird. In der sogenannten Mischkammerwird dem Aerosol Brenngas und Oxidans zugeführt, dieses Gemisch wird nun über dem Bren-nerkopf gezündet. In der Flamme verdunstet dann das Lösungsmittel und die entstehendenSalzpartikel schmelzen, verdampfen und dissoziieren zu Metallatomen.

Gase in der Flammen-AASNachstehende Tabelle fasst die gebräuchlichsten Flammenarten und deren Eigenschaften zu-sammen:

Tabelle 1: Gase in der Flammen-AAS

Oxidans Brenngas Temperatur in ˚C BemerkungenLuft Propan 1930 für leicht ionosierbare ElementeLuft Acetylen 2300 gebräuchlichste Flamme

Lachgas Acetylen 2750 für schwer ionisierbare Elemente

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Interferenzen in der Flammen-AASUnter Interferenzen versteht man die Beeinflussung des Messergebnisses durch Bestandteileder Matrix. Da die AAS eine Relativmethode ist, können Interferenzen durch unterschiedlichesVerhalten von Proben- und Bezugslösungen verursacht werden. Die Störungen werden eingeteiltin spektrale und nichtspektrale Interferenzen. Bei spektralen Interferenzen täuscht die Matrixeine zu hohe Absorption vor, bei nichtspektralen Interferenzen täuscht sie eine zu niedrigeAbsorption vor.

- Spektrale InterferenzenDie häufigste spektrale Störung ist die Untergrundabsorption. Die Ursachen liegen in derStreuung der Partikel in der Flamme oder durch Molekülabsorption durch schwer dis-soziierbare Oxide oder Hydroxide. Weitere spektrale Störungen können durch direktesÜberlappen der Analysenlinie des Analyten mit einer Absorptionslinie eines Begleitele-ments in der Matrix auftreten.

- Nichtspektrale InterferenzenSie werden im Allgemeinen unterteilt in Transport-, Verteilungs-, Verdampfungs-, Dis-soziations- und Ionisationsinterferenzen. Transportinterferenzen umfassen alle Vorgängevom Ansaugen der Messlösung über deren Zerstäubung hin zum Transport des Aerosols indie Flamme. Diese Störungen entstehen durch unterschiedliche physikalische Eigenschaf-ten (Viskosität, Oberflächenspannung) von Proben- und Kalibrierlösungen. Verteilungsin-terferenzen treten auf, wenn die Verteilung des Analyten in der Flamme in Anwesenheitvon Begleitsubstanzen (Matrix) anders ist als in deren Abwesenheit. Störungen in derräumlichen Verteilung des Analyten findet man in der heißeren Acetylen/Lachgas-Flammehäufiger, da diese eine größere laterale Ausdehnung besitzt als die Acetylen/Luft-Flamme.Verdampfungs- und Dissoziationsinterferenzen haben die gleiche Ursache. Sie werden her-vorgerufen durch die Bildung von Verbindungen des Analyten mit Begleitsubstanzen inder Probe in der kondensierten Phase, die langsamer in gasförmige Moleküle überführtwerden können als der Analyt in der Bezugslösung. Ionisationsinterferenzen treten spezi-ell bei der Verwendung der Acetylen/Lachgas-Flamme auf. Hier ist die Konzentration anIonen und Radikalen aus den Flammengasen hoch genug, um speziell Alkali-, Erdalkali-und Seltenerdmetalle durch Ladungsübertragung zu ionisieren. Die teilweise Ionisationeines Analyten an sich kann nicht als Interferenz bezeichnet werden, solange sie in glei-chem Ausmaß den Analyt in der Probe und der Bezugslösung betrifft. Dennoch ist eswünschenswert, die Ionisation des Analyten zu verhindern, da sie grundsätzlich die Emp-findlichkeit erniedrigt. Ionisation und Ionisationsinterferenzen lassen sich durch Zugabeeines leicht ionisierbaren Elementes in großem Überschuß zu Proben- und Bezugslösungbeseitigen. Hierfür eignen sich am besten Alkalielemete wie Kalium oder Cäsium, die einsehr kleines Ionisationspotential besitzen. In der Flamme wird durch diese Elemente dasIonisationsgleichgewicht so beeinflusst, dass die Ionisation des Analyten zurückgedrängtwird. Mit Barium als Beispiel soll dies verdeutlicht werden:Wird Barium mithilfe der Acetylen/Lachgas-Flamme gemessen, beträgt dessen Ionisati-onsgrad bis zu 88%:

Ba ↽−−−⇀ Ba+ + e−

Durch Zusatz von 0,1% Kalium als KCl verschiebt sich das Gleichgewicht bei Barium indie gewünschte Richtung:

K ↽−−−⇀ K+ + e−

Ba+ + e− ↽−−−⇀ Ba

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Benötigte Reagenzien und Lösungen

Mithilfe der Chromstandardlösung (c = (249,5 ± 6,5) mg/L) sollen insgesamt 7 Kalibrierlö-sungen (Kal1 - Kal7) und 4 Spikelösungen (Spike1 - Spike4) zu je 50 mL hergestellt werden.Die Berechnung der zu pipettierenden Volumina sollte vor Praktikumsbeginn erfolgen. BeimStandard-Additions-Verfahren wird die Messlösung in 5 gleiche Volumenanteile zu je 25 mLgeteilt. Zu 4 dieser Volumenanteile wird zusätzlich der Analyt durch Zugabe von Chromstan-dardlösung eingebracht (Spike1 - Spike4). Daher das + im Pipettierschema. Zur vereinfachtenBerechnung gehen Sie bitte von einer Konzentration der Chromstandardlösung von 250 mg/Laus und berechnen Sie das erforderliche zu pipettierende Volumen der Chromstandardlösungund des Ionisationspuffers (c = 0,05 g/mL), wenn die Kalibrierlösungen folgende Konzentratio-nen besitzen sollen und der Ionisationspuffer eine Massenkonzentration von 0,1 % in der Lösungbesitzen sollte:

Tabelle 2: Pipettierschema zur Herstellung der Kalibrier- und Spikelösungen

Kal1 Kal2 Kal3 Kal4 Kal5 Kal6 Kal7 Spike1 Spike2 Spike3 Spike4cSoll

in mg/L 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 + 1 + 1,5 + 2 + 2,5

VCr-Standard

in µLVIopuffer

in mLVMesslösung

in mL - - - - - - - 25 25 25 25

Berechnen Sie mithilfe der berechneten Volumina die tatsächliche Konzentration der einzelnenKalibrier- und Spikelösungen auf 4 signifikante Stellen genau.

Bereitgestellte Geräte und Lösungen

12 Messkolben (50 mL)Eppendorfpipetten25 mL Vollpipette1%ige (m/m) HNO3

Ionisationspuffer (0,05 g KCl/1 mL Lösung)Chromstandardlösung, c = (249,5 ± 6,5) mg/LMesslösung mit unbekannter Chromkonzentration

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Durchführung

- Die Durchführung des Versuchs findet im Raum 32.01.11 statt. Dieser Raum befindetsich in einem Strahlenschutzbereich (Kontrollbereich). Aus diesem Grund ist eine Strah-lenschutzbelehrung unbedingt erforderlich. Sollten Sie aus irgendeinem Grund an diesernicht teilgenommen haben, informieren Sie bitte Ihren Assistenten rechtzeitig!Treffpunkt ist der Raum 32.01.44 (im Keller neben der Massenspektrometrie). BitteSchutzkleidung (Kittel und Schutzbrille) mitbringen!

- Alle Voreinstellungen des Geräts, wie z.B. Einstellung der PMT-Spannung, Lampenjus-tierung, Integrationsparameter, Zerstäuberjustierung, Spaltbreite und Flammenoptimie-rung, wurden bereits vom Assistenten durchgeführt und sind in der Methode gespeichert.

- Nach einer kurzen Vorbesprechung und Einweisung ins Gerät wird die Flamme gezün-det (Spüllösung ist 1% (m/m) HNO3) und der Energie-Scan der Hohlkathodenlampebeobachtet. Sobald dieser konstant ist, kann mit den Messungen begonnen werden. DieZündung der Flamme erfolgt zunächst mit Acetylen/Luft, dann kann manuell auf dieAcetylen/Lachgas-Flamme umgeschaltet werden.! Aufgrund der Aussendung von UV-Strahlung der Acetylen/Lachgas-Flamme ist dasTragen einer Schutzbrille unbedingt erforderlich!Die Acetylen/Lachgas-Flamme ist so heiß, dass sich Graphit auf dem Brennerschlitz vonZeit zu Zeit absetzt. Das Graphit muß dann manuell entfernt werden.Bei brennender Flamme wird die Edelstahlesse über dem Gerät heiß, bei Berührung be-steht Verbrennungsgefahr!

- Zuerst werden die 7 Kalibrierlösungen (2 Leerzyklen und 5 Messzyklen) gemessen und dieKalibriergerade bewertet. Im Anschluß wird die Messlösung (2 Leerzyklen und 5 Messzy-klen) mit unbekannter Chromkonzentration gemessen.

- Im zweiten Teil wird die Konzentration der Messlösung mithilfe des Standard-Additions-Verfahrens bestimmt (2 Leerzyklen und 5 Messzyklen).

- Nach Beendigung aller Messungen wird der Probenschlauch in die Spüllösung gehaltenund ca. 10 min lang gespült, davon ca. 5 min mit der Acetylen/Lachgas-Flamme undca. 5 min mit der Acetylen/Luft-Flamme. Dies verhindert eine Auskristallisation im Pro-benschlauch bzw. auf dem Probenweg. Anschließend löscht man die Flamme, schaltet dasGerät ab und unterbricht die Gaszufuhr. Die Kalibrier- und Spikelösungen werden in dembereitgestellten Kanister entsorgt.

- Am Ende des Versuchstags erhalten Sie einen Ausdruck über alle Messungen. Es empfiehltsich, einen USB-Stick mit ins Praktikum zu bringen.

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Auswertung und Protokollführung

- Jede Praktikumsgruppe hat ein Protokoll innerhalb einer Woche abzugeben. Auch dieRohdaten (Ausdruck) müssen dem Protokoll beigefügt sein. Bitte vergessen Sie nicht,Ihre Namen und Gruppennummer auf das Protokoll zu schreiben, sinnvoll zu runden undauf die Angabe der Einheiten und Achsenbeschriftungen zu achten.

- Beantworten Sie einleitend in Ihrem Protokoll folgende Fragen:

1. Warum ist in nicht idealen Lösungen der molare Extinktionskoeffizient ε nicht mehrkonzentrationsunabhängig?

2. Was wird bei der AAS gemessen?

3. Warum erniedrigt eine Ionisation des Analyten die Empfindlichkeit?

4. In welcher Form muss der Analyt in der AAS letztendlich vorliegen?

5. Chrom lässt sich prinzipiell leicht ionisieren (daher wird mit einem Ionisationspuffergearbeitet). Aus diesem Grund würde eigentlich die Verwendung der Acetylen/Luft-Flamme ausreichen. Warum wird dennoch die Acetylen/Lachgas-Flamme verwen-det?

6. Was sind die Vorteile des Standard-Additons-Verfahrens? Welche Interferenzen las-sen sich dadurch ausschalten?

7. Wie werden nichtspektrale Interferenzen oft auch bezeichnet, und täuschen sie einezu hohe oder zu geringe Konzentration vor?

8. Was ist der Grund für die beiden Leerzyklen am Anfang jeder neuen Messung?

- Beschreiben Sie knapp die Durchführung des Versuchs. Bitte erstellen Sie eine Tabellemit den tatsächlichen Konzentrationen der Kalibrier- und Spikelösungen.

- Stellen Sie die Messwerte E für jede der 7 Kalibrierlösungen (inklusive Leerwert) nocheinmal zusammen (alle Einzelwerte der 5 Messzyklen, Bildung der arithmetischen Mit-telwerte und Ermittlung der Standardabweichung, graphische Darstellung der Extinktiongegen die Konzentration) und bestimmen Sie durch lineare Regression die Empfindlichkeitder Bestimmung, die Reststandardabweichung, die Verfahrensstandardabweichung sowiedie Nachweisgrenze. Bitte verwenden Sie die im folgenden Abschnitt „Auswertung derKalibrierdaten“ verwendeten Formeln.

- Vergleichen Sie das Messergebnis des Standard-Additons-Verfahrens nach Verdünnungs-korrektur mit dem des Standard-Verfahrens.

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Auswertung der Kalibrierdaten

Die Kalibrierung hat zum Ziel, aus gemessenen oder bekannten Daten ein gültiges mathemati-sches Modell für die Abhängigkeit der Größen y (hier Extinktionswerte) von x (Analytkonzen-trationen) der Kalibrierlösungen zu entwickeln. Es soll, falls möglich, ein linearer Zusammen-hang (lineare Regression) gewählt werden (gerades Kalibriersystem):

y = m · x + b (3)

Es bedeuten:y = abhängige Größe, Messwert (hier Extinktion)x = unabhängige Größe, Konzentrationm = Steigungb = Ordinatenabschnitt (kalibrierter Blindwert)

Sind die beiden Parameter m und b der Geradengleichung bekannt, kann von jedem Signalwertdie dazugehörige Konzentration (xi) berechnet werden:

xi =yi − b

m(4)

Dabei sind yi die aus den 5 Messzyklen berechneten Mittelwerte der Extinktion.Ziel der linearen Regression ist es, aus den vorliegenden x,y-Wertepaaren die beiden Parameterm und b zu berechnen.

m =Σ(xi · yi)− [Σyi · Σxi] ·N−1

Σx2i −

[(Σxi)

2 ·N−1] (5)

N ist die Anzahl der Kalibrierlösungen (hier N = 7).Der Wert im Zähler wird zusammengefasst als Qxy-Wert:

Qxy = Σ(xi · yi)−[Σyi · Σxi

N

](6)

Den Wert im Nenner nennt man Qxx-Wert:

Qxx = Σx2i −

(Σxi)2

N(7)

m =Qxy

Qxx

(8)

Der Ordinatenabschnitt b berechnet sich mit:

b = yM −m · xM (9)

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Schupfner/Schmied Versuch 5 Seite 9 von 11

Die Mittelwerte yM und xM sind die Arbeitsbereichsmitten in Signal- und Konzentrationsrich-tung.

xM =Σxi

N(10)

yM =Σyi

N(11)

Der Parameter m ist ein Maß für die Empfindlichkeit E des Verfahrens. Der Parameter b,der Ordinatenabschnitt bei der Konzentration c = 0, wird häufig als „kalibrierter BlindwertyB“ bezeichnet.

Die Präzision der linearen Regression: Reststandardabweichung sy

s2y =

Σ [yi − (m · xi + b)]2

N − 2(12)

mityi = Signalwertxi = Konzentrationswertm = Steigung der Ausgleichsgeradenb = OrdinatenabschnittN = Anzahl der Messwerte

Die Reststandardabweichung sy kann als Maß für die Anpassungspräzision der Ausgleichsgera-den an die Messwertepaare aufgefasst werden.

Die Reststandardabweichung sy und die Empfindlichkeit E (Steigung der Geraden m) werdenzusammengefasst zu einem gütebestimmenden Kennwert , der Verfahrensstandardab-weichung sx0:

sx0 =sy

m(13)

Bei gleicher Reststandardabweichung sy liefert das Verfahren die bessere Güte (die geringereVerfahrensstandardabweichung sx0), dessen Empfindlichkeit E höher ist.

Eine weitere abgeleitete statistische Kenngröße bei Kalibrierungsbewertungen ist die relativeVerfahrensstandardabweichung Vx0:

Vx0 =Sx0 · 100%

xM

(14)

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Schupfner/Schmied Versuch 5 Seite 10 von 11

Probenauswertung und Prognoseintervall

Die „wahre“ (jedoch unbekannte) Gerade liegt zwischen zwei Hyperbelästen:

yu,o = (m · x + b)± sy · t ·

[1

N+

1

N+

(x− xM)2

Qxx

]1/2

(15)

wobeiŇ = Anzahl der Einzelwerte pro Messwert, entspricht der Anzahl der Messzyklen (hier: Ň = 5)

yu und y0 sind für x = 0 gleichzeitig der obere bzw. der untere Grenzwert des Ordinatenab-schnitts b (Blindwerts). Die Hyperbeläste werden „Prognosebänder“ bzw. „Vertrauensbänder“genannt.

VB = x0 - x´ = x´ - xu nennt man Prognoseintervall

Der tatsächliche unbekannte Analysenwert befindet sich mit der gewählten Sicherheit vonP = 95% im Intervall x´ ± VB.

Berechnung der Größen xu und x0:

xu,0 =y − b

m± sy · t

[1

N+

1

N+

(y − yM)2

m2 ·Qxx

]1/2

(16)

wobeiyM = Arbeitsbereichsmitte von y (Signalstärke)y = Signalwert

Ermittlung der Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmunggrenze (nach DIN 32645)

Nachweisgrenze xNG:Zur Bestimmung der Nachweisgrenze xNG werden Ň Parallelmessungen an N unabhängig her-gestellten Blindproben durchgeführt. Aus allen Werten wird der Mittelwert yM,B und die Stan-dardabweichung sy berechnet. yk ist die Summe aus dem Blindwert und der Breite des einsei-tigen Prognoseintervalls.

yk = yM,B + sy · t ·[

1

N+

1

N

]1/2

(17)

dabei bedeutet:yk = kritischer Wert der MessgrößeyM,B = Mittelwert der Blindwertmessungensy = Standardabweichung der N BlindwertmessungenN = Anzahl der BlindwerteŇ = Anzahl der Parallelmessungent = t-Wert (Tabelle mit einseitiger Fragestellung, f = N-1, P = 95%)

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Schupfner/Schmied Versuch 5 Seite 11 von 11

- Einsetzen des kritischen Wertes der Messgröße yk in die Kalibrierfunktion y = m . x + b

- Ersetzen des Ordinatenabschnitts b durch den Mittelwert der Blindwertmessung yM,B indie Kalibrierfunktion

xNG =sy

m· t ·

[1

N+

1

N

]1/2

(18)

Erfassungsgrenze xEG:

xEG = 2 · xNG = 2 · sy

m· t ·

[1

N+

1

N

]1/2

(19)

Bestimmungsgrenze xBG:Die Bestimmungsgrenze xBG ist bei einer statistischen Sicherheit von P = 95% etwa die sechs-fache Standardabweichung sx (in x-Richtung) des Streubereichs der Blindproben.

xBG ≈ 3 · xNG (20)

Quelle und Literatur

Durch freundliche Genehmigung der Analytik Jena AG wurde vorliegenes Praktikumsskriptmithilfe des Skriptes „Grundlagen, Instrumentation und Techniken der Atomabsorptionsspek-trometrie“ zusammengestellt. Für weiteres Hintergrundwissen empfiehlt sich das LehrbuchAtomabsorptionsspektrometrie von Bernhard Welz und Michael Sperling, 1997, 4. vollständigüberarbeitete Auflage, Wiley-VHC.

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R. Schupfner Versuch 6 1 von 14

Kernspektroskopie: Teil 1: Bestimmung von -Strahlern in Umweltproben Einleitung Die -Spektrometrie mit hochauflösenden Reinstgermaniumdetektoren (abgekürzt: HPGe) ist die Methode mit der größten Anwendungsbreite. Es lassen sich in praktisch allen Probenarten viele künstliche und natürliche Radionuklide eindeutig identifizieren und die Aktivitäten dieser Radionuklide bestimmen. Aufgrund der Durchdringungsfähigkeit von -Strahlung in Materie kann eine aufwendige radiochemische Abtrennung und Probenaufarbeitung einzelner Radionuklide in der Regel entfallen. Der Anwendungsbereich dieser Methode umfasst bildge-bende diagnostische Verfahren und Funktionsuntersuchungen von Organen ebenso, wie Bestimmungen der Aktivität in Trinkwasser, Nahrungsmittel, Baustoffen und Boden, z. B. zum Zweck der Emissions- und Immissionskontrolle kerntechnischer Anlagen. Grundlagen Der Versuch „-Spektrometrie“ setzt voraus, dass Grundbegriffe bekannt sind. - Aktivität (Zeitgesetz der Radioaktivität, Einheiten, Bedeutung) - Natürliche und künstliche Radionuklide - -Strahlung (Wechselwirkung mit Materie, Zerfallsenergien, Emissionswahrscheinlichkeit) - Prinzip der -Spektrometrie mit HPGe-Detektoren - Spektrum - Radioanalytische Grundgleichung Aufgabenstellung Dieser Versuch vermittelt einen Einblick in die hochauflösende -Spektrometrie. Die Möglichkeiten zur Identifikation und Bestimmung der Aktivität von natürlichen und künstlichen Radionukliden in Umweltproben ohne aufwendige Probenaufarbeitung soll gezeigt werden. Aufgabe ist es, in einer Boden- bzw. einer Nahrungsmittelprobe (Paranüsse) die wichtigsten künstlichen und natürlichen Radionuklide zu identifizieren und die spezifischen Aktivitäten einiger Radionuklide wie 40K, 137Cs, 228Ra, 226Ra und 228Th zu bestimmen. Dabei gehört die richtige Zuordnung der -Linien zu den Radionukliden ebenso zur Aufgabenstellung, wie die Diskussion der Möglichkeiten und Grenzen der Anwendbarkeit der -Spektrometrie. Fragen und Aufgaben zur Vorbereitung

- Skizzieren und erläutern Sie das -Spektrum von 40K. - Physikalischer Wirkungsgrad phys - Leiten Sie die Formel für die Ermittlung von phys her. Von welchen Einflußfaktoren

ist phys abhängig. - Erläutern Sie das Prinzip der -Spektrometrie mit HPGe-Detektoren - Leiten Sie die Formel zur Berechnung der Aktivität Ai her. - Wie ist „spezifische Aktivität“ definiert?

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R. Schupfner Versuch 6 2 von 14

Hinweise zur Dokumentation (Protokoll) Die Voraussetzungen für die Vergabe des Testats sind:

- Rechtzeitige und vollständige Anwesenheit - Nachweis der ausreichenden Vorbereitung des Versuchs - Einhaltung der Auflagen im Strahlenschutz - Richtige und vollständige Darstellung der durchgeführten Versuchsteile, der

Ergebnisse, Auswertungen, Rohdaten, Formeln, inklusive der Zwischenergebnisse. - Nachweis der Urheberschaft (Datum, Unterschrift und Protokollbuch).

Bitte beachten Sie:

- Je zwei Studierende bilden eine Arbeitsgruppe. Je Arbeitsgruppe ist ein Protokoll zu erstellen. Es muss eindeutig hervorgehen, welcher Teilnehmer/in welche Ergebnisse erzielt hat.

- Der Wert für die spezifische Aktivität der folgenden Radionuklide ist zu ermitteln: a) im Boden Cs-137, Ra-228, Ra-226 und K-40 b) in den Paranüssen Ra-226, Ra-228 bzw. Th-228

Zeitplan Der Versuch ist an einem Nachmittag durchzuführen. Die Auswertung der Ergebnisse kann teilweise zu Hause erfolgen. Die Abgabe des Protokolls erfolgt spätestens eine Woche nach Durchführung des Versuchs. Arbeitsprogramm Funktionstüchtigkeitsprüfung Es wird ein 40K Kalibrierpräparat gemessen und das -Spektrum auf folgende Parameter hin untersucht:

- Halbwertsbreite (FWHM) und Linienform (Energieauflösung des Detektors) - Test der Photopeakausbeute durch Bildung der Verhältnisse aus Photopeak-Maximum

(P) zu Minimum des Comptonkontinuum (C) bei der -Linie, z. B. 40K (1460,83 keV). - Bewertung der Energiekalibrierung

Bewerten Sie, ob die aktuelle Energiekalibrierung eine einwandfreie hochauflösende Spektrometrie ermöglicht. Als Ergebnis soll die näherungsweise Energiezuordnung dokumentiert werden. Der Istwert der jeweiligen Energiezuordnung durch das Auswertungsprogramm soll vom Sollwert nur um höchstens 0,3 keV abweichen. Verwenden Sie dazu die -Linie des K-40. Bestimmung des physikalischen Wirkungsgrads als Funktion der Energie phys.(E) Achtung: Kalibrierlösung immer waagrecht halten. Vorsichtig und unter Beachtung des Kontaminationsschutzes handhaben. Schutzhandschuhe verwenden. Die Kalibrierlösung enthält das Radionuklid 152Eu in bekannter Aktivität homogen in saurer Lösung zusammen mit dem stabilen Eu. Sie wird in der für die Messprobe günstigsten Geometrie (1 L Ringschale) gemessen (Messzeit: 1000 s). Die zertifizierte Aktivität ist im Beiblatt aufgelistet. Die Zerfallsdaten sind in Tabelle 1 aufgelistet:

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R. Schupfner Versuch 6 3 von 14

Tabelle 1: Zerfallsdaten (Auswahl) des 152Eu Halbwertszeit: 13,51(3) y. Quelle: K. Debertin und R.G.Helmer, Gamma- And X-Ray Spectrometry with Semiconductor Detectors, Elsevier Science Publication B.V., New York, 1988).

Ei [keV] Emissionswahrscheinlichkeit Yi [(Bqs)-1]

121,7824(4) 0,2840(15) 244,6989(10) 0,0754(5) 344,2811(19) 0,2652(18) 411,126(3) 0,02246(16) 443,965(4) 0,0310(2) 778,920(4) 0,1294(7) 867,390(6) 0,0423(3)

964,055(4) 0,1460(8) 1085,842(4) 0,1009(4) 1089,767(14) 0,0137(8) 1112,087(6) 0,1356(6) 1212,970(13) 0,01423(10) 1299,152(9) 0,01630(10) 1408,022(4) 0,2080(12) Sowie viele andere -Übergänge

Der physikalische Wirkungsgrad phys ist in Abhängigkeit von der -Energie zu bestimmen. Für den Energiebereich von ca. 200 bis ca. 1400 keV ist eine Funktion zu finden, die die experimentellen Werte gut interpoliert. Die folgenden Auswertungen durchzuführen:

- Festlegung der Auswertungsbereiche für geeignete -Linien der Energien Ei - Berechnung der Nettozählraten R(Ei) für die -Linien i - Berechnung des physikalischen Wirkungsgrads phys(Ei). - Graphische Darstellung des physikalischen Wirkungsgrads phys(Ei) - Ermittlung der Parameter für eine möglichst einfache mathematische Darstellung im

Energiebereich 200 keV < Ei < 2000 keV, unter Verwendung der Fit-Funktion: (Ei) = (E0)(Ei/E0)

-mit E0 = 344,28 keV Zu ermitteln sind die Parameter phys (E0) und . Die hier erstellte Kurve ermöglicht die Auswertung der Probenmessung. Die Dokumentation ist in Tabellenform (siehe folgende Tabelle 2) und graphisch durchzuführen.

Tabelle 2: Physikalischer Wirkungsgrad gegen die -Energie. Energie Impulse Zählraten / cps Aktivität Ei/ keV NAK/counts R´K R0 RK=R´K -R0 A(tm)/Bq Y(Ei)

/(Bqs)-1 (Ei)/

cps/Bq Hinweise: Bitte vernünftig runden! Falls erforderlich, Nulleffekt beachten!

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R. Schupfner Versuch 6 4 von 14

Vorbereitung der Proben Die Proben werden in eine 1 L Ringschale überführt. Die Bestimmungen der spezifischen Aktivitäten erfolgen an einer Bodenprobe und an einer Lebensmittelprobe. Es sind die folgenden Probenparameter zu dokumentieren: Probenvolumen., Probenmasse in kg einschließlich Bestimmungsunsicherheit. Nulleffektszählrate Da die zu bestimmenden Proben auch natürliche Strahler enthalten, ist bei der Auswertung die Nulleffektszählrate zu berücksichtigen. Als Nulleffektsprobe wurde 1 L entmineralisiertes Wasser in 1 L Ringschale verwendet. Die Messzeit betrug mindestens 60000 s. Aus den gespeicherten Spektren werden die Nettozählraten des Nulleffektsspektrums bestimmt. Vorbereitung zur Messung Die Proben sind in die Messkammer des -Spektrometers auf den HPGe-Detektor zu geben. Dabei ist durch Sichtprüfung darauf zu achten, dass

- sich kein Probenmaterial sich an der Aussenseite der Messgefäße befindet, - die Messgefäße dicht verschlossen sind, - die Messkammer stets vor Kontamination geschützt ist (Papiertuch). - Die Pb-Abschirmung wird vollständig geschlossen. - In die Parameterzeile der Auswertungssoftware werden die wichtigsten - Detektortyp, Messgeometrie, Masse, Datum und Namenskürzel eingetragen.

Durchführung der -Spektrometrie Die Messung wird gestartet (Messzeit: 30 Minuten). Es ist darauf zu achten, dass die Totzeit im Rahmen der Auswertbarkeit ist (< 20 %), die Uhrzeit und Datumsangabe in Ordnung ist, die -Linien symmetrisch, schmal und nicht verzerrt sind. Die Messung wird gespeichert. Identifizierung von natürlichen und künstlichen Radionukliden in Umweltproben Die Energien der -Linien sind zu bestimmen, zu dokumentieren und den auszuwertenden Radionukliden zuzuordnen. In den folgenden Abschnitten sind die zu beachtenden Radionuklide aufgelistet. Die Werte der gemessenen Energien sollten von den Sollwerten um nicht mehr als 0,3 keV abweichen. Es sind die -Linien den folgenden Radionukliden zuzuordnen (siehe Tabelle 3): K-40, Cs-137, Ra-226 (Pb-214, Bi-214), Ra-228 (Ac-228), Th-228 (Tl-208) Tabelle 3: Parameter zur Auswertung: -Energien Ei und Emissionswahrscheinlichkeiten yi. Radionuklid Ei/keV yi

/(Bq·s)-1 Radionuklid Ei/keV yi

/(Bq·s)-1 Ra-226, U-235 186,2 0,0351 Ra-226(Bi-214) 609,3 0,4460

Ra-228(Ac-228) 338,4 0,1126 Ra-228 (Ac-228) 911,2 0,2660

Ra-226(Pb-214) 351,9 0,3510 Th-228(Tl-208) 583,2 0,3058

Cs-137(Ba-137m) 661,7 0,851 K-40 1460,8 0,1067

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R. Schupfner Versuch 6 5 von 14

Aktivitätsbestimmung Es sollen für die in obiger Tabelle 3 genannten Radionuklide die spezifischen Aktivitäten aus den geeigneten -Linien bestimmt werden. Dazu sind folgende Auswertungsschritte zweckmäßig.

Tabelle 4: Auswertung Rohdaten Zählraten / cps Aktivität Nuk-

lid

E/keV (ROI)

y(i) /Bq·s-1

phys(Ei) /cps·Bq-1

NA±AN/counts

Brutto R´

NE*) R0

Netto R=R´-R0

A /Bq a/ Bq·kg-1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 *) NE: Nulleffekt Spalte 1: Zuordnung des gefundenen Radionuklids. Spalte 2: Energie und ROI. Spalte 3: Emissionswahrscheinlichkeit (siehe Tabelle 3). Spalte 4: Physikalischer Wirkungsgrad (siehe Tabelle 2) Es wurde der physikalische Wirkungsgrad phys(Ei) als Funktion der -Energie ermittelt. Berechnen Sie daraus den Wert für die -Linie der Energie Ei (Spalte 2), Spalte 5: Rohdaten: Nettofläche (englisch: Net Area; abgekürzt: NA), sowie der durch die Auswertungssoftware ermittelte Messunsicherheit der Nettofläche NA. Spalte 6: Bruttozählrate R´ unter Verwendung der „life time“ tL. Spalte 7: Nulleffektszählrate R0. Auswertungsschritte unter Verwendung des bereits

gemessenen Nulleffektsspektrums mit der tL0 >60000 s. Spalte 8: Nulleffektskorrigierte Nettozählrate R Spalte 9: Bestimmung der Aktivität A aus den einzelnen -Linien. Spalte 10: Ermittlung der spezifischen Aktivitäten a aus den einzelnen -Linien.

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R. Schupfner Versuch 6 6 von 14

Detektor: Ort:

durchgeführt von: am:

Teilnehmer:

gespeichert unter:

Probe Art:

Herkunft:

Masse: Massenbasis trocken feucht

Dichte:

Probenvorbereitung:

Nulleffekt Filename: ________________ geprüft und o. B. geprüft und Befund ___________________________ ___________________________

Messung Messgeometrie Punktquelle auf Detektor

0,2 L in 0,5 L Kautex (WH) 0,5 L in 0,5 L Ringschale 1 L in 1 L Ringschale 2 L in 2 L Ringschale

Messzeit: Real time (RT): _____________________s Live time (LT): _____________________s ´

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R. Schupfner Versuch 6 7 von 14

Kernspektrometrie

Teil 2: -Spektrometrie mittels LSC und Cerenkov-Counting

Einleitung Viele Radionuklide, deren Aktivität bestimmt werden muss, weisen ausser der Emission von Elektronen (- oder ec-Strahler) keine z.B. durch -Spektrometrie direkt bestimmbare Strahlung auf. Solche Radionuklide kommen nicht nur in der Umwelt vor, sondern werden als markierte Verbindungen in den Lebenswissenschaften eingesetzt. Häufig bei Markierungs-versuchen eingesetzte Radionuklide sind 3H (Tritium), 32P, 35S oder auch 45Ca. In diesem Versuch sollen Sie die Grundlagen der Bestimmungsmethode von Strahlern kennenlernen und ermitteln können welche Verfahren bei Aktivitätsbestimmungen die niedrigsten Nachweisgrenzen ergeben. Dazu werden geeignete Modellradionuklide wie 3H, 40K, 108Ag und 110Ag eingesetzt. Je nach Höhe der Strahlungsenergie wird die Methode der LSC (Liquid Scintillation Counting) oder bei ausreichend hohen Strahlungsenergien die Methode des Cerenkov-Counting angewendet. Mit dem Messgerät vom Typ „Triathler“ kann man beide Bestimmungsmethoden durchführen. Grundlagen - Zeitgesetz des radioaktiven Zerfalls - Zusammenhang zwischen Aktivität, Masse und Halbwertszeit - Prinzip der Flüssigszintillationsspektrometrie (LSC) - Cerenkov-Counting - Neutronenaktivierung - Grundgleichung der Radioanalytik - Methoden zur Bestimmung von Halbwertszeiten Aufgabenstellung Im Rahmen dieses Versuchs soll am Beispiel geeigneter Radionuklide wie 3H, 40K, 108Ag und 110Ag die wichtigsten Aspekte der Messung von -Strahlung mittels LSC und Cerenkov-Counting untersucht werden. Dazu sind die physikalischen Wirkungsgrade von 3H und 40K sowie die Halbwertszeiten von 108Ag und 110Ag und von 40K zu bestimmen. Fragen und Aufgaben zur Vorbereitung a) Beschreiben Sie Methoden, mit denen man die Halbwertszeiten von Radionukliden

bestimmen kann. b) Leiten Sie eine Gleichung her, mit der Sie den physikalischen Wirkungsgrad berechnen

können. c) Nennen Sie Gründe, warum sich zur Bestimmung von 108Ag, 110Ag und 40K die Methode des Cerenkov-Counting eignet. d) Was bedeutet cpm bzw. ipm? Rechnen Sie um in cps bzw. ips. 1 ips= ? ipm? c) Was bedeutet „FOM“ und wozu setzt man diesen Parameter ein?

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R. Schupfner Versuch 6 8 von 14

Dokumentation (Protokoll) Die richtige und vollständige Dokumentation der durchgeführten Versuchsteile, der Meßergebnisse, Auswertungen, Rohdaten, Zwischen-ergebnisse usw. in Form eines Protokolls ist die wesentliche Voraus-setzung für die Vergabe des Testats. Bitte achten Sie auf Folgendes:

- Je zwei Studierende bilden eine Arbeitsgruppe. Jede Arbeitsgruppe hat ein Protokoll abzugeben.

- Jede Gruppe hat mindestens drei Präparationen und Messreihen bei der Cerenkovmessung des 108Ag und 110Ag durchzuführen.

- Jede/r Praktikumsteilnehmer/in hat je eine radiochemische Präpration des 40K durchzuführen und für die präparierte Messprobe die Messung durchzuführen und den Wert für den physikalischen Wirkungsgrad zu berechnen. Dieser Wert soll innerhalb des Unsicherheitsbereichs des Referenzwerts liegen.

- Jede von Ihnen präparierte Probe ist mit ihrem Namenskürzel zu beschriften. Die Proben sind ausschließlich am Deckel zu beschriften.

Sicherheit und Zeitplan Der Versuch ist an einem Nachmittag durchzuführen. Dieser zeitliche Rahmen zwingt zu einer sorgfältigen und effektiven Arbeitsweise. Beachten Sie bitte alle Hinweise, die Sie erhalten. Halten Sie zur Ihrem eigenen Schutz und zum Schutz von Betreuer/in und Kommilito/inn/en stets alle Strahlenschutz- und Sicherheitsauflagen ein. Sicherheit geht vor Schnelligkeit! Arbeitsprogramm Im ersten Versuchsteil lernen Sie das Messgerät „Triathler“ kennen. Dazu wird mit dem Tritium- (3H-) und dem Blank-(Blindwert-)Standard die Funktionstüchtigkeit überprüft. Im zweiten Versuchsteil werden die physikalischen Wirkungsgrade für LSC und Cerenkov für 40K bestimmt. Durch die Berechung des „FOM“ soll ermittelt werden, ob die LSC- oder die Cerenkov-Methode niedrigere Nachweisgrenzen ergibt. Beim dritten Versuchsteil werden Halbwertszeiten von kurz- und langlebigen Radionukliden ermittelt. Die Zerfallkurve von 108Ag und 110Ag wird in neutronenaktiverten Silberblech aufgenommen. Mit der Aktivitäts-bestimmung einer unbekannten Probe von 40K soll die Halbwertszeit bestimmt werden. Test der Funktionstüchtigkeit Es erfolgt die Messung des LSC-Tritiumstandard und des LSC-Blindwerts (Nulleffekts) durch jede Arbeitsgruppe. Die Bedienungsanleitung des Messgeräts in Kurzfassung finden Sie in Anhang 2. Dabei werden die folgenden Messparameter (Geräteeinstellung) kontrolliert und auf einem gesondertem Blatt (Anhang 3) dokumentiert.

- Optische Tests (Vollständigkeit, Schäden, normaler Betriebszustand). - Überprüfung der Spannung am Photomultiplier (PMT-Spannung) in V - ROI-Bereich: 30-120. - 3H- und Blindwert-Standard (Blank) zweimal messen (je 1 Minute). - Aktivität und Bezugszeit ist aufgedruckt. Messzeiten: je 1 min.

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R. Schupfner Versuch 6 9 von 14

Zur Auswertung sind die folgenden Arbeiten durchzuführen: - Mittelwerte der Zählraten des 3H-Standards und des Blanks bilden und in die dafür vorgesehenen Abbildungen der Langzeit-dokumentation (am Messgerät) eintragen. - Berechnen Sie mit den gemessenen Zählraten unter Berücksichtigung des Blindwerts den physikalischen Wirkungsgrad phys für die LSC-Messung des 3H-Standards. - Bewerten Sie die Ergebnisse des Funktionstüchtigkeitstests. LSCund Cerenkov-Kalbiermessungen an 40K Jede Arbeitsgruppe stellt ein LSC- und ein Cerenkov-Kalibierpräparat einschließlich Blindwertpräparat her. Es ist durch sorgfältige Sichtprüfung stets besonders darauf zu achten, dass - die zu messenden Präparate dicht, unbeschädigt und kontaminationsfrei sind. Kann dies nicht zweifelsfrei sichergestellt werden, so darf das entsprechende Präparat unter keinen Umständen gemessen werden. Die/Der Betreuer/in ist unverzüglich zu verständigen. - die Präparate deutlich, eindeutlich und richtig beschriftet sind. Die Beschriftungen sind oben auf den Deckel anzubringen. Präparation für die LSC-Messung - 40K-LSC-Kalibierpräparat (Beschriftung: K40-LSC-Gruppennummer) - In ein Messgefäß (20 mL) werden 1-2g KCl eingewogen (Masse dokumentieren). - Es werden 20 mL des LSC-Cocktails vom Tpy QSA zugegeben. Achtung: QSA befindet sich im Kühlraum (CHE32.01.36). Dieser darf nur mit der/dem Betreuer/in betreten werden. Es ist darauf zu achten, dass der Ausflußhahn des Vorratsgefäßes das Messgefäß nicht berührt. - Nach Zugabe des LSC-Cocktails ist das Messgefäß dicht zu verschließen und das Präparat gut zu schütteln. - LSC-Blindwertpräparat (Beschriftung: BW-LSC-Gruppennummer) Präparation für die Cerenkov-Messung - 40K-Cerekov-Kalibierpräparat(Beschriftung:K40-H2O-Gruppennummer) - In ein Glasgefäß mit ca. 20 mL Füllvolumen werden ca. 2-3 g KCl eingewogen (Masse dokumentieren). - Es werden 17 mL (einwiegen: Dichte: ca. 1 g/mL) von H2O eingewogen. - Nach Zugabe des Wassers ist das Messgefäß dicht zu verschließen und das Präparat gut zu schütteln bis sich das KCl weitgehend gelöst hat. - Cerenkov-Blindwertpräparat (Beschriftung: BW-H2O-Gruppennummer)

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R. Schupfner Versuch 6 10 von 14

Durchführung der LSC-Messungen und Auswertungen Messgeräteeinstellungen: PMT-Spannung: 858 V Messmodus: K40 ROI-Bereich: 30 – 1000 Messzeiten: je 10 Minuten. Auswertung:

- Ablesen und Dokumentation der Bruttozählrate R´ des 40K und des Blindwerts (R0) - Berechung des physikalischen Wirkungsgrads für 40K (siehe Anhang 1) - Berechung des FOM-Werts für 40K - Vergleich mit dem Sollwert.

Durchführung der Cerenkov-Messungen und Auswertungen Messgeräteeinstellungen PMT-Spannung: 858 V Messmodus: Tritium ROI-Bereich: 30 – 120 Messzeiten: je 10 Minuten. Auswertung: Ablesen und Dokumentation der Bruttozählrate R´ des 40K und des Blindwerts (R0) Berechung des physikalischen Wirkungsgrads für 40K bei der Cerenkov-Messung Berechung des FOM-Werts für 40K (siehe Anhang 1) Vergleich mit dem Sollwert. Vorbereitung des Versuchsteils 7.3.1 Blindwertmessungen (ca. 60mal) im Cerenkov-Messmodus mit je 10 Sekunden Messzeit. Vergleichen und bewerten Sie die Ergebnisse der Cerenkov- und der LSC-Messung. Bestimmung von Halbwertszeiten 108Ag, 110Ag Herstellung von 108Ag und 110Ag -Messpräparaten Durch Bestrahlung von dünnen Silberblechen (ca. 12mm x 30mm x 0,5mm) mit thermischen Neutronen einer Neutronenquelle werden die Radionuklide 108Ag und 110Ag erzeugt. Die/der Betreuer/in entnimmt die bestrahlten Proben. Sie stellen die Messpräparate in folgenden Schritten her: - stellen Sie ein offenes mit ca. 17 mL H2O gefülltes Messgefäß bereit - geben das aktivierte Silberblech hinein - verschließen dieses sorgfältig - gehen damit zum Messgerät - positionieren die Messprobe, so dass das Silberblech mit der schmalsten Kante dem Photomultiplier gegenüberliegt und starten die Messung. Achtung: Der gesamte Ablauf soll nicht länger als 30 Sekunden dauern.

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R. Schupfner Versuch 6 11 von 14

Messparameter der 108Ag und 110Ag –Messungen: - Messmodus: Cerenkov (Tritium) - Messfenster: 30-120 - Repeat: 70 - Messzeit: 10 Sekunden Wiederholungen der 108Ag und 110Ag –Messungen: Die Messungen werden in einer Messreihe so lange fortgeführt, bis die Bruttozählraten sich nicht mehr signifikant von den Blindwert-zählraten unterscheiden. Danach wird nochmals neu präpariert und wiederholt gemessen. Insgesamt werden drei Messreihen durchgeführt. Dokumentation und Auswertung der 108Ag und 110Ag –Messungen: Die Ergebnisse können direkt am Rechner mittels EXCEL eingetragen und ausgewertet werden. Es sei folgende Tabellenstruktur empfohlen.

0 1 2 3 Fit Ag-108Berechung Ag110 Fit Ag-110

Lfd.Nr.

Zeit seit Messbeginn in Sekunden

Blindwert R0

Brutto R´1

Brutto R´2

Brutto R´3

Brutto R´= R´1 +R´2+ R´3

Netto R = R´- 3·Ř0

RAg108(t) =

RAg108(0)·e-Ag108·tRAg110(t) = R-RAg108(t)

RAg110(t) =

RAg110(0)·e-Ag110·t

1 02 103 204 305 406 507 608 709 8010 90

70 69071 700

Mittelwert

Zählraten in cpmBerechnete DatenNummer der Messreihe

Summe (Rohdaten)

Stellen Sie die Zerfallskurven als R(t) graphisch dar. Berechnen Sie durch einsetzen plausibler Werte für die Halbwertszeiten die für beide Radionuklide beste Ausgleichskurve. Verwenden Sie eine halblogarithmische Darstellung. Bestimmen Sie die Halbwertszeiten des 108Ag und des 110Ag. 40K Bestimmung der Aktivität einer wässrigen 40K Lösung - Messung im Cerenkov-Modus bei einer Messzeit von 10 Minuten - Berechnung der Aktivität des 40K unter Verwendung der Werte des physikalischen

Wirkungsgrads und des Blindwerts aus Abschnitt 7.2 - Berechnung der Halbwertszeit des 40K (Anhang).

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R. Schupfner Versuch 6 12 von 14

Anhang 1: Angaben zu 40K 40K ist ein natürliches primordiales Radionuklid, dessen Zerfall sich für Testzwecke bei radioanalytischen Versuchen besonders gut eignet. Es kann als hochenergetischer -Strahler sowohl durch die Cerenkov- als auch die LSC-Methode detektiert werden und weist darüber hinaus sehr niedrige Dosiskoeffizienten auf und führt beim Umgang nur zu einer vernachlässigbar geringen Strahlenexposition.

Nuklide T1/2 Zerfalls- Y(i) E /keV

arten / (Bq·s)-1Mittel

K-40 zu -0,893 585,0

bestimmen EC < 0,006 2,88 - 3,19 0,107 1460,83

Die spezifische Aktivität von 40K in KCl beträgt: 15,86 Bq 40K/g KCl

Nuklid Eigenschaft rel. Häufigkeit M/g·mol-1

K-39 stabil 93,2581% 39K-41 stabil 6,7302% 41K-40 radioaktiv 0,0117% 40Cl-35 stabil 75,77% 35Cl-37 stabil 24,23% 37

NA 6,0223E+23 mol-1

MK/MKCl = 0,524 A(K-40) = 30,25 Bq K-40/g K

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R. Schupfner Versuch 6 13 von 14

Anhang 2: Dokumentation des Funktionstüchtigkeitstests

Name: Vorname:

Gruppennummer: Messdatum:

Optische Tests

Parameter Anzeige/Merkmal ja nein

Schäden am Messgerät

Display am „TRIATHLER“ „Ready“

Standardprobe „Blank“ unbeschädigt klar

Standardprobe „H-3“ unbeschädigt klar

Programm „Commfiler“ aktiv Eingabefeld aktiv

Messungen (Modus <H-3>)

Parameter Sollwert Istwert Messmodus <H-3> _________ Messzeit 1 min _________ s „ROI“ in Kanalnummern 30 - 120 _____-_____ PMT*)-Spannung 858 V _________ LSC-Messung des H-3-Standards: Messzeit: 1 min Aktivität: 194800 dpm;

Bezugsdatum: 01.06.2003 Sollwert Istwert Bruttozählraten bei einer Messzeit von 1 Minute:

H-3-Standard R`1,H-3 _________ cpm

R`2,H-3 _________ cpm

R´H-3(Mittel) Abbildung _________ cpm

Blank R10 _________ cpm

R10 _________ cpm R0(Mittel) 50-70 _________ cpm

Nettozählraten RH-3 = R´H-3 - R0 entfällt _________ cpm

Physikalischer Wirkungsgrad H-3 _________

*)PMT: Photomultipliertube

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 1

Universität RegensburgLS für Organische ChemieProf. B. König

AbteilungInstrumentelle Analytik

Einführendes Praktikum in die HPLC

Skript WS 2010/11

Dr. R. Vasold

CH 32.1.06

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Seite 2 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Inhalt

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung ............................................................. 4

I.2 Zielsetzung .......................................................... 4

I.3 Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase) .......................... 5

I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen ................................ 7

I.4 Die mobile Phase (Eluent) .................................. 7

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen ........ 7

I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen .................................... 9

I.4.2.1 Die Isokratische-Elution ........................................... 10 I.4.2.2 Die Gradienten-Elution ............................................ 10

I.5 Die Pumpen ....................................................... 11

I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem ........................... 11

I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme ........................................ 11

I.6 Die Injektionseinheit ......................................... 12

I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) .............. 12

I.6.2 Die manuelle Injektion ..................................................... 12

I.7 Der Detektor ....................................................... 13

I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software ....... 15

I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD) .. 16

I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers ...................................... 16

I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil................... 18

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 3

II Experimenteller Teil

II.1 Einleitung ........................................................... 19

II.2 Durchführung ..................................................... 20

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen ......................... 20

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen ......................... 20 II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung ................ 20 II.2.1.2 Vorbereitung der Probenlösungen ......................... 21 II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen ................................. 22

II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung ................................. 22 II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens ........ 23 II.2.2.3 Die Detektor-Programmierung................................. 23 II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten ....... 24 II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter .............. 24 II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers .................. 25 II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence ......................... 25 II.2.3 Die quantitative Auswertung ........................................... 26

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data-Analysis ................................ 26 II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle ............................ 26 II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes ............... 27

I.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil ................ 28

III Auswertung Theoretischer Teil ........ 29

IV Auswertung Experimenteller Teil ..... 30

Abgabe-Bogen .............................................. 31

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Seite 4 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Einführendes Praktikum in die HPLC

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung

Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine leis-

tungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen

chromatographischen Trennung und quantitativen Bestimmung von organi-

schen und anorganischen Verbindungen fast aller Klassen. Für fast alle Verbin-

dungen, die man in Lösung bringen kann, kann man in der Regel auch ein

chromatographisches Trennsystem finden, mit dem man die Verbindungen

trennen und anschließend qualitativ oder quantitativ bestimmen kann.

Aber: die HPLC ist (noch) keine Knopfdruckmethode! Ihre erfolgreiche Anwen-

dung erfordert die richtige Auswahl des chromatographischen Trennsystems,

sorgfältiges, sauberes Arbeiten und viel Fingerspitzengefühl. Man muss die Ei-

genschaften der zu trennenden Substanzen und ihr Verhalten im Trennsystem

abschätzen können, man muss Misserfolge bei der Trennung erklären können

und sich am besten durch viel Praxis einen großen Erfahrungsschatz erwerben.

I.2 Zielsetzung

Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung

in die HPLC zu geben.

In diesem Praktikum sollen u.a.

die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems

kennen gelernt werden, wie

- die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. RP-Phase, d.h.

reversed phase-Phase) und ihr "Behälter", die Trennsäule.

- die mobile Phase mit Eluentenversorgung,

- Pumpen und Einspritzventil (Autosampler),

- der Detektor,

- die Steuerungs- und Auswertesoftware;

die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt wer-

den;

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 5

wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durch-

bruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsge-

schwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden.

die quantitative Bestimmung einer chemischen Substanz in verschiedenen

Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden.

Im folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Systems

näher beschrieben.

I.3. Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase)

RP-Phasen gehören zu den sog. chemisch modifizierten Kieselgelphasen, von

denen eine kaum noch überschaubare Vielfalt im Angebot ist. Bei den RP-

Phasen ist die normalerweise polare, nicht chemisch modifizierte, Kieselgel-

oberfläche (normal-Phase) durch kovalent gebundene, hydrophobe Reste (z.B.

C-18-Ketten [RP-18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) unpolar ge-

macht worden (sog. „endcapping“). Über die chemischen Einzelheiten der Her-

stellung solcher Festphasen und die verschiedenen Typen, sowie über die Ei-

genschaften (Einheitlichkeit der Korngröße, Porosität) und die Charakterisie-

rung von RP-Phasen muss man sich in geeigneten Büchern oder beim Herstel-

ler informieren. RP-Phasen haben gegenüber Normal-Phasen aber eine Reihe

von Vorteilen, die dazu geführt haben, dass heute weit über 90% aller Trennun-

gen auf RP-Phasen durchgeführt werden. Neben der öfteren Wiederverwend-

barkeit (bei guter Pflege) liegt der wesentliche Vorteil in der schnellen Einstel-

lung der Gleichgewichte beim Eluentenwechsel und der deutlich erhöhten Re-

produzierbarkeit der Retentionszeiten. Diese Eigenschaften sind vor allem beim

Gradientenbetrieb sehr wichtig.

Durch fast vollständiges „endcapping“ sind weniger Wechselwirkungen mit noch freien Silanolgruppen (SiOH) möglich. Folge: „scharfe Peakform“

Abb. 1.3.a Schematische Darstellung eines relativ gut “endgecappten“ C18-Materials.

Si Si Si Si Si Si Si Si Si

Si

NCH

3

CH3

N

Cl

C18-Ketten

Si H O

Si H O

Si

H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si

Probensubstanz Beispiel einer Probensubstanz

Silicagel

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Seite 6 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Im Versuch wird eine RP-18- Phase vom Typ LUNA RP18 der Firma

Phenomenex verwendet (also eine Phase mit einem entsprechend „hydropho-

bem Schild“ auf der Kieselgelbasis).

Bei Kieselgeloberflächen, bei denen nicht alle ursprünglich vorhandenen

Silanolgruppen mit unpolaren Ketten modifiziert wurden, liegt ein je nach Her-

steller unterschiedlicher Anteil der Silanolgruppen noch unmodifiziert vor. We-

gen der schwach sauren Eigenschaften der Silanolgruppen verleiht dieser

Restanteil den diesen nicht vollständig „endgecappten" RP-Phasen gewisse

„Ionenaustauscheigenschaften“.

Für ungeladene Substanzen hat das meist keine nachteiligen Folgen. Geladene

Substanzen, bzw. Substanzen, die in Abhängigkeit vom pH-Wert ihren La-

dungszustand ändern, z.B. saure Substanzen (z.B. Phenole) und besonders

basische Substanzen (Amine, N-Heterocyclen) neigen jedoch auf solchen "nicht

vollständig endgecappten“ RP-Phasen zur Bandenverbreiterung und zum

Tailing. Bei manchen Aminen kann dieser unerwünschte Effekt so stark sein,

dass man keine ausreichenden Trennungen erzielen kann. Deshalb gibt es

heute viele spezielle RP-Phasen für basische Verbindungen. Bei diesen spezi-

ellen RP-Phasen werden auch die restlichen Silanolgruppen noch meist mit

kürzeren organischen Resten (z.B. C12) möglichst vollständig modifiziert.

Verbindung interagiert mit noch „freien Silanolgruppen“ Folge: „Bandenverbreiterung“ und „Peaktailing“

Abb. 1.3.b Schematische Darstellung eines relativ schlecht „endgecappten“

C18-Materials.

Viele (heterocyclische) Diamine und andere Substanzen, die als Chelatliganden

wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur

endgecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein Gerüst-Kieselgel, das völlig

frei ist von Schwermetallverunreinigungen (z.B. Merck: Purospher).

Si Si Si Si Si Si Si Si Si

Si

N C H 3 C H 3

N

Cl

C18-Ketten

Si H

O

Si H

O

Si

H

O

Si H

O

Si HO

Si

H

O

Si H

O

Si H

O

Si H

O

Si H

O

Si

H O

Si

H O

Si H

O

Si H

O

Si H

O

Si

H

O

H

OH

O

H

OH

O

Silicagel

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 7

I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen

Hauptursachen für die Schädigung von RP-Phasen und anderen Festphasen

sind:

1. Verunreinigungen und Verstopfungen am Säulenkopf durch irre-

versibel retardiertes (Proben)-Material oder unlösliche Bestandteile (Staub,

Pumpenabrieb) in Probe oder Eluent.

Abhilfe: Bessere Eluenten- und Probenvorbereitung (Filtration des

Eluenten und der Probe); Verwendung von guard-columns

(=Vorsäulen); Säulenspülung mit geeignetem Eluenten.

2. Schrumpfung der Festphase bei Anwendung extremer pH-Werte.

Abhilfe: Verwendung von "gepufferten Eluenten"

3. Falsche Säulenaufbewahrung.

Wegen Pilzwachstum (Pufferlösungen !) und der Gefahr des Auskristallisie-

rens von Puffersalzen, sollen Säulen niemals in 100% Wasser oder gar in

Pufferlösungen aufbewahrt werden. RP-Pasen müssen nach Verwendung

von Puffern gut mit Wasser und anschließend mit Methanol od. Acetonitril

gespült werden. Als Eluent für eine längere Aufbewahrung empfiehlt sich

eine Mischung aus 20% H2O und 80% Acetonitril.

I.4 Die mobile Phase (Eluent)

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen

In der Normal-Phasen-Chromatographie besteht die mobile Phase aus einem

unpolaren organischen Lösungsmittel(gemisch), dem nur in bestimmten Fäl-

len (welchen?) etwas polares Lösungsmittel oder gar Wasser (in geringen Men-

gen) zugesetzt wird. Die Elutionskraft oder „Stärke“ der verschiedenen Eluenten

wurde empirisch bestimmt und ist für jeden Eluenten als Zahlenwert festgehal-

ten. Als Symbol dafür verwendet man E0 oder ε0. Die so gefundene Reihenfolge

von schwachen zu mittleren bis hin zu starken Eluenten nennt man die

Eluotrope Reihe. Es zeigt sich, dass darin die Eluenten nach ihrer Polarität

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Seite 8 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

geordnet sind. Ein (in der NP-Adsorptionschromatographie) stärkerer Eluent ist

immer polarer, ein schwächerer unpolar:

Eluent Polarität [E0] UV-Grenze

[nm]

NP

-Chr

omat

ogra

phie

* n-Hexan 0,00 190

Toluol 0,29 285

Chloroform 0,40 245

Dichlormethan 0,42 230

Aceton 0,56 330

Essigsäureethylester 0,58 260

RP

-Chr

omat

ogra

phie

* Dimethylsulfoxid 0,62 270

Diethylamin 0,63 275

Acetonitril 0,65 190

Ethanol 0,88 210

Methanol 0,95 205

Wasser >1,11 <190 * im angegebenen Chromatographiemodus (RP/NP) häufig, aber nicht aus-

schließlich verwendet. Wichtige Voraussetzung ist die Mischbarkeit der Eluenten

Tab. 1.4.1 Eluotrope Reihe (Auszug). Die angegebenen E0-Werte

gelten streng genommen für Aluminiumoxid als

Adsorbens, doch sind sie für Silicagel nur um einen

konstanten Faktor verschieden: E0 (SiO2) = 0,77 E0

(Al2O3). Die Lösungsmittelreihenfolge ändert sich also

nicht, wenn man von Aluminiumoxid auf Silicagel über-

geht. In der linken Spalte ist angegeben, bei welcher

Chromatographieart die Eluenten häufiger Verwendung

finden.

In der RP-Chromatographie ist es umgekehrt: Dort besteht die mobile Phase

in der Mehrzahl der Fälle aus einem überwiegend polaren, mit Wasser misch-

baren organischen Lösungsmittel (meist Methanol oder Acetonitril), dem zur

Erhöhung der Polarität ein bestimmter Wasseranteil (evtl. mit Zusatz von Sal-

zen: Puffersysteme zur Einstellung eines erwünschten pH-Wertes) beigemischt

wird. Bei Standardtrennungen ist meist Acetonitril im Vergleich zu Methanol die besse-

re Wahl (warum ?). Das verwendete Wasser muss stets sehr rein sein (Millipore-

Qualität) und darf insbesondere keine organischen Verunreinigungen enthalten

(deshalb niemals Wasser verwenden, das lediglich mit Ionenaustauschern

entionisiert wurde).

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 9

Weiterhin sollten die Eluenten (besonders das Wasser) keine gelösten Gase

enthalten (warum?). Deshalb müssen die Eluenten vor Gebrauch sorgfältig ent-

gast werden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren im Gebrauch: Va-

kuumentgasung, Membranfiltration, Ultraschall, Heliumspülung (Helium ist in

Wasser unlöslich und transportiert die in Wasser gelösten Gase, die mit Helium

mischbar sind, ab).

Ganz wichtig ist auch, dass die Eluenten (ebenso wie die Probenlösung) frei

von Partikeln (z.B. Staub, ungelöste Substanzrückstände etc.) sind, die die sehr

feinen Einlassfritten (2 m) der Trennsäule verstopfen könnten oder gar die

Pumpenköpfe schädigen könnten. Eine (Membran)-Filtration der Eluenten oder

der Gebrauch von Einlassfiltern ist deshalb unerlässlich. Besondere Vorsicht ist

bei der Verwendung von wässerigen Salzlösungen (Puffern) angeraten. Es

muss sicher gestellt sein, dass es nicht zu Ausfällungen kommt, wenn die wäs-

serige Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel vermischt wird. Nie-

mals darf ein Eluentengemisch, das eine wässerige Salzlösung enthält, nach

Beendigung der Trennung im HPLC-System verbleiben. Totalschäden an Pum-

pen, Säulen und Detektorzellen sind vorprogrammiert, wenn darin Salze im

Laufe der Zeit auskristallisieren!

I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen

Im Versuch werden Gemische aus Wasser und Acetonitril verwendet mit einem

Volumenanteil Acetonitril zwischen 0,10 und 0,95 (0,10 < < 0,95). Dies ent-

spricht einer Eluentenzusammensetzung von 10% ACN bis 95% ACN gegen

H2O im Verlauf der Trennung.

Anmerkung:

Man muss sich leider damit abfinden, dass in fast allen HPLC-Büchern und Ar-

beitsanweisungen die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht so wie oben

unter Verwendung der definierten Gehaltsgröße σ "Volumenanteil", sondern oft

nicht ganz eindeutig angegeben wird. So heißt es z.B. oft: "Methanol/Wasser

50:50" oder "50% Wasser in Methanol" etc. Man kann dann aber davon ausge-

hen, dass damit der Volumenanteil gemeint ist, weil dies der gängigen Arbeits-

weise entspricht.

Beim Einsatz der mobilen Phasen unterscheidet man generell zwischen zwei

Arbeitsweisen: Der isokratischen Elution und der sog. Gradientenelution.

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Seite 10 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

I.4.2.1 Die Isokratische-Elution

D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Tren-

nung nicht. Die Eluenten werden im benötigten Verhältnis vorgemischt und ent-

gast und können dann von z.B. nur einer Pumpe gefördert werden.

- Vorteil: es wird nur einer Pumpe benötigt;

- Nachteil: mangelnde Flexibilität, denn bei wechselnden Trennprob-

lemen oder in der Erprobungsphase eines neuen

Eluentensystems muss der Vorratsbehälter der mobilen

Pase häufig gewechselt werden. Erfahrung oder langwieri-

ge Erprobungen sind nötig, um ein geeignetes isokratisches

Eluentengemisch zu optimieren (Zeitaufwendig !!).

I.4.2.2 Die Gradienten-Elution

D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Tren-

nung! Man spricht von binären Gradienten, wenn sich die mobile Phase aus

zwei, von ternären bzw. quaternären Gradienten, wenn sie sich aus drei, bzw.

vier Bestandteilen zusammensetzt. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zu-

sammensetzung kann mit Hilfe der Steuerungssoftware programmiert werden.

Auf diese Weise sind viele Arten von Gradientenverläufen (linear, konvex, kon-

kav, stufenförmig) möglich. Meist jedoch sind lineare Gradienten völlig ausrei-

chend.

- Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennprob-

lemen, die isokratisch nicht zu lösen sind; Verkürzung von

Analysenzeiten bei stark retardierten Substanzen;

- Nachteil: es werden oft mehrere Pumpen (Hochdruckgradient) bzw.

komplexere Pumpensysteme benötigt. Erfahrungen im

Gradientendesign sind nötig. So muss man z.B. wissen,

dass Methanol-Wasser-Gemische zur Bildung von Gradien-

ten nicht optimal sind, weil die Mischungsreaktion stark exo-

therm ist, sowie eine Volumenverminderung und eine Vis-

kositätserhöhung (Druckerhöhung!) eintritt. Gemische aus

Acetonitril und Wasser sind in dieser Hinsicht viel unprob-

lematischer.

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 11

Einlaßventil

Auslaßventil

Kolben

Hydraulik-Flüssigkeit

Membran

Kolben

I.5 Die Pumpen

I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem

Über die raffinierten technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktion der

Pumpen muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Als die zwei wich-

tigsten Anforderungen, die an die Pumpen gestellt werden müssen, seien ge-

nannt:

Es muss eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit ge-

währleistet werden.

Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und

damit die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig.

Es muss ein möglichst pulsationsfreier Fluss gewährleistet werden, weil

sonst die Grundlinie des Detektors zu unruhig wird, und Druckstöße die

stationäre Phase schädigen können.

Die van Deemter-Gleichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC) zeigt,

dass sich die Bodenzahl einer Trennsäule und damit die Güte einer Trennung

durch die Steigerung der Fließgeschwindigkeit über einen bestimmten Wert

hinaus nicht mehr wesentlich optimieren lässt. Abgesehen davon, würde der

Rückdruck bei zu hohen Fließgeschwindigkeiten und sehr kleinen Korngrößen

der stationären Phase (< 3 m) auch viel zu hoch werden.

I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme

Abb. 1.5.2.a Kolbenpumpe Abb. 1.5.2.b Diaphragmapumpe

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Seite 12 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

I.6 Die Injektionseinheit

I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler)

Moderne HPLC-Anlagen sind fast ausschließlich mit einer automatischen Pro-

bengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen nicht nur in einer deutlichen

Zeitersparnis beim Abarbeiten größerer Probenmengen, sondern auch in der

außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges.

I.6.2 Die manuelle Injektion

Das Probeninjektionsventil bei der manuellen Injektion ist ein wichtiges, emp-

findliches und verschmutzungsanfälliges Einzelteil einer HPLC-Anlage. In Ver-

bindung mit einer Probenschleife gestattet es die Injektion eines definierten

Probenvolumens in ein HPLC-System, das unter hohem Druck steht. Über die

technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktionsweise muss man sich in

geeigneten Büchern informieren. Sollte man einmal in Ermangelung eines

Autosamplers auf die Benutzung eines manuellen Injektionsventils angewiesen

sein, seien hier einige wichtige Bedienungshinweise zur geflissentlichen Beach-

tung genannt:

Niemals das Ventil ohne Lösungsmittelfluss betätigen.

Vor jedem Einspritzen einer Probe muss die Probenschleife gespült werden.

Das kann per Hand mit einer Spritze geschehen. Zum Einspritzen der Probe

dürfen nur spezielle Mikroliterspritzen mit stumpfen Endungen verwendet

werden, damit die Dichtungen im Inneren des Ventils nicht beschädigt wer-

den.

Der Umschaltvorgang des Ventils von der "load"- auf die "inject"-Stellung,

der ja bei laufenden Pumpen erfolgt, muss zügig und schnell erfolgen, da es

sonst zu einem Druckstoß im System kommen kann, der die Säulenpackung

schädigen kann oder eventuell die Sicherheitsabschaltung des gesamten

Systems auslöst.

Das Probeninjektionsventil kann zu einer Quelle von Verunreinigungen wer-

den, wenn es nicht regelmäßig gereinigt und gepflegt wird.

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 13

I.7 Der Detektor

Ohne Detektor ist jedes Chromatographiesystem blind. Es gibt eine Vielzahl

von Detektionsverfahren. Diejenigen, die auf der Absorption von UV- oder

sichtbarer Strahlung beruhen, haben einen großen Einsatzbereich. Viele orga-

nische und anorganische Moleküle (Aromaten, Carbonylverbindungen, etc.)

absorbieren im mittleren UV-Bereich (250nm - 300nm) mit ausreichend großen

Absorptionskoeffizienten (Lambert-Beersches-Gesetz). Wenn das nicht aus-

reicht, kann man auch in das kurzwellige UV (190nm - 250nm) wechseln. Dann

allerdings ist eine etwaige Eigenabsorption der Eluenten zu berücksichtigen.

Abb. 1.7.a: Schematische Darstellung eines einfachen UV/VIS-

Detektors (z.B. sog. VWD- oder MWD-Detektor) mit einstellbaren

Einzel-Wellenlängen (nicht kontinuierlich).

Anstelle eines einfachen UV/VIS-Detektors (Abb. 1.7.a), bei dem man meist nur

eine bestimmte Wellenlänge auswählen kann, ist es besser, ein spezielles,

computerunterstütztes Spektrophotometer, den Photodioden-Array-Detektor

(DAD) mit sog. „inverser Optik“ zu verwenden (siehe Abb. 1.7.b). Die Be-

zeichnung „inverse Optik“ bedeutet, dass hier die Messzelle nicht nach, son-

dern vor dem spektralen Gitter angebracht ist. Das gesamte Licht fällt so durch

die Flusszelle und wird erst danach am Gitter spektral aufgeteilt. Der spektrale

Lichtfächer fällt dann auf ein Dioden-Array. Dies ist ein Chip mit zahlreichen

(100 - 1000) lichtempfindlichen Photodioden. Diese Dioden werden kontinuier-

lich in sehr kurzer Zeit (ca. 50 ms) elektronisch ausgelesen und daraus eine

Vielzahl von UV-Spektrum generiert. Der DAD-Detektor ist somit in der Lage,

während einer chromatographischen Trennung die kompletten UV-Spektren

aller Peaks zu registrieren und abzuspeichern. Dies ist besonders wichtig zur

Peakidentifikation, zur Reinheitskontrolle (Peak-Purity-Check) und zur Ermitt-

lung optimaler Detektionswellenlängen bei der Untersuchung unbekannter Pro-

ben.

Spalt

Deuteriumlampe

Gitter

Flußzelle

Photozelle

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Seite 14 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Deuteriumlampe

Gitter

Spalt Photodioden

Flußzelle

Abb. 1.7.b: Schematische Darstellung eines Diodenarray-Detektors

(DAD-Detektor)

Weitere häufig eingesetzte HPLC Detektoren sind:

HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität

UV-VIS

(VWD. MWD)

selektiv

nur für einzelne UV-aktive

Komponenten

ca. 0,3 ng/ml 104

DAD

=Diode-Array-Det.

(Diodenarray-Detektor)

190-950 nm

selektiv

für fast alle UV-aktiven Kompo-

nenten

0,3 ng/ml 104

RI

=Refractive-Index-Det.

(Brechungsindex-

Detektor)

universell

(stark temperaturabhängig,

keine Gradientenelution mög-

lich, relativ unempfindlich)

ca. 0,7 g/ml 3 x 103

FLD

=Fluorescence Det.

(Fluoreszenz-Detektor)

selektiv,

nur für fluoreszierende Kompo-

nenten

0,8 pg/ml 103 - 104

ECD

=Electro-Chemical-Det.

(Elektrochemischer De-

tektor)

selektiv,

nur für oxidierbare oder redu-

zierbare Komponenten

ca. 1,0 pg/ml --

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 15

CD

=Conductivity-Det.

(Leitfähigkeitsdetektor)

ionenselektiv

bis zu ca 0,2%

untersch. Leit-

fähigkeit

ca. 105

ELSD

=Evaporative-Light –

Scattering-Detector

(Verdampfungslichtstreudetek-

tor)

speziell geeignet für

Makromoleküle und Sub-

stanzen, die im UV nicht

absorbieren.

von

Modell

abhängig

-

von

Modell

abhängig

-

Tab. 1.7 Übersicht über häufig eingesetzte HPLC-Detektoren:

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Seite 16 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software

Bei modernen HPLC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Pro-

benaufgabe, Pumpen, Säulenthermostat, Ventile, Detektoren) von einem

Rechner aus gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Dar-

stellung, Speicherung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach

Aufnahme des Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Be-

arbeitung und Auswertung des Chromatogramms übernehmen und einen

passenden Ausdruck der Ergebnisse liefern. Bei älteren HPLC-Anlagen, bei

denen die Steuerung der Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt,

übernimmt ein separater Integrator die Aufzeichnung und Auswertung der

Chromatogramme (heute nicht mehr gebräuchlich).

Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration)

wohl die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Vorausset-

zung zur exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen

Peaks völlig getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie

konstant verläuft. Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlap-

pende oder aufsitzende Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der

Grundlinie berücksichtigen, jedoch ist es immer angebracht, zunächst die

Trennung zu optimieren oder die Probenvorbereitung zu verbessern um

Störpeaks zu beseitigen.

Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog.

Peakverarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus

den Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden

wichtigsten Peakverarbeitungsparameter sind:

- Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der

ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten

interessierenden Peaks.

- Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest

(Peakerkennungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive

(Peakbeginn) bzw. negative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen,

aus den Schwankungen der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es

zur Peakerkennung durch die Software.

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 17

I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD)

In der HPLC ist es von größter Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen

Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Be-

dingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten erlau-

ben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei exakt

symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herangezogen

werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge der zu

analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der Kon-

zentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten abhän-

gig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Konzent-

ration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder

Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vor-

zugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleich-

barer Korrekturfaktor verwendet werden.

I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers

Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchen-

den Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den

sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard

eingesetzt werden soll, muss aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfül-

len:

sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vor-

kommen.

sie muss chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Kom-

ponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der

Säule und der verwendeten mobilen Phase.

sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.

sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften

(Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestim-

mende Substanz verfügen.

sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den

chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in ver-

gleichbarer Konzentration zugesetzt werden.

Nach der HPLC-Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den

genauen Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine

Referenzsubstanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in ähn-

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Seite 18 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

lichen Konzentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, lässt sich für

jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren fTr und

fi nach folgenden Zusammenhängen ermitteln:

fi = i

ima

fi = Response-Faktor der

Komponente i

ai = Fläche der Substanz i

mi = Masse der Komponente i

KFi = i

Tr

f

f = K

iKTr

KTr

Ki

amam

KFi = Kalibrierfaktor der

Komponente i

fTr = Response-Faktor

desTracers

miK = Masse der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

mTrK = Masse des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aTrK = Fläche des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aiK = Fläche der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

m xi = KFi x

Tr

xi

aa

mTr

m xi = Masse der Komponente i in

der Probenlösung (X)

m xTr = Masse des Tracers in der

Probenlösung (X)

a xi = Fläche der Komponente i

a xTr = Fläche des Tracers

Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und glei-

cher Konzentration (Masse mTr) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus der

Eichung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten nach

Formel (3) ermitteln.

(1)

(2)

(3)

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I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil

1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Ad-

sorptionschromatographie unterschieden werden?

2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.

3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.B.

stark basische Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten

RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele aufzeichnen )?

4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu

NP-Phasen aufweisen.

5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt,

und welchem Ordnungsprinzip folgt sie?

6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?

7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Ein-

satz der mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung

unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution?

8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe „binärer“, „ternärer“

und „quaternärer“ Gradient.

9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten.

10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung.

11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert ?

12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer

aufweisen muss.

13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip

eines herkömmlichen VWD-Detektors und eines DAD-Detektors. Erläu-

tern sie in diesem Zusammenhang den Ausdruck: „Inverse Optik“.

14.) Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.

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II Experimenteller Teil

HPLC-Bestimmung von Coffein in Getränken (Kaffee und Energy-Drinks) mit der Methode des Internen Standards

II.1 Einleitung

Coffein gehört als pharmazeutischer Wirkstoff in die große Gruppe der Psycho-

pharmaka und in die Untergruppe der Psychoanaleptika. Analeptika sind Sub-

stanzen, die das Zentralnervensystem stimulieren und in hohen Dosen Krämpfe

auslösen. Psychoanaleptika sind unspezifisch wirksame Substanzen, die vor-

wiegend die "Psyche" anregen, aber auch noch andere, z.B. bei Coffein diureti-

sche, Wirkungen zeigen. Eine tägliche Coffeinzufuhr hinterläßt in der Regel kei-

ne bleibenden organische Schädigungen.

Chemisch gesehen ist Coffein (1,3,7-

Trimethylxanthin), genau wie Theophyllin und

Theobromin als Xanthinderivat eine Purinbase. Alle

drei genannten Xanthinderivate kommen in Teeblät-

tern vor, Theobromin auch in der Kakaobohne und

in der Colanuß. In der Kaffeebohne und auch in

Teeblättern ist Coffein gegenüber den beiden ande-

ren Xanthinderivaten der Hauptbestandteil.

N

NN

N

O

O

CH3

CH3

CH3

Auch in vielen käuflichen Limonaden ist Coffein in bisher erlaubten Konzentrati-

onen von 85 - 250 mg/L enthalten. Die sog. Energy-Drinks dürfen nach speziel-

len Genehmigungen der Lebensmittelbehörden Coffein in höherer Konzentrati-

on (ca. 350 mg/L) und außerdem noch weitere Inhaltsstoffe, wie Taurin (2-

Amino-ethansulfonsäure), Glucuronolacton, Inosit und sehr viel Zucker enthal-

ten. Diese Inhaltsstoffe sollen angeblich zur höheren "Leistungsfähigkeit" ver-

helfen (Werbung: "pure Energie für Kopf und Körper"). Während die Wirksam-

keit von Coffein als Anregungsmittel nicht umstritten ist (250 mL Energy Drink

hat die Wirkung einer starken Tasse Bohnenkaffee), ist die Wirksamkeit der

übrigen Bestandteile eher spekulativ.

Coffein

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 21

II.2 Durchführung

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen

Coffein-Stammlösung (Lösung A):

10 mg Coffein (27600 Fluka ≥ 99% HPLC) werden in ein Zinnwägeschiffchen

(Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysen-

systeme GmbH, D-63452 Hanau, Germany), genau eingewogen. Anschließend

wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben

überführt und mit H2O (Millipore-Qualität) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der

Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird

beschriftet (Lösung A / Konzentration-Coffein [mg/ml] ! ).

Tracer-Stammlösung (Lösung B):

25 mg Benzophenon (84676 Fluka) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z

276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysensysteme

GmbH, D-63452 Hanau, Germany) genau eingewogen. Anschließend wird das

Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben über-

führt und mit Acetonitril (HPLC –Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt Ba-

ker, D-64347 Griesheim, Germany) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Messkol-

ben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird beschriftet

(Lösung B / Konzentration-Benzophenon [mg/ml] ! ).

II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung

Herstellung der Eichlösung C:

Mit einer Pipette (Transferpette ,Fa. Brandt, D-97861 Wertheim, Germany) wer-

den je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen

zusammenpipettiert (Vorsicht ! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze

vermeiden !). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel verschlos-

sen und 10 s geschüttelt und beschriftet.

Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze

(NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D-78532 Tuttlingen, Germany) mittels

einer aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x

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Seite 22 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

11/2, Fa. Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die

Kanüle von der Spritze wieder entfernt (Achtung ! Spritze dabei senkrecht nach

oben halten, damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft !) und ein Chromafil

Einmalfilter (PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa.

Macherey-Nagel, D-52313 Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vor-

sichtig ! durch den aufgesetzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen

gepresst. Das Gläschen wird mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und

beschriftet (Lösung C / Konzentrationen in [mg/ml] ! ). Achtung: Jeweils

Vialkonzentrationen angeben !

II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen

Herstellung der Kaffee-Probenlösung (P1):

Der aufgebrühten und auf Raumtemperatur abgekühlten Kaffee-Lösung wer-

den mit der Transferpette 700µl entnommen und in ein Präparategläschen

überführt. Es werden 700µl Lösung B (Tracer-Stammlösung) zupipettiert. Es

wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt. Filtration

analog Lösung C.

Herstellung der Red-Bull-Probenlösung (P2):

700µl (Transfepette) Red-Bull-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden mit

700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein

Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung C.

Herstellung der Coca-Cola-Probenlösung (P3):

700µl (Transferpette) Coca-Cola-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden

mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein

Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung (C).

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HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 23

II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen

Säule:

Phenomenex Luna© C18 / 3µm / 150 x 4.6 mm

Vorbereitung:

Nachdem die HPLC-Anlage mit den benötigten Eluenten (Kanal A: 100% H2O

[Millipore-Qualität] / Kanal B: 100% Acetonitril [HPLC –Ultra-Gradient-Grade

9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D-64347 Griesheim, Germany] bestückt wurde,

wird zunächst die Säule für 10 min mit 98% B gespült. Anschließend konditio-

niert man die Säule für weitere 10 min auf die gewünschten Anfangsbedingun-

gen (hier 10% B). Danach wird die Software programmiert. Bevor die Sequence

mit der Eichlösung (C) und den einzelnen Probenlösungen (P1, P2, P3) ver-

messen werden, wird ein Chromatogramm der Tracer-Lösung (B) aufgenom-

men, um beurteilen zu können, ob Benzophenon als Interner Standard über-

haupt verwendet werden kann.

II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung

A : Geben sie eine Flussrate von 1.00 ml/min ein.

B : Stellen sie Solvent B auf 10% ein (Anfangsbedingungen).

C : Programmieren sie die Timetable in dem sie das gewünschte

Gradientenprogramm angeben 10% B → 95% B in 20 min.

B

C

A

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II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens

D : Geben sie als Injektionsvolumen 5.0 µl ein.

II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung

E : Geben sie als Signalspur A = 220 nm ein.

F : Geben sie als Signalspur B = 254 nm ein.

D

E

F

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II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten

G : Geben sie als Temperatur für den Säulenthermostaten 25.0°C ein.

II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter

H : Geben sie für die Slope Sensitivity den Wert 50 ein.

I : Geben sie für die Peak Width den Wert 0.05 ein.

G

H

I

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Seite 26 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers

J : Geben in der Sequence Table (programmiert den Autosampler) die

Bezeichnungen der Proben in der Reihenfolge ein, in der sie abge-

arbeitet werden sollen (Eichlösung / P1 / P2 / P3 ).

Unter „Inj/Location“ ist standardmäßig 1 eingetragen, was bedeu-

tet, dass jede Probe nur jeweils einmal injiziert werden soll.

Tragen sie unter der Rubrik „Sample Info“ die jeweiligen

Vialkonzentrationen der Komponenten in ihrer Lösung ein.

II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence

K : Starten sie mit dem Kommando „Run Sequence“ die

Analysensequence, nachdem sie die Proben in den Probenteller

des Autosamplers gestellt haben.

J

K

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II.2.3 Die quantitative Auswertung

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis

L : Die Auswerung der gewonnenen Analysenergebnisse erfolgt unter

dem Menüpunkt „Data Analysis“. Hier können u.a. die Integrations-

parameter für die aufgenommenen Chromatogramme optimiert, als

auch spektroskopische Analysen (UV-Spektren, Isoplot, 3-D-Plot

etc.) durchgeführt werden.

II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle

M : Laden sie das Datenfile des Eich-Chromatogramms und öffnen sie

die „Calibration Table“. Geben sie unter der Rubrik „Compound“

für den jeweiligen Peak den entsprechenden Namen ein.

N : Geben sie in der der Spalte „Amt (=Amount !)“ die

Vialkonzentration der Komponente ein. Indizieren sie den Tracer in

der Spalte ISTD mit „YES“. Nach abspeichern als Kalibrier-Methode

drucken sie mit „Print“ die Tabelle aus und schließen mit „OK“ ab.

L

N M

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Seite 28 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes (ISTD-Report)

O : Nachdem sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben

(Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme

der Lösungen P1 bis P3 geladen werden und für jedes

Chromatogramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wäh-

len sie den Menüpunkt „Specify Report“ aus. Im Fenster „Destina-

tion“ wählen sie „Printer“, im Fenster „Style“ wählen sie „Short“

aus. Unter der Rubrik „Quantitative Results“ muss „ISTD“ aktiviert

sein. Die restlichen Einstellungen können beibehalten werden. Mit

dem Kommando „Print Report“ kann danach jeweils der spezifi-

sche quantitative Ergebnis-Report erstellt werden. Drucken sie die-

sen Report für jedes Chromatogramm aus.

O

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II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil

1.) Was versteht man unter der chromatographischen Durchbruchszeit tm.

2.) Welche apparativen Einflüsse (zusätzlich zur Säule) können zu einer deutli-

chen Beeinflussung der Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)?

3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)

von Benzophenon, sowie die Durchbruchszeit tm des chromatographi-

schen Systems.

4.) Berechnen sie daraus die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Pha-

se um in [cm/min] (Länge der Säule = 150 mm).

5) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie

das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.

6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.

7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Er-

gebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.

8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an

Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originalgetränken (Kaffee-

Lösung / Red Bull / Coca-Cola).

9.) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz

Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-

sulfonsäure. Zeichnen sie die Strukturformel von Taurin.

10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum

Coffeinpeak tendentiell erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit).

Begründen sie ihre Aussage?

11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor ein-

schätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode

für Taurin.

12.) Welche Auftragung stellt ein Isoplot dar?

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III Auswertung Theoretischer Teil

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IV Auswertung Experimenteller Teil

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Seite 32 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Abgabe-Bogen / Name _________ Gruppe

Name Vorname

Bemerkungen: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Testat erteilt am durch

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 1

Universität RegensburgLS für Organische Chemie

Prof. B. König

AbteilungInstrumentelle Analytik

CH 22.1.41

Einführendes Praktikum in die GC

Skript WS 2010/11

Dr. R. Vasold

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Seite 2 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Inhalt

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung ............................................................. 4

I.2 Zielsetzung .......................................................... 4

I.3 Die stationäre Phase ........................................... 5

I.3.1 Gepackte Säulen ........................................................... 5 I.3.2 Kapillarsäulen ................................................................ 5 I.3.2.1 Temperaturbeständigkeit von Kapillarsäulen ................ 7

I.4 Die mobile Phase (Trägergas) ............................ 8

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen .... 7

I.5 Methoden der GC ................................................ 8

I.5.1 Die isotherme GC .......................................................... 8 I.5.2 Die temperaturprogrammierte GC ................................. 9

I.6 Pneumatik und Säulenofen ................................ 9

I.7 Die Injektionseinheit ......................................... 10

I.7.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) ........... 10 I.7.1.1 Split/Splitless-Injektor .................................................. 10 I.7.1.2 On Column-Injektor ..................................................... 11

I.8 Der GC-Detektor ................................................ 11

I.8.1 Der Flammenionisationsdetektor (FID) ....................... 12 I.8.2 Der Massenselektive Detektor (MSD) ......................... 12

I.9 Probenvorbereitung (Derivatisierung) ............ 14

I.10 Die Steuerungs- und Auswerte-Software ....... 16

I.11 Die Methode des Internen Standards (ISTD) .. 16

I.11.1 Wahl eines geeigneten Tracers ................................... 16

I.12 Aufgaben zum Theoretischen Teil................... 18

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 3

II Experimenteller Teil

II.1 Einleitung ........................................................... 20

II.2 Durchführung ..................................................... 21

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen ......................... 21

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen ......................... 21 II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung ................ 22 II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen ......................... 22 II.2.2 Durchführung der GC/MS-Analysen ............................... 23

II.2.2.1 Die Injektor-Programmierung .................................. 24 II.2.2.2 Der Injektionsmodus .......................................... 23 II.2.2.3 Programmierung des Säulenflusses ....................... 25 II.2.2.4 Programmierung des Säulenofens .......................... 25 II.2.2.5 Einstellung der Transferline-Temperatur ................. 26 II.2.2.6 Programmierung des Autosamplers ........................ 25 II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence ......................... 27 II.2.3 Die quantitative Auswertung ........................................... 27

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis ................................ 27 II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle ............................ 28 II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes ............... 30

II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil ................ 31

III Auswertung Theoretischer Teil ........ 32

IV Auswertung Experimenteller Teil ..... 33

Abgabe-Bogen .............................................. 35

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Seite 4 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

Einführendes Praktikum in die GC

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung

Die Gaschromatographie (GC) ist, wie die HPLC (High Performance/Pressure Li-

quid Chromatography), eine leistungsfähige Methode zur meist analytischen (in

Spezialfällen aber auch präparativen) chromatographischen Trennung und quanti-

tativen Bestimmung von organischen und anorganischen Verbindungen fast aller

Klassen.

Gaschromatographisch können solche Stoffe getrennt werden, die unzersetzt in

den Gaszustand überführt oder unter Zersetzung reproduzierbar verdampft wer-

den können.

Unter dem Begriff der Gaschromatographie (GC) werden physikalisch-chemische

Trennmethoden zusammengefasst, bei denen eine Stoffmenge durch Verteilung

zwischen einer ruhenden („stationären“) und einer sich bewegenden („mobilen“)

Phase erfolgt. Ein gaschromatographisches System besteht also wiederum aus

zwei nicht miteinander mischbaren Phasen, von denen die eine sich an der ande-

ren vorbeibewegt. Die Gaschromatographie umfasst dabei alle

chromatographischen Methoden, bei denen die mobile Phase ein Gas ist.

I.2 Zielsetzung

Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung in

die Technik der Gaschromatographie zu geben.

In diesem Praktikum sollen u.a.

die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines GC-Trennsystems kennen

gelernt werden, wie

- die stationäre Phase (in diesem Fall eine HP-5MS Phase mit 5%

Diphenylpolysiloxan).

- die mobile Phase (Trägergas ist in diesem Fall Helium),

- Pneumatik, Säulenofen und Injektionseinheit (Autosampler),

- der Detektor

- die Steuerungs- und Auswertesoftware;

die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt werden;

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 5

wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durchbruchs-

zeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsgeschwindigkeit

der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden.

die quantitative Bestimmung einer chemischer Substanzen in verschiedenen

Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden.

Im Folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines GC-Systems nä-

her beschrieben:

I.3. Die stationäre Phase

Trennsäulen für die GC lassen sich prinzipiell in gepackte Säulen und in Kapillar-

säulen einteilen (siehe Skriptum Analytische Chemie II):

1.3.1 Gepackte Säulen:

Gepackte Säulen bestehen aus einem Glas- oder Metallrohr (2 - 4 mm Innen-

durchmesser, Länge: 0.5 – 4 m), das mit einem Säulenmaterial gefüllt ist. Als sta-

tionäre Phasen werden hierbei entweder feste Adsorbentien oder Trennflüssigkei-

ten, die auf einem Träger (z.B. Kieselgur) aufgebracht sind, verwendet.

Feste Adsorbentien werden häufig bei Bestimmung von Gasen oder kleinen orga-

nischem Molekülen verwendet. Als Adsorbentien dienen hierbei u.a. z.B. Kiesel-

gel, Al2O3 oder Aktivkohle.

1.3.2 Kapillarsäulen:

Bei den Kapillarsäulen werden als stationäre Phasen sehr häufig Silikonöle und

Polyethylenglykole eingesetzt. Bei den Silikonölen (Polysiloxanen) hängt die Pola-

rität von der Zusammensetzung ab:

Die Kapillarenwand ist in der Regel aus synthetischem Quarz (engl. „fused silica“)

hergestellt und auf der Innenseite mit der Trennflüssigkeit beschichtet. Es werden

in der Regel Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 0.2 – 0.75 mm verwen-

det. Bei Kapillaren mit 0.2 mm Innendurchmesser liegen die Schichtdicken der

Trennflüssigkeit (Film) bei 0.1 – 0.8 um. Bei Kapillaren mit größerem Innendurch-

messer beträgt die Schichtdicke bis zu 5 um. Je größer die Schichtdicke der

Trennflüssigkeit ist, desto größer ist zwar die Beladbarkeit (Kapazität) der Säule,

je geringer ist aber auch ihre Trennleistung

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Abb 1.3.2.a: Bei n = 100% besteht die Trennflüssigkeit aus reinem Polydimethylsiloxan. Folge: Sehr unpolare stationäre Phase

Reine Polydimethylsiloxane (abb 1.3.2.a) besitzen relativ unpolare Eigenschaften.

Die Polarität der Polydimethylsiloxane steigt aber durch Erhöhung des Anteils an

z.B. Diphenyl-, Cyanopropylphenyl- oder Dicyanopropylsiloxanen.

Abb 1.3.2.b: Die Trennflüssigkeit besteht neben n Antei-len an Polydimethylsiloxan auch aus un-terschiedlichen Anteilen an Diphenylpolysiloxan m mit (n=100%-m). Folge: Zunehmend höhere Polarität der stationäre Phase

Zu den polaren stationären Phasen zählen Polysiloxane mit einem hohen Anteil an

Cyanopropyl- oder Phenylsiloxan und die Polyethylenglykolphasen.

Abb 1.3.2.c: Die Trennflüssigkeit besteht neben n Antei-len an Polydimethylsiloxan auch aus un-terschiedlichen Anteilen an Cyanopropylphenylpolysiloxan m mit (n=100%-m). Folge: Zunehmend höhere Polarität der stationären Phase

Abb 1.3.2.d: (n=100%) Die Trennflüssigkeit besteht aus 100% Polyethylenglykol. Folge: Sehr hohe Polarität der stationären Phase. Achtung !! Empfindlich gegenüber Sauerstoff und hohen Trenntemperaturen.

Diese sehr polaren stationären Phasen („Trennflüssigkeiten“) werden durch Sau-

erstoff oxidiert und zersetzt. Dieser Effekt tritt insbesondere bei hohen Trenntem-

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peraturen auf. Daher ist darauf zu achten, dass die verwendeten Trägergase mög-

lichst sauerstofffrei sind und die Säule bis zum Abkühlen kontinuierlich mit Träger-

gas gespült wird.

Damit eine Substanz als „Trennflüssigkeit“ überhaupt geeignet ist, muss sie be-

stimmte Eigenschaften besitzen:

Thermische Beständigkeit

geringer Dampfdruck bei der verwendetet Trenntemperatur

geringe Viskosität bei der verwendeten Trenntemperatur

chemisch innert

hohe Selektivität für das entsprechende Trennproblem

Die Trennleistung einer GC-Säule ist generell umso höher, je länger die Säule ist.

Bei gepackten Säulen sind der Säulenlänge aufgrund des hohen Widerstandes,

der dem Trägergas durch die Säulenfüllung entgegengebracht wird, enge Grenzen

gesetzt.

Kapillarsäulen hingegen besitzen, im Gegensatz zu den gepackten Säulen, aber

keine „Säulenfüllung“ im herkömmlichen Sinn. Durch den Hohlraum in der Mitte

der Kapillare ist der Säulenwiderstand geringer als bei einer gepackten Säule.

Dies erlaubt die Verwendung von sehr langen Säulen (15 - 150 Meter).

Im Versuch wird eine (5%-Phenyl)-methylpolysiloxanphase vom Typ HP-5ms der

Firma Agilent Technologies verwendet (also eine Phase mit einem 5%-igen

Diphenylpolysiloxan-Anteil). Max. Temp. 325° - 350°C.

I.3.2.1 Temperaturbeständigkeit von Kapillarsäu-len

Eine wichtige Angabe bei Kapillarsäulen ist der zulässige Temperaturbereich in

dem eine Säule verwendet werden darf. Ist die gewählte Trenntemperatur für eine

bestimmte Trennflüssigkeit („stationäre Phase“) zu niedrig, so kann dies zu einer

schlechten Trennleistung führen, ist die Temperatur hingegen zu hoch, so kommt

es zum Zersetzen der Trennflüssigkeit (zum sog. „Ausbluten“ der Säule) durch

den erhöhten Dampfdruck der stationären Phase. Dies macht sich in einer oft

drastisch steigenden Grundliniendrift bemerkbar.

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Um das „Ausbluten“ einer Säule zu vermindern wird von vielen Herstellern die

Trennflüssigkeit chemisch an der Kapillarwand fixiert. Man unterscheidet daher

immobilisierte/chemisch gebundene Phasen (bonded phases) von sog. ungebun-

denen (nonbonded phases), bei denen die Trennflüssigkeit lediglich auf die Kapil-

larwand aufgetragen jedoch nicht weiter in der Kapillare fixiert ist.

I.4 Die mobile Phase (Trägergas)

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen

Als Trägergas wird in den meisten Fällen - so auch bei diesem Versuch - Helium,

seltener hingegen Wasserstoff (Explosionsgefahr !), verwendet. Die Trägergase

müssen von besonderer Reinheit sein. Von der mobilen Phase wird außerdem

gefordert, dass sie weder mit den zu trennenden Substanzen, noch mit dem Trä-

germaterial d.h. mit dem stationären Flüssigkeitsfilm bei hohen Temperaturen rea-

giert. Da das Trägergas direkt aus einer Entnahmestation über einen Druckminde-

rer (4 bar) in den Gaschromatographen eingespeist wird, ist eine weiterführende

Aufbereitung der mobilen Phase nicht notwendig.

I.5 Methoden der GC

Die Verweildauer von Substanzen in der stationären Phase nimmt generell mit

steigender Temperatur ab. Die Retentionszeit einer Substanz ist daher stark tem-

peraturabhängig und verkürzt sich mit steigender Trenntemperatur.

I.5.1 Die isotherme-GC

D.h. die Temperatur im Säulenofen wird während der Trennung nicht geändert.

- Vorteil: nach der Messung muss die Säule nicht wieder auf Anfangs-

bedingungen abgekühlt werden.

- Nachteil: mangelnde Flexibilität bei der Untersuchung von Gemischen

mit Verbindungen von stark unterschiedliche Polarität oder

stark unterschiedlichen Siedepunkten. Im isothermen Modus

werden bei Trennproblemen oder in der Erprobungsphase ei-

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ner neuen Trennmethode oft viele Messungen nötig, um ein

geeignetes isothermes System zu finden (zeitaufwendig!!).

I.5.2 Die temperaturprogrammierte GC

Bei der temperaturprogrammierten GC werden die Temperatur des Säulenofens

und damit die Säulentemperatur linear mit der Zeit verändert.

- Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennproble-

men, die isotherm (s.o.) nicht zu lösen sind; Verkürzung von

Analysenzeiten bei komplexen Probengemischen mit stark un-

terschiedlich retardierenden Substanzen.

- Nachteil: Um reproduzierbare Messergebnisse zu erhalten ist eine

exakt arbeitende Temperatursteuerung notwendig (in moder-

nen GC-Systemen sehr gut realisiert).

Bei Verwendung eines Temperaturprogramms wird eine Anfangstemperatur emp-

fohlen, die etwa 10°C unter der Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels

liegt. Die Endtemperatur richtet sich nach der zu analysierenden Komponente. Sie

sollte jedoch über dem Siedepunkt der jeweiligen Substanz liegen, um ein Ver-

schleppen der Probe auf der Säule zu verhindern.

I.6 Pneumatik und Säulenofen

Die Trägergaszufuhr (He oder H2 selten N2), sowie die Versorgung der verschie-

denen Detektoren mit Brenngasen (z.B. H2 und synthetische Luft für FID) erfolgt

über eine Regeleinheit, welche für einen konstanten Druck vor der Säule und für

konstante Strömungsgeschwindigkeiten während der Messung sorgt. Wegen der

starken Temperaturabhängigkeit der Retentionszeiten in der GC muss, um repro-

duzierbare Ergebnisse zu erhalten, die Säulentemperatur im Säulenofen der GC-

Anlage exakt regel- und kontrollierbar sein. Säulenöfen werden meist mit einem

Temperaturprogramm zwischen 30 und 350°C betrieben.

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I.7 Die Injektionseinheit (GC-Einlass-System)

1.7.1 Der automatische Probengeber (Autosampler)

Der Autosampler dient zur Einbringung der Probe in den GC-Injektor und somit in

das Trennsystem. Wichtig dabei ist, dass beim Einspritzvorgang eine möglichst

schmale Startbande produziert wird, d.h. dass die Probe auf möglichst kleinem

Raum an den Säuleneingang gebracht wird. Dies geschieht bei modernen GC-

Systemen fast ausschließlich mit Hilfe eines automatischen Probengebers. Das

Probengemisch wird dabei meist in einem relativ flüchtigen Lösungsmittel (z.B.

CHCl3, CH2Cl2, Hexan) gelöst und mit Hilfe einer Spritze automatisch injiziert.

Prinzipiell kann die Injektion auch manuell per Injektionsspritze erfolgen. Dies ist

allerdings wegen der genannten Nachteile (Reproduzierbarkeit, Genauigkeit etc.)

heute kaum noch gebräuchlich. Prinzipiell unterscheidet man zwei Arten von GC-

Injektorsystemen:

I.7.1.1 Split/Splitless – Injektor

Beim „Split/Splitless - Injector“

(Abb 1.7.1.1) wird die Probenlösung über

ein Septum (Membran aus Kunststoff

oder Gummi) in den Verdampfungsraum

injiziert. Durch die dort herrschende Tem-

peratur (meist 200 - 300°C) verdampft die

Probe und es entsteht eine Dampfwolke,

welche mit Hilfe des Trägergases in die

Säule transportiert wird. Die Probenauf-

gabe auf die Säule kann hierbei entweder

komplett (splitless-mode), oder durch Va-

riation der Spliteinstellung nur teilweise

(split-mode) erfolgen. Der split-mode

kommt vor allem bei sehr konzentrierten

Probenlösungen zum Einsatz. Splitlos

wird oft in der Spurenanalytik gemessen.

Abb 1.7.1.1. Schematische Darstellung

eines split/splitless Injektors

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I.7.1.2 On - Column - Injektor

Beim sog. „On-Column-Injector“

wird dagegen die Spritzenkanüle

(sehr dünne Nadel erforderlich) di-

rekt in die Trennsäule eingeführt

und somit die Probenlösung in flüs-

siger Form direkt in den Kapillar-

säuleneingang injiziert. Dieses Ver-

fahren der Injektion wird auch kal-

tes Injektionsverfahren genannt, da

die Probe nicht sofort, sondern erst

beim Hochheizen des Ofens ver-

dampft wird. Es eignet sich beson-

ders für die Analyse thermisch labi-

ler Substanzen.

Abb 1.7.1.2 Schematische Darstellung eines

On-Column-Injektors

I.8 Der GC-Detektor Wie bei der HPLC, werden bei der Gaschromatographie Detektoren eingesetzt, um die

Substanzen nach der Trennung nachweisen zu können. Die Wahl des Detektors hängt

hierbei im Wesentlichen von den Eigenschaften der nachzuweisenden Substanz ab.

Häufig eingesetzte Detektoren sind:

Detektor Anwendung Nachweisgren-

ze

Linearität

FID

(flame ionization detector)

selektiv

nur ionisierbare Komponenten

in H2/Luft-Flamme

ca. 5,0 pg C/sec

107

TCD (WLD)

(thermal conductivity detector

=Wärmeleitfähigkeitsdetektor)

universell

für Komponenten mit unter-

schiedlicher therm. Leitfähigkeit

zum Trägergas

400 pg/ml car-

rier

106

ECD

(electron capture detektor

=Elektroneneinfangdetektor)

selektiv

z.B. Moleküle mit Heteroatomen

z.B. 0,1 pg Cl

/sec

104

NPD

(Stickstoff-Phosphor Detektor)

selektiv

für stickstoff und –

phosphorhaltige organische

Komponenten

0,1 – 0,40 pg

104

MSD

(mass selective detector)

universell

kaum Einschränkungen

10 pg – 10 ng

105

Tab. 1.8 Übersicht über häufig eingesetzte GC-Detektoren:

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Seite 12 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

I.8.1 Der Flammenionisationsdetektor (FID)

Einer der meist verwendete Detektoren

in der GC ist der Flammenionisations-

detektor (flame ionization detector, FID,

siehe Abb 1.14). Gegenüber anderen

Detektoren weist er den Vorteil großer

Empfindlichkeit bei einem sehr breiten

Anwendungsbereich auf. Der FID ist

praktisch auf sämtliche kohlenstoffhalti-

ge Verbindungen empfindlich und kaum

auf bestimmte Substanzklassen be-

schränkt. In der Wasserstoffflamme

(„Knallgasreaktion“) finden Radikalreak-

tionen statt. Gelangt ein organisches

Molekül in die Flamme, wird es zu ent-

sprechenden Radikalen pyrolysiert, die

Abb 1.8.1 Schematische Darstellung

eines FID- Detektors

durch angeregte Sauerstoffatome und OH-Radikale oxidiert und ionisiert werden. Die so

erzeugten Ionen werden von der Collector-Electrode angezogen, wodurch ein Strom

fließt, welcher zur Probenmenge proportional ist.

Da die Detektion auf der Verbrennung der Probe beruht, spricht der FID nur auf „brenn-

bare“ Substanzen an. Verbindungen wie H2O, N2 oder CO2 werden daher nicht erfasst.

Stark halogenierte Verbindungen geben meist ein nur schwaches Signal (hier wäre die

bessere Wahl ein ECD Detektor).

I.8.2 Der Massenselektive Detektor (MSD)

Bei diesem Verfahren (GC/MS-Kopplung) wird ein Gaschromatograph (GC) mit einem

Massenspektrometer (MS) gekoppelt. Diese Methode verbindet die Vorteile einer

chromatographischem Trennmethode mit dem selektiven und empfindlichen Nachweis

von Substanzen durch die Massenspektrometrie. Durch dieses Verfahren kann zusätz-

lich zur Retentionszeit einer Verbindung, auch ihr jeweiliges Massenspektrum zur Iden-

tifikation herangezogen werden (vgl. UV Spektrum beim DAD in der HPLC). Die am

weitesten verbreiteten massenspektrometrischen Detektoren in der GC sind der Quad-

rupol- und der Ion-Trap-Detektor. Im vorliegenden Versuch wird ein Quadrupoldetektor

mit EI-Ionisationstechnik (Elektronenstoßionisation = Electron Impact) verwendet. Im

Gegensatz zur sog. „weichen“ CI-Ionisationstechnik (chemische Ionisation mittels Rea-

genzträgergasen z.B. NH3 oder CH4 ) werden bei der EIektronenstoßionisation die

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von der Säule eluierenden Probenkomponenten durch Elektronen mit einer Energie von

70eV ionisiert. Dabei entstehen sowohl Radikalionen M+ mit ungepaartem Elektron, als

auch verbindungsspezifische Fragmente. Diese Fragmentiersungsmuster können zur

Identifizierung und Charakterisierung der Komponenten herangezogen werden

(Spektrendatenbanken !).

Abb 1.8.2 Schematischer Aufbau eines Quadrupol MSD

Die zu analysierende Komponente wird dabei nach dem Verlassen der GC-Säule über

die sog. Transfeline (310°C) in den Massendetektor geleitet. Das Massenspektrometer

steht unter Vakuum (8.2 X 10-6 Torr). Wichtig ist hierbei, dass die Temperatur der

Transferline etwa 10°C höher liegt, als die Endstufentemperatur des gewählten Ofen-

programms, da sonst Substanzen in die Transferline verschleppt werden könnten. Die

Transferline-Temperatur darf jedoch den für die jeweilige Säule maximal zulässigen

Höchstwert (hier 325°C) nicht überschreiten, da sonst Säulenmaterial in den Massen-

analysator austritt und diesen verunreinigt. Unmittelbar nach dem Start eines Laufes

bleibt der MS Detektor meist noch für eine Zeit von 2 - 5 min ausgeschaltet (sog. sol-

vent delay), um das Massenspektrometer nicht durch das meist sehr früh eluierende

Solvens der Probe zu verunreinigen. Aus diesem Grund sollte die Durchbruchszeit tm

für das verwendete chromatographische System bereits vorher ermittelt worden sein.

Transferline (310°C)

GC

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Seite 14 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

1.9 Probenvorbereitung in der GC (Derivatisierung)

Viele schwerflüchtige Substanzen lassen sich erst nach Derivatisierung zu

leichterflüchtigen Verbindungen gaschromatographisch bestimmen. Der hohe Siede-

punkt mancher Verbindungen ist oft auf polare funktionelle Gruppen (COOH-, OH,- oder

NH2-Gruppen) zurückzuführen. Die Derivatisierung dieser Funktionen zu relativ

unpolaren Strukturelementen (z.B. Ester, Amide) senkt die Siedetemperatur. Weitere

Gründe für eine Derivatisierung können sein:

Verbesserung der Trennung der entsprechenden Komponenten.

Verbesserung der Nachweisgrenze.

Verbesserung der thermischen Stabilität

Eine wichtige Rolle spielt hierbei vor allem die Umsetzung von Verbindungen zu

Trimethylsilyl-Derivaten. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Silylierungsmittel hängt da-

bei stark vom gewählten Reagenz, von der funktionellen Gruppe sowie vom Lösungs-

mittel ab.

Reaktion Reagenz Substanzklasse

Acylierung Trifluoressigsäureanhydrid

N-Methyl-bis-trifluoracetamid

Pentafluorpropionsäureanhydrid

Essigsäureanhydrid

Amine, Alkohole

Alkylierung Diazomethan Carbonsäuren, Phenole, Enole

Dimethylformamiddimethylacetal Carbonsäuren, Amine, Alkohole

Silylierung Trimethylchlorsilan (TMS)

N-Methyltrimethylsilyltrifluoracetamid

(MSTFA)

N,O-bis-(Trimethylsilyl)-trifluoracetamid

(BSA)

bis-(Trimethylsilyl)-trifluoracetamid

(BSTFA)

Alkohole, Amine, Carbonsäuren

Tab 1.9 Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der GC

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I.10 Die Steuerungs- und Auswerte-Software

Bei modernen GC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Probenauf-

gabe, Pneumatik, Ofentemperatur, Ventile, Detektoren) von einem Rechner aus

gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Darstellung, Speiche-

rung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach Aufnahme des

Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Bearbeitung und Aus-

wertung des Chromatogramms übernehmen und einen passenden Ausdruck

der Ergebnisse liefern. Bei älteren GC-Anlagen, bei denen die Steuerung der

Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt, übernimmt ein separater Integra-

tor die Aufzeichnung und Auswertung der Chromatogramme (heute nicht mehr

gebräuchlich).

Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration) wohl

die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Voraussetzung zur

exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen Peaks völlig

getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie konstant verläuft.

Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlappende oder aufsitzende

Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der Grundlinie berücksichtigen,

jedoch ist es immer angebracht, zunächst die Trennung zu optimieren oder die

Probenvorbereitung zu verbessern um Störpeaks zu beseitigen.

Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog.

Peakverarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus

den Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden wich-

tigsten Peakverarbeitungsparameter sind:

- Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der

ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten in-

teressierenden Peaks.

- Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest

(Peakerkennungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive (Peakbeginn)

bzw. negative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen, aus den Schwan-

kungen der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es zur

Peakerkennung durch die Software.

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Seite 16 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

I.11 Die Methode des Internen Standards (ISTD)

In der GC/HPLC ist es von größter Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhalte-

nen Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten

Bedingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten er-

lauben. Als Messgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei

exakt symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß heran-

gezogen werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge

der zu analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der

Konzentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten ab-

hängig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Kon-

zentration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder

Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vor-

zugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleich-

barer Korrekturfaktor verwendet werden.

I.11.1 Wahl eines geeigneten Tracers

Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchenden

Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den sog.

Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard einge-

setzt werden soll, muß aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfüllen:

sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vor-

kommen.

sie muß chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Kompo-

nenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der Säule

und der verwendeten mobilen Phase.

sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.

sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften

(Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestimmen-

de Substanz verfügen.

sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den

chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in vergleich-

barer Konzentration zugesetzt werden.

Nach der Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den genauen

Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine Referenz-

substanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in ähnlichen Kon-

zentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, läßt sich für jede Substanz i

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 17

ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren fTr und fi nach folgenden

Zusammenhängen ermitteln:

fi = i

ima

fi = Response-Faktor der

Komponente i

ai = Fläche der Substanz i

mi = Masse der Komponente i

KFi = i

Tr

f

f = K

iKTr

KTr

Ki

amam

KFi = Kalibrierfaktor der

Komponente i

fTr = Response-Faktor

desTracers

miK = Masse der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

mTrK = Masse des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aTrK = Fläche des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aiK = Fläche der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

m xi = KFi x

Tr

xi

aa

mTr

m xi = Masse der Komponente i in

der Probenlösung (X)

m xTr = Masse des Tracers in der

Probenlösung (X)

a xi = Fläche der Komponente i

a xTr = Fläche des Tracers

Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und gleicher

Konzentration (Masse mTr) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus der Ei-

chung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten nach Formel

(3) ermitteln.

(1)

(2)

(3)

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Seite 18 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

I.12 Aufgaben zum Theoretischen Teil

1.) Welche beiden unterschiedlichen Chromatograpiearten werden in der GC

hauptsächlich eingesetzt?

2.) In der Gaschromatographie unterscheidet man im Wesentlichen zwischen

zwei unterschiedlichen Kategorien von Trennsäulen. Wie heißen sie und

worin unterscheiden sie sich?

3.) Nennen sie einen wesentlichen Vorteil, bei der Verwendung von Kapillar-

säulen.

4.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen der Schichtdicke (Film) der

Trennflüssigkeit in Kapillarsäulen und der Kapazität der Trennsäule bzw.

der Trennleistung der Kapillarsäule.

5.) Nennen sie drei Beispiele fester Adsorbentien die bei gepackten Säulen

zum Einsatz kommen und für welche Substanzen sie verwendet werden.

6.) Aus welchem Material ist in der Regel die Kapillarwand einer Kapillarsäule

hergestellt. Wie heißt der entsprechende Fachausdruck?

7.) Was versteht man unter Säulenbluten, wie kommt es zustande und wie

macht es sich bemerkbar?

8.) Wie kann eine Säule hinsichtlich des aufgebrachten stationären Trägerma-

terials modifiziert werden, um Säulenbluten zu verhindern und wie nennt

man eine so veränderte Phase?

9.) Welche notwendigen Voraussetzungen muss die in einer Kapillarsäule auf-

gebrachte Trennflüssigkeit u.a. aufweisen (5 Beispiele)?

10.) Wann wird in der GC mit Split-Injektion und wann im Splitless-Mode gear-

beitet (je 1 Beispiel)?

11.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip ei-

nes Split-Splitlos Injektors und eines On-Column-Injektors. Wie nennt man

das Injektionsverfahren bei der On-Column-Injektion?

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12.) Nennen sie ein Beispiel für ein sog. kaltes Injektionsverfahren und bei wel-

chen Substanzen wird es überwiegend angewendet?

13.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird bei der Wahl

des Ofen-Temperaturprogramms während einer chromatographischen GC-

Trennung unterschieden und wie nennt man diese?

14.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert?

15.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer auf-

weisen muss.

16.) Nennen sie neben dem FID Detektor vier weitere Arten von GC-Detektoren.

17.) Erläutern Sie einen wesentlichen Unterschied zwischen der EI- und der CI-

Ionisationstechnik in einem massenselektiven Detektor.

18.) Warum sollte die Temperatur der Transferline in der GC/MS stets 10°C hö-

her liegen als die jeweils gewählte Endtemperatur des Ofenprogramms und

welche Einschränkung gilt hierbei?

19.) Nennen Sie drei Gründe für eine Probenderivatisierung in der GC.

20.) Nennen Sie drei Derivatisierungsreagentien und die Substanzklasse für die

sie jeweils Anwendung finden.

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II Experimenteller Teil

GC/MS-Bestimmung von Cumarin in den Par-fums Chanel-No 5©, Joop© und Pure© (Jil San-der) mit der Metode des Internen Standards

II.1 Einleitung

Cumarin ist ein natürlich vorkommender sekundärer Pflanzenstoff, der in vielen

Gräsern (beispielsweise Anthoxanthum odoratum), Schmetterlingsblütlern (bei-

spielsweise Melilotus officinalis), im Waldmeister, in Datteln sowie in der Tonka-

bohne (Dipteryx odorata) enthalten ist. Der Name leitet sich von span. cumarú =

Tonkabohnenbaum ab. Cumarin (und verwandte Stoffe) sind für den typischen

Heugeruch beim Trocknen von Gras verantwortlich, da Cumarin in der Pflanze

teilweise glykosidisch gebunden ist und erst bei Verletzung beziehungsweise beim

Welken der Pflanzen durch Abspaltung des Zuckers frei wird.

Chemisch gesehen ist Cumarin 1,2-Benzpyron.

Weitere Namen sind:

1-Benzopyran-2-on, o-Cumarsäurelacton,

Tonkabohnencampher, Chromen-2-on oder α-

Benzopyron.

Einige mit Cumarin verwandte Verbindungen wurden früher als Geruchs- und Ge-

schmackstoffe in Nahrungsmitteln verwendet. Cumarin ist wohl nur in größeren

Mengen und über längere Zeiträume aufgenommen gesundheitsschädlich. Hohe

Dosen können zu Leberschäden, Kopfschmerzen, Übelkeit, Schwindel und Be-

nommenheit führen, sehr hohe Dosen führen zu Bewusstlosigkeit und Atemläh-

mung. Auch können Leber und Nieren geschädigt werden. Aus diesen Gründen

darf Cumarin in Deutschland nicht mehr als Aromastoff in Lebensmitteln verwen-

det werden. Für die bekannte Maibowle aus Waldmeister sollen höchstens 3 g

Kraut je Liter Bowle verwendet werden. In dieser geringen Menge ist das enthalte-

ne Cumarin nicht gesundheitsschädlich.

Cumarin

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In der Medizin werden Hydroxycumarine oder synthetische Cumarin-Derivate als

gerinnungshemmende Medikamente eingesetzt. Sie wirken, indem sie die Synthe-

se der in der Leber gebildeten Blutgerinnungsfaktoren (II, VII, IX, X) inhibieren und

sind Antagonisten des Vitamins K. Außerdem werden sie als Rodentizide vor al-

lem zur Bekämpfung von Ratten eingesetzt, die, wenn sie hohe Dosen an

Cumarin aufgenommen haben, nach einiger Zeit innerlich verbluten.

II.2 Durchführung

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen

Cumarin-Stammlösung (Lösung A):

25 mg Cumarin (Fluka 28150: 1-Benzopyran-2-on ≥ 99% HPLC) werden in ein

Zinnwägeschiffchen (Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa.

Elementar Analysensysteme GmbH, D-63452 Hanau, Germany), genau eingewo-

gen. Anschließend wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen

25 ml Meßkolben überführt und mit CHCl3 (GC-Qualität) bis zur Eichmarke aufge-

füllt. Der Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben

wird beschriftet (Lösung A Cumarin / Konzentration [1,00 mg/ml] ! ).

Tracer-Stammlösung (Lösung B):

25 mg Acetanilid (Fluka 00401: N-Phenylacetamid ≥ 99.5% CHN) werden in ein

Zinnwägeschiffchen (Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa.

Elementar Analysensysteme GmbH, D-63452 Hanau, Germany) genau eingewo-

gen. Anschließend wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen

25 ml Meßkolben überführt und mit CHCl3 (GC-Qualität) bis zur Eichmarke aufge-

füllt. Der Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben

wird beschriftet (Lösung B / Konzentration-Acetanilid [1,00 mg/ml] ! ).

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Seite 22 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung

Herstellung der Eichlösung (Lösung C):

Mit einer Pipette (Transferpette ,Fa. Brandt, D-97861 Wertheim, Germany) werden

je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen

zusammenpipettiert (Vorsicht ! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze

vermeiden !). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s ultrabeschallt (Durchmischung) und beschriftet.

Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze

(NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D-78532 Tuttlingen, Germany) mittels ei-

ner aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x 11/2, Fa.

Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die Kanüle von

der Spritze wieder entfernt (Achtung ! Spritze dabei senkrecht nach oben halten,

damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft !) und ein Chromafil Einmalfilter

(PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa. Macherey-Nagel, D-

52313 Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vorsichtig ! durch den aufge-

setzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen gepresst. Das Gläschen wird

mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und beschriftet (Lösung C / Konzentra-

tionen in [mg/ml] ! ). Achtung: Jeweils Vialkonzentrationen angeben !

II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen

Herstellung der Parfum-Probenlösungen:

Wenige Sprühstöße des jeweiligen Parfums werden in je ein Präparategläschen

gegeben. Daraus werden jeweils 100ul (Micromanpipette) entnommen und in ei-

nem weiteren Präparategläschen mit vorgelegten 900ul CHCl3 (Transferpette) um

den Faktor 10 verdünnt. Aus der verdünnten Lösungen werden mit der

Transferpette (neue Pipettenspitze verwenden) 700µl entnommen und in ein wei-

teres Präparategläschen überführt zu dem je 700µl Lösung B (Tracer-

Stammlösung) zupipettiert werden. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlos-

sen und 10 s geschüttelt. Die Filtration der Lösungen erfolgt analog Lösung C.

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Nach Abschluss der Probenvorbereitung stehen somit folgende Lösungen für die

Messungen mittels GC/MS zur Verfügung:

Lösung A: Cumarin [1.00 mg/ml in CHCl3]

Lösung B: Acetanilid (Tracer) [1.00 mg/ml in CHCl3]

Lösung C: Eichlösung [0.50 mg/ml Acetanilid + 0.50 mg/ml Cumarin]

Lösung Joop: [+ 0.50 mg/ml Acetanilid]

Lösung Chanel: [+ 0.50 mg/ml Acetanilid]

Lösung Pure: [+ 0.50 mg/ml Acetanilid]

II.2.2 Durchführung der GC/MS-Analysen

Säule:

HP-5MS© Capillary Column / Fa. J+W Scientific / Länge: 30 m / I.D. 0.25 mm /

Film 0.25 um. Temperaturlimit: -60°C - 325°C (350°C). Part 19091S-433

Vorbereitung:

Nachdem die Säule im Gaschromatographen bei einer Temperatur von 310 °C für

20 min ausgeheizt wurde, wird sie auf die Anfangstemperatur der jeweiligen

Messmethode (hier 50°C) für 10 Minuten konditioniert. Danach wird die Software

(siehe unten) programmiert. Bevor die Sequence mit der Eichlösung (C) und den

einzelnen Probenlösungen vermessen werden, wird ein Einzelchromatogramm

der Tracer-Lösung (B) aufgenommen, um beurteilen zu können, ob Acetanilid als

Interner Standard überhaupt verwendet werden kann.

Vor der ersten Injektion sind die CHCl3-Spüllösungen für die Injektionsspritze des

Autosamplers bereitzustellen.

Temperaturprogramm für Ofen:

Heizrate Temperatrur Dauer

initial 50°C 3 min

20°C/min 300°C 5 min

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Seite 24 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.2.1 Die Injektor-Programmierung

A : Geben Sie ein Injektionsvolumen von 1.00 ul ein.

B : Stellen Sie Solvent A auf 12 ( = Anzahl der Spritzenspülungen mit

CHCl3 vor Injektion aus Fläschen A).

C : Stellen Sie Solvent B auf 12 ( = Anzahl der Spritzenspülungen mit

CHCl3 nach Injektion aus Fläschen B).

II.2.2.2 Der Injektionsmodus

D : Geben Sie als Injektortemperatur 300°C ein.

E : Wählen Sie ein Splitverhältnis von 40:1

B

C

A

D

E

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 25

II.2.2.3 Programmierung des Säulenflusses

F : Geben Sie als Trägergasfluss (He) 1.0 ml/min ein.

II.2.2.4 Programmierung des Säulenofens

G : Geben sie das Temperaturprogramm für den Säulenofen ein.

F

G

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Seite 26 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.2.5 Einstellung der Transferline-Temperatur

H : Geben Sie als Temperatur für die Transferline 310°C ein

I.2.2.6 Programmierung des Autosamplers

I : Geben Sie in die Sequence-Log-Table die Bezeichnungen der Proben

in der Reihenfolge ein, in der Sie abgearbeitet werden sollen (Eichlö-

sung / Joop / Chanel / Pure).

J : In das Kommentarfeld werden zu jeder Probe die jeweils bekannten

Vialkonzentrationen der Komponenten eingetragen.

H

I J

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 27

II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence

K : Starten Sie mit dem Kommando „Run Sequence“ die

Analysensequence, nachdem Sie die Proben in den Probenteller des

Autosamplers gestellt haben.

II.2.3 Die quantitative Auswertung

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis

L : Öffnen Sie mit „Select Data File“ das Eichchromatogramm

K

L

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Seite 28 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle

M : Wählen Sie über den Menüpunkt „Set Up Quantitation“ die

„Quantitation Database Globals“ und geben Sie danach den Namen

des gewünschten Integrationsfile ein.

N : Geben Sie nun die gewünschte Konzentrationseinheit (z.B. mg/ml)

sowie die ISTD-Konzentration [0.50 ] ein und bestätigen Sie mit „OK“.

O : Anschließend werden den Peaks im Eichchromatogramm die Namen

des Tracers und der Zielkomponente zugeordnet (Save, Exit)

M

N

O

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 29

P : Die Substanzen der Kalibriermessung erscheinen nun mit den zuge-

hörigen Retentionszeiten im „Edit Compound Fenster“. Bestätigen Sie

mit „Exit“.

Q : Wählen Sie mit „Add New Level“ einen neuen Kalibrierlevel aus.

R : Tragen Sie als Level ID „1“ ein.

S : Tragen Sie als Konzentrationswert für die Zielkomponente (Cumarin)

in der Eichlösung den Wert 0.5 mg/ml ein und bestätigen Sie anschlie-

ßend mit „Do Update“.

P

Q R

S

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Seite 30 GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11

II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reports (ISTD-Report)

T : Nachdem Sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben

(Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme der

Lösungen Joop, Chanel und Pure geladen werden und für jedes

Chromatogramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wählen

Sie im „Data-Analysis“ Menü den Punkt „Quantitate -> Calculate“ aus.

Daraufhin erscheint der ISTD Report (siehe oben). In der Spalte

„Conc“ werden die Konzentration des Tracers sowie die ermittelte

Konzentration der gesuchten Zielkomponente (Cumarin) angezeigt.

Zusätzlich sind die Werte der Peakflächen (Response), die Retentions-

zeiten (RT) und die Namen der Substanzen aufgeführt. Die Reports

werden für jede untersuchte Lösung ausgedruckt und die erhaltenen

Ergebnisse mit den berechneten Ergebnissen verglichen.

T

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GC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2010/11 Seite 31

II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil

1.) Was versteht man unter der Durchbruchszeit tm eines chromatographischen

Systems und warum ist diese mit der im Praktikumsversuch eingestellten

Messmethode nicht zu bestimmen?

2.) Welche Einflüsse tragen in der GC zu einer deutlichen Beeinflussung der

Durchbruchszeit bei (nennen sie 2 Beispiele)?

3.) Für das verwendete chromatographische System sei eine Durchbruchszeit

von 2.5 min gegeben. Ermitteln Sie aus dem Eich-Chromatogramm die Re-

tentionszeiten tR(X) von Acetanilid und Cumarin.

4.) Berechnen sie die lineare Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase

um in [cm/s] (Länge der Säule 30 Meter).

5.) Wie würde sich die Trennleistung der Säule verändern, wenn Sie die lineare

Wanderungsgeschwindigkeit um drastisch erhöhen oder drastisch reduzie-

ren würden. Begründen Sie Ihre Aussage.

6.) Ermitteln Sie im Chromatogramm des Parfums Joop die Retentionszeit tR

für die Komponente Cumarin und für die Komponente Ethylvanillin (NIST

Spektrensuche). Berechnen Sie für beide Komponenten den jeweiligen Ka-

pazitätsfaktor k und bestimmen Sie den Trennfaktor α zwischen Cumarin

und Ethylvanillin. Bewerten Sie das erhaltene Ergebnis.

7.) Berechnen Sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Er-

gebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Cumarin.

8.) Berechnen Sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an

Cumarin [mg/ml] in den Parfums Joop und Chanel No5.

9.) Überprüfen Sie das Chromatogramm des Parfums Pure (Jil Sander) mit

Hilfe der MS-Spektren auf den möglichen Inhaltsstoff Cumarin.

10.) Untersuchen Sie anhand der erhaltenen EI-Massenspektren das

Chromatogramm des Parfums Chanel auf den möglichen Inhaltsstoff Mo-

schusketon (MW 294).

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III Auswertung Theoretischer Teil

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IV Auswertung Experimenteller Teil

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Abgabe-Bogen / Name _________ Gruppe

Name Vorname

Bemerkungen: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Testat erteilt am durch

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Anhang 1: Strahlenschutz

Hinweise zur Minimierung der Strahlenexposition.

Sie gehen bei der Durchführung der Versuche zur Radioanalytik mit Radionukliden in Aktivitätsbereichen um, die so niedrig sind, dass selbst bei einer Inkorporation der gehandhabten Radionuklide (K-40, Ag-110, Ag-108, Mischnuklidlösung 1) eine mögliche Strahlenexposition weit unterhalb der Dosisgrenzwerte liegen würde. Die maximal zu erwartende Dosis durch unbemerkt inkorporierbare Aktivität liegt bei unter 0,1% der Grenzwerte für nicht beruflich strahlenexponierte Personen. Damit ist das zusätzliche Strahlenrisiko so gering, dass ein Umgang innerhalb des Praktikums gerechtfertigt ist. Machen Sie sich aber auch bewußt, dass beim Umgang mit radioaktiven Stoffen Risiken zwar sehr gering, aber nicht vollständig auszuschließen sind. Insbesondere gilt:

Eine äußere und innere Exposition durch ionisierende Strahlung durch Strahlenquellen oder Inkorporation radioaktiver Stoffe kann nicht völlig ausgeschlossen werden.

Jede Strahlenexposition (auch die natürliche) und sei sie noch so gering, kann bei exponierten Personen somatische und genetische Schäden verursachen und damit schwere Erkrankungen, wie z. B. Krebs und Schädigung der Leibesfrucht auslösen, die eine Lebensverkürzung der exponierten Person bzw. genetische Defekte bei den Nachkommen der exponierten Person zur Folge haben können.

Jede Strahlenexposition einer Mutter kann auch das ungeborene Kind schädigen.

Daher sind auch bei der Durchführung der radioanalytischen Versuche die Strahlenschutzgrundsätze zu beachten: • Eine Dosisreduzierung ist auch unterhalb der Grenzwerte durchzuführen. • Vermeiden Sie durch Ihr verantwortungsbewußtes Verhalten und durch Ihre

sorgfältige Arbeitsweise jede unnötige Strahlenexposition von Menschen, Umwelt und Sachgütern.

• Folgen Sie stets den Anweisungen der/des Betreuers/in.

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Anhang 1 (Fortsetzung): • Pippetieren Sie Lösungen, die Radionuklide enthalten können nicht mit dem

Mund. • Halten Sie die Kalibrier- und Messpräparate so, dass ein Verschütten

radioaktiver Stoffe ausgeschlossen ist. • Wenden Sie Ihre persönliche Schutzausrüstung stets richtig und mit

Überlegung an (Einmalhandschuhe, Labormantel, Laborschutzbrille). • Um das Inkorporationsrisiko zu minimieren ist es untersagt, während der

Durchführung des Praktikums, zu Essen, zu Trinken, zu Rauchen, Schnupftabak zu gebrauchen, Kaugummi zu kauen und Kosmetika anzuwenden.

• Teilen Sie dem/der Betreuer/in vor dem Versuchsbeginn mit, wenn

→ Sie an Allergien leiden, die die natürliche Schutzfunktion der Haut als Inkorporationsschutz herabsetzen können, → Sie früher Radionuklide inkorporiert haben und/oder in Strahlenschutz- bereichen gearbeitet haben oder noch arbeiten und als beruflich strahlen- exponierte Person eingruppiert waren bzw. sind. → bei Ihnen eine nuklearmedizinische Untersuchung oder Therapie vorgenommen wurde oder wird.

→ bei Ihnen als Teilnehmerin eine Schwangerschaft vorliegt. → ärztliche Befunde vorliegen, die ein Umgang mit offenen radioaktiven Stoffen ausschließen.

• Bitte lassen Sie während des Praktikums Ihr Handy ausgeschaltet, da eine Störung der empfindlichen Messgeräte nicht ausgeschlossen werden kann.

• Bitte betreten Sie nur die Ihnen für Ihr Praktikum zugewiesene Räume (CHE 32.01.48, CHE 32.01.49, CHE 32.01.36 nur in Begleitung).

• Bitte befolgen Sie stets alle Auflagen und Vorschriften zum Arbeits-, Brand-

Gesundheitsschutz, Strahlenschutz und zur Unfallverhütung, die Ihnen in der allgemeinen Sicherheitsbelehrung vermittelt werden.

• Missbrauchen Sie keine radioaktiven Warnzeichen! • Nehmen Sie nur die Unterlagen mit, die Sie für die Durchführung der

Versuche unbedingt benötigen. • Fragen Sie im Zweifelsfall die/den Betreuer/in.

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